一种核桃肽及其制备方法和应用与流程

1.本发明涉及生物活性肽技术领域，具体涉及一种核桃肽及其制备方法和应用。


背景技术：

2.核桃，又称胡桃，羌桃，为胡桃科植物。与扁桃、腰果、榛子并称为世界著名的“四大干果”。核桃仁含有丰富的营养素，每百克含脂肪较多，蛋白质15~20克，碳水化合物10克；并含有人体必需的钙、磷、铁等多种微量元素和矿物质，以及胡萝卜素、核黄素等多种维生素，深受人们喜爱。
3.核桃粕是核桃榨油时的副产物，目前仅被用作饲料或肥料，这使得核桃粕中的营养物质没有得到充分利用，特别是其中的生物活性物质被忽视。高营养价值的核桃粕的利用率不高导致产品增值较低。近几十年，生物活性肽的发展为核桃粕的精深加工带来了新思路。核桃粕蛋白酶解物具有较多的生物活性，多肽多样的生物活性功能和良好的加工特性使其逐渐成为研究的热点。
4.记忆力下降作为一种临床症状在很多神经退行性疾病中都有表现，目前研究较多的有阿尔兹海默病、血管性痴呆、帕金森症、铝中毒、癫痫等。记忆力下降作为神经退行性疾病发生发展过程中显著的特征而广受关注。神经退行性疾病的成因有很多，包括β-淀粉样肽（aβ）的积淀、胆碱功能系统功能紊乱、谷氨酸含量过高、线粒体作用紊乱、氧化应激及炎症释放等。由此可见，对神经退行性疾病中记忆能力的调控趋势是多方位多靶点的。因此，开发具有预防、改善记忆力下降及认知功能退化的活性物质成为科学工作者的重点。
5.核桃蛋白是一种包含18种氨基酸且8种必需氨基酸种类齐全、含量合理的优质植物蛋白。其中谷氨酸（glu）、精氨酸（arg）和天冬氨酸（asp）对于维持人体神经系统具有重要的作用。核桃肽中起神经保护、辅助改善记忆作用的多肽序列结构尚未有大量的研究。现有的核桃肽提取工艺存在成本高、浪费大，不利于工业化的问题，并且酶解过程常采用各种蛋白酶一起参与整个酶解过程，忽略了蛋白酶之间的差异性，从而存在酶解效果不理想，制备得到的核桃肽质量不高的问题。


技术实现要素：

6.为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种核桃肽，所得核桃肽具有保护神经，促进功能性神经元生长，改善学习和记忆功能的功效，能促进细胞在缺氧下的存活，提高抗氧化能力，抑制细胞凋亡，发挥大脑保护功效。
7.本发明的目的还在于提供了上述核桃肽的制备方法和应用。
8.为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：本发明提供了一种核桃肽，所述核桃肽为单链多肽，结构序列为iralpeevl。
9.优选的，所述肽链分子量为1039.222da。
10.本发明还提供了上述核桃肽的制备方法，包括以下步骤：（1）核桃粕浆用纤维素酶和果胶酶进行酶解，灭酶后过滤干燥，得到核桃蛋白；
（2）制备核桃蛋白浆，将核桃蛋白浆在50~60℃保温，调节ph后依次用碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶进行酶解，得到核桃蛋白酶解液；（3）所述核桃蛋白酶解液中加入活性炭保温、过滤、干燥，得核桃肽混合物；（4）将核桃肽混合物制备成溶液，采用高效液相色谱分离纯化得到核桃肽iralpeevl。
11.优选的，所述步骤（1）中纤维素酶的添加量为1200~1800u/ml，果胶酶的添加量为400~600u/ml，核桃粕浆液在ph值6~7、温度为50~55℃下酶解3~5 h。
12.优选的，所述步骤（2）中碱性蛋白酶酶解4.5~5.5 h后，加入木瓜蛋白酶继续酶解3.5~4.5 h；碱性蛋白酶的添加量为450~550u/ml，木瓜蛋白酶的添加量为200~300u/ml，碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶的酶解ph值为8~8.5、温度为50~60℃。
13.优选的，所述步骤（4）中核桃肽混合物配制得到浓度为0.8~1.2 mg/ml的水溶液。
14.优选的，所述步骤（4）中采用高效液相色谱进行两次分离纯化，以流动相a：水 0.1%三氟乙酸，流动相b：乙腈 0.1%三氟乙酸进行梯度洗脱得到核桃肽iralpeevl。
15.优选的，第一次高效液相色谱条件如下：采用规格为550mm
×
40μm，20μm的制备型液相色谱柱流速14~15ml/min；洗脱程序为0~5min 5%b，5~15min 5%b~25%b，15~45min 25%~55%b；收集21~24min的洗脱流份。
16.优选的，第二次高效液相色谱条件如下：采用规格为250mm
×
4.6mm，5μm的agilent plus c18色谱柱；流速0.4~0.5ml/min；洗脱程序为0~10min 5%b，10~25min 80%b，25~30min 5%b；收集16~20 min的洗脱流份。
17.本发明还提供了上述核桃肽在制备神经保护和/或记忆力改善产品中的应用。
18.与现有技术相比，本发明的技术方案的有益效果如下：本发明制备得到的核桃肽能明显上调斑马鱼bdnf基因的表达，可通过增加半乳糖凝集素蛋白表达促进bdnf的产生以及外周神经元及轴突的再生来发挥神经保护功效；能通过增加cav1表达促进功能性神经元生长，从而改善学习和记忆功能；可以增加higd2a表达，促进细胞在缺氧下的存活、提高抗氧化能力，可以增加mcmbp表达，抑制细胞凋亡，以发挥大脑保护功效。
19.本发明中核桃肽的制备方法简单，成本低、浪费少，可用于工业化生产。
附图说明
20.图1为核桃肽序列结构；图2为样品处理后斑马鱼中枢神经凋亡细胞典型图；图3为重复实验的cv分布图；图4为差异蛋白数量统计条形图，a为模型与对照组，b为核桃肽组与模型组；图5为差异蛋白数量统计火山图，a为模型与对照组，b为核桃肽组与模型组；图6为差异蛋白venn图；图7为差异蛋白的表达聚类图；图8为差异蛋白go功能分类图；图9为生物学过程（biological process）富集气泡图；图10为细胞组分（cellular component）富集气泡图；
图11为分子功能（molecular function）富集气泡图；图12为差异蛋白pathway功能分类图；图13为显著富集的pathway统计图。
具体实施方式
21.本发明提供了一种核桃肽，利用纳升级液相色谱-q exactive质谱联用鉴定其结构为iralpeevl的单链多肽，分子量为1039.222da，序列结构见图1。
22.本发明所述核桃肽是从脱脂核桃粕中酶解、分离、纯化得到的，能明显上调斑马鱼bdnf基因的表达，可通过增加半乳糖凝集素蛋白表达促进bdnf的产生以及外周神经元及轴突的再生来发挥神经保护功效；能通过增加cav1表达促进功能性神经元生长，从而改善学习和记忆功能；可以增加higd2a表达，促进细胞在缺氧下的存活、提高抗氧化能力，可以增加mcmbp表达，抑制细胞凋亡，以发挥大脑保护功效。
23.本发明还提供了上述核桃肽的制备方法，包括以下步骤：（1）核桃粕浆用纤维素酶和果胶酶进行酶解，灭酶后过滤干燥，得到核桃蛋白；（2）制备核桃蛋白浆，将核桃蛋白浆在50~60℃保温，调节ph后依次用碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶进行酶解，得到核桃蛋白酶解液；（3）所述核桃蛋白酶解液中加入活性炭保温、过滤、干燥，得核桃肽混合物；（4）制备核桃肽混合物溶液，并采用高效液相法进行分离纯化得核桃肽。
24.在本发明中，所述核桃粕是由核桃脱壳，冷榨去油后得到的脱脂核桃粕，蛋白含量为45~56%，优选为50~55%，对脱脂核桃粕的具体来源不作限定。
25.本发明将脱脂核桃粕和水按料液比1:8~12 g/ml混合得到核桃粕浆液，所述料液比优选为1:9~11 g/ml，更优选为1:10 g/ml。本发明所述水优选为去离子水。
26.本发明将核桃粕浆液ph值调节至6~7，并升温至50~55℃。优选的，所述ph值为6.5~6.8，所述温度为52~54℃。本发明对具体使用的ph调节剂不作限定，采用常规酸碱ph调节剂即可，作为一种可选的实施方式，本发明采用浓度为10mol/l的hcl调节核桃粕浆液ph。本发明对具体的升温方式不作限定。本发明通过调节核桃粕浆液的ph和温度，可提高纤维素酶和果胶酶的活性。
27.本发明在核桃粕浆液中添加纤维素酶和果胶酶进行酶解反应，所述反应时间为3~5h，优选为4h。本发明中纤维素酶的添加量为1200~1800u/ml，优选为1500~1600u/ml；果胶酶的添加量为400~600u/ml，优选为500~550u/ml。本发明通过同时添加纤维素酶和果胶酶对核桃粕进行双酶解反应，复合提取核桃蛋白，可以有效提高核桃蛋白的提取效率。本发明对纤维素酶和果胶酶的具体来源不作限定。
28.本发明将核桃粕浆液酶解产物于100~110℃下灭酶处理8~10min。
29.本发明对灭酶后的核桃粕浆液酶解产物进行过滤干燥。作为一种可选的实施方式，本发明利用板框压滤机对酶解产物进行过滤，收集滤饼；将滤饼于管束干燥机中干燥，得到核桃蛋白。本发明对具体的过滤干燥方式不作限定。本发明制备得到的核桃蛋白中蛋白质的含量可达82~89%。
30.本发明将上述制备得到的核桃肽蛋白与水按料液比1:18~22g/ml混合得到核桃蛋白浆，所述料液比优选为1:19~21g/ml，更进一步优选为1:20g/ml。本发明所述水优选为去
离子水，得到的核桃肽蛋白浆底物浓度约为5%。
31.本发明将核桃蛋白浆ph值调节至8.8~9.2，优选的，所述ph值为8.9~9.0。本发明对具体使用的ph调节剂不作限定，采用常规酸碱ph调节剂即可。作为一种可选的实施方式，本发明采用浓度为9~10mol/l的naoh溶液调节核桃蛋白浆ph至9.0。本发明发现该ph值条件下的核桃蛋白的溶解性更好。
32.本发明对核桃蛋白浆进行均质处理。作为一种可选的实施方式，本发明将核桃蛋白浆于胶体磨（5000~6000转/分钟，过滤网50~60目）中处理10~15min，然后利用高压均质机（6~7kpa）处理5~10min。本发明对具体的均质处理方式不作限定。本发明通过均质处理，可以保证浆液颗粒粒径一致，浆液质地细腻、不分层，有利于提高浆液的稳定性。
33.本发明将均质后的核桃蛋白浆液进行搅拌处理，并升温至50~60℃，保温1~2h。所述升温温度优选为55~58℃，所述保温时间优选为1.5h。本发明通过升温并保温处理，有利于核桃蛋白浆液的脱色脱味。
34.本发明对保温处理后的核桃蛋白浆液再次进行ph调节，所述ph值调节为8~8.5，优选为8.2~8.4。本发明对具体使用的ph调节剂不作限定，采用常规酸碱ph调节剂即可。作为一种可选的实施方式，本发明采用浓度为0.5~1mol/l的hcl溶液调节核桃蛋白浆ph至8.5。本发明在ph调节过程中保持温度恒定（50~60℃）。本发明通过调节核桃蛋白浆液的ph和温度，可提高后续酶解过程中的碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶的活性。
35.本发明在核桃蛋白浆液中先添加碱性蛋白酶进行酶解反应，所述反应时间为4.5~5.5 h，优选为5 h。本发明中碱性蛋白酶的添加量为450~550u/ml，优选为480~520u/ml。本发明对碱性蛋白酶的具体来源不作限定。
36.本发明在碱性蛋白酶酶解反应结束后，继续添加木瓜蛋白酶进行酶解反应，所述反应时间为3.5~4.5 h，优选为4 h。本发明中木瓜蛋白酶的添加量为200~300u/ml，优选为250~280u/ml。本发明对木瓜蛋白酶的具体来源不作限定。
37.本发明将核桃蛋白浆液酶解产物升温至100~110℃，保持5~7min，对产物中的蛋白酶进行灭活。
38.本发明将灭酶后的核桃蛋白浆酶解产物降温至45~55℃，加入活性炭保温5~7 h，进行脱味、脱色处理。所述温度优选为50℃；所述活性炭的添加量为7~9 wt%，优选为8 wt%；所述保温时间优选为6 h。
39.本发明对核桃蛋白浆酶解产物进行过滤、干燥处理，得到核桃肽混合物。作为一种可选的实施方式，本发明将脱苦后的核桃蛋白浆酶解产物过28000~ 30000da陶瓷膜，然后再过1~1.2kd有机膜，所得滤液进行喷雾干燥，得到核桃肽混合物。本发明对具体的过滤、干燥方式不作限定。
40.本发明将上述制备得到的核桃肽制备核桃肽混合物溶液，所述核桃肽混合物溶液的制备方法为：用超纯水配制浓度为0.8~1.2 mg/ml的溶液，所述溶液浓度优选为1 mg/ml。
41.本发明采用高效液相法对上述制备得到的核桃肽混合物溶液进行分离纯化，采用高效液相色谱进行两次分离纯化得到所述核桃肽iralpeevl。在本发明的两次高效液相色谱分离过程中，均采用流动相a：水 0.1%三氟乙酸，流动相b：乙腈 0.1%三氟乙酸进行梯度洗脱。
42.本发明先对核桃肽混合物溶液进行第一次分离纯化，色谱条件为：液相色谱柱
（550mm*40μm，20μm），流速14~15ml/min，采用流动相a（水 0.1%三氟乙酸），流动相b（乙腈 0.1%三氟乙酸）进行梯度洗脱，洗脱程序为0~5min 5%b，5~15min 5%b~25%b，15~45min 25%~55%b。
43.本发明将21~24min得到的流份进行第二次分离纯化，色谱条件为：色谱柱（agilent plus c18 250mm*4.6mm，5μm），流速0.4~0.5ml/min，采用流动相a（水 0.1%三氟乙酸），流动相b（乙腈 0.1%三氟乙酸）进行梯度洗脱，洗脱程序为0~10min 5%b，10~25min 80%b，25~30min 5%b。本发明在第二次洗脱16~20 min得到的流份即为所述核桃肽流份。
44.本发明对上述制备得到的核桃肽流份进行冷冻干燥，得到核桃肽iralpeevl。本发明对具体的干燥方式不作限定。
45.本发明还提供了上述核桃肽在制备神经保护和/或记忆力改善药物中的应用。本发明所得核桃肽能明显上调bdnf基因和gdnf基因，提高脑源性神经营养因子和胶质细胞源性神经营养因子的表达量，具有神经保护、辅助改善记忆力的作用，可应用于神经保护和/或记忆力改善药品的制备。
46.下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
47.实施例1本实施例提供了核桃肽的制备方法：（1）双酶复合提取核桃蛋白：取1200kg脱脂核桃粕，与去离子水按照1:10g/ml混合，调节ph至6.5，升温至54℃，添加纤维素酶（1500u/ml）和果胶酶（500u/ml），酶解4h，100℃灭酶10min，利用板框压滤机，收集滤饼，利用管束干燥机将滤饼干燥，即为核桃蛋白。
48.（2）核桃肽生产工艺：a.取核桃蛋白500kg，加入去离子水10000l进行调浆。
49.b.将步骤a的核桃蛋白溶液搅拌均匀，利用浓度为10mol/l的naoh调ph至9.0，然后采用胶体磨（6000转/分钟，过滤网60目）进行处理10min，再利用高压均质机（7kpa）进行处理6min。
50.c.将高压均质后的匀浆液进行投料，进行搅拌处理，并升温至55℃，保温1小时。
51.d.将步骤c的溶液用浓度为1mol/l的hcl调ph至8.5，并始终保持温度恒定。
52.e.将步骤d中的溶液加入碱性蛋白酶（500u/ml），酶解5小时后再加入木瓜蛋白酶（250u/ml），继续酶解4h。
53.f.将步骤e中的溶液升温至110℃，保持5min，对蛋白酶进行灭活。
54.g.将步骤f的灭酶溶液降温至50℃，加入8%的活性炭（40kg），保温6小时后过30000da陶瓷膜，然后过1kd有机膜，喷雾干燥，得到核桃肽混合物。
55.h.取步骤g得到的核桃肽混合物2g，加入适量超纯水，制备得到浓度为1mg/ml的核桃肽混合物溶液。
56.i.采用高效液相法对核桃肽混合物溶液进行分离纯化。
57.第一次分离纯化：取适量步骤h制备得到的核桃肽混合物溶液进行超声处理5min，至表面没有气泡
产生，然后进行离心处理，离心条件为8000r/min，15℃，15min，经孔径为0.45μm滤头过滤后备用。
58.色谱条件：制备型液相色谱柱（550mm*40μm，20μm），流速为15ml/min，进样量为20ml，流动相a（水 0.1%三氟乙酸），流动相b（乙腈 0.1%三氟乙酸）进行梯度洗脱，洗脱程序为0~5min 5%b，5~15min 5%b~25%b，15~45min 25%~55%b。
59.得到15个组分：0~3min得流份1；3~6min得流份2；6~9min得流份3；9~12min得流份4；12~15min得流份5；15~18min得流份6；18~21min得流份7；21~24min得流份8；24~27min得流份9；27~30min得流份10；30~33min得流份11；33~36min得流份12；36~39min得流份13；39~42min得流份14；42~45min得流份15。
60.第二次分离纯化：对第一次分离纯化得到的流份8进一步进行液相分析称取10mg冷冻干燥后的流份8，用1ml超纯水溶解，超声处理至表面没有气泡，经孔径为0.45μm滤头过滤后备用。
61.检测条件为：色谱柱:agilent plus c18 250mm*4.6mm，5μm流动相：a：水 三氟乙酸(0.1%)；b：乙腈 三氟乙酸（0.1%）洗脱程序为0~10min 5%b，10~25min 80%b，25~30min 5%b。
62.检测波长：214 nm；流速：0.5 ml/ min；检测时间：30 min；进样体积：10μl；柱温：室温。
63.对流份8进一步分离共得到4个流份，12~16min得流份8-1；16~20min得流份8-2；20~24min得流份8-3；24~28min得流份8-4。
64.j.对核桃肽流份8-2进行冷冻干燥，即得核桃肽。
65.实施例2本实施例与实施例1的区别仅在于：步骤（1）双酶复合提取核桃蛋白：双酶复合提取核桃蛋白：取1200kg脱脂核桃粕，与去离子水按照1:10g/ml混合，调节ph至6，升温至50℃，添加纤维素酶（1200u/ml）和果胶酶（400u/ml），酶解3h，100℃灭酶10min，利用板框压滤机，收集滤饼，利用管束干燥机将滤饼干燥，即为核桃蛋白。
66.实施例3本实施例与实施例1的区别仅在于：步骤（1）双酶复合提取核桃蛋白：双酶复合提取核桃蛋白：取1200kg脱脂核桃粕，与去离子水按照1:10g/ml混合，调节ph至7，升温至55℃，添加纤维素酶（1800u/ml）和果胶酶（600u/ml），酶解5h，100℃灭酶10min，利用板框压滤机，收集滤饼，利用管束干燥机将滤饼干燥，即为核桃蛋白。
67.实施例4本实施例与实施例1的区别仅在于：步骤（1）中脱脂核桃粕与去离子水按照1:12g/ml混合。
68.实施例5本实施例与实施例1的区别仅在于：步骤（1）中添加纤维素酶（1800 u/ml）和果胶酶（400u/ml），酶解5h。
69.实施例6
本实施例与实施例1的区别仅在于：步骤a中加入核桃蛋白500kg，加入去离子水11000l进行调浆。
70.实施例7本实施例与实施例1的区别仅在于：步骤c中将高压均质后的匀浆液进行投料，进行搅拌处理，并升温至50℃。
71.实施例8本实施例与实施例1的区别仅在于：步骤c中将高压均质后的匀浆液进行投料，进行搅拌处理，并升温至60℃。
72.实施例9本实施例与实施例1的区别仅在于：步骤c中调ph至8。
73.实施例10本实施例与实施例1的区别仅在于：步骤c中调ph至8.5。
74.实施例11本实施例与实施例1的区别仅在于：步骤e中加入碱性蛋白酶（450u/ml），酶解4.5小时后再加入木瓜蛋白酶（200u/ml），继续酶解3.5h。
75.实施例12本实施例与实施例1的区别仅在于：步骤e中添加碱性蛋白酶（550u/ml），酶解5.5小时后再加入木瓜蛋白酶（300u/ml），继续酶解4.5h。
76.实施例13本实施例与实施例1的区别仅在于：步骤g中加入7%的活性炭。
77.实施例14本实施例与实施例1的区别仅在于：步骤h中制备得到浓度为0.8mg/ml的核桃肽混合物溶液。
78.实施例15本实施例与实施例1的区别仅在于：步骤h中制备得到浓度为1.2mg/ml的核桃肽混合物溶液。
79.实施例16本实施例与实施例1的区别仅在于：步骤i中第一次分离纯化流速为14.5ml/min，第二次分离纯化流速为0.45ml/min。
80.实施例17本实施例与实施例1的区别仅在于：步骤i中第一次分离纯化流速为14ml/min，第二次分离纯化流速为0.4ml/min。
81.实施例18本实施例对实施例1得到的核桃肽各流份进行活性检测。
82.1.对第一次分离纯化得到的各流份进行抗氧化性评价收集步骤第一次分离纯化得到的液相色谱仪的洗脱液，并将15个流份冷冻干燥，分别配制得到10mg/ml的样品溶液，进行抗氧化性评价。
83.（1）不同组分dpph自由基清除率测定将100μl的0.2mmol/l dpph溶液和100μl 10mg/ml的样品溶液混合，室温反应
30min，然后在517nm处测定吸光度a1；将100μl 10mg/ml的样品溶液在517nm处测定吸光度a2；100μl的0.2mmol/l dpph溶液在517nm处测定吸光度a0。计算公式如下：（2）不同组分羟自由基清除率测定羟自由基清除率测定原理是利用h2o2和fe
2
混合产生
·
oh，在体系中加入水杨酸捕捉
·
oh显色。依次在试管中加入100μl 10mg/ml的样品溶液，5mmol/l水杨酸乙醇溶液200μl，5mmol/lfeso4溶液200μl，涡旋振荡，37℃反应1h，然后取200μl反应液在510nm处测定吸光度。计算公式如下：式中：ac为空白组吸光度；ab为对照组吸光度；aa为试验组吸光度。
84.对各组分dpph自由基清除率和羟自由基清除率测定结果如表1所示：表1 不同流份的抗氧化性评价
流份dpph自由基清除率（%）
·
oh自由基清除率（%）流份dpph自由基清除率（%）
·
oh自由基清除率（%）流份11.210.92流份962.158.2流份29.366.79流份1053.549.1流份316.312.6流份1139.333.9流份428.120.9流份1226.619.1流份539.831.1流份1319.311.2流份651.245.3流份149.15.2流份763.556.5流份153.262.15流份871.665.5
ꢀꢀꢀ
由表1可知，流份8的dpph自由基清除率和羟自由基清除率最高，具有较高的抗氧化活性。
85.2.对第二次分离纯化得到的各流份对h2o2诱导的pc12细胞的保护作用进行探究。
86.（1） pc12细胞培养将pc12细胞采用rmpi-1640完全培养基（含有10%胎牛血清、100u/ml青霉素和链霉素）培养条件为37℃，5%co2培养箱中进行培养，选择生长状态较好的3~7代细胞进行试验。
87.（2） 核桃肽对h2o2诱导的pc12细胞的保护作用取对数生长期的pc12细胞，调整细胞密度4
×
105个/ml，按照4
×
104个/孔接种于96孔培养板上，设置空白对照组（未经任何处理）、模型组（0.5mm的h2o2处理）、核桃肽样品组（0.5mm的h2o2处理，给予核桃肽4个流份处理），于37℃、5%co2恒温培养箱培养24h，用pbs轻轻洗涤1次，孵育24h后，每孔加入10μl 5mg/ml mtt溶液，继续培养4h，洗弃培养基，每孔加入100μl dmso，震荡10min至蓝紫色甲瓒晶体完全溶解后，用酶标仪测定od
490
值。
88.根据公式计算各流份的细胞存活率，结果见表2。
89.表2 不同组别细胞存活率不同流份流份8-1流份8-2流份8-3流份8-4模型组对照组细胞存活率（%）62.978.375.353.645.2100
由表2可知，流份8-2对于h2o2诱导的pc12细胞具有明显的保护作用。
90.实施例19本实施例采用纳升级液相色谱-q exactive质谱联用系统，对实施例1得到的流份8-2进行纯度和结构鉴定。
91.1. 色谱条件：流动相：a相：100%纯净水 0.1%甲酸；b相：100%乙腈 0.1%甲酸；流动相流速：300nl/min；进样量：1μl上清；流动相梯度程序如下表3所示。
92.表3 流动相梯度程序时间（分）02.036.038.041.042.045.0a（%）97976310109797b（%）3337909033利用纳升级液相色谱-q exactive质谱联用，从核桃肽流份8-2中纯化得到了1条多肽，鉴定其结构为iralpeevl（1039.222da）的单链多肽，具体序列结构见图1。通过液质联用技术测定所得核桃肽在核桃肽混合物中的质量百分含量为0.92%。委托武汉星皓生物技术有限公司对核桃肽进行合成，进行后续实验，记为核桃肽t1。
93.实施例20本实施例对核桃肽对中枢神经的保护作用进行探究。
94.1. 样品配制信息核桃肽t1，用标准稀释水配制成2.00 mg/ml母液，现配现用。
95.阳性对照：谷胱甘肽，白色粉末，批号slcf2362，sigma，阴凉避光储存。用超纯水配制成154 mg/ml母液，-20℃储存。
96.2. 实验动物斑马鱼均饲养于28℃的养鱼用水中（水质：每1 l反渗透水中加入200 mg速溶海盐，电导率为450~550
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s/cm；ph为6.5~8.5；硬度为50~100 mg/l caco3），实验动物使用许可证号为：syxk（浙）2012-0171。饲养管理符合国际aaalac认证（认证编号：001458）的要求。
97.野生型ab品系斑马鱼，以自然成对交配繁殖方式进行。年龄为受精后1天（1 dpf）的斑马鱼用于样品最大检测浓度（mtc）测定及中枢神经保护功效评价。
98.3. mtc测定随机选取1 dpf野生型ab品系斑马鱼于6孔板中，每孔（实验组）均处理30尾斑马鱼。除正常对照组外，其余各实验组均水溶给予霉酚酸吗啉乙酯建立斑马鱼中枢神经损伤模型。分别水溶给予样品（浓度见表4），同时设置正常对照组和模型对照组，每孔容量为3 ml。28℃处理24 h后，测定样品对模型斑马鱼的mtc。mtc测定结果详见表4。
99.由表4可知，在本实验条件下，核桃肽对模型斑马鱼的最大检测浓度（mtc）为2000μg/ml。
100.4. 中枢神经保护功效评价随机选取1 dpf野生型ab品系斑马鱼于6孔板中，每孔（实验组）均处理30尾斑马鱼。分别水溶给予样品（浓度见表5），阳性对照谷胱甘肽616μg/ml浓度，同时设置正常对照组和模型对照组，每孔容量为3 ml。除正常对照组外，其余各实验组均水溶给予霉酚酸吗啉乙酯建立斑马鱼中枢神经损伤模型。28 ℃处理1天后，用吖啶橙（ao）进行染色，染色后每个实验组随机选取10尾斑马鱼置于荧光显微镜下拍照，使用nis-elements d 3.20高级图像处理软件采集数据，分析斑马鱼中枢神经凋亡细胞荧光强度，以该指标的统计学分析结果评价样品中枢神经保护功效，结果见表5和图2（图中方框为定量的区域）。统计学处理结果采用mean
±
se表示。用spss26.0软件进行统计学分析，p《0.05表明差异具有统计学意义。
101.由表5和图2可知，模型对照组斑马鱼中枢神经凋亡细胞荧光强度（242416像素）与正常对照组（85600像素）比较p《0.001，表明斑马鱼中枢神经损伤模型建立成功。阳性对照药谷胱甘肽616
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g/ml浓度组斑马鱼中枢神经凋亡细胞荧光强度（86541像素）与模型对照组比较p《0.001，说明谷胱甘肽对霉酚酸吗啉乙酯诱发的斑马鱼中枢神经损伤模型具有明显的中枢神经保护功效。
102.核桃肽t1 2.5、5.0和500μg/ml浓度组斑马鱼中枢神经凋亡细胞荧光强度分别为110433、88562和85712像素，与模型对照组比较，p均《0.001，说明核桃肽t1在本实验浓度条
件下对霉酚酸吗啉乙酯诱发的斑马鱼中枢神经损伤模型具有明显的中枢神经保护功效。
103.实施例21本实施例对核桃肽辅助改善记忆力机制进行研究。
104.1. 样品配制信息核桃肽t1，用标准稀释水配制成2.00 mg/ml母液，现配现用。
105.2. 实验动物斑马鱼均饲养于28℃的养鱼用水中（水质：每1 l反渗透水中加入200 mg速溶海盐，电导率为450 ~ 550
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s/cm；ph为6.5~8.5；硬度为50~100 mg/l caco3），实验动物使用许可证号为：syxk（浙）2012-0171。饲养管理符合国际aaalac认证（认证编号：001458）的要求。
106.野生型ab品系斑马鱼，以自然成对交配繁殖方式进行。年龄为受精后5天（5 dpf）的斑马鱼用于样品辅助改善记忆力机制研究（蛋白组学）。
107.3. 检测方法3.1. 样品制备随机选取5 dpf野生型ab品系斑马鱼于烧杯中，每个烧杯（实验组）均处理30尾斑马鱼。水溶给予核桃肽t1，同时设置正常对照组和模型对照组，每个烧杯容量为20 ml。除正常对照组外，其余各实验组均水溶给予双酚af建立斑马鱼记忆损伤模型。28 ℃处理1天后，收集各实验组斑马鱼样本，均用超纯水洗净后，立即转入1.5 ml ep管（100尾/管）中，每个实验组4个重复；吸尽液体后，采用液氮快速冷冻，-80 ℃保存用于后续蛋白组学检测。
108.3.2. 液相参数描述将抽干的肽段样品用流动相a（2% acn，0.1% fa）复溶，20000 g离心10 min后，取上清进样。通过thermo公司ultimate 3000 uhplc进行分离。样品首先进入trap柱富集并除盐，随后与自装c18柱（150μm内径，1.8μm柱料粒径，约35cm柱长）串联，以500nl/min流速通过如下有效梯度进行分离：0~5 min，5%流动相b（98% acn，0.1% fa）；5~120 min，流动相b从5%线性升至25%；120~160 min，流动相b从25%升至35%；160~170 min，流动相b从35%升至80%；170~175 min，80%流动相b；175~180 min，5%流动相b。纳升液相分离末端直接连接质谱仪。
109.3.3. 质谱检测参数描述经过液相分离的肽段通过nanoesi源离子化后进入到串联质谱仪q-exactive hf x（thermo fisher scientific，san jose，ca）进行dda（data dependent acquisition）模式检测。主要参数设置：离子源电压设置为1.9 kv；一级质谱扫描范围350~1500 m/z；分辨率设置为120000，最大离子注入时间（mit）为100 ms；二级质谱碎裂模式为hcd，碎裂能量设置为nce 28；分辨率30000，最大离子注入时间（mit）为100 ms，动态排除时间设定为30 s。二级质谱起始m/z固定为100；二级碎裂的母离子筛选条件为：电荷2 到6 ，峰强度超过5e4的强度排在前20的母离子。agc设置为：一级3e64的强度排在前20的母离子。agc设置为：一级3e6，二级1e5。
110.3.4. 原始质谱数据在生物信息分析中，质谱原始文件需要转换成mgf格式后才能被使用，mgf文件主要包含了二级质谱（ms/ms）谱图的信息，其中“begin ions”和“end ions”是每一张谱的开
始和结束位置。
111.mgf文件格式如下：title：谱图名称pepmass：母离子质量charge：母离子所带电荷rtinseconds：保留时间scans：谱图扫描号3.5. 分析方法本试验采用下一代非标记定量蛋白质组学技术完成分析。在数据非依赖型采集（data independent acquisition，dia）模式下，它能够提供无与伦比的蛋白质组覆盖，同时实现每个样品大量蛋白质的精确、高度可重复的定量。dia流程提供一个理想的差异表达蛋白质组定性分析或海量样品的蛋白质组定量平台。
112.蛋白质数据库的选择：本发明使用到的数据库包括：（1）uniprot蛋白数据库，uniprot是信息最丰富、资源最广的蛋白质数据库；（2）基于基因组注释的蛋白数据库，主要包括ncbi和ensembl两大基因注释系统衍生出的一系列数据库；（3）其它来源数据库，通常指客户提供的目标蛋白数据库，或者指基因组转组学测序产生并denovo组装完成的新基因序列。
113.蛋白质dda定量：maxquant是德国马普实验室（max planck institutes）开发的一款免费的适用于高精度质谱数据的蛋白质鉴定、定量软件。本实验使用该软件完成dda数据的鉴定，作为后续dia分析的谱图库。操作时以原始下机数据为输入文件，配置好相应参数及数据库，然后进行鉴定和定量分析。其中满足fdr ≤ 1%的鉴定信息将用于建立最终的谱图库。下机的dia数据利用irt肽段对保留时间（retention time）完成校正。然后基于swath-ms适用的target-decoy模型，以fdr 1%完成假阳性控制，从而获得显著性的定量结果。
114.4. 检测结果4.1 蛋白质鉴定结果详见表6。
115.表6 蛋白鉴定结果样本名多肽特殊多肽蛋白n斑马鱼65824541477360在该蛋白质dia定量项目中，共有12组danio rerio样品，分别为：c-1、c-2、c-3、c-4、m-1、m-2、m-3、m-4、w-1、w-2、w-3、w-4，共进行了1次重复实验，共有101722张二级谱图生成下机。在“1�r”过滤标准下，一共有54147条肽段和7360个蛋白被鉴定到。
116.4.2 蛋白质dda定量及蛋白定量重复性分析结果见图3（图中x轴为样品组别，y轴为相应cv值）。单次实验的显著差异蛋白以差异倍数（fold change）》 1.2和显著性（q-value）《 0.05两个条件筛选。对有生物重复的比较而言，在生物重复不配对情况下，最终差异蛋白需以fold change 》 1.2（所有比较组比值的平均值）和q-value《 0.05（所有比较组的t-test）两个条件筛选。利用cv值来评估定量的重复性。cv=标准差sd/平均mean。cv值越低，重复性越好。由图3可知，核桃肽t1组cv值略高于对照组和模型组的cv值，但三者相差不大，重复性相当。
117.4.3. 差异蛋白数量统计图见图4，火山图见图5（图中右侧划分区域为显著上调蛋
infection；gap junction。
126.由图7~13分析可知，49个差异蛋白中共有四个蛋白表现出双酚af诱导后，模型组、对照组蛋白表达受到影响，经核桃肽t1处理后能明显改善模型对照组的蛋白表达。四个蛋白分别为半乳糖凝集素（galectin），小窝蛋白（caveolin），缺氧诱导基因1（hypoxia inducible gene 1，hig1）蛋白家族同源基因higd2a和小型染色体维持复合物结合蛋白（mcmbp）。
127.对半乳糖凝集素（galectin），小窝蛋白（caveolin），缺氧诱导基因1（hypoxia inducible gene 1，hig1）蛋白家族同源基因higd2a和小型染色体维持复合物结合蛋白（mcmbp）表达量进行检测，结果详见表7。
128.表7 各实验组蛋白表达差异
样本ratio(模型组/对照组)ratio(核桃肽组/对照组)qvalue(模型组/对照组)qvalue(核桃肽组/对照组)lgalslb0.7405771.354488820.02601160.02486756cav10.68861571.373015860.016591670.03414725higd2a0.19412153.39095160.0077128710.03014083mcmbp0.75774991.426022690.04906840.01401415
备注：ratio为fc（fold change）差异倍数；q-value是统计检验的p-value经过校正后得到的数值。
129.根据表7结果显示：双酚af处理斑马鱼后，半乳糖凝集素蛋白表达减少，核桃肽t1处理后半乳糖凝集素蛋白表达增加，且前期基因结果显示，核桃肽t1能明显上调斑马鱼bdnf基因的表达，说明核桃肽t1可通过增加半乳糖凝集素蛋白表达促进bdnf的产生以及外周神经元及轴突的再生来发挥神经保护功效；双酚af处理斑马鱼后，cav1表达减少，核桃肽t1处理后cav1表达增加，说明核桃肽t1可通过增加cav1表达促进功能性神经元生长，从而改善学习和记忆功能；双酚af处理斑马鱼后，higd2a表达明显减少，核桃肽t1处理后higd2a表达增加，说明核桃肽t1可通过增加higd2a表达促进细胞在缺氧下的存活、提高抗氧化能力等发挥大脑保护功效；双酚af处理斑马鱼后，mcmbp表达明显减少，核桃肽t1处理后mcmbp表达增加，说明核桃肽t1可通过增加mcmbp表达抑制细胞凋亡发挥大脑保护功效。
130.以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。