一种耦合黄酮苷酶转化提取淫羊藿苷的工艺的制作方法

1.本发明涉及中药提取技术领域，尤其涉及一种耦合黄酮苷酶转化提取淫羊藿苷的工艺。


背景技术：

2.淫羊藿(herba epimedii)，别名仙灵脾，为小檗科淫羊藿属多种植物的地上部分，在《神农本草经》中列为中品。淫羊藿是我国传统补益类中药，用于阳痿遗精、筋骨疲软、风湿痹痛、麻木拘挛等症。近年来的研究表明淫羊藿对机体的药理作用是相当广泛的，具有增加心脑血管血流量，促进造血功能、免疫功能及骨代谢，抗衰老，抗肿瘤等功效。
3.淫羊藿黄酮苷是淫羊藿的主要有效成分，现已发现70余种淫羊藿黄酮，淫羊藿中80-90％以上的黄酮为淫羊藿苷(icariin)、朝藿定a(epimedina)、朝藿定b(epimedinb)、朝藿定c(epimedin c)；其中，50％以上为淫羊藿苷，其他40％左右的黄酮为朝藿定a、b和c。
4.淫羊藿苷、朝藿定a、朝藿定b和朝藿定c的结构如下所示。
[0005][0006][0007]
国内淫羊藿提取物的质量以淫羊藿苷含量来表示。淫羊藿苷具有防抑郁、抗肿瘤、抗氧化和增强机体免疫力等功能，也具有抗皮肤老化、抗皱纹、美白等功能。但是淫羊藿提取物中除了淫羊藿苷之外，还含有朝藿定a、b和c等黄酮，这降低了淫羊藿提取物的品质和药效，并且也造成了浪费。
[0008]
可以通过酶转化将其他的淫羊藿黄酮转化成淫羊藿苷，但是转化率较低；且在酶转化过程中，还存在淫羊藿苷被转化成其他物质的问题；另外后期柱洗脱的分离提纯工艺操作复杂。


技术实现要素：

[0009]
基于背景技术存在的技术问题，本发明提出了一种耦合黄酮苷酶转化提取淫羊藿苷的工艺，本发明可以提高淫羊藿苷的含量，且操作简单，适合工业化生产。
[0010]
本发明提出了一种耦合黄酮苷酶转化提取淫羊藿苷的工艺，包括如下步骤：
[0011]
s1、将淫羊藿提取物、水和果胶酶混匀，进行一次酶解，然后加热灭活，调节ph，加入α-l-鼠李糖酶混匀，进行二次酶解得到酶解液；
[0012]
s2、将酶解液加入双水相体系中混匀，然后静置分层，取上层液，然后将上层液离心，静置，取上清液浓缩，干燥得到转化物。
[0013]
优选地，在s1中，一次酶解的温度为40-45℃，一次酶解的时间为3-4h。
[0014]
优选地，在s1中，二次酶解的温度为53-57℃，二次酶解的时间为30-60min。
[0015]
优选地，在s1中，调节ph＝6.0-6.2。
[0016]
发明人发现果胶酶在适宜条件下对淫羊藿提取物酶解适当时间，可以提高淫羊藿苷和朝藿定c的含量，酶解时间过长会降低淫羊藿苷的含量，因此选用果胶酶先对淫羊藿提取物进行酶解，提高淫羊藿苷和朝藿定c的含量，再进行酶灭活；
[0017]
然后选择α-l-鼠李糖酶继续酶解，α-l-鼠李糖酶可以选择性的酶解去除朝藿定c上的鼠李糖基，通过选用合适的酶解条件和时间，使得朝藿定c酶解转化成淫羊藿苷，避免酶解时间过长，使得淫羊藿苷和朝藿定c中的鼠李糖基被过度酶解，降低淫羊藿苷的含量。
[0018]
本发明采用双水相体系对酶解液进行提纯，操作简单，用时短；耗时远小于柱洗脱工艺。
[0019]
优选地，在s1中，淫羊藿提取物、果胶酶的比值为1g:400-800u。
[0020]
优选地，在s1中，淫羊藿提取物、α-l-鼠李糖酶的比值为1g:300-500u。
[0021]
优选地，在s1中，淫羊藿提取物和水的重量比为1:40-60。
[0022]
优选地，在s1中，用硫酸铵调节ph。
[0023]
优选地，在s2中，双水相体系由乙醇和硫酸铵水溶液组成。
[0024]
优选地，乙醇的质量分数为40-45wt％。
[0025]
优选地，硫酸铵水溶液中，硫酸铵的浓度为0.22-0.25g/ml。
[0026]
优选地，在s2中，酶解液和双水相体系的重量比为0.7-1:10。
[0027]
优选地，在s2中，静置分层30-60min。
[0028]
有益效果：
[0029]
本发明选用果胶酶在适宜温度下酶解适宜时间提高淫羊藿提取物中的淫羊藿苷和朝藿定c的含量，然后酶灭活，避免果胶酶对淫羊藿苷酶解，降低淫羊藿苷的含量；再使用α-l-鼠李糖酶，在适应条件下酶解适宜时间，使得朝藿定c转变为淫羊藿苷，从而大幅提高淫羊藿苷的含量；然后使用双水相体系对酶解液进行提纯，操作简单，耗时短，适合工业化生产；且双水相体系的原料廉价易得，成本低。
具体实施方式
[0030]
下面，通过具体实施例对本发明的技术方案进行详细说明。
[0031]
实施例1
[0032]
一种耦合黄酮苷酶转化提取淫羊藿苷的工艺，包括如下步骤：
[0033]
s1、将10g淫羊藿提取物与400ml水混匀溶解，然后加入4000u果胶酶(果胶酶的酶活力为10万u/g)搅拌30min混匀，调节温度为45℃，保温一次酶解3h，然后加热将果胶酶灭活，冷却至室温，用硫酸铵调节ph＝6.2，加入3000u的α-l-鼠李糖酶(α-l-鼠李糖酶的酶活力为10万u/g)搅拌30min混匀，调节温度为57℃，保温二次酶解30min得到酶解液；
[0034]
s2、将酶解液加入双水相体系中混匀，然后静置分层60min，取上层液，然后以3000r/min的速度将上层液离心，静置，取上清液减压浓缩，真空干燥得到转化物，其中，双水相体系由乙醇和硫酸铵水溶液组成，乙醇的质量分数为40wt％，硫酸铵水溶液中，硫酸铵的浓度为0.25g/ml；酶解液和双水相体系的重量比为0.7:10。
[0035]
实施例2
[0036]
一种耦合黄酮苷酶转化提取淫羊藿苷的工艺，包括如下步骤：
[0037]
s1、将10g淫羊藿提取物与600ml水混匀溶解，然后加入8000u果胶酶(果胶酶的酶活力为10万u/g)搅拌30min混匀，调节温度为40℃，保温一次酶解4h，然后加热将果胶酶灭活，冷却至室温，用硫酸铵调节ph＝6.0，加入5000u的α-l-鼠李糖酶(α-l-鼠李糖酶的酶活力为10万u/g)搅拌30min混匀，调节温度为53℃，保温二次酶解60min得到酶解液；
[0038]
s2、将酶解液加入双水相体系中混匀，然后静置分层30min，取上层液，然后以3000r/min的速度将上层液离心，静置，取上清液减压浓缩，真空干燥得到转化物，其中，双水相体系由乙醇和硫酸铵水溶液组成，乙醇的质量分数为45wt％，硫酸铵水溶液中，硫酸铵的浓度为0.22g/ml；酶解液和双水相体系的重量比为0.9:10。
[0039]
实施例3
[0040]
一种耦合黄酮苷酶转化提取淫羊藿苷的工艺，包括如下步骤：
[0041]
s1、将10g淫羊藿提取物与500ml水混匀溶解，然后加入6000u果胶酶(果胶酶的酶活力为10万u/g)搅拌30min混匀，调节温度为43℃，保温一次酶解3.5h，然后加热将果胶酶灭活，冷却至室温，用硫酸铵调节ph＝6.1，加入4000u的α-l-鼠李糖酶(α-l-鼠李糖酶的酶活力为10万u/g)搅拌30min混匀，调节温度为55℃，保温二次酶解45min得到酶解液；
[0042]
s2、将酶解液加入双水相体系中混匀，然后静置分层50min，取上层液，然后以3000r/min的速度将上层液离心，静置，取上清液减压浓缩，真空干燥得到转化物，其中，双水相体系由乙醇和硫酸铵水溶液组成，乙醇的质量分数为42wt％，硫酸铵水溶液中，硫酸铵的浓度为0.24g/ml；酶解液和双水相体系的重量比为1:10。
[0043]
对比例1
[0044]
一种耦合黄酮苷酶转化提取淫羊藿苷的工艺，包括如下步骤：
[0045]
s1、将10g淫羊藿提取物与500ml水混匀溶解，然后加入6000u果胶酶(果胶酶的酶活力为10万u/g)搅拌30min混匀，调节温度为43℃，保温酶解3.5h，然后加热将果胶酶灭活，冷却至室温，得到酶解液；
[0046]
s2、同实施例3的s2。
[0047]
对比例2
[0048]
一种耦合黄酮苷酶转化提取淫羊藿苷的工艺，包括如下步骤：
[0049]
s1、将10g淫羊藿提取物与500ml水混匀溶解，然后加入4000u的α-l-鼠李糖酶(α-l-鼠李糖酶的酶活力为10万u/g)搅拌30min混匀，用硫酸铵调节ph＝6.1，调节温度为55℃，保温酶解45min得到酶解液；
[0050]
s2、同实施例3的s2。
[0051]
对比例3
[0052]
一次酶解8h，其他同实施例3。
[0053]
对比例4
[0054]
二次酶解2h，其他同实施例3。
[0055]
上述实施例1-3、对比例1-4中淫羊藿提取物为同一批次制得的，其成分相同。
[0056]
采用高效液相色谱法检测淫羊藿提取物、转化物中淫羊藿苷的含量。
[0057]
高效液相色谱条件为：使用agilent1200高效液相色谱分析仪，色谱柱为kromasil c18柱(5μm，250mm
×
4.6mm)，进样量为10μl，柱温为35℃，流速为1.0ml/min，检测波长为273nm，流动相a为乙腈，流动相b为纯化水，进行梯度洗脱，具体洗脱程序如表1所示。
[0058]
表1洗脱程序
[0059][0060][0061]
检测结果如表2所示。
[0062]
表2检测结果
[0063]
分组淫羊藿苷含量％淫羊藿提取物58实施例172实施例271实施例373对比例160对比例267对比例332对比例440
[0064]
由表2可以看出选用合适的酶和酶解条件，可以提高淫羊藿苷的含量。
[0065]
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。