异多聚体蛋白质及其使用方法1.相关申请的交叉引用2.本技术要求2019年3月28日提交的美国临时申请第62/825,726号的优先权，该申请的内容出于所有目的据此通过引用以其整体并入本文。3.在ascii文本文件上提交序列表4.在ascii文本文件上提交的以下内容通过引用以其整体并入本文：序列表的计算机可读形式(crf)(文件名：792702000240seqlist.txt，记录日期：2020年3月24日，大小：32kb)。
技术领域：
：5.本技术涉及异多聚体蛋白质，诸如双特异性抗体、组合物、制备方法和使用方法。
背景技术：
：：6.通过在杂交瘤中共表达两种不同的igg分子来产生双特异性抗体的经典方法导致多达10种可能的重链与轻链的组合。这降低了收率，并带来了纯化的挑战。为了克服这些挑战，已经开发了多种促进异二聚体形成的双特异性抗体形式。许多已知的形式采用单链可变区(scfv)模块或类似的结构，所述模块或结构依赖于经工程化的接头来迫使抗原结合组分组装成所需的构型。然而，与天然抗体相比，许多这些双特异性抗体形式忍受不利的性质，包括易于聚集、生产困难、血清半衰期短和潜在的免疫原性。7.已经开发了几种天然抗体形式(即，由两条轻链和两条重链组成的抗体)的双特异性抗体设计。例如，重链fc‑fc界面可以用相互作用的氨基酸对(诸如旋钮进入孔(knobs‑into‑holes)(kih)残基、形成二硫键的半胱氨酸或具有相反静电荷的残基)来工程化，以便当它们共表达时，积极促进来自不同重链的异二聚体形成。然而，经典的kih策略仍然导致显著的同二聚体形成和双特异性抗体的低产量。8.本文提及的所有出版物、专利、专利申请和公开的专利申请的公开内容据此通过引用以其整体并入本文。技术实现要素：9.本技术提供了异多聚体蛋白质，诸如含fc的异二聚体蛋白质、多特异性抗体和多特异性免疫粘附素、其制备方法和使用方法。10.本技术的一个方面提供了异多聚体(例如，异二聚体)蛋白质，其包含含有第一重链恒定结构域3(ch3)结构域的第一多肽和含有第二ch3结构域的第二多肽，其中第一ch3结构域包含相对于野生型ch3结构域在氨基酸位置354处利用大疏水氨基酸进行的取代，并且/或者第二ch3结构域包含相对于野生型ch3结构域在氨基酸位置347处利用带负电荷的氨基酸进行的取代，并且其中氨基酸残基编号基于eu编号。在一些实施方案中，氨基酸位置354处的大疏水氨基酸与第二ch3结构域中的氨基酸残基形成疏水相互作用。在一些实施方案中，第二ch3结构域在氨基酸位置349(例如，y349)处包含大疏水残基。在一些实施方案中，氨基酸位置347处的带负电荷的氨基酸与第一ch3结构域中的氨基酸残基形成离子键。在一些实施方案中，第一ch3结构域在氨基酸位置360(例如，k360)处包含带正电荷的残基。在一些实施方案中，第一ch3结构域和第二ch3结构域是人ch3结构域。在一些实施方案中，第一ch3结构域包含选自由以下组成的组的取代：s354y、s354f和s354w。在一些实施方案中，第一ch3结构域包含s354y。在一些实施方案中，第二ch3结构域不包含对第一ch3结构域中s354的取代的补偿性取代(例如，y349处的取代)。在一些实施方案中，第二ch3结构域包含选自由以下组成的组的取代：q347e和q347d。在一些实施方案中，第二ch3结构域包含q347e。11.在根据上述任一种异多聚体蛋白质的一些实施方案中，第一ch3结构域和第二ch3结构域还包含钮入孔(kih)残基。在一些实施方案中，钮入孔残基是t366y和y407t。在一些实施方案中，第一ch3结构域包含t366y和s354y，并且第二ch3结构域包含y407t和q347e。在一些实施方案中，第一ch3结构域包含y407t和s354y，第二ch3结构域包含t366y和q347e。并且12.在根据上述任一种异多聚体蛋白质的一些实施方案中，第一多肽和/或第二多肽包含重链恒定结构域2(ch2)。在一些实施方案中，异多聚体蛋白质包含iggfc区。在一些实施方案中，iggfc区是igg1、igg2、igg3或igg4fc区。在一些实施方案中，第一多肽是抗体重链，并且/或者第二多肽是抗体重链。在一些实施方案中，异多聚体蛋白质包含一个或多个抗体轻链。13.在根据上述任一种异多聚体蛋白质的一些实施方案中，异多聚体蛋白质是多特异性(例如，双特异性)抗体。14.在根据上述任一种异多聚体蛋白质的一些实施方案中，异多聚体蛋白质包含：(a)第一重链，其从n末端至c末端包含：第一重链可变结构域(vh1)、第一重链恒定结构域1(ch1)、第一重链恒定结构域2(ch2)和第一ch3结构域；(b)第一轻链，其从n末端至c末端包含：第一轻链可变结构域(vl1)和第一轻链恒定结构域(cl)；(c)第二重链，其从n末端至c末端包含：第二重链可变结构域(vh2)、第二ch1、第二ch2和第二ch3结构域；和(d)第二轻链，其从n末端至c末端包含：第二轻链可变结构域(vl2)和第二cl；其中vh1与vl1缔合形成特异性结合第一靶标的第一抗原结合位点，vh2与vl2结合形成特异性结合第二靶标的第二抗原结合位点。在一些实施方案中，vl1和vl2具有相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，vl1和vl2具有不同的氨基酸序列。在一些实施方案中，第一靶标和第二靶标是相同的表位。在一些实施方案中，第一靶标和第二靶标是相同抗原的不同表位。在一些实施方案中，第一靶标和第二靶标是不同的抗原。在一些实施方案中，第一抗原结合位点特异性结合肿瘤抗原，并且第二抗原结合位点特异性结合cd3，或者第一抗原结合位点特异性结合cd3，并且第二抗原结合位点特异性结合肿瘤抗原。在一些实施方案中，第一抗原结合位点特异性结合cd20，并且第二抗原结合位点特异性结合cd3，或者第一抗原结合位点特异性结合cd3，并且第二抗原结合位点特异性结合cd20。在一些实施方案中，第一抗原结合位点特异性结合her2，并且第二抗原结合位点特异性结合cd3，或者第一抗原结合位点特异性结合cd3，并且第二抗原结合位点特异性结合her2。在一些实施方案中，异多聚体蛋白质包含：(a)第一重链，其从n末端至c末端包含：第三重链可变结构域(vh3)、第三ch1、vh1、第一ch1、第一ch2和第一ch3结构域；(b)第一轻链，其从n末端至c末端包含：第三轻链可变结构域(vl2)、第三cl、vl1和第一cl；其中vh3与vl3缔合形成特异性结合第三靶标的第三抗原结合位点。在一些实施方案中，第一抗原结合位点和第三抗原结合位点特异性结合相同的抗原。在一些实施方案中，第一抗原结合位点和第三抗原结合位点特异性结合her2，并且第二抗原结合位点特异性结合cd3。15.在根据上述任一种异多聚体蛋白质的一些实施方案中，异多聚体蛋白质包含：(a)第一重链，其从n末端至c末端包含：第一vhh、第一重链恒定结构域2(ch2)和第一ch3区；(b)第二重链，其从n末端至c末端包含：第一重链可变结构域(vh1)、第二ch1、第二ch2和第二ch3结构域；和(d)轻链，其从n末端至c末端包含：第一轻链可变结构域(vl1)和第一cl；其中vh1与vl1缔合形成特异性结合第一靶标的第一抗原结合位点，和特异性结合第二靶标的第一vhh。在一些实施方案中，第一抗原结合位点特异性结合cd3，并且第一vhh特异性结合肿瘤抗原，或者第一抗原结合位点特异性结合肿瘤抗原，并且第一vhh特异性结合cd3。在一些实施方案中，第一vhh特异性结合bcma。在一些实施方案中，第一重链从n末端至c末端包含：第二vhh、第一vhh、第一ch2和第一ch3结构域，其中第二vhh特异性结合第三靶标。在一些实施方案中，第一vhh和第二vhh特异性结合相同的抗原。在一些实施方案中，第一vhh和第二vhh特异性结合bcma。16.在根据上述任何一种异多聚体蛋白质的一些实施方案中，异多聚体蛋白质是免疫粘附素或抗体‑免疫粘附素嵌合体。17.本技术的另一个方面提供了包含抗体ch3结构域的多肽，其中ch3结构域包含相对于野生型ch3结构域在氨基酸位置354处利用大疏水氨基酸进行的取代和/或相对于野生型ch3结构域在氨基酸位置347处利用带负电荷的氨基酸进行的取代，并且其中与包含野生型ch3结构域的多肽相比，该多肽形成同二聚体的能力降低。在一些实施方案中，ch3结构域是人ch3结构域。在一些实施方案中，ch3结构域包含选自由以下组成的组的取代：s354y、s354f和s354w。在一些实施方案中，ch3结构域包含s354y。在一些实施方案中，ch3结构域包含选自由以下组成的组的取代：q347e和q347d。在一些实施方案中，ch3结构域包含q347e。在一些实施方案中，ch3结构域还包含旋钮进入孔残基，诸如t366y或s407t。在一些实施方案中，多肽还包含重链恒定结构域2(ch2)。在一些实施方案中，多肽包含抗体重链。18.在一些实施方案中，提供了包含seqidno:1‑4中任一个的ch3结构域的多肽。在一些实施方案中，提供了包含seqidno:1‑4中任一个的氨基酸序列的多肽。19.在一些实施方案中，提供了包含根据上述任何一种多肽的多肽的抗体(例如，双特异性抗体)。20.本技术的另一方面提供了产生特异性结合第一靶标和第二靶标的异多聚体蛋白质的方法，所述方法包括：(a)提供包含特异性结合第一靶标的第一结合结构域和第一ch3结构域的第一多肽；以及(b)提供包含特异性结合第二靶的第二结合结构域和第二ch3结构域的第二多肽；其中：(i)第一ch3结构域包含相对于野生型ch3结构域在氨基酸位置354处利用大疏水氨基酸进行的取代，并且/或者第二ch3结构域包含相对于野生型ch3结构域在氨基酸位置347处利用带负电荷的氨基酸进行的取代；或者(ii)第一ch3结构域包含相对于野生型ch3结构域在氨基酸位置347处利用带负电荷的氨基酸进行的取代，并且/或者第二ch3结构域包含相对于野生型ch3结构域在氨基酸位置354处利用大疏水氨基酸进行的取代；并且其中氨基酸残基编号基于eu编号。在一些实施方案中，一个ch3结构域中氨基酸位置354处的大疏水氨基酸与另一个ch3结构域中的氨基酸残基形成疏水相互作用。在一些实施方案中，另一个ch3结构域在氨基酸位置349(例如，y349)处包含大疏水残基。在一些实施方案中，一个ch3结构域中氨基酸位置347处的带负电荷的氨基酸与另一个ch3结构域中的氨基酸残基形成离子键。在一些实施方案中，另一个ch3结构域在氨基酸位置360(例如，k360)处包含带正电荷的残基。在一些实施方案中，第一ch3结构域和第二ch3结构域是人ch3结构域。在一些实施方案中，第一或第二ch3结构域包含选自由以下组成的组的取代：s354y、s354f和s354w。在一些实施方案中，第一或第二ch3结构域包含s354y。在一些实施方案中，第一或第二ch3结构域包含选自由以下组成的组的取代：q347e和q347d。在一些实施方案中，第一或第二ch3结构域包含q347e。在一些实施方案中，第一ch3结构域和第二ch3结构域还包含kih残基，诸如t366y和y407t。在一些实施方案中，第一ch3结构域包含t366y和s354y，并且第二ch3结构域包含y407t和q347e。在一些实施方案中，第一ch3结构域包含y407t和s354y，第二ch3结构域包含t366y和q347e。并且21.在一些实施方案中，提供了使用上述任何一种方法制备的异多聚体蛋白质。22.本技术的一个方面提供了一种或多种核酸，所述核酸编码根据上述任何一种异多聚体蛋白质的异多聚体蛋白质或根据上述任一种多肽的多肽。在一些实施方案中，提供了包含根据上述任一种核酸的一种或多种核酸的载体。在一些实施方案中，提供了包含根据上述任一种核酸的一种或多种核酸或根据上述任一种载体的载体的宿主细胞。23.本技术的一个方面提供了用于制备多特异性(例如，双特异性)抗体或异多聚体(例如，异二聚体)蛋白质的方法，所述方法包括：(a)在允许表达一种或多种核酸或载体的条件下，培养根据上述任一种宿主细胞的宿主细胞；以及(b)从宿主细胞培养物中回收多特异性抗体或异多聚体蛋白质。24.本技术的另一方面提供了药物组合物，其包含根据上述任一种异多聚体蛋白质的异多聚体蛋白质或根据上述任一种抗体的抗体，以及药学上可接受的赋形剂。在一些实施方案中，提供了用于治疗有需要的受试者的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的根据上述任一种药物组合物的药物组合物。25.还提供了包含上述任一种异多聚体蛋白质(例如，双特异性抗体)或用于上述任一种方法的试剂盒和制品。26.附图简述27.图1显示了两种双特异性抗体构建体的示意性结构。在一些实施方案中，双特异性抗体构建体的第一重链具有工程化残基，诸如q347e，其与第二重链中的天然残基(例如，k360)形成离子键；并且第二重链具有工程化残基，诸如s354y，其与第一重链中的天然残基(例如，y349)形成疏水相互作用。左边(s1)的构建体具有共同的轻链，右边(s2)的构造有两个不同的轻链。本文所述的工程化离子键和疏水相互作用可以与常规旋钮进入孔(kih)突变相组合，以促进异二聚体的形成。28.图2a显示了抗体中两条重链的ch3‑ch3界面的晶体结构的局部视图。第一重链中的s354(即，图中根据kabat编号的s375)不与第二重链中的残基形成任何接触。29.图2b显示了在第一重链中具有s354y突变(即，图中根据kabat编号的y375)的异二聚体fc的ch3‑ch3界面的模拟晶体结构的局部视图。s354y与第二重链中的y349(即，图中根据kabat编号的y370)形成疏水相互作用。30.图2c显示了第一重链中具有q347e突变(即，图中根据kabat编号的e368)的异二聚体fc的ch3‑ch3界面的模拟晶体结构的局部视图。q347e与第二重链中的k360(即，图中根据kabat编号的k383)形成离子键。q347可以与或者可以不与k360形成非常弱的氢键。31.图3显示了用于cd20/cd3双特异性抗体的生产和质量控制的示意性工作流程。32.图4显示了在monoq纯化后，monoq柱上的cd20/cd3抗体的色谱图。v2是具有kih(即，t366y和y407t)残基的共同轻链双特异性抗体。v4b是共同轻链双特异性抗体，其kih残基与v2相同，q347e和s354y突变分别在两条重链中。33.图5a显示了在蛋白a纯化后，monoq柱上的cd20/cd3v4b双特异性抗体的色谱图。图5b显示了monoq纯化级分的sds凝胶和蛋白质浓度。图5c显示了monoq纯化级分的t细胞活化测定的结果。图5d显示了纯化的cd20/cd3v4b双特异性抗体在还原条件下的毛细管电泳十二烷基硫酸钠(ce‑sds)的结果。图5e显示了纯化的cd20/cd3v4b双特异性抗体在非还原条件下的ce‑sds的结果。图5f显示了纯化的cd20/cd3v4b双特异性抗体的差示扫描荧光测定法(dsf)和静态光散射法(sls)的结果。34.图6显示了蛋白a纯化后monoq柱上的四批cd20/cd3v4b双特异性抗体的色谱图。35.图7显示了来自不同物种的igg恒定区序列的序列比对:人igg1(seqidno:5)、人igg2(seqidno:6)、人igg3(seqidno:7)、人igg4(seqidno:8)、鼠igg1(seqidno:9)、鼠igg2a(seqidno:10)、鼠igg3(seqidno:11)、大鼠igg1(seqidno:12)、大鼠igg2a(seqidno:13)、大鼠igg(seqidno:14)、牛igg1(seqidno:15)、牛igg2(seqidno:16)、猫igg(seqidno:17)和犬igg(seqidno:18)。氨基酸残基347、349、354和360在多个物种的igg分子中高度保守。36.图8显示了包含一个抗her2fab、一个抗cd3fab和一个fc结构域的her2‑b3/cd3双特异性抗体的示意图。37.图9显示了通过阳离子交换色谱(cex)进行的her2‑b3/cd3双特异性抗体的纯化。保留时间以分钟为单位显示于x轴上，相对蛋白质丰度以毫吸光度单位(mau)显示于y轴上。标记单个峰级分(即，a1‑a15和b15‑b6)。38.图10显示了通过cex纯化的her2‑b3/cd3双特异性抗体的级分的十二烷基硫酸钠‑聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds‑page)，如图9所示的。泳道1‑8显示标记为a1‑a8的主峰的级分，泳道9和10显示标记为a14和b7的小峰的第2和第3级分，泳道11显示蛋白a纯化后的her2‑b3/cd3双特异性抗体。泳道m显示了蛋白质标记的阶梯，蛋白质标记的千道尔顿(kd)质量显示在右边。39.图11显示了her2‑b3‑v3/cd3双特异性抗体的示意图，所述her2‑b3‑v3/cd3双特异性抗体包含两个抗her2fab、一个抗cd3fab和一个fc结构域。40.图12显示了her2‑b3‑v3/cd3双特异性抗体的cex纯化。样品预先在蛋白a柱上纯化。保留时间以分钟为单位显示于x轴上，相对蛋白质丰度以毫吸光度单位(mau)显示于y轴上。标记单个峰级分。41.图13显示了cex纯化后的her2‑b3‑v3/cd3双特异性抗体级分的sds‑page。泳道1显示了上清液中表达的her2‑b3‑v3/cd3。泳道2‑6显示了纯化的级分a3‑a7(非还原的)(参见图12)。泳道7‑11显示了纯化的级分a3‑a7(还原的)(参见图12)。泳道m显示了蛋白质标记的阶梯，并且蛋白质标记的千道尔顿(kd)质量显示在左边。组装的her2/cd3双特异性抗体(“her2/cd3bsab”)的位置，以及单个组分(即，具有两个fab“her2(2fab)hc”的抗her2重链、抗cd3重链“cd3hc”和轻链“共同lc”)显示于右侧。42.图14显示了bcma‑fc/cd3双特异性抗体的示意图。左边是bcma‑3e5/cd3，其由一个bcma‑3e5vhh结构域、一个cd3fab和一个fc结构域组成。右边一个是bcma‑3e1b2/cd3，其包含两个bcmavhh结构域(3e1和3b2)、一个cd3fab和一个fc结构域。43.图15显示了蛋白a纯化的bcma‑3e1b2/cd3和bcma‑3e5/cd3的sds‑page。泳道1显示非还原的bcma‑3e1b2/cd3，泳道2显示非还原的bcma‑3e5/cd3，泳道3显示还原的bcma‑3e1b2/cd3，并且泳道4显示还原的bcma‑3e5/cd3。泳道m显示了蛋白质标记的阶梯，并且蛋白质标记的千道尔顿(kd)质量显示在左边。bcma‑fc/cd3双特异性抗体组分的位置显示在右侧。44.图16显示了在fc区中具有工程化离子键和疏水相互作用的多特异性抗体构建体的示意性结构。双特异性抗体形式显示在顶行，并且三特异性和四特异性抗体形式显示在底行。如上所述，椭圆形结构获自美洲驼vhh文库。具体实施方式45.本技术提供了异多聚体(例如，异二聚体)蛋白质，其包含具有新型工程化离子键和/或疏水相互作用的抗体重链恒定结构域3(ch3)结构域，所述抗体重链恒定结构域3可与旋钮进入孔(kih)残基组合，促进异二聚体的形成。还提供了制备和使用异多聚体蛋白质的方法。当两种不同的含ch3的多肽共表达时，本文所述的制备方法可用于增强异二聚体的形成和阻碍同二聚体的形成。本文所述的基于ch3的异多聚体蛋白质策略适用于所有含fc的异多聚体蛋白质，诸如双特异性抗体和双特异性免疫粘附素。46.因此，本技术的一个方面提供了一种异多聚体蛋白质，其包含含有第一ch3结构域的第一多肽和含有第二ch3结构域的第二多肽，其中第一ch3结构域包含相对于野生型ch3结构域在氨基酸位置354处利用大疏水氨基酸进行的取代(例如，s354y)的取代，并且/或者第二ch3结构域包含相对于野生型ch3结构域在氨基酸位置347处利用带负电荷的氨基酸进行的取代(例如，q347e)，并且其中氨基酸残基编号基于eu编号。47.还提供了组合物(诸如药物组合物)、制备方法、治疗方法、试剂盒和制品。48.i.定义49.如本文中所用，“异多聚体”或“异多聚体蛋白质”是包含至少第一多肽和第二多肽的分子，其中第二多肽在氨基酸序列上与第一多肽相异在于至少一个氨基酸残基。在一些实施方案中，异多聚体对至少两种不同的配体或结合位点具有结合特异性。异多聚体可包含由第一多肽和第二多肽形成的“异二聚体”，或者可形成其中存在除了第一多肽和第二多肽之外的多肽的更高阶的三级结构(higherordertertiarystructure)。50.如本文中所用，“结合结构域”包括多肽的任何区域，其负责特异性结合目标分子(例如，抗原、配体、受体、底物或抑制剂)。示例性结合结构域包括抗体可变结构域、受体结合结构域、配体结合结构域和酶促结构域。51.如本文中所用，术语“特异性结合”、“特异性识别”或“特异于”是指可测量和可再现的相互作用，诸如靶标与抗体之间的结合，其决定了在包括生物分子在内的异质分子群体存在的情况下靶标的存在。例如，特异性识别靶标(其可以是表位)的抗体是以比其与其它靶标的结合更大的亲和力、亲合力、更容易和/或更长的持续时间结合该靶的抗体。在一些实施方案中，特异性识别抗原的抗体与抗原的一个或多个抗原决定簇反应，其中结合亲和力至少是其与其它靶标的结合亲和力的约10倍。52.本文中的术语“抗体”以最广义使用，并且包括全长抗体及其抗原结合片段。术语“抗体”包括单克隆抗体(包括全长4链抗体或具有免疫球蛋白fc区的仅有全长重链的抗体)、具有多表位特异性的抗体组合物、多特异性抗体(例如，双特异性抗体、双抗体和单链分子)以及抗体片段(例如，fab、f(ab’)2和fv)。本文设想的抗体包括单结构域抗体，诸如仅有重链的抗体。53.全长四链抗体包含两条重链和两条轻链。轻链和重链的可变区负责抗原结合。两条链中的可变区通常包含三个称为互补决定区(cdr)(轻链(lc)cdr，包括lc‑cdr1、lc‑cdr2和lc‑cdr3，重链(hc)cdr，包括hc‑cdr1、hc‑cdr2和hc‑cdr3)的高度可变的环。本文公开的抗体和抗原结合片段的cdr边界可以由kabat、chothia或al‑lazikani惯例(al‑lazikani1997；chothia1985；chothia1987；chothia1989；kabat1987；kabat1991)定义或鉴定。重链或轻链的三个cdr被间插在称为框架区(fr)的侧翼区段之间，所述框架区比cdr更高度保守，并形成支持高变环的支架。重链和轻链的恒定区不参与抗原结合，但表现出各种效应子功能。抗体根据其重链恒定区的氨基酸序列分类。抗体的五个主要类别或同种型是iga、igd、ige、igg和igm，其特征分别在于存在α、δ、ε、γ和μ重链。几个主要抗体类别被分为亚类，诸如igg1(γ1重链)、igg2(γ2重链)、igg3(γ3重链)、igg4(γ4重链)、iga1(α1重链)或iga2(α2重链)。54.抗体的“可变区”或“可变结构域”是指抗体重链或轻链的氨基末端结构域。重链和轻链的可变结构域可分别称为“vh”和“vl”。这些结构域通常是抗体的变化最大的部分(相对于同类的其它抗体)，并且包含抗原结合位点。来自骆驼科动物物种的仅有重链的抗体具有单个重链可变区，其被称为“vhh”。因此，vhh是一种特殊类型的vh。55.术语“仅有重链的抗体”或“hcab”是指功能性抗体，其包含重链，但缺少通常在4链抗体中发现的轻链。已知骆驼科动物(诸如骆驼、美洲驼或羊驼)会产生hcab。56.术语“单结构域抗体”或“sdab”是指具有三个互补决定区(cdr)的单一抗原结合多肽。单独的sdab能够与抗原结合，而不与相应的含cdr的多肽配对。在一些情况下，单结构域抗体是从骆驼hcab工程化而来的，并且它们的重链可变结构域在本文中被称为“vhh”(重链抗体的重链的可变结构域)。骆驼sdab是最小的已知抗原结合抗体片段之一(参见，例如，hamers‑casterman等人,nature363:446‑8(1993)；greenberg等人，nature374:168‑73(1995)；hassanzadeh‑ghassabeh等人，nanomedicine(lond),8:1013‑26(2013))。基本vhh从n末端至c末端具有以下结构：fr1‑cdr1‑fr2‑cdr2‑fr3‑cdr3‑fr4，其中fr1至fr4分别指框架区1至4，并且其中cdr1至cdr3是指互补决定区1至3。57.如本文中所用，术语“抗原结合片段”是指抗体片段，其包括例如双抗体、fab、fab’、f(ab’)2、fv片段、二硫化物稳定的fv片段(dsfv)、(dsfv)2、双特异性dsfv(dsfv‑dsfv’)、二硫化物稳定的双抗体(ds双抗体)、单链fv(scfv)、scfv二聚体(二价双抗体)；单结构域抗体(诸如vhh)，和由包含一个或多个cdr的抗体部分形成的多特异性抗体，或结合抗原但不包含完整抗体结构的任何其它抗体片段。抗原结合片段能够与亲本抗体或亲本抗体片段(例如，亲本scfv)所结合的相同抗原结合。在一些实施方案中，抗原结合片段可包含被移植到来自一个或多个不同的人抗体的框架区的来自特定人抗体的一个或多个cdr。抗体的木瓜蛋白酶消化产生了两个相同的抗原结合片段(称为“fab”片段)和残留的“fc”片段(名称反映了容易结晶的能力)。fab片段由完整的l链和h链的可变结构域(vh)以及一条重链的第一个恒定结构域(ch1)组成。就抗原结合而言，每个fab片段都是单价的，即，其只有单个抗原结合位点。抗体的胃蛋白酶处理产生单个大的f(ab′)2片段，其大致对应于两个具有不同抗原结合活性的二硫化物连接的fab片段，并且仍然能够交联抗原。fab’片段与fab片段相异在于在ch1结构域的羧基末端有一些额外的残基，包括一个或多个来自抗体铰链区的半胱氨酸。fab′‑sh在本文中是fab′的名称，其中恒定结构域的一个或多个半胱氨酸残基具有游离硫醇基。f(ab’)2抗体片段最初是以成对的fab’片段产生的，所述成对的fab’片段在其之间具有铰链半胱氨酸。抗体片段的其它化学偶联也是已知的。58.术语“恒定结构域”是指免疫球蛋白分子的相对于所述免疫球蛋白的另一部分(可变结构域)(其包含抗原结合位点)具有更保守的氨基酸序列的部分。恒定结构域包含重链的ch1、ch2和ch3结构域(统称为ch)和轻链的chl(或cl)结构域。59.来自任何哺乳动物物种的抗体(免疫球蛋白)的“轻链”可以根据它们的恒定结构域的氨基酸序列被分配至两种明显不同的类型(称为卡帕(“κ”)和兰姆达(“λ”))之一。[0060]“fv”是最小的抗体片段，其包含完整的抗原识别和结合位点。该片段由紧密非共价缔合的一个重链可变区结构域和一个轻链可变区结构域的二聚体组成。从这两个结构域的折叠产生了六个高变环(h链和l链各有3个环)，它们为抗原结合提供了氨基酸残基，并赋予抗体抗原结合特异性。然而，即便是单一可变结构域(或是仅包含对抗原具有特异性的三个cdr的fv的一半)也具有识别并结合抗原的能力，尽管其亲合力低于完整的结合位点。[0061]“单链fv”，也缩写为“sfv”或“scfv”，是包含连接成单个多肽链的vh和vl抗体结构域的抗体片段。优选地，scfv多肽还包含在vh结构域与vl结构域之间的多肽接头，这使得scfv能够形成抗原结合所需的结构。关于scfv的综述，参见pluckthuninthepharmacologyofmonoclonalantibodies，第113卷，rosenburg和moore编辑，springer‑verlag,newyork，第269‑315页(1994)。[0062]术语“双抗体”是指通过构建在vh结构域与vl结构域之间具有短接头(约5‑10个残基)的sfv片段(见前段)制备的小抗体片段，所述短接头使得实现v结构域的链间配对而不是链内配对，从而产生二价片段，即，具有两个抗原结合位点的片段。双特异性双抗体是两个“交叉”sfv片段的异二聚体，其中两种抗体的vh结构域和vl结构域存在于不同的多肽链上。例如，在ep404,097、wo93/11161、hollinger等人，proc.natl.acad.sci.usa90:6444‑6448(1993)中更详细地描述了双抗体。[0063]术语“特异性”是指抗原结合蛋白对抗原的特定表位的选择性识别。例如，天然抗体是单特异性的。如本文中所用，术语“多特异性”表示抗原结合蛋白具有多表位特异性(即，具有两个、三个或更多个抗原结合位点能够特异性结合一个生物分子上的两个、三个或更多个不同表位，或者能够特异性结合两个、三个或更多个不同生物分子上的表位)。如本文中所用，“双特异性”表示抗原结合蛋白具有两种不同的抗原结合特异性。除非另有说明，否则由列出的双特异性抗体结合的抗原的顺序是任意的。[0064]术语“嵌合抗体”是指这样的抗体以及此类抗体的片段，在所述抗体中重链和/或轻链的一部分与源于特定物种或属于特定抗体类或亚类的抗体中的相应序列等同或同源，immunol.22:161‑206(1985)。[0073]“ch3结构域”(也称为“c2”或“h3”结构域)包含fc区中残基c末端至ch2结构域的延伸(即从抗体序列的大约氨基酸残基341至c末端(通常在igg的氨基酸残基446或447处))。[0074]术语“旋钮进入孔”或“kih”是指ch3结构域中的一对工程化氨基酸残基，所述工程化氨基酸残基导致第一ch3结构域的接触表面的空间修饰，所述第一ch3结构域通过互补的空间修饰优先附着至第二ch3结构域的相应接触表面。此类空间修饰主要源自不同的氨基酸残基和侧链，例如，以产生“旋钮”或“孔”结构，它们互补形成“旋钮进入孔”二聚体。参见，例如，参见，例如，ridgway,j.b.,l.g.presta等人(1996).“‘knobs‑into‑holes’engineeringofantibodych3domainsforheavychainheterodimerization.”proteineng9(7):617‑21；atwell,s.,j.b.ridgway等人(1997).“stableheterodimersfromremodelingthedomaininterfaceofahomodimerusingaphagedisplaylibrary.”jmolbiol270(1):26‑35；merchant,a.m.,z.zhu等人(1998).“anefficientroutetohumanbispecificigg.”natbiotechnol16(7):677‑81；carter,p.(2001).“bispecifichumaniggbydesign.”jimmunolmethods248(1‑2):7‑15；以及美国专利第5,731,168号和第7,183,076号，所述文献通过引用并入本文。[0075]“分离的”异多聚体是指已经从其天然细胞培养环境的组分中鉴定以及分离和/或回收的异多聚体。其天然环境中的污染组分是会干扰异多聚体的诊断或治疗用途的物质，可包括酶、激素和其它蛋白质性质或非蛋白质性质的溶质。本发明的异多聚体通常被纯化至基本上同质。短语“基本上同质的”、“基本上同质的形式”和“基本同质性”用于表示产物基本上不含源自不需要的多肽组合(例如，同源多聚体)的副产物。就纯度而言，基本同质性意味着副产物的量不超过约10％、5％、1％、0.5％或更少，其中百分比以重量计。[0076]如本文中所用，术语“分离的核酸”旨在指基因组、cdna或合成来源的核酸或其某种组合，由于其来源，“分离的核酸”(1)不与其中天然地存在“分离的核酸”的多核苷酸的全部或一部分相结合，(2)与天然不与其连接的多核苷酸可操作地连接，或者(3)不会天然地作为更大序列的一部分存在。[0077]除非另有说明，否则“编码氨基酸序列的核苷酸序列”包括为彼此的简并形式且编码同一氨基酸序列的所有核苷酸序列。短语编码蛋白质或rna的核苷酸序列也可包括内含子至编码蛋白质的核苷酸序列在一些形式中可以包含一个或多个内含子的程度。[0078]术语“可操作地连接的”是指调控序列与异源核酸序列之间的导致后者表达的功能性键联。例如，当第一核酸序列与第二核酸序列处于功能关系时，第一核酸序列与第二核酸序列可操作地连接。例如，如果启动子影响编码序列的转录或表达，则启动子与编码序列可操作地连接。一般来说，可操作地连接的dna序列是连续的，并且在必要时在同一阅读框中连接两个蛋白质编码区。[0079]如本文中所用，“治疗(treatment)”或“治疗(treating)”是获得有益或期望的结果(包括临床结果)的方法。出于本发明的目的，有益的或期望的临床结果包括但不限于以下的一项或多项：减轻由疾病引起的一种或多种症状、降低疾病的程度、稳定疾病(例如，防止或延迟疾病的恶化)、防止或延迟疾病的传播、防止或延迟疾病的复发、延迟或减缓疾病的进展、改善疾病状态、提供疾病的缓解(部分或完全)、减少治疗疾病所需的一种或多种其它药物的剂量、延缓疾病的进展、提高或改善生活质量、体重增加和/或延长生存期。本发明的方法设想了治疗的这些方面中的任一个或多个方面。[0080]本文公开的抗体或组合物的“有效量”是足以实现明确说明的目的的量。“有效量”可以通过经验和与所述目的相关的已知方法来确定。[0081]如本文中所用，“药学上可接受的”或“药理学上相容的”是指在生物学上或其它方面不是不希望的材料，例如，所述材料可被掺入到向患者施用的药物组合物中，而不会引起任何明显的不希望的生物效应或者以有害的方式与包含其的组合物的任何另外的组分相互作用。药学上可接受的载体或赋形剂优选满足毒理学和生产测试的所要求的标准并且/或者包含在美国食品和药物管理局编制的非活性成分指南中。[0082]应当理解，本文所述的本发明的实施方案包括“由实施方案组成”和/或“基本上由实施方案组成”。[0083]本文中提及的“约”某一值或参数包括(并描述)针对该值或参数本身的变化。例如，提及“约x”的描述包括对“x”的描述。[0084]如本文中所用，提及“非”某一值或参数通常是指并描述“除某一值或参数外”。[0085]如本文和所附权利要求中所用，除非上下文另有明确规定，否则单数形式“一个/种(a)”、“一个/种(an)”和“该(the)”包括复数指代物。[0086]ii.异多聚体蛋白质[0087]本技术提供了异多聚体蛋白质，诸如异二聚体蛋白质，其包含含有第一抗体重链恒定结构域3(ch3)结构域的第一多肽和含有第二ch3结构域的第二多肽，其中第一ch3结构域和第二ch3结构域包含工程化疏水相互作用和静电相互作用。在一些实施方案中，第一ch3结构域和第二ch3结构域还包含旋钮进入孔(“kih”)残基。异多聚体蛋白质的示例性结构包括异二聚体(例如，双特异性免疫粘附素)、异三聚体(例如，抗体‑免疫粘附素嵌合体)、异四聚体(例如，双特异性抗体)和其它寡聚体结构。在一些实施方案中，异多聚体蛋白质是双特异性抗体，诸如共同轻链抗体或具有两个不同轻链的抗体。例如，参见，图1)。[0088]在一些实施方案中，提供了异多聚体蛋白质(例如，异二聚体蛋白质)，其包含含有第一ch3结构域的第一多肽和包含第二ch3结构域的第二多肽，其中第一ch3结构域包含与第二ch3结构域的天然氨基酸残基形成疏水相互作用的工程化氨基酸残基，并且第二ch3结构域包含与第一ch3结构域中的天然氨基酸残基形成离子键的工程化氨基酸残基。在一些实施方案中，提供了异多聚体蛋白质(例如，异二聚体蛋白质)，其包含含有第一ch3结构域的第一多肽和含有第二ch3结构域的第二多肽，其中第一ch3结构域包含与第二ch3结构域的第一天然氨基酸残基形成疏水相互作用的第一工程化氨基酸残基，以及与第二ch3结构域中的第二天然氨基酸残基形成离子键的第二工程化氨基酸残基。在一些实施方案中，第一ch3结构域和第二ch3结构域还包含kih残基。[0089]在一些实施方案中，提供了异多聚体蛋白质(例如，异二聚体蛋白质)，其包含含有第一ch3结构域的第一多肽和含有第二ch3结构域的第二多肽，其中第一ch3结构域包含相对于野生型ch3结构域在氨基酸位置354处利用大疏水氨基酸进行的取代，并且/或者第二ch3结构域包含相对于野生型ch3结构域在氨基酸位置347处利用带负电荷的氨基酸进行的取代，并且其中氨基酸残基编号基于eu编号。在一些实施方案中，提供了异多聚体蛋白质(例如，异二聚体蛋白质)，其包含含有第一ch3结构域的第一多肽和含有第二ch3结构域的第二多肽，其中第一ch3结构域包含相对于野生型ch3结构域在氨基酸位置354处利用大疏水氨基酸进行的取代，和/或相对于野生型ch3结构域在氨基酸位置347处利用带负电荷的氨基酸进行的的取代，并且其中氨基酸残基编号基于eu编号。在一些实施方案中，大疏水氨基酸是酪氨酸(y)、苯丙氨酸(f)或色氨酸(w)。在一些实施方案中，带负电荷的氨基酸是天冬氨酸(d)或谷氨酸(e)。在一些实施方案中，一个ch3结构域中氨基酸位置354处的大疏水氨基酸与另一个ch3结构域中的氨基酸残基形成疏水相互作用。在一些实施方案中，另一个ch3结构域在氨基酸位置349(例如，y349)处包含大疏水残基。在一些实施方案中，一个ch3结构域中氨基酸位置347处的带负电荷的氨基酸与另一个ch3结构域中的氨基酸残基形成离子键。在一些实施方案中，另一个ch3结构域在氨基酸位置360(例如，k360)处包含带正电荷的残基。在一些实施方案中，第一ch3结构域和第二ch3结构域还包含kih残基，诸如t366y和y407t。在一些实施方案中，第一和第二ch3结构域是人ch3结构域、鼠ch3结构域、大鼠ch3结构域、骆驼ch3结构域或兔ch3结构域。图7显示了来自不同物种的igg分子的fc区序列的序列比对。[0090]在一些实施方案中，提供了异多聚体蛋白质(例如，异二聚体蛋白质)，其包含含有第一ch3结构域的第一多肽和含有第二ch3结构域的第二多肽，其中第一ch3结构域包含大疏水氨基酸对s354的取代，并且/或者第二ch3结构域包含带负电荷的氨基酸对q347的取代，并且其中氨基酸残基编号基于eu编号。在一些实施方案中，提供了异多聚体蛋白质(例如，异二聚体蛋白质)，其包含含有第一ch3结构域的第一多肽和含有第二ch3结构域的第二多肽，其中第一ch3结构域包含大疏水氨基酸对s354的取代，和/或带负电荷的氨基酸对q347的取代，并且其中氨基酸残基编号基于eu编号。在一些实施方案中，大疏水氨基酸是y、f或w。在一些实施方案中，带负电荷的氨基酸是d或e。在一些实施方案中，一个ch3结构域中的氨基酸位置354处的大疏水氨基酸与另一个ch3结构域中的氨基酸残基形成疏水相互作用。在一些实施方案中，另一个ch3结构域在氨基酸位置349(例如，y349)处包含大疏水残基。在一些实施方案中，一个ch3结构域中氨基酸位置347处的带负电荷的氨基酸与另一个ch3结构域中的氨基酸残基形成离子键。在一些实施方案中，另一个ch3结构域在氨基酸位置360(例如，k360)处包含带正电荷的残基。在一些实施方案中，ch3结构域是人ch3结构域。在一些实施方案中，第一ch3结构域和第二ch3结构域还包含kih残基，诸如t366y和y407t。[0091]在一些实施方案中，提供了异多聚体蛋白质(例如，异二聚体蛋白质)，其包含含有第一人ch3结构域的第一多肽和含有第二人ch3结构域的第二多肽，其中第一ch3结构域包含s354y，第二ch3结构域包含q347e，并且其中氨基酸残基编号基于eu编号。在一些实施方案中，第一ch3结构域中的s354y与第二ch3结构域中的氨基酸残基形成疏水相互作用。在一些实施方案中，第二ch3结构域在氨基酸位置349(例如，y349)处包含大疏水残基。在一些实施方案中，第二ch3结构域中的q347e与第一ch3结构域中的氨基酸残基形成离子键。在一些实施方案中，第一ch3结构域在氨基酸位置360(例如，k360)处包含带正电荷的残基。在一些实施方案中，第一ch3结构域和第二ch3结构域还包含kih残基。在一些实施方案中，第二ch3结构域不包含y349的取代，例如y349s。[0092]本文所述的ch3结构域中相对于野生型ch3结构域在氨基酸位置354和347处的取代可以与ch3结构域中任何已知的突变和/或工程化残基(包括旋钮进入孔(“kih”)突变)组合，这可以促进异二聚体的形成。可使用与氨基酸位置354和347处的取代相容的任何kih残基，包括例如t366y和y407t。在一些实施方案中，异多聚体蛋白质不包含ch3结构域中的kih残基。在一些实施方案中，异多聚体蛋白质包含促进异二聚体形成的额外的非kih突变，诸如形成二硫键的半胱氨酸残基，和/或形成静电相互作用的工程化残基。参见，例如美国专利第8,592,562号。[0093]在一些实施方案中，提供了异多聚体蛋白质(例如，异二聚体蛋白质)，其包含含有第一人ch3结构域的第一多肽和含有第二人ch3结构域的第二多肽，其中第一ch3结构域包含s354y和t366y，第二ch3结构域包含q347e和y407t，并且其中氨基酸残基编号基于eu编号。在一些实施方案中，第一ch3结构域中的s354y与第二ch3结构域中的氨基酸残基形成疏水相互作用。在一些实施方案中，第二ch3结构域在氨基酸位置349(例如，y349)处包含大疏水残基。在一些实施方案中，第二ch3结构域中的q347e与第一ch3结构域中的氨基酸残基形成离子键。在一些实施方案中，第一ch3结构域在氨基酸位置360(例如，k360)处包含带正电荷的残基。在一些实施方案中，第二ch3结构域不包含y349的取代，例如y349s。在一些实施方案中，与野生型人ch3结构域相比，第一ch3和第二ch3不包含其它突变。[0094]在一些实施方案中，提供了异多聚体蛋白质(例如，异二聚体蛋白质)，其包含含有第一人ch3结构域的第一多肽和含有第二人ch3结构域的第二多肽，其中第一ch3结构域包含s354y和y407t，第二ch3结构域包含q347e和t366y，并且其中氨基酸残基编号基于eu编号。在一些实施方案中，第一ch3结构域中的s354y与第二ch3结构域中的氨基酸残基形成疏水相互作用。在一些实施方案中，第二ch3结构域在氨基酸位置349(例如，y349)处包含大疏水残基。在一些实施方案中，第二ch3结构域中的q347e与第一ch3结构域中的氨基酸残基形成离子键。在一些实施方案中，第一ch3结构域在氨基酸位置360(例如，k360)处包含带正电荷的残基。在一些实施方案中，第二ch3结构域不包含y349的取代，例如y349s。在一些实施方案中，与野生型人ch3结构域相比，第一ch3和第二ch3不包含其它突变。[0095]第一多肽是与第二多肽缔合的任何多肽。第一多肽和第二多肽在包括ch3‑ch3界面的界面处相互作用。在一些实施方案中，第一多肽和第二多肽中的每一种可包含一个或多个额外的结构域，诸如结合结构域(例如，抗体可变结构域、受体结合结构域、配体结合结构域或酶促结构域)和抗体恒定结构域(或其部分)，包括ch2、ch1、铰链和cl结构域。示例性第一多肽和第二多肽包括抗体重链多肽、将抗体恒定结构域与异源多肽的结合结构域组合的嵌合体(即，免疫粘附素，诸如受体‑fc融合多肽、配体‑fc融合多肽)，以及抗体可变结构域多肽(例如，双抗体、双特异性大体(maxibody)或双特异性肽体(peptibody))。[0096]在一些实施方案中，第一多肽和/或第二多肽包含ch2结构域。在一些实施方案中，第一多肽和/或第二多肽包含ch1结构域和ch2结构域。在一些实施方案中，第一多肽和第二多肽各自包含igg诸如人igg的fc区。在一些实施方案中，第一多肽和第二多肽各自包含igg1、igg2、igg3或igg4的fc区。igg分子的野生型fc区的示例性序列如图7所示。示例性突变fc序列如表1所示。本领域技术人员对对应于igg分子的各种结构域的确切氨基酸的理解可能不同。因此，本文概述的结构域的n末端或c末端可以延长或缩短1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或甚至10个氨基酸。此外，请注意，有多种已知的编号方案来指定igg中的氨基酸位置，这可能不同于本专利申请中使用的eu编号方案。在一些实施方案中，fc区来自iga、igd、ige或igm重链的恒定区。[0097]在一些实施方案中，提供了包含第一多肽和第二多肽的异多聚体蛋白质(例如，异二聚体蛋白质)，所述第一多肽包含seqidno:1的ch3结构域(例如，氨基酸116‑217)，所述第二多肽包含seqidno:2的ch3结构域(例如，氨基酸116‑217)。在一些实施方案中，提供了包含第一多肽和第二多肽的异多聚体蛋白质(例如，异二聚体蛋白质)，所述第一多肽包含seqidno:3的ch3结构域(例如，氨基酸116‑217)，所述第二多肽包含seqidno:4的ch3结构域(例如，氨基酸116‑217)。在一些实施方案中，提供了包含第一多肽和第二多肽的异多聚体蛋白质(例如，异二聚体蛋白质)，所述第一多肽包含seqidno:1的氨基酸序列，所述第二多肽包含seqidno:2的氨基酸序列。在一些实施方案中，提供了包含第一多肽和第二多肽的异多聚体蛋白质(例如，异二聚体蛋白质)，所述第一多肽包含seqidno:3的氨基酸序列，所述第二多肽包含seqidno:4的氨基酸序列。[0098]表1.示例性iggfc序列。[0099][0100][0101]本发明的示例性实施方案包括但不限于抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)、单特异性多价抗体、双特异性大体(即，scfv‑fc融合蛋白)、单体(即，fab‑fc)、肽体(即，与异二聚体fc分子的一个臂融合的一个肽，包括单价、二价、单特异性和双特异性肽体)、免疫粘附素、抗体‑免疫粘附素嵌合体、受体‑fc融合蛋白以及配体‑fc融合蛋白。[0102]在一些实施方案中，异多聚体蛋白质是抗体，诸如多特异性(例如，双特异性)抗体。在一些实施方案中，异多聚体蛋白质包含一个或多个抗体轻链。在一些实施方案中，异多聚体蛋白质是共同轻链抗体，即，包含两条相同轻链的双特异性抗体。在一些实施方案中，异多聚体蛋白质共是同可变轻链抗体，即，包含具有相同轻链可变区的两条轻链的双特异性抗体。在一些实施方案中，异多聚体蛋白质包含具有相同轻链可变区的轻链。在一些实施方案中，异多聚体蛋白质包含轻链，所述轻链包含源自相同亲本抗体的轻链可变区。在一些实施方案中，异多聚体蛋白质包含两条不同的轻链。在一些实施方案中，异多聚体蛋白质包含源自两种不同抗体的轻链。在一些实施方案中，异多聚体蛋白质包含λ轻链。在一些实施方案中，异多聚体蛋白质包含κ轻链。在一些实施方案中，异多聚体蛋白质包含λ轻链和κ轻链。共同轻链抗体，包括共同可变轻链抗体，是本领域已知的。参见，例如美国专利第8642745b2号和美国专利申请公布第2016/0319036a1号，所述美国专利和美国专利申请公布通过引用并入本文。任何已知的共同可变轻链策略可以与本文所述的基于ch3的异二聚化策略组合使用，以提供多特异性抗体。[0103]在一些实施方案中，异多聚体蛋白质是抗体，诸如多特异性(例如，双特异性)抗体，其包含结合第一抗原的第一抗原结合片段和结合第二抗原的第二抗原结合片段。在一些实施方案中，异多聚体蛋白质包含结合第一抗原的第一抗原结合片段和第二抗原结合片段，以及结合第二抗原的第三抗原结合片段。在一些实施方案中，异多聚体蛋白质包含结合肿瘤抗原的第一抗原结合片段和第二抗原结合片段，以及结合第二抗原(诸如cd3)的第三抗原结合片段。在一些实施方案中，异多聚体蛋白质包含对肿瘤抗原具有相对低的亲和力的肿瘤抗原结合区，因此其与具有较低的肿瘤抗原密度的健康细胞的结合弱得多。在一些实施方案中，第一抗原结合片段、第二抗原结合片段和/或第三抗原结合片段是fab。在一些实施方案中，第一抗原结合片段、第二抗原结合片段和/或第三抗原结合片段是vhh。在一些实施方案中，第一抗原结合片段、第二抗原结合片段和/或第三抗原结合片段是scfv。在一些实施方案中，多特异性抗体包含两个fab结构域。在一些实施方案中，多特异性抗体包含三个fab结构域。在一些实施方案中，多特异性抗体包含两个vhh结构域。在一些实施方案中，多特异性抗体包含三个vhh结构域。在一些实施方案中，多特异性抗体包含fab结构域和vhh结构域。在一些实施方案中，多特异性抗体包含两个fab结构域和vhh结构域。在一些实施方案中，多特异性抗体包含fab结构域和两个vhh结构域。本文描述的多特异性抗体的示例性结构如图16所示。[0104]在一些实施方案中，提供了多特异性(例如，双特异性)抗体，其包含：(a)第一重链，其从n末端至c末端包含：第一重链可变结构域(vh1)、第一重链恒定结构域1(ch1)、第一重链恒定结构域2(ch2)和第一ch3结构域；(b)第一轻链，其从n末端至c末端包含：第一轻链可变结构域(vl1)和第一轻链恒定结构域(cl)；(c)第二重链，其从n末端至c末端包含：第二重链可变结构域(vh2)、第二ch1、第二ch2和第二ch3结构域；和(d)第二轻链，其从n末端至c碳末端包含：第二轻链可变结构域(vl2)和第二cl；其中vh1与vl1缔合形成特异性结合第一靶标的第一抗原结合位点，以及vh2与vl2缔合形成特异性结合第二靶标的第二抗原结合位点；其中第一ch3结构域包含相对于野生型ch3结构域在氨基酸位置354处利用大疏水氨基酸的取代，并且/或者第二ch3结构域包含相对于野生型ch3结构域在氨基酸位置347处利用带负电荷的氨基酸的取代，并且其中氨基酸残基编号基于eu编号。在一些实施方案中，大疏水氨基酸是y、f或w。在一些实施方案中，带负电荷的氨基酸是d或e。在一些实施方案中，氨基酸位置354处的大疏水氨基酸与第二ch3结构域中的氨基酸残基形成疏水相互作用。在一些实施方案中，第二ch3结构域在氨基酸位置349(例如，y349)处包含大疏水残基。在一些实施方案中，氨基酸位置347处的带负电荷的氨基酸与第一ch3结构域中的氨基酸残基形成离子键。在一些实施方案中，第一ch3结构域在氨基酸位置360(例如，k360)处包含带正电荷的残基。在一些实施方案中，第一和第二ch3结构域是人ch3结构域、鼠ch3结构域、大鼠ch3结构域、骆驼ch3结构域或兔ch3结构域。在一些实施方案中，第一ch3结构域和第二ch3结构域还包含kih残基，诸如t366y和y407t。在一些实施方案中，多特异性抗体是嵌合的、人的或人源化的。在一些实施方案中，vl1和vl2具有相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，vl1和vl2具有不同的氨基酸序列。[0105]在一些实施方案中，提供了多特异性(例如，双特异性)抗体，其包含：(a)第一重链，其从n末端至c碳末端包含：vh1结构域、第一ch1结构域、第一ch2结构域和第一ch3结构域；(b)第一轻链，其从n末端至c末端包含：vl1结构域和第一cl结构域；(c)第二重链，其从n末端至c末端包含：vh2结构域、第二ch1结构域、第二ch2结构域和第二ch3结构域；和(d)第二轻链，其从n末端至c末端包含：vl2结构域和第二cl结构域；其中vh1与vl1缔合形成特异性结合第一靶标的第一抗原结合位点，以及vh2与vl2缔合形成特异性结合第二靶标的第二抗原结合位点；其中第一ch3结构域包含大疏水氨基酸对s354的取代，并且/或者第二ch3结构域包含带负电荷的氨基酸对q347的取代，并且其中氨基酸残基编号基于eu编号。在一些实施方案中，大疏水氨基酸是y、f或w。在一些实施方案中，带负电荷的氨基酸是d或e。在一些实施方案中，氨基酸位置354处的大疏水氨基酸与第二ch3结构域中的氨基酸残基形成疏水相互作用。在一些实施方案中，第二ch3结构域在氨基酸位置349(例如，y349)处包含大疏水残基。在一些实施方案中，氨基酸位置347处的带负电荷的氨基酸与第一ch3结构域中的氨基酸残基形成离子键。在一些实施方案中，第一ch3结构域在氨基酸位置360(例如，k360)处包含带正电荷的残基。在一些实施方案中，第一ch3结构域和第二ch3结构域还包含kih残基，诸如t366y和y407t。在一些实施方案中，多特异性抗体是嵌合的、人的或人源化的。在一些实施方案中，vl1和vl2具有相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，vl1和vl2具有不同的氨基酸序列。[0106]在一些实施方案中，提供了多特异性(例如，双特异性)抗体，其包含：(a)第一重链，其从n末端至c碳末端包含：vh1结构域、第一ch1结构域、第一ch2结构域和第一ch3结构域；(b)第一轻链，其从n末端至c末端包含：vl1结构域和第一cl结构域；(c)第二重链，其从n末端至c末端包含：vh2结构域、第二ch1结构域、第二ch2结构域和第二ch3结构域；和(d)第二轻链，其从n末端至c末端包含：vl2结构域和第二cl结构域；其中vh1与vl1缔合形成特异性结合第一靶标的第一抗原结合位点，以及vh2与vl2缔合形成特异性结合第二靶标的第二抗原结合位点；其中第一ch3结构域包含s354y和t366y，第二ch3结构域包含q347e和y407t，其中氨基酸残基编号基于eu编号。在一些实施方案中，第一ch3结构域的s354y与第二ch3结构域中的氨基酸残基形成疏水相互作用。在一些实施方案中，第二ch3结构域在氨基酸位置349(例如，y349)处包含大疏水残基。在一些实施方案中，第二ch3结构域的q347e与第一ch3结构域中的氨基酸残基形成离子键。在一些实施方案中，第一ch3结构域在氨基酸位置360(例如，k360)处包含带正电荷的残基。在一些实施方案中，第二ch3结构域不包含y349的取代，例如y349s。在一些实施方案中，与野生型人ch3结构域相比，第一ch3和第二ch3不包含其它突变。在一些实施方案中，多特异性抗体是嵌合的、人的或人源化的。在一些实施方案中，vl1和vl2具有相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，vl1和vl2具有不同的氨基酸序列。在一些实施方案中，第一抗原结合位点特异性结合cd3，并且第二抗原结合位点特异性结合肿瘤抗原，或者第一抗原结合位点特异性结合cd3，并且第二抗原结合位点特异性结合肿瘤抗原。在一些实施方案中，第一抗原结合位点特异性结合cd20，并且第二抗原结合位点特异性结合cd3，或者第一抗原结合位点特异性结合cd3，并且第二抗原结合位点特异性结合cd20。在一些实施方案中，第一抗原结合位点特异性结合her2，并且第二抗原结合位点特异性结合cd3，或者第一抗原结合位点特异性结合cd3，并且第二抗原结合位点特异性结合her2。[0107]在一些实施方案中，提供了多特异性(例如，双特异性)抗体，其包含：(a)第一重链，其从n末端至c碳末端包含：vh1结构域、第一ch1结构域、第一ch2结构域和第一ch3结构域；(b)第一轻链，其从n末端至c末端包含：vl1结构域和第一cl结构域；(c)第二重链，其从n末端至c末端包含：vh2结构域、第二ch1结构域、第二ch2结构域和第二ch3结构域；和(d)第二轻链，其从n末端至c末端包含：vl2结构域和第二cl结构域；其中vh1与vl1缔合形成特异性结合第一靶标的第一抗原结合位点，以及vh2与vl2缔合形成特异性结合第二靶标的第二抗原结合位点；其中第一ch3结构域包含s354y和y407t，第二ch3结构域包含q347e和t366y，其中氨基酸残基编号基于eu编号。在一些实施方案中，第一ch3结构域的s354y与第二ch3结构域中的氨基酸残基形成疏水相互作用。在一些实施方案中，第二ch3结构域在氨基酸位置349(例如，y349)处包含大疏水残基。在一些实施方案中，第二ch3结构域的q347e与第一ch3结构域中的氨基酸残基形成离子键。在一些实施方案中，第一ch3结构域在氨基酸位置360(例如，k360)处包含带正电荷的残基。在一些实施方案中，第二ch3结构域不包含y349的取代，例如y349s。在一些实施方案中，与野生型人ch3结构域相比，第一ch3和第二ch3不包含其它突变。在一些实施方案中，多特异性抗体是嵌合的、人的或人源化的。在一些实施方案中，vl1和vl2具有相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，vl1和vl2具有不同的氨基酸序列。在一些实施方案中，第一抗原结合位点特异性结合cd3，并且第二抗原结合位点特异性结合肿瘤抗原，或者第一抗原结合位点特异性结合cd3，并且第二抗原结合位点特异性结合肿瘤抗原。在一些实施方案中，第一抗原结合位点特异性结合cd20，并且第二抗原结合位点特异性结合cd3，或者第一抗原结合位点特异性结合cd3，并且第二抗原结合位点特异性结合cd20。在一些实施方案中，第一抗原结合位点特异性结合her2，并且第二抗原结合位点特异性结合cd3，或者第一抗原结合位点特异性结合cd3，并且第二抗原结合位点特异性结合her2。[0108]在一些实施方案中，提供了多特异性(例如，双特异性)抗体，其包含：(a)第一重链，其从n末端至c末端包含：第一vhh结构域(vhh1)、第一重链恒定结构域2(ch2)和第一ch3结构域；和(b)第二重链，其从n末端至c末端包含：第二vhh结构域(vhh2)、第二ch2和第二ch3结构域；其中vhh1特异性结合第一靶标，以及vhh2特异性结合第二靶标；其中第一ch3结构域包含相对于野生型ch3结构域在氨基酸位置354处利用大疏水氨基酸进行的取代，并且/或者第二ch3结构域包含相对于野生型ch3结构域在氨基酸位置347处利用带负电荷的氨基酸进行的取代，并且其中氨基酸残基编号基于eu编号。在一些实施方案中，大疏水氨基酸是y、f或w。在一些实施方案中，带负电荷的氨基酸是d或e。在一些实施方案中，氨基酸位置354处的大疏水氨基酸与第二ch3结构域中的氨基酸残基形成疏水相互作用。在一些实施方案中，第二ch3结构域在氨基酸位置349(例如，y349)处包含大疏水残基。在一些实施方案中，氨基酸位置347处的带负电荷的氨基酸与第一ch3结构域中的氨基酸残基形成离子键。在一些实施方案中，第一ch3结构域在氨基酸位置360(例如，k360)处包含带正电荷的残基。在一些实施方案中，第一和第二ch3结构域是人ch3结构域、鼠ch3结构域、大鼠ch3结构域、骆驼ch3结构域或兔ch3结构域。在一些实施方案中，第一ch3结构域和第二ch3结构域还包含kih残基，诸如t366y和y407t。在一些实施方案中，多特异性抗体是嵌合的、人的或人源化的。[0109]在一些实施方案中，提供了多特异性(例如，双特异性)抗体，其包含：(a)第一重链，其从n末端至c末端包含：第一vhh结构域(vhh1)、第一重链恒定结构域2(ch2)和第一ch3结构域；和(b)第二重链，其从n末端至c末端包含：第二vhh结构域(vhh2)、第二ch2和第二ch3结构域；其中vhh1特异性结合第一靶标，以及vhh2特异性结合第二靶标；其中第一ch3结构域包含大疏水氨基酸对s354的取代，并且/或者第二ch3结构域包含带负电荷的氨基酸对q347的取代，并且其中氨基酸残基编号基于eu编号。在一些实施方案中，大疏水氨基酸是y、f或w。在一些实施方案中，带负电荷的氨基酸是d或e。在一些实施方案中，氨基酸位置354处的大疏水氨基酸与第二ch3结构域中的氨基酸残基形成疏水相互作用。在一些实施方案中，第二ch3结构域在氨基酸位置349(例如，y349)处包含大疏水残基。在一些实施方案中，氨基酸位置347处的带负电荷的氨基酸与第一ch3结构域中的氨基酸残基形成离子键。在一些实施方案中，第一ch3结构域在氨基酸位置360(例如，k360)处包含带正电荷的残基。在一些实施方案中，第一ch3结构域和第二ch3结构域还包含kih残基，诸如t366y和y407t。在一些实施方案中，多特异性抗体是嵌合的、人的或人源化的。[0110]在一些实施方案中，提供了多特异性(例如，双特异性)抗体，其包含：(a)第一重链，其从n末端至c末端包含：第一vhh结构域(vhh1)、第一重链恒定结构域2(ch2)和第一ch3结构域；和(b)第二重链，其从n末端至c末端包含：第二vhh结构域(vhh2)、第二ch2和第二ch3结构域；其中vhh1特异性结合第一靶标，以及vhh2特异性结合第二靶标；其中第一ch3结构域包含s354y和t366y，第二ch3结构域包含q347e和y407t，并且其中氨基酸残基编号基于eu编号。在一些实施方案中，第一ch3结构域的s354y与第二ch3结构域中的氨基酸残基形成疏水相互作用。在一些实施方案中，第二ch3结构域在氨基酸位置349(例如，y349)处包含大疏水残基。在一些实施方案中，第二ch3结构域的q347e与第一ch3结构域中的氨基酸残基形成离子键。在一些实施方案中，第一ch3结构域在氨基酸位置360(例如，k360)处包含带正电荷的残基。在一些实施方案中，第二ch3结构域不包含y349的取代，例如y349s。在一些实施方案中，与野生型人ch3结构域相比，第一ch3和第二ch3不包含其它突变。在一些实施方案中，多特异性抗体是嵌合的、人的或人源化的。[0111]在一些实施方案中，提供了多特异性(例如，双特异性)抗体，其包含：(a)第一重链，其从n末端至c末端包含：第一vhh结构域(vhh1)、第一重链恒定结构域2(ch2)和第一ch3结构域；和(b)第二重链，其从n末端至c末端包含：第二vhh结构域(vhh2)、第二ch2和第二ch3结构域；其中vhh1特异性结合第一靶标，以及vhh2特异性结合第二靶标；其中第一ch3结构域包含s354y和y407t，第二ch3结构域包含q347e和t366y，并且其中氨基酸残基编号基于eu编号。在一些实施方案中，第一ch3结构域的s354y与第二ch3结构域中的氨基酸残基形成疏水相互作用。在一些实施方案中，第二ch3结构域在氨基酸位置349(例如，y349)处包含大疏水残基。在一些实施方案中，第二ch3结构域的q347e与第一ch3结构域中的氨基酸残基形成离子键。在一些实施方案中，第一ch3结构域在氨基酸位置360(例如，k360)处包含带正电荷的残基。在一些实施方案中，第二ch3结构域不包含y349的取代，例如y349s。在一些实施方案中，与野生型人ch3结构域相比，第一ch3和第二ch3不包含其它突变。在一些实施方案中，多特异性抗体是嵌合的、人的或人源化的。[0112]在一些实施方案中，提供了多特异性(例如，双特异性)抗体，其包含：(a)第一重链，其从n末端至c末端包含：vhh结构域、第一重链恒定结构域2(ch2)和第一ch3结构域；(b)第二重链，其从n末端至c碳末端包含：第一重链可变结构域(vh1)、第一ch1、第二ch2和第二ch3结构域；和(d)轻链，其从n末端至c末端包含：第一轻链可变结构域(vl1)和第一cl；其中vh1与vl1缔合形成特异性结合第一靶标的第一抗原结合位点，并且vhh结构域特异性结合第二靶标；其中第一ch3结构域包含相对于野生型ch3结构域在氨基酸位置354处利用大疏水氨基酸进行的取代，并且/或者第二ch3结构域包含相对于野生型ch3结构域在氨基酸位置347处利用带负电荷的氨基酸进行的取代，或者其中第二ch3结构域包含相对于野生型ch3结构域在氨基酸位置354处利用大疏水氨基酸进行的取代，并且/或者第一ch3结构域包含相对于野生型ch3结构域在氨基酸位置347处利用带负电荷的氨基酸进行的取代；并且其中氨基酸残基编号基于eu编号。在一些实施方案中，大疏水氨基酸是y、f或w。在一些实施方案中，带负电荷的氨基酸是d或e。在一些实施方案中，氨基酸位置354处的大疏水氨基酸与第二ch3结构域中的氨基酸残基形成疏水相互作用。在一些实施方案中，第二ch3结构域在氨基酸位置349(例如，y349)处包含大疏水残基。在一些实施方案中，氨基酸位置347处的带负电荷的氨基酸与第一ch3结构域中的氨基酸残基形成离子键。在一些实施方案中，第一ch3结构域在氨基酸位置360(例如，k360)处包含带正电荷的残基。在一些实施方案中，第一和第二ch3结构域是人ch3结构域、鼠ch3结构域、大鼠ch3结构域、骆驼ch3结构域或兔ch3结构域。在一些实施方案中，第一ch3结构域和第二ch3结构域还包含kih残基，诸如t366y和y407t。在一些实施方案中，多特异性抗体是嵌合的、人的或人源化的。[0113]在一些实施方案中，提供了多特异性(例如，双特异性)抗体，其包含：(a)第一重链，其从n末端至c末端包含：vhh结构域、第一重链恒定结构域2(ch2)和第一ch3结构域；(b)第二重链，其从n末端至c碳末端包含：第一重链可变结构域(vh1)、第一ch1、第二ch2和第二ch3结构域；和(d)轻链，其从n末端至c末端包含：第一轻链可变结构域(vl1)和第一cl；其中vh1与vl1缔合形成特异性结合第一靶标的第一抗原结合位点，并且vhh结构域特异性结合第二靶标；其中第一ch3结构域包含大疏水氨基酸对s354的取代，并且/或者第二ch3结构域包含带负电荷的氨基酸对q347的取代，或者其中第二ch3结构域包含大疏水氨基酸对s354的取代，并且/或者第一ch3结构域包含带负电荷的氨基酸对q347的取代；并且其中氨基酸残基编号基于eu编号。在一些实施方案中，大疏水氨基酸是y、f或w。在一些实施方案中，带负电荷的氨基酸是d或e。在一些实施方案中，氨基酸位置354处的大疏水氨基酸与第二ch3结构域中的氨基酸残基形成疏水相互作用。在一些实施方案中，第二ch3结构域在氨基酸位置349(例如，y349)处包含大疏水残基。在一些实施方案中，氨基酸位置347处的带负电荷的氨基酸与第一ch3结构域中的氨基酸残基形成离子键。在一些实施方案中，第一ch3结构域在氨基酸位置360(例如，k360)处包含带正电荷的残基。在一些实施方案中，第一ch3结构域和第二ch3结构域还包含kih残基，诸如t366y和y407t。[0114]在一些实施方案中，提供了多特异性(例如，双特异性)抗体，其包含：(a)第一重链，其从n末端至c末端包含：vhh结构域、第一重链恒定结构域2(ch2)和第一ch3结构域；(b)第二重链，其从n末端至c碳末端包含：第一重链可变结构域(vh1)、第一ch1、第二ch2和第二ch3结构域；和(d)轻链，其从n末端至c末端包含：第一轻链可变结构域(vl1)和第一cl；其中vh1与vl1缔合形成特异性结合第一靶标的第一抗原结合位点，并且vhh结构域特异性结合第二靶标；其中第一ch3结构域包含s354y和t366y，并且第二ch3结构域包含q347e和y407t，或者其中第二ch3结构域包含s354y和t366y，并且第一ch3结构域包含q347e和y407t；并且其中氨基酸残基编号基于eu编号。在一些实施方案中，第一ch3结构域的s354y与第二ch3结构域中的氨基酸残基形成疏水相互作用。在一些实施方案中，第二ch3结构域在氨基酸位置349(例如，y349)处包含大疏水残基。在一些实施方案中，第二ch3结构域的q347e与第一ch3结构域中的氨基酸残基形成离子键。在一些实施方案中，第一ch3结构域在氨基酸位置360(例如，k360)处包含带正电荷的残基。在一些实施方案中，第二ch3结构域不包含y349的取代，例如y349s。在一些实施方案中，与野生型人ch3结构域相比，第一ch3和第二ch3不包含其它突变。在一些实施方案中，多特异性抗体是嵌合的、人的或人源化的。在一些实施方案中，vhh特异性结合肿瘤抗原(例如，bcma)，并且第一抗原结合位点特异性结合cd3。[0115]在一些实施方案中，提供了多特异性(例如，双特异性)抗体，其包含：(a)第一重链，其从n末端至c末端包含：vhh结构域、第一重链恒定结构域2(ch2)和第一ch3结构域；(b)第二重链，其从n末端至c碳末端包含：第一重链可变结构域(vh1)、第一ch1、第二ch2和第二ch3结构域；和(d)轻链，其从n末端至c末端包含：第一轻链可变结构域(vl1)和第一cl；其中vh1与vl1缔合形成特异性结合第一靶标的第一抗原结合位点，并且vhh结构域特异性结合第二靶标；其中第一ch3结构域包含s354y和y407t，并且第二ch3结构域包含q347e和t366y，或者其中第二ch3结构域包含s354y和y407t，并且第一ch3结构域包含q347e和t366y；并且其中氨基酸残基编号基于eu编号。在一些实施方案中，第一ch3结构域的s354y与第二ch3结构域中的氨基酸残基形成疏水相互作用。在一些实施方案中，第二ch3结构域在氨基酸位置349(例如，y349)处包含大疏水残基。在一些实施方案中，第二ch3结构域的q347e与第一ch3结构域中的氨基酸残基形成离子键。在一些实施方案中，第一ch3结构域在氨基酸位置360(例如，k360)处包含带正电荷的残基。在一些实施方案中，第二ch3结构域不包含y349的取代，例如y349s。在一些实施方案中，与野生型人ch3结构域相比，第一ch3和第二ch3不包含其它突变。在一些实施方案中，多特异性抗体是嵌合的、人的或人源化的。在一些实施方案中，vhh特异性结合肿瘤抗原(例如，bcma)，并且第一抗原结合位点特异性结合cd3。[0116]在一些实施方案中，提供了多特异性(例如，双特异性或三特异性)抗体，其包含：(a)第一重链，其从n末端至c末端包含：第一重链可变结构域(vh1)、第一ch1、第二重链可变结构域(vh2)、第二ch1、第一ch2和第一ch3结构域；(b)第一轻链，其从n末端至c末端包含：第一轻链可变结构域(vl1)、第一cl、第二轻链可变结构域(vl2)和第二cl；(c)第二重链，其从n末端至c末端包含：第三重链可变结构域(vh3)、第三ch1、第二ch2和第二ch3结构域；和(d)第二轻链，其从n末端至c末端包含：第三轻链可变结构域(vl3)和第三cl；其中vh1与vl1缔合形成特异性结合第一靶标的第一抗原结合位点，以及vh2与vl2缔合形成特异性结合第二靶标的第二抗原结合位点，以及vh3与vl3缔合形成特异性结合第三靶标的第三抗原结合位点；其中第一ch3结构域包含相对于野生型ch3结构域在氨基酸位置354处利用大疏水氨基酸进行的取代，并且/或者第二ch3结构域包含相对于野生型ch3结构域在氨基酸位置347处利用带负电荷的氨基酸进行的取代，或者其中第二ch3结构域包含相对于野生型ch3结构域在氨基酸位置354处利用大疏水氨基酸进行的取代，并且/或者第一ch3结构域包含相对于野生型ch3结构域在氨基酸位置347处利用带负电荷的氨基酸进行的取代；并且其中氨基酸残基编号基于eu编号。在一些实施方案中，大疏水氨基酸是y、f或w。在一些实施方案中，带负电荷的氨基酸是d或e。在一些实施方案中，氨基酸位置354处的大疏水氨基酸与第二ch3结构域中的氨基酸残基形成疏水相互作用。在一些实施方案中，第二ch3结构域在氨基酸位置349(例如，y349)处包含大疏水残基。在一些实施方案中，氨基酸位置347处的带负电荷的氨基酸与第一ch3结构域中的氨基酸残基形成离子键。在一些实施方案中，第一ch3结构域在氨基酸位置360(例如，k360)处包含带正电荷的残基。在一些实施方案中，第一和第二ch3结构域是人ch3结构域、鼠ch3结构域、大鼠ch3结构域、骆驼ch3结构域或兔ch3结构域。在一些实施方案中，第一ch3结构域和第二ch3结构域还包含kih残基，诸如t366y和y407t。在一些实施方案中，多特异性抗体是嵌合的、人的或人源化的。在一些实施方案中，vl1、vl2和/或vl3具有相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，vl1、vl2和vl3具有不同的氨基酸序列。[0117]在一些实施方案中，提供了多特异性(例如，双特异性或三特异性)抗体，其包含：(a)第一重链，其从n末端至c末端包含：第一重链可变结构域(vh1)、第一ch1、第二重链可变结构域(vh2)、第二ch1、第一ch2和第一ch3结构域；(b)第一轻链，其从n末端至c末端包含：第一轻链可变结构域(vl1)、第一cl、第二轻链可变结构域(vl2)和第二cl；(c)第二重链，其从n末端至c末端包含：第三重链可变结构域(vh3)、第三ch1、第二ch2和第二ch3结构域；和(d)第二轻链，其从n末端至c末端包含：第三轻链可变结构域(vl3)和第三cl；其中vh1与vl1缔合形成特异性结合第一靶标的第一抗原结合位点，vh2与vl2缔合形成特异性结合第二靶标的第二抗原结合位点，以及vh3与vl3缔合形成特异性结合第三靶标的第三抗原结合位点；其中第一ch3结构域包含大疏水氨基酸对s354的取代，并且/或者第二ch3结构域包含带负电荷的氨基酸对q347的取代，或者其中第二ch3结构域包含大疏水氨基酸对s354的取代，并且/或者第一ch3结构域包含带负电荷的氨基酸对q347的取代；并且其中氨基酸残基编号基于eu编号。在一些实施方案中，大疏水氨基酸是y、f或w。在一些实施方案中，带负电荷的氨基酸是d或e。在一些实施方案中，氨基酸位置354处的大疏水氨基酸与第二ch3结构域中的氨基酸残基形成疏水相互作用。在一些实施方案中，第二ch3结构域在氨基酸位置349(例如，y349)处包含大疏水残基。在一些实施方案中，氨基酸位置347处的带负电荷的氨基酸与第一ch3结构域中的氨基酸残基形成离子键。在一些实施方案中，第一ch3结构域在氨基酸位置360(例如，k360)处包含带正电荷的残基。在一些实施方案中，第一ch3结构域和第二ch3结构域还包含kih残基，诸如t366y和y407t。在一些实施方案中，多特异性抗体是嵌合的、人的或人源化的。在一些实施方案中，vl1、vl2和/或vl3具有相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，vl1、vl2和vl3具有不同的氨基酸序列。[0118]在一些实施方案中，提供了多特异性(例如，双特异性或三特异性)抗体，其包含：(a)第一重链，其从n末端至c末端包含：第一重链可变结构域(vh1)、第一ch1、第二重链可变结构域(vh2)、第二ch1、第一ch2和第一ch3结构域；(b)第一轻链，其从n末端至c末端包含：第一轻链可变结构域(vl1)、第一cl、第二轻链可变结构域(vl2)和第二cl；(c)第二重链，其从n末端至c末端包含：第三重链可变结构域(vh3)、第三ch1、第二ch2和第二ch3结构域；和(d)第二轻链，其从n末端至c末端包含：第三轻链可变结构域(vl3)和第三cl；其中vh1与vl1缔合形成特异性结合第一靶标的第一抗原结合位点，vh2与vl2缔合形成特异性结合第二靶标的第二抗原结合位点，以及vh3与vl3缔合形成特异性结合第三靶标的第三抗原结合位点；其中第一ch3结构域包含s354y和t366y，并且第二ch3结构域包含q347e和y407t，或者其中第二ch3结构域包含s354y和t366y，并且第一ch3结构域包含q347e和y407t；并且其中氨基酸残基编号基于eu编号。在一些实施方案中，第一ch3结构域的s354y与第二ch3结构域中的氨基酸残基形成疏水相互作用。在一些实施方案中，第二ch3结构域在氨基酸位置349(例如，y349)处包含大疏水残基。在一些实施方案中，第二ch3结构域的q347e与第一ch3结构域中的氨基酸残基形成离子键。在一些实施方案中，第一ch3结构域在氨基酸位置360(例如，k360)处包含带正电荷的残基。在一些实施方案中，第二ch3结构域不包含y349的取代，例如y349s。在一些实施方案中，与野生型人ch3结构域相比，第一ch3和第二ch3不包含其它突变。在一些实施方案中，多特异性抗体是嵌合的、人的或人源化的。在一些实施方案中，vl1、vl2和/或vl3具有相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，vl1、vl2和vl3具有不同的氨基酸序列。在一些实施方案中，第一抗原结合位点和第二抗原结合位点特异性结合肿瘤抗原(例如，her2)，并且第三抗原结合位点特异性结合cd3。[0119]在一些实施方案中，提供了多特异性(例如，双特异性或三特异性)抗体，其包含：(a)第一重链，其从n末端至c末端包含：第一重链可变结构域(vh1)、第一ch1、第二重链可变结构域(vh2)、第二ch1、第一ch2和第一ch3结构域；(b)第一轻链，其从n末端至c末端包含：第一轻链可变结构域(vl1)、第一cl、第二轻链可变结构域(vl2)和第二cl；(c)第二重链，其从n末端至c末端包含：第三重链可变结构域(vh3)、第三ch1、第二ch2和第二ch3结构域；和(d)第二轻链，其从n末端至c末端包含：第三轻链可变结构域(vl3)和第三cl；其中vh1与vl1缔合形成特异性结合第一靶标的第一抗原结合位点，vh2与vl2缔合形成特异性结合第二靶标的第二抗原结合位点，以及vh3与vl3缔合形成特异性结合第三靶标的第三抗原结合位点；其中第一ch3结构域包含s354y和y407t，并且第二ch3结构域包含q347e和t366y，或者其中第二ch3结构域包含s354y和y407t，并且第一ch3结构域包含q347e和t366y；并且其中氨基酸残基编号基于eu编号。在一些实施方案中，第一ch3结构域的s354y与第二ch3结构域中的氨基酸残基形成疏水相互作用。在一些实施方案中，第二ch3结构域在氨基酸位置349(例如，y349)处包含大疏水残基。在一些实施方案中，第二ch3结构域的q347e与第一ch3结构域中的氨基酸残基形成离子键。在一些实施方案中，第一ch3结构域在氨基酸位置360(例如，k360)处包含带正电荷的残基。在一些实施方案中，第二ch3结构域不包含y349的取代，例如y349s。在一些实施方案中，与野生型人ch3结构域相比，第一ch3和第二ch3不包含其它突变。在一些实施方案中，多特异性抗体是嵌合的、人的或人源化的。在一些实施方案中，vl1、vl2和/或vl3具有相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，vl1、vl2和vl3具有不同的氨基酸序列。在一些实施方案中，第一抗原结合位点和第二抗原结合位点特异性结合肿瘤抗原(例如，her2)，并且第三抗原结合位点特异性结合cd3。[0120]在一些实施方案中，提供了多特异性(例如，双特异性或三特异性)抗体，其包含：(a)第一重链，其从n氮末端至c末端包含：第一vhh结构域(vhh1)、第二vhh结构域(vhh2)、第一ch2和第一ch3结构域；(b)第二重链，其从n末端至c末端包含：第三vhh结构域(vhh3)、第二ch2和第二ch3结构域；其中vhh1特异性结合第一靶标，vhh2特异性结合第二靶标，以及vhh3特异性结合第三靶标；其中第一ch3结构域包含相对于野生型ch3结构域在氨基酸位置354处利用大疏水氨基酸进行的取代，并且/或者第二ch3结构域包含相对于野生型ch3结构域在氨基酸位置347处利用带负电荷的氨基酸进行的取代，或者其中第二ch3结构域包含相对于野生型ch3结构域在氨基酸位置354处利用大疏水氨基酸进行的取代，并且/或者第一ch3结构域包含相对于野生型ch3结构域在氨基酸位置347处利用带负电荷的氨基酸进行的取代；并且其中氨基酸残基编号基于eu编号。在一些实施方案中，大疏水氨基酸是y、f或w。在一些实施方案中，带负电荷的氨基酸是d或e。在一些实施方案中，氨基酸位置354处的大疏水氨基酸与第二ch3结构域中的氨基酸残基形成疏水相互作用。在一些实施方案中，第二ch3结构域在氨基酸位置349(例如，y349)处包含大疏水残基。在一些实施方案中，氨基酸位置347处的带负电荷的氨基酸与第一ch3结构域中的氨基酸残基形成离子键。在一些实施方案中，第一ch3结构域在氨基酸位置360(例如，k360)处包含带正电荷的残基。在一些实施方案中，第一和第二ch3结构域是人ch3结构域、鼠ch3结构域、大鼠ch3结构域、骆驼ch3结构域或兔ch3结构域。在一些实施方案中，第一ch3结构域和第二ch3结构域还包含kih残基，诸如t366y和y407t。在一些实施方案中，多特异性抗体是嵌合的、人的或人源化的。[0121]在一些实施方案中，提供了多特异性(例如，双特异性或三特异性)抗体，其包含：(a)第一重链，其从n氮末端至c末端包含：第一vhh结构域(vhh1)、第二vhh结构域(vhh2)、第一ch2和第一ch3结构域；(b)第二重链，其从n末端至c末端包含：第三vhh结构域(vhh3)、第二ch2和第二ch3结构域；其中vhh1特异性结合第一靶标，vhh2特异性结合第二靶标，以及vhh3特异性结合第三靶标；其中第一ch3结构域包含大疏水氨基酸对s354的取代，并且/或者第二ch3结构域包含带负电荷的氨基酸对q347的取代，或其中第二ch3结构域包含大疏水氨基酸对s354的取代，并且/或者第一ch3结构域包含带负电荷的氨基酸对q347的取代；并且其中氨基酸残基编号基于eu编号。在一些实施方案中，大疏水氨基酸是y、f或w。在一些实施方案中，带负电荷的氨基酸是d或e。在一些实施方案中，氨基酸位置354处的大疏水氨基酸与第二ch3结构域中的氨基酸残基形成疏水相互作用。在一些实施方案中，第二ch3结构域在氨基酸位置349(例如，y349)处包含大疏水残基。在一些实施方案中，氨基酸位置347处的带负电荷的氨基酸与第一ch3结构域中的氨基酸残基形成离子键。在一些实施方案中，第一ch3结构域在氨基酸位置360(例如，k360)处包含带正电荷的残基。在一些实施方案中，第一ch3结构域和第二ch3结构域还包含kih残基，诸如t366y和y407t。在一些实施方案中，多特异性抗体是嵌合的、人的或人源化的。[0122]在一些实施方案中，提供了多特异性(例如，双特异性或三特异性)抗体，其包含：(a)第一重链，其从n氮末端至c末端包含：第一vhh结构域(vhh1)、第二vhh结构域(vhh2)、第一ch2和第一ch3结构域；(b)第二重链，其从n末端至c末端包含：第三vhh结构域(vhh3)、第二ch2和第二ch3结构域；其中vhh1特异性结合第一靶标，vhh2特异性结合第二靶标，以及vhh3特异性结合第三靶标；其中第一ch3结构域包含s354y和t366y，并且第二ch3结构域包含q347e和y407t，或者其中第二ch3结构域包含s354y和t366y，并且第一ch3结构域包含q347e和y407t；并且其中氨基酸残基编号基于eu编号。在一些实施方案中，第一ch3结构域的s354y与第二ch3结构域中的氨基酸残基形成疏水相互作用。在一些实施方案中，第二ch3结构域在氨基酸位置349(例如，y349)处包含大疏水残基。在一些实施方案中，第二ch3结构域的q347e与第一ch3结构域中的氨基酸残基形成离子键。在一些实施方案中，第一ch3结构域在氨基酸位置360(例如，k360)处包含带正电荷的残基。在一些实施方案中，第二ch3结构域不包含y349的取代，例如y349s。在一些实施方案中，与野生型人ch3结构域相比，第一ch3和第二ch3不包含其它突变。在一些实施方案中，多特异性抗体是嵌合的、人的或人源化的。[0123]在一些实施方案中，提供了多特异性(例如，双特异性或三特异性)抗体，其包含：(a)第一重链，其从n氮末端至c末端包含：第一vhh结构域(vhh1)、第二vhh结构域(vhh2)、第一ch2和第一ch3结构域；(b)第二重链，其从n末端至c末端包含：第三vhh结构域(vhh3)、第二ch2和第二ch3结构域；其中vhh1特异性结合第一靶标，vhh2特异性结合第二靶标，以及vhh3特异性结合第三靶标；其中第一ch3结构域包含s354y和y407t，并且第二ch3结构域包含q347e和t366y，或者其中第二ch3结构域包含s354y和y407t，并且第一ch3结构域包含q347e和t366y；并且其中氨基酸残基编号基于eu编号。在一些实施方案中，第一ch3结构域的s354y与第二ch3结构域中的氨基酸残基形成疏水相互作用。在一些实施方案中，第二ch3结构域在氨基酸位置349(例如，y349)处包含大疏水残基。在一些实施方案中，第二ch3结构域的q347e与第一ch3结构域中的氨基酸残基形成离子键。在一些实施方案中，第一ch3结构域在氨基酸位置360(例如，k360)处包含带正电荷的残基。在一些实施方案中，第二ch3结构域不包含y349的取代，例如y349s。在一些实施方案中，与野生型人ch3结构域相比，第一ch3和第二ch3不包含其它突变。在一些实施方案中，多特异性抗体是嵌合的、人的或人源化的。[0124]在一些实施方案中，提供了多特异性(例如，双特异性或三特异性)抗体，其包含：(a)第一重链，其从n末端至c末端包含：第一vhh结构域(vhh1)、第二vhh结构域(vhh2)、第一ch2和第一ch3结构域；(b)第二重链，其从n末端至c末端包含：第一重链可变结构域(vh1)、第一ch1、第二ch2和第二ch3结构域；和(c)轻链，其从n末端至c末端包含：第一轻链可变结构域(vl1)和第一cl；其中vh1与vl1缔合形成特异性结合第一靶标的第一抗原结合位点，vhh1特异性结合第二靶标，以及vhh2特异性结合第三靶标；其中第一ch3结构域包含相对于野生型ch3结构域在氨基酸位置354处利用大疏水氨基酸进行的取代，并且/或者第二ch3结构域包含相对于野生型ch3结构域在氨基酸位置347处利用带负电荷的氨基酸进行的取代，或者其中第二ch3结构域包含相对于野生型ch3结构域在氨基酸位置354处利用大疏水氨基酸进行的取代，并且/或者第一ch3结构域包含相对于野生型ch3结构域在氨基酸位置347处利用带负电荷的氨基酸进行的取代；并且其中氨基酸残基编号基于eu编号。在一些实施方案中，大疏水氨基酸是y、f或w。在一些实施方案中，带负电荷的氨基酸是d或e。在一些实施方案中，氨基酸位置354处的大疏水氨基酸与第二ch3结构域中的氨基酸残基形成疏水相互作用。在一些实施方案中，第二ch3结构域在氨基酸位置349(例如，y349)处包含大疏水残基。在一些实施方案中，氨基酸位置347处的带负电荷的氨基酸与第一ch3结构域中的氨基酸残基形成离子键。在一些实施方案中，第一ch3结构域在氨基酸位置360(例如，k360)处包含带正电荷的残基。在一些实施方案中，第一和第二ch3结构域是人ch3结构域、鼠ch3结构域、大鼠ch3结构域、骆驼ch3结构域或兔ch3结构域。在一些实施方案中，第一ch3结构域和第二ch3结构域还包含kih残基，诸如t366y和y407t。在一些实施方案中，多特异性抗体是嵌合的、人的或人源化的。[0125]在一些实施方案中，提供了多特异性(例如，双特异性或三特异性)抗体，其包含：(a)第一重链，其从n末端至c末端包含：第一vhh结构域(vhh1)、第二vhh结构域(vhh2)、第一ch2和第一ch3结构域；(b)第二重链，其从n末端至c末端包含：第一重链可变结构域(vh1)、第一ch1、第二ch2和第二ch3结构域；和(c)轻链，其从n末端至c末端包含：第一轻链可变结构域(vl1)和第一cl；其中vh1与vl1缔合形成特异性结合第一靶标的第一抗原结合位点，vhh1特异性结合第二靶标，以及vhh2特异性结合第三靶标；其中第一ch3结构域包含大疏水氨基酸对s354的取代，并且/或者第二ch3结构域包含带负电荷的氨基酸对q347的取代，或者其中第二ch3结构域包含大疏水氨基酸对s354的取代，并且/或者第一ch3结构域包含带负电荷的氨基酸对q347的取代；并且其中氨基酸残基编号基于eu编号。在一些实施方案中，大疏水氨基酸是y、f或w。在一些实施方案中，带负电荷的氨基酸是d或e。在一些实施方案中，氨基酸位置354处的大疏水氨基酸与第二ch3结构域中的氨基酸残基形成疏水相互作用。在一些实施方案中，第二ch3结构域在氨基酸位置349(例如，y349)处包含大疏水残基。在一些实施方案中，氨基酸位置347处的带负电荷的氨基酸与第一ch3结构域中的氨基酸残基形成离子键。在一些实施方案中，第一ch3结构域在氨基酸位置360(例如，k360)处包含带正电荷的残基。在一些实施方案中，第一ch3结构域和第二ch3结构域还包含kih残基，诸如t366y和y407t。在一些实施方案中，多特异性抗体是嵌合的、人的或人源化的。[0126]在一些实施方案中，提供了多特异性(例如，双特异性或三特异性)抗体，其包含：(a)第一重链，其从n末端至c末端包含：第一vhh结构域(vhh1)、第二vhh结构域(vhh2)、第一ch2和第一ch3结构域；(b)第二重链，其从n末端至c末端包含：第一重链可变结构域(vh1)、第一ch1、第二ch2和第二ch3结构域；和(c)轻链，其从n末端至c末端包含：第一轻链可变结构域(vl1)和第一cl；其中vh1与vl1缔合形成特异性结合第一靶标的第一抗原结合位点，vhh1特异性结合第二靶标，以及vhh2特异性结合第三靶标；其中第一ch3结构域包含s354y和t366y，并且第二ch3结构域包含q347e和y407t，或者其中第二ch3结构域包含s354y和t366y，并且第一ch3结构域包含q347e和y407t；并且其中氨基酸残基编号基于eu编号。在一些实施方案中，第一ch3结构域的s354y与第二ch3结构域中的氨基酸残基形成疏水相互作用。在一些实施方案中，第二ch3结构域在氨基酸位置349(例如，y349)处包含大疏水残基。在一些实施方案中，第二ch3结构域的q347e与第一ch3结构域中的氨基酸残基形成离子键。在一些实施方案中，第一ch3结构域在氨基酸位置360(例如，k360)处包含带正电荷的残基。在一些实施方案中，第二ch3结构域不包含y349的取代，例如y349s。在一些实施方案中，与野生型人ch3结构域相比，第一ch3和第二ch3不包含其它突变。在一些实施方案中，多特异性抗体是嵌合的、人的或人源化的。在一些实施方案中，vhh1和vhh2特异性结合肿瘤抗原(例如，bcma)，并且第一抗原结合位点特异性结合cd3。[0127]在一些实施方案中，提供了多特异性(例如，双特异性或三特异性)抗体，其包含：(a)第一重链，其从n末端至c末端包含：第一vhh结构域(vhh1)、第二vhh结构域(vhh2)、第一ch2和第一ch3结构域；(b)第二重链，其从n末端至c末端包含：第一重链可变结构域(vh1)、第一ch1、第二ch2和第二ch3结构域；和(c)轻链，其从n末端至c末端包含：第一轻链可变结构域(vl1)和第一cl；其中vh1与vl1缔合形成特异性结合第一靶标的第一抗原结合位点，vhh1特异性结合第二靶标，以及vhh2特异性结合第三靶标；其中第一ch3结构域包含s354y和y407t，并且第二ch3结构域包含q347e和t366y，或者其中第二ch3结构域包含s354y和y407t，并且第一ch3结构域包含q347e和t366y；并且其中氨基酸残基编号基于eu编号。在一些实施方案中，第一ch3结构域的s354y与第二ch3结构域中的氨基酸残基形成疏水相互作用。在一些实施方案中，第二ch3结构域在氨基酸位置349(例如，y349)处包含大疏水残基。在一些实施方案中，第二ch3结构域的q347e与第一ch3结构域中的氨基酸残基形成离子键。在一些实施方案中，第一ch3结构域在氨基酸位置360(例如，k360)处包含带正电荷的残基。在一些实施方案中，第二ch3结构域不包含y349的取代，例如y349s。在一些实施方案中，与野生型人ch3结构域相比，第一ch3和第二ch3不包含其它突变。在一些实施方案中，多特异性抗体是嵌合的、人的或人源化的。在一些实施方案中，vhh1和vhh2特异性结合肿瘤抗原(例如，bcma)，并且第一抗原结合位点特异性结合cd3。[0128]在一些实施方案中，提供了多特异性(例如，双特异性、三特异性或四特异性)抗体，其包含：(a)第一重链，其从n末端至c末端包含：第一vhh结构域(vhh1)、第二vhh结构域(vhh2)、第一ch2和第一ch3结构域；(b)第二重链，其从n末端至c末端包含：第三vhh结构域(vhh3)、第四vhh结构域(vhh4)、第二ch2和第二ch3结构域；其中vhh1特异性结合第一靶标，vhh2特异性结合第二靶标，vhh3特异性结合第三靶标，以及vhh4特异性结合第四靶标；其中第一ch3结构域包含相对于野生型ch3结构域在氨基酸位置354处利用大疏水氨基酸进行的取代，并且/或者第二ch3结构域包含相对于野生型ch3结构域在氨基酸位置347处利用带负电荷的氨基酸进行的取代，并且其中氨基酸残基编号基于eu编号。在一些实施方案中，大疏水氨基酸是y、f或w。在一些实施方案中，带负电荷的氨基酸是d或e。在一些实施方案中，氨基酸位置354处的大疏水氨基酸与第二ch3结构域中的氨基酸残基形成疏水相互作用。在一些实施方案中，第二ch3结构域在氨基酸位置349(例如，y349)处包含大疏水残基。在一些实施方案中，氨基酸位置347处的带负电荷的氨基酸与第一ch3结构域中的氨基酸残基形成离子键。在一些实施方案中，第一ch3结构域在氨基酸位置360(例如，k360)处包含带正电荷的残基。在一些实施方案中，第一和第二ch3结构域是人ch3结构域、鼠ch3结构域、大鼠ch3结构域、骆驼ch3结构域或兔ch3结构域。在一些实施方案中，第一ch3结构域和第二ch3结构域还包含kih残基，诸如t366y和y407t。在一些实施方案中，多特异性抗体是嵌合的、人的或人源化的。[0129]在一些实施方案中，提供了多特异性(例如，双特异性、三特异性或四特异性)抗体，其包含：(a)第一重链，其从n末端至c末端包含：第一vhh结构域(vhh1)、第二vhh结构域(vhh2)、第一ch2和第一ch3结构域；(b)第二重链，其从n末端至c末端包含：第三vhh结构域(vhh3)、第四vhh结构域(vhh4)、第二ch2和第二ch3结构域；其中vhh1特异性结合第一靶标，vhh2特异性结合第二靶标，vhh3特异性结合第三靶标，以及vhh4特异性结合第四靶标；其中第一ch3结构域包含大疏水氨基酸对s354的取代，并且/或者第二ch3结构域包含带负电荷的氨基酸对q347的取代，并且其中氨基酸残基编号基于eu编号。在一些实施方案中，大疏水氨基酸是y、f或w。在一些实施方案中，带负电荷的氨基酸是d或e。在一些实施方案中，氨基酸位置354处的大疏水氨基酸与第二ch3结构域中的氨基酸残基形成疏水相互作用。在一些实施方案中，第二ch3结构域在氨基酸位置349(例如，y349)处包含大疏水残基。在一些实施方案中，氨基酸位置347处的带负电荷的氨基酸与第一ch3结构域中的氨基酸残基形成离子键。在一些实施方案中，第一ch3结构域在氨基酸位置360(例如，k360)处包含带正电荷的残基。在一些实施方案中，第一ch3结构域和第二ch3结构域还包含kih残基，诸如t366y和y407t。在一些实施方案中，多特异性抗体是嵌合的、人的或人源化的。[0130]在一些实施方案中，提供了多特异性(例如，双特异性、三特异性或四特异性)抗体，其包含：(a)第一重链，其从n末端至c末端包含：第一vhh结构域(vhh1)、第二vhh结构域(vhh2)、第一ch2和第一ch3结构域；(b)第二重链，其从n末端至c末端包含：第三vhh结构域(vhh3)、第四vhh结构域(vhh4)、第二ch2和第二ch3结构域；其中vhh1特异性结合第一靶标，vhh2特异性结合第二靶标，vhh3特异性结合第三靶标，以及vhh4特异性结合第四靶标；其中第一ch3结构域包含s354y和t366y，第二ch3结构域包含q347e和y407t，并且其中氨基酸残基编号基于eu编号。在一些实施方案中，第一ch3结构域的s354y与第二ch3结构域中的氨基酸残基形成疏水相互作用。在一些实施方案中，第二ch3结构域在氨基酸位置349(例如，y349)处包含大疏水残基。在一些实施方案中，第二ch3结构域的q347e与第一ch3结构域中的氨基酸残基形成离子键。在一些实施方案中，第一ch3结构域在氨基酸位置360(例如，k360)处包含带正电荷的残基。在一些实施方案中，第二ch3结构域不包含y349的取代，例如y349s。在一些实施方案中，与野生型人ch3结构域相比，第一ch3和第二ch3不包含其它突变。在一些实施方案中，多特异性抗体是嵌合的、人的或人源化的。[0131]在一些实施方案中，提供了多特异性(例如，双特异性、三特异性或四特异性)抗体，其包含：(a)第一重链，其从n末端至c末端包含：第一vhh结构域(vhh1)、第二vhh结构域(vhh2)、第一ch2和第一ch3结构域；(b)第二重链，其从n末端至c末端包含：第三vhh结构域(vhh3)、第四vhh结构域(vhh4)、第二ch2和第二ch3结构域；其中vhh1特异性结合第一靶标，vhh2特异性结合第二靶标，vhh3特异性结合第三靶标，以及vhh4特异性结合第四靶标；其中第一ch3结构域包含s354y和y407t，第二ch3结构域包含q347e和t366y，并且其中氨基酸残基编号基于eu编号。在一些实施方案中，第一ch3结构域的s354y与第二ch3结构域中的氨基酸残基形成疏水相互作用。在一些实施方案中，第二ch3结构域在氨基酸位置349(例如，y349)处包含大疏水残基。在一些实施方案中，第二ch3结构域的q347e与第一ch3结构域中的氨基酸残基形成离子键。在一些实施方案中，第一ch3结构域在氨基酸位置360(例如，k360)处包含带正电荷的残基。在一些实施方案中，第二ch3结构域不包含y349的取代，例如y349s。在一些实施方案中，与野生型人ch3结构域相比，第一ch3和第二ch3不包含其它突变。在一些实施方案中，多特异性抗体是嵌合的、人的或人源化的。[0132]还提供了包含本文所述的第一ch3结构域和第二ch3结构域中任一个的多特异性抗体。在一些实施方案中，本技术提供了双特异性t细胞衔接子(bite)分子，其包含特异性结合肿瘤抗原的第一抗原结合片段、特异性结合cd3的第二抗原结合片段和本文所述的任一个突变fc区。在一些实施方案中，本技术提供了双特异性t细胞衔接子(bite)分子，其包含特异性结合肿瘤抗原的第一抗原结合片段和第二抗原结合片段、特异性结合cd3的第三抗原结合片段和本文所述的任一个突变fc区。在一些实施方案中，本技术提供了特异性结合cd20和cd3的多特异性(例如，双特异性或三特异性)抗体。在一些实施方案中，本技术提供了特异性结合her2和cd3的双特异性抗体。在一些实施方案中，本技术提供了特异性结合cd3和bcma的多特异性(例如，双特异性或三特异性)抗体。任何合适的抗原结合片段可用于本文所述的多特异性抗体，包括例如国际申请第pct/us2018/044778号或国际申请第pct/us2020/015311号中描述的抗cd20和抗cd3抗原结合片段。[0133]在一些实施方案中，异多聚体蛋白质是异多聚体免疫粘附素。免疫粘附素是抗体样分子，其将蛋白质(诸如细胞表面受体)的结合结构域或配体(“粘附素”)与免疫球蛋白恒定结构域的效应子功能组合在一起。免疫粘附素可拥有人抗体的许多有价值的化学和生物特性。由于免疫粘附素可以由具有与适当的人免疫球蛋白铰链和恒定结构域(fc)序列相连的所需特异性的人蛋白质序列构建，因此可以完全使用人组分来实现目标结合特异性。在一些实施方案中，异多聚体蛋白质是多特异性免疫粘附素，例如双特异性免疫粘附素，即，免疫粘附素的两个臂具有不同的特异性。[0134]在一些实施方案中，异多聚体蛋白质是抗体‑免疫粘附素嵌合体。这些分子将免疫粘附素的结合区与抗体的结合结构域组合在一起。已在例如berg等人，pnas(usa)88:4723‑4727(1991)和chamow等人，j.immunol.153:4268(1994)中描述了示例性抗体‑免疫粘附素嵌合体。[0135]在一些实施方案中，异多聚体蛋白质是免疫粘附素或抗体‑免疫粘附素嵌合体，其包含一个或多个非抗体片段的结合结构域，诸如配体结合结构域、受体结合结构域或酶结构域。如本文中所用，术语“配体结合结构域”是指任何天然细胞表面受体或其任何区域或衍生物(其至少保持定性配体结合能力，优选相应天然受体的生物活性)。在一些实施方案中，受体来自具有与免疫球蛋白超家族成员同源的细胞外结构域的细胞表面多肽。其它典型的受体不是免疫球蛋白超家族的成员，但仍被该定义特别地涵盖，它们是细胞因子受体、具有酪氨酸激酶活性的受体(受体酪氨酸激酶)、血细胞生成素和神经生长因子受体超家族的成员以及细胞粘附分子，例如，(e‑、l‑和p‑)选择素。[0136]术语“受体结合结构域”是指受体的任何天然配体，包括细胞粘附分子，或这种天然配体的任何区域或衍生物(其至少保持定性的受体结合能力，优选相应天然配体的生物活性)。该定义，除其它以外，特别地包括来自上述受体的配体的结合序列。[0137]在一些实施方案中，提供了多特异性(例如，双特异性)免疫粘附素，其包含：(a)第一多肽，其从n末端至c末端包含：特异性结合第一靶标的第一结合结构域、第一ch2结构域和第一ch3结构域；(b)第二多肽，其从n末端至c末端包含：特异性结合第二靶标的第二结合结构域、第二ch2结构域和第二ch3结构域；其中第一ch3结构域包含相对于野生型ch3结构域在氨基酸位置354处利用大疏水氨基酸进行的取代，并且/或者第二ch3结构域包含相对于野生型ch3结构域在氨基酸位置347处利用带负电荷的氨基酸进行的取代，并且其中氨基酸残基编号基于eu编号。在一些实施方案中，大疏水氨基酸是y、f或w。在一些实施方案中，带负电荷的氨基酸是d或e。在一些实施方案中，氨基酸位置354处的大疏水氨基酸与第二ch3结构域中的氨基酸残基形成疏水相互作用。在一些实施方案中，第二ch3结构域在氨基酸位置349(例如，y349)处包含大疏水残基。在一些实施方案中，氨基酸位置347处的带负电荷的氨基酸与第一ch3结构域中的氨基酸残基形成离子键。在一些实施方案中，第一ch3结构域在氨基酸位置360(例如，k360)处包含带正电荷的残基。在一些实施方案中，第一和第二ch3结构域是人ch3结构域、鼠ch3结构域、大鼠ch3结构域、骆驼ch3结构域或兔ch3结构域。在一些实施方案中，第一ch3结构域和第二ch3结构域还包含kih残基，诸如t366y和y407t。在一些实施方案中，第一结合结构域和第二结合结构域是受体结合结构域。在一些实施方案中，第一结合结构域和第二结合结构域是配体结合结构域。在一些实施方案中，第一结合结构域是受体结合结构域，第二结合结构域是配体结合结构域，或者第一结合结构域是配体结合结构域，第二结合结构域是受体结合结构域。[0138]在一些实施方案中，提供了多特异性(例如，双特异性)免疫粘附素，其包含：(a)第一多肽，其从n末端至c末端包含：特异性结合第一靶标的第一结合结构域、第一ch2结构域和第一ch3结构域；(b)第二多肽，其从n末端至c末端包含：特异性结合第二靶标的第二结合结构域、第二ch2结构域和第二ch3结构域；其中第一ch3结构域包含大疏水氨基酸对s354的取代，并且/或者第二ch3结构域包含带负电荷的氨基酸对q347的取代，并且其中氨基酸残基编号基于eu编号。在一些实施方案中，大疏水氨基酸是y、f或w。在一些实施方案中，带负电荷的氨基酸是d或e。在一些实施方案中，氨基酸位置354处的大疏水氨基酸与第二ch3结构域中的氨基酸残基形成疏水相互作用。在一些实施方案中，第二ch3结构域在氨基酸位置349(例如，y349)处包含大疏水残基。在一些实施方案中，氨基酸位置347处的带负电荷的氨基酸与第一ch3结构域中的氨基酸残基形成离子键。在一些实施方案中，第一ch3结构域在氨基酸位置360(例如，k360)处包含带正电荷的残基。在一些实施方案中，第一ch3结构域和第二ch3结构域还包含kih残基，诸如t366y和y407t。在一些实施方案中，第一结合结构域和第二结合结构域是受体结合结构域。在一些实施方案中，第一结合结构域和第二结合结构域是配体结合结构域。在一些实施方案中，第一结合结构域是受体结合结构域，第二结合结构域是配体结合结构域，或者第一结合结构域是配体结合结构域，第二结合结构域是受体结合结构域。[0139]在一些实施方案中，提供了多特异性(例如，双特异性)免疫粘附素，其包含：(a)第一多肽，其从n末端至c末端包含：特异性结合第一靶标的第一结合结构域、第一ch2结构域和第一ch3结构域；(b)第二多肽，其从n‑端到c末端包含：特异性结合第二靶标的第二结合结构域、第二ch2结构域和第二ch3结构域；其中：(i)第一ch3结构域包含s354y和t366y，第二ch3结构域包含q347e和y407t，或者(ii)第一ch3结构域包含s354y和y407t，第二ch3结构域包含q347e和t366y，并且其中氨基酸残基编号基于eu编号。在一些实施方案中，第一ch3结构域的s354y与第二ch3结构域中的氨基酸残基形成疏水相互作用。在一些实施方案中，第二ch3结构域在氨基酸位置349(例如，y349)处包含大疏水残基。在一些实施方案中，第二ch3结构域的q347e与第一ch3结构域中的氨基酸残基形成离子键。在一些实施方案中，第一ch3结构域在氨基酸位置360(例如，k360)处包含带正电荷的残基。在一些实施方案中，第二ch3结构域不包含y349的取代，例如y349s。在一些实施方案中，与野生型人ch3结构域相比，第一ch3和第二ch3不包含其它突变。在一些实施方案中，第一结合结构域和第二结合结构域是受体结合结构域。在一些实施方案中，第一结合结构域和第二结合结构域是配体结合结构域。在一些实施方案中，第一结合结构域是受体结合结构域，第二结合结构域是配体结合结构域，或者第一结合结构域是配体结合结构域，第二结合结构域是受体结合结构域。[0140]本文所述的多特异性抗体和多特异性免疫粘附素可以特异性结合表位、抗原或靶分子的任何合适的组合。在一些实施方案中，第一靶标、第二靶标、第三靶标和第四靶标是相同的表位。在一些实施方案中，第一靶标、第二靶标、第三靶标和/或第四靶标是相同抗原的不同表位。在一些实施方案中，第一靶标、第二靶标、第三靶标和第四靶标是不同的抗原。在一些实施方案中，第一靶、第二靶、第三靶和第四靶是不同的靶分子。[0141]在一些实施方案中，第一靶标、第二靶标、第三靶标和/或第四靶标是细胞表面分子。在一些实施方案中，第一靶标、第二靶标、第三靶标和/或第四靶标是肿瘤抗原。肿瘤抗原是由肿瘤细胞产生的蛋白质，其可以引发免疫反应，特别是t细胞介导的免疫反应。本发明靶向抗原的选择将取决于待治疗癌症的具体类型。示例性肿瘤抗原包括例如神经胶质瘤相关抗原、癌胚抗原(cea)、β‑人绒毛膜促性腺激素、甲胎蛋白(afp)、凝集素反应性afp、甲状腺球蛋白、rage‑1、mn‑caix、人端粒酶逆转录酶、ru1、ru2(as)、肠羧基酯酶、muthsp70‑2、m‑csf、前列腺酶、前列腺特异性抗原(psa)、pap、ny‑eso‑1、lage‑la、p53、前列腺素、psma、her2/neu、存活素和端粒酶、前列腺癌肿瘤抗原‑1(pcta‑1)、mage、elf2m、嗜中性粒细胞弹性蛋白酶、ephrinb2、cd22、胰岛素生长因子(igf‑i)、igf‑ii、igf‑i受体和间皮素。[0142]在一些实施方案中，肿瘤抗原包含一个或多个与恶性肿瘤相关的抗原性癌症表位。恶性肿瘤表达许多可作为免疫攻击的靶抗原的蛋白质。这些分子包括但不限于组织特异性抗原，诸如黑色素瘤中的mart‑1、酪氨酸酶和gp100以及前列腺癌中的前列腺酸性磷酸酶(pap)和前列腺特异性抗原(psa)。其它靶分子属于转化相关分子(诸如癌基因her2/neu/erbb‑2)的组。另一组靶抗原是瘤胎抗原(onco‑fetalantigen)，诸如癌胚抗原(cea)。在b细胞淋巴瘤中，肿瘤特异性独特型免疫球蛋白构成了真正的肿瘤特异性免疫球蛋白抗原，所述抗原是个体肿瘤所独有的。诸如cd19、cd20和cd37等b细胞分化抗原是b细胞淋巴瘤中靶抗原的其它候选者。[0143]在一些实施方案中，肿瘤抗原是肿瘤特异性抗原(tsa)或肿瘤相关抗原(taa)。tsa是肿瘤细胞所独有的，不会发生在身体的其它细胞上。taa不是肿瘤细胞所独有的，相反，其也在不能诱导对抗原的免疫耐受状态的条件下在正常细胞上表达。抗原在肿瘤上的表达可能在使免疫系统能够对抗原做出反应的条件下发生。taa可以是在胎儿发育过程中，当免疫系统不成熟且无法应答时，在正常细胞上表达的抗原，或者它们可以是正常情况下在正常细胞上以极低水平存在，但在肿瘤细胞上以高得多的水平表达的抗原。[0144]tsa或taa抗原的非限制性实例包括以下抗原：诸如mart‑1/melana(mart‑i)、gp100(pmel17)、酪氨酸酶、trp‑1、trp‑2等分化抗原和诸如mage‑1、mage‑3、bage、gage‑1、gage‑2、pl5等肿瘤特异性多谱系抗原；诸如cea等过表达的胚胎抗原；诸如p53、ras、her2/neu等过表达的癌基因和突变的肿瘤抑制基因；染色体易位导致的独特肿瘤抗原，诸如bcr‑abl、e2a‑prl、h4‑ret、igh‑igk、myl‑rar；以及病毒抗原，诸如eb病毒抗原ebva和人乳头瘤病毒(hpv)抗原e6和e7。其它基于蛋白质的大抗原包括tsp‑180、mage‑4、mage‑5、mage‑6、rage、ny‑eso、pl85erbb2、pl80erbb‑3、c‑met、nm‑23hi、psa、tag‑72、ca19‑9、ca72‑4、cam17.1、numa、k‑ras、β‑连环蛋白、cdk4、mum‑1、p15、p16、43‑9f、5t4、791tgp72、甲胎蛋白、β‑hcg、bca225、btaa、ca125、ca15‑3\ca27.29\bcaa、ca195、ca242、ca‑50、cam43、cd68\p1、co‑029、fgf‑5、g250、ga733\epcam、htgp‑175、m344、ma‑50、mg7‑ag、mov18、nb/70k、ny‑co‑1、rcas1、sdccag16、ta‑90\mac‑2结合蛋白\环孢素c相关蛋白、taal6、tag72、tlp和tps。[0145]在一些实施方案中，第一靶标、第二靶标、第三靶标和/或第四靶标是免疫检查点分子，诸如刺激性免疫检查点分子或抑制性免疫检查点分子。示例性刺激免疫检查点分子包括但不限于cd28、ox40、icos、gitr、4‑1bb、cd27、cd40、cd3、hvem和tcr(例如，mhci类或ii类分子)。示例性抑制性免疫检查点分子包括但不限于ctla‑4、tim‑3、a2a受体、lag‑3、btla、kir、pd‑1、ido、cd47及其配体，诸如b7.1、b7.2、pd‑l1、pd‑l2、hvem、b7‑h4、nktr‑218和sirp‑α受体。[0146]在一些实施方案中，第一靶标、第二靶标、第三靶标和/或第四靶标是免疫效应细胞(诸如t细胞、b细胞、巨噬细胞或天然杀伤细胞)上的抗原。在一些实施方案中，第一靶标、第二靶标、第三靶标或第四靶标是cd3。在一些实施方案中，第一靶标是cd3，第二靶标是肿瘤抗原，或者第一靶标是肿瘤抗原，第二靶标是cd3。在一些实施方案中，第一靶标是cd3，第二靶标和第三靶标是肿瘤抗原。[0147]还提供了本文所述的任一种异多聚体蛋白质的单个多肽。[0148]在一些实施方案中，提供了包含抗体ch3结构域的多肽，其中ch3结构域包含相对于野生型ch3结构域在氨基酸位置354处利用大疏水氨基酸进行的取代和/或相对于野生型ch3结构域在氨基酸位置347处利用带负电荷的氨基酸进行的取代，并且其中与包含野生型ch3结构域的多肽相比，该多肽形成同二聚体的能力降低。在一些实施方案中，大疏水氨基酸是y、f或w。在一些实施方案中，带负电荷的氨基酸是d或e。在一些实施方案中，ch3结构域是人ch3结构域、鼠ch3结构域、大鼠ch3结构域、骆驼ch3结构域或兔ch3结构域。在一些实施方案中，ch3结构域还包含kih残基，诸如t366y或y407t。在一些实施方案中，多肽包含ch2结构域。在一些实施方案中，多肽包含抗体重链。[0149]在一些实施方案中，提供了包含人抗体ch3结构域的多肽，其中ch3结构域包含大疏水氨基酸对s354的取代和/或带负电荷的氨基酸对q347的取代，并且其中与包含野生型ch3结构域的多肽相比，所述多肽形成同二聚体的能力降低。在一些实施方案中，ch3结构域包含选自由以下组成的组的取代：s354y、s354f和s354w。在一些实施方案中，ch3结构域包含选自由以下组成的组的取代：q347e和q347d。在一些实施方案中，ch3结构域还包含kih残基，诸如t366y或y407t。在一些实施方案中，多肽包含ch2结构域。在一些实施方案中，多肽包含抗体重链。[0150]本文还提供了上述任一种异多聚体蛋白质或多肽的变体和衍生物。[0151]在一些实施方案中，设想了本文提供的异多聚体蛋白质(例如，多特异性抗体)的氨基酸序列变体。例如，可能希望提高异多聚体蛋白质的结合亲和力和/或其它生物学特性。异多聚体蛋白质的氨基酸序列变体可以通过将适当的修饰引入到编码异多聚体蛋白质的核苷酸序列中或通过肽合成来制备。此类修饰包括例如异多聚体蛋白质氨基酸序列内残基的缺失和/或插入和/或取代。可进行缺失、插入和取代的任意组合以获得最终的构建体，前体条件是最终的构建体具有所需的特性，例如，抗原结合。[0152]在一些实施方案中，提供了具有一个或多个氨基酸取代的异多聚体蛋白质变体。用于取代诱变的目标位点包括多特异性抗体的cdr和fr。可将氨基酸取代引入到目标多特异性抗体中，并筛选产物的所需活性，例如，保持/提高抗原结合和裂解、降低免疫原性或改善adcc或cdc。[0153]保守取代如下表2所示。[0154]表2：保守取代[0155][0156]氨基酸可根据共同侧链性质分为不同的类别:[0157]a.疏水：正亮氨酸、met、ala、val、leu、ile[0158]b.中性亲水：cys、ser、thr、asn、gln[0159]c.酸性：asp、glu[0160]d.碱性：his、lys、arg[0161]e.影响链取向的残基：gly、pro[0162]f.芳族：trp、tyr、phe。[0163]非保守取代将需要用这些类别之一的成员替换另一个类别的。[0164]在一些实施方案中，可以在一个或多个cdr内发生取代、插入或缺失，只要此类改变不实质性降低多特异性抗体结合抗原的能力。例如，可以对cdr进行不实质性降低结合亲和力的保守性改变(例如，如本文提供的保守性取代)。此类改变可以在hvr“热点”或sdr的外部。[0165]一种可用于鉴定抗体中可以作为诱变靶位的残基或区域的方法称为“丙氨酸扫描诱变”，如由cunningham和wells(1989)science,244:1081‑1085所述。在此方法中，鉴定残基或靶残基的组(例如，带电荷的残基诸如arg、asp、his、lys和glu)，并用中性或带负电荷的氨基酸(例如，丙氨酸或聚丙氨酸)替代以确定抗体与抗原的相互作用是否受到影响。可以在对初始取代显示功能敏感性的氨基酸位置引入进一步的取代。可选地或另外地，可以确定抗原‑抗体复合物的晶体结构，以鉴定抗体与抗原之间的接触点。可以靶向或消除此类接触残基和邻近残基作为取代的候选者。可以筛选变体以确定它们是否包含所需的特性。[0166]氨基酸序列插入包括长度在一个残基至包含一百个或更多个残基的多肽的范围内的氨基‑和/或羧基‑末端融合，以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的实例包括具有n末端甲硫氨酰基残基的异多聚体蛋白质。异多聚体蛋白质的其它插入变体包括异多聚体蛋白质的n‑或c‑末端与酶(例如，对于adept)或多肽的融合，所述多肽延长了异多聚体蛋白质的血清半衰期。[0167]异多聚体蛋白质变体也被提供予氨基末端前导延伸。例如，氨基末端前导序列的一个或多个氨基酸残基存在于抗体的任一个或多个重链或轻链的氨基末端上。[0168]异多聚体蛋白质的共价修饰也包括在本发明的范围内。异多聚体蛋白质的共价修饰可通过使异多聚体蛋白质或其片段的靶向氨基酸残基与有机衍生剂反应而引入分子中，所述有机衍生剂能够与选定的侧链或者n‑或c‑末端残基反应。异多聚体蛋白质的另一种类型的共价修饰包括改变多肽的天然糖基化模式。例如，可以删除在原始异多聚体蛋白质中发现的一个或多个碳水化合物部分，并且/或者可以添加一个或多个在原始异多聚体蛋白质中不存在的糖基化位点。通过改变氨基酸序列使其包含一个或多个n连接的糖基化位点，可以方便地实现糖基化位点至异多聚体蛋白质中的添加。还可通过向原始异多聚体蛋白质序列(对于o‑连接的糖基化位点)中添加一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基或者用一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基进行取代来进行所述改变。例如，异多聚体蛋白质的氨基酸序列可通过dna水平上的变化，例如，通过在预选的碱基上突变编码异多聚体蛋白质的dna，使得产生将翻译成所需氨基酸的密码子来改变。增加异多聚体蛋白质上碳水化合物部分的数量的另一种方法是通过糖苷与多肽的化学或酶促偶联。这些方法描述于wo87/05330以及aplin和wriston,crccrit.rev.biochem，第259‑306页(1981)中。异多聚体蛋白质上存在的碳水化合物部分的去除可以通过化学或酶促方式完成。[0169]另一种类型的异多聚体蛋白质的共价修饰包括将异多聚体蛋白质连接到多种非蛋白质性质[0170]部分之一。适于异多聚体蛋白质衍生的部分包括但不限于水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性实例包括但不限于聚乙二醇(peg)、乙二醇/丙二醇的共聚物、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚‑1,3‑二氧戊环、聚‑1,3,6‑三噁烷、乙烯/马来酸酐共聚物、聚氨基酸(均聚物或无规共聚物)和葡聚糖或聚(正乙烯基吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、环氧丙烷/环氧乙烷共聚物、聚氧乙烯多元醇(例如，甘油)、聚乙烯醇及其混合物。聚乙二醇丙醛由于其在水中的稳定性，在生产中可能具有有利方面。聚合物可具有任何分子量，并且可以是支化的或未支化的。附接至异多聚体蛋白质上的聚合物的数量可以不同，如果附接了不止一个聚合物，则它们可以是相同或不同的分子。一般而言，可根据包括但不限于待改善的异多聚体蛋白质的特定性质或功能、异多聚体蛋白质衍生物是否将用于确定条件下的治疗等的考虑来确定用于衍生化的聚合物的数目和/或类型。[0171]iii.制备方法[0172]本技术还提供了制备异多聚体(例如，异二聚体)蛋白质，诸如多特异性抗体或免疫粘附素的方法。还提供了用于制备异多聚体蛋白质或其多肽的核酸、载体和宿主细胞。[0173]本文所述的异多聚体蛋白质可使用本领域任何已知的方法制备，所述方法包括下文和实施例中所述的方法。此类方法可包括培养包含编码第一和第二含有ch3的多肽的核酸的宿主细胞，使得所述多肽被细胞共表达。在某些实施方案中，编码第一和第二含有ch3的多肽的核酸以例如约1:1、1:2、2:1、1:3、3:1、1:4、4:1、1:5、5:1、1:6、6:1、1:7、7:1、1:8、8:1、1:9、9:1、1:10或10:1(摩尔∶摩尔)中的任一种比率提供给宿主细胞。在一些实施方案中，异多聚体蛋白质包含一个或多个抗体轻链。在一些实施方案中，异多聚体蛋白质包含由细胞共表达的第一重链、第二重链和共同轻链。在一些实施方案中，编码共同轻链的核酸和编码第一或第二重链的核酸以至少约1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1、7∶1、8∶1、9∶1或10∶1中的任一种的比率提供给宿主细胞。在一些实施方案中，编码第一重链的核酸、编码第二重链的核酸和编码共同轻链的核酸以约1∶1∶5的比率提供给宿主细胞。设想了改变核酸的比率可以增加异二聚体分子相对于同二聚体分子的产量。[0174]在一些实施方案中，提供了产生特异性结合第一靶标和第二靶标的异多聚体蛋白质的方法，所述方法包括：(a)提供包含特异性结合第一靶标的第一结合结构域和第一ch3结构域的第一多肽；以及(b)提供包含特异性结合第二靶的第二结合结构域和第二ch3结构域的第二多肽；其中：(i)第一ch3结构域包含相对于野生型ch3结构域在氨基酸位置354处利用大疏水氨基酸进行的取代，并且/或者第二ch3结构域包含相对于野生型ch3结构域在氨基酸位置347处利用带负电荷的氨基酸进行的取代；或者(ii)第一ch3结构域包含相对于野生型ch3结构域在氨基酸位置347处利用带负电荷的氨基酸进行的取代，并且/或者第二ch3结构域包含相对于野生型ch3结构域在氨基酸位置354处利用大疏水氨基酸进行的取代；并且其中氨基酸残基编号基于eu编号。在一些实施方案中，大疏水氨基酸是y、f或w。在一些实施方案中，带负电荷的氨基酸是d或e。在一些实施方案中，氨基酸位置354处的大疏水氨基酸与第二ch3结构域中的氨基酸残基形成疏水相互作用。在一些实施方案中，第二ch3结构域在氨基酸位置349(例如，y349)处包含大疏水残基。在一些实施方案中，氨基酸位置347处的带负电荷的氨基酸与第一ch3结构域中的氨基酸残基形成离子键。在一些实施方案中，第一ch3结构域在氨基酸位置360(例如，k360)处包含带正电荷的残基。在一些实施方案中，第一和第二ch3结构域是人ch3结构域。在一些实施方案中，氨基酸位置354处的取代是s354y。在一些实施方案中，氨基酸位置347处的取代是q347e。在一些实施方案中，第一ch3结构域和第二ch3结构域还包含kih残基，诸如t366y或y407t。[0175]在一些实施方案中，提供了产生特异性结合第一靶标和第二靶标的多特异性抗体的方法，所述方法包括：(a)提供第一重链，所述第一重链从n末端至c末端包含：vh1、第一ch1、第一ch2和第一ch3结构域；(b)提供第一轻链，所述第一轻链从n末端至c末端包含：vl1和cl；(c)第二重链，其从n末端至c末端包含：vh2、第二ch1、第二ch2和第二ch3结构域；以及(d)第二轻链，其从n末端至c末端包含：vl2和第二cl；其中vh1与vl1缔合形成特异性结合第一靶标的第一抗原结合位点，以及vh2与vl2缔合形成特异性结合第二靶标的第二抗原结合位点；其中：(i)第一ch3结构域包含相对于野生型ch3结构域在氨基酸位置354处利用大疏水氨基酸进行的取代，并且/或者第二ch3结构域包含相对于野生型ch3结构域在氨基酸位置347处利用带负电荷的氨基酸进行的取代；或者(ii)第一ch3结构域包含相对于野生型ch3结构域在氨基酸位置347处利用带负电荷的氨基酸进行的取代，并且/或者第二ch3结构域包含相对于野生型ch3结构域在氨基酸位置354处利用大疏水氨基酸进行的取代；并且其中氨基酸残基编号基于eu编号。在一些实施方案中，大疏水氨基酸是y、f或w。在一些实施方案中，带负电荷的氨基酸是d或e。在一些实施方案中，氨基酸位置354处的大疏水氨基酸与第二ch3结构域中的氨基酸残基形成疏水相互作用。在一些实施方案中，第二ch3结构域在氨基酸位置349(例如，y349)处包含大疏水残基。在一些实施方案中，氨基酸位置347处的带负电荷的氨基酸与第一ch3结构域中的氨基酸残基形成离子键。在一些实施方案中，第一ch3结构域在氨基酸位置360(例如，k360)处包含带正电荷的残基。在一些实施方案中，第一和第二ch3结构域是人ch3结构域。在一些实施方案中，氨基酸位置354处的取代是s354y。在一些实施方案中，氨基酸位置347处的取代是q347e。在一些实施方案中，第一ch3结构域和第二ch3结构域还包含kih残基，诸如t366y或y407t。在一些实施方案中，vl1和vl2具有相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，vl1和vl2具有不同的氨基酸序列。[0176]核酸[0177]本技术还提供了分离的核酸分子，其包含编码本文所述的异多聚体蛋白质(诸如多特异性抗体)的一条或多条多肽链的多核苷酸。[0178]寡核苷酸介导的诱变可用于制备编码第一或第二多肽的dna的取代变体。该技术是本领域所周知的，如adelman等人，dna,2:183(1983)中所描述的。简言之，通过将编码所需突变的寡核苷酸与dna模板杂交来改变第一或第二多肽dna，其中模板是含有未改变的或天然的异多聚体dna序列的质粒或噬菌体的单链形式。杂交后，使用dna聚合酶合成模板的完整第二互补链，从而并入寡核苷酸引物，并编码异多聚体dna中的选定改变。盒诱变可以如wells等人，gene34:315(1985)所述，通过用通过使互补寡核苷酸退火产生的合成突变片段替换目标dna区域来进行。pcr诱变也适用于制造第一或第二多肽dna的变体。[0179]在一些实施方案中，核酸分子包含编码异多聚体蛋白质的第一多肽或第二多肽的多核苷酸。在一些实施方案中，核酸分子包含编码异多聚体蛋白质的第一多肽的多核苷酸和编码异多聚体蛋白质的第二多肽的多核苷酸。在一些实施方案中，核酸分子包含编码多特异性抗体的重链或轻链的多核苷酸。在一些实施方案中，核酸分子包含编码多特异性抗体的重链和一条或多条轻链的多核苷酸。在一些实施方案中，第一核酸分子包含编码第一重链的第一多核苷酸，第二核酸分子包含编码第二重链的第二多核苷酸，以及第三核酸分子包含编码共同轻链的第三多核苷酸。在一些实施方案中，一种或多种核酸分子可操作地连接至启动子。在一些实施方案中，不同的核酸分子可操作地连接至不同的启动子。[0180]额外的启动子元件，例如增强子，调控转录起始的频率。通常，这些启动子位于起始位点上游30‑110bp的区域，尽管最近已显示许多启动子也包含起始位点下游的功能元件。启动子元件之间的间距通常是灵活的，因此当元件相对于彼此倒置或移动时，启动子功能得以保留。在胸苷激酶(tk)启动子中，在活性开始下降之前，启动子元件之间的间隔可以增加至相隔50bp。[0181]合适启动子的一个实例是立即早期巨细胞病毒(cmv)启动子序列。该启动子序列是强组成型启动子序列，其能够驱动与其有效连接的任何多核苷酸序列的高水平表达。合manual,coldspringharborlaboratory,newyork)以及其它病毒学和分子生物学手册中。可用作载体的病毒包括但不限于逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒和慢病毒。一般而言，合适的载体包含在至少一种生物体中起作用的复制起点、启动子序列、方便的限制性内切酶位点和一个或多个选择标记(参见，例如，wo01/96584；wo01/29058；和美国专利第6,326,193号)。[0192]通过一个或多个编码多肽的核酸表达异多聚体蛋白质可以通过将所述核酸插入合适的表达载体，使得所述核酸可操作地连接至5’和3’调控元件(包括例如启动子和3’非翻译区(utr))来实现。载体可以适合在真核宿主细胞中复制和整合。典型的克隆和表达载体包含转录和翻译终止子、起始序列和用于调控所需核酸序列表达的启动子。[0193]在一些实施方案中，选择经优化用于在cho细胞或cho衍生细胞或nso细胞中表达多肽的载体。例如，在runningdeer等人，biotechnol.prog.20:880‑889(2004)中描述了示例性的此类方法。[0194]为了评估多肽或其部分的表达，待引入细胞的表达载体也可以包含选择标记基因或报告基因或两者，以便于从寻求通过病毒载体转染或感染的细胞群中鉴定和选择表达细胞。在其它方面，选择标记可以携带在单独的dna片段上并用于共转染程序。选择标记和报告基因都可侧接适当的调控序列，以使得能够在宿主细胞中表达。有用的选择标记包括，例如，抗生素抗性基因，诸如neo等。[0195]报告基因用于鉴定潜在转染的细胞和评价调控序列的功能性。一般来说，报告基因是受体生物体或组织中不存在或不表达的基因，其编码其表达表现为一些易于检测的性质(例如，酶促活性)的多肽。在将dna引入受体细胞后的合适时间检测报告基因的表达。合适的报告基因可包括编码萤光素酶、β‑半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、分泌型碱性磷酸酶的基因或绿色荧光蛋白基因(例如，ui‑tel等人，2000febsletters479:79‑82)。合适的表达系统是公知的，并且可以使用已知技术制备或商业获得。一般来说，显示最高报告基因表达水平的具有最小5’侧翼区域的构建体被鉴定为启动子。此类启动子区域可以与报告基因连接，并用于评价剂的调节启动子驱动的转录的能力。[0196]宿主细胞[0197]本技术提供了包含本文所述的任一种异多聚体蛋白质(诸如多特异性抗体)、核酸分子或载体的分离的宿主细胞。[0198]本文所述的异多聚体蛋白质(诸如多特异性抗体)可在原核细胞(诸如细菌细胞)中或者在真核细胞(诸如真菌细胞(诸如酵母)、植物细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞)中表达。这种表达可以例如根据本领域已知的程序进行。可用于表达多肽的示例性真核细胞包括但不限于cos细胞，包括cos7细胞；293细胞，包括293‑6e细胞；cho细胞，包括cho‑s、dg44。lec13cho细胞和fut8cho细胞；per.细胞(crucell)；和nso细胞。合适的非哺乳动物宿主细胞包括原核生物(诸如大肠杆菌(e.coli)或枯草芽孢杆菌(b.subtillis))和酵母(诸如酿酒酵母(s.cerevisae)、裂殖酵母(s.pombe)；或乳酸克鲁维酵母(k.lactis))。在一些实施方案中，基于特定真核宿主细胞对抗体的重链和/或轻链进行所需翻译后修饰的能力来选择该所述特定真核宿主细胞。例如，在一些实施方案中，cho细胞产生的多肽相较于在293细胞中产生的相同多肽具有更高水平的唾液酸化。[0199]可以通过任何方法将一种或多种核酸引入所需的宿主细胞，所述方法包括但不限于磷酸钙转染、deae‑葡聚糖介导的转染、阳离子脂质介导的转染、电穿孔、转导、感染等。描述了非限制性的示例性方法描述于例如sambrook等人，molecularcloning,alaboratorymanual，第3版coldspringharborlaboratorypress(2001)中。根据任何合适的方法，核酸可以瞬时或稳定转染到所需的宿主细胞中。[0200]在一些实施方案中，在无细胞系统中产生异多聚体蛋白质。例如，在sitaraman等人，methodsmol.biol.498:229‑44(2009)；spirin,trendsbiotechnol.22:538‑45(2004)；endo等人，biotechnol.adv.21:695‑713(2003)中描述了非限制性示例性无细胞系统。[0201]纯化[0202]可使用标准技术从宿主细胞培养物中纯化异多聚体蛋白质。异多聚体蛋白质可以作为分泌蛋白从培养基中回收，尽管其也可以在没有分泌信号的情况下直接产生时从宿主细胞裂解物中回收。如果异多聚体蛋白质是膜结合的，则可以使用合适的去垢剂溶液将其从膜中释放出来。[0203]当异多聚体蛋白质除人来源的重组细胞外的重组细胞中产生时，其完全不含人来源的蛋白质或多肽。然而，有必要从重组细胞蛋白质或多肽中纯化异多聚体蛋白质，以获得就异多聚体蛋白质而言基本上同质的制剂。作为第一步骤，通常将培养基或裂解物离心以除去颗粒细胞碎片。[0204]具有抗体恒定结构域的异多聚体蛋白质可通过羟基磷灰石色谱、凝胶电泳、透析或亲和色谱方便地纯化。其它纯化技术包括但不限于色谱方法，诸如尺寸排阻、离子交换(例如，monoq)、疏水相互作用色谱、混合模式色谱(例如，反相/阴离子交换、反相/阳离子交换、亲水相互作用/阴离子交换、亲水相互作用/阳离子交换等)、硅胶色谱、肝素琼脂糖色谱、阴离子或阳离子交换树脂色谱(诸如聚天冬氨酸柱)、反相hplc、超速离心、乙醇沉淀、色谱聚焦、sds‑page和硫酸铵沉淀。合适的亲和配体包括结合抗体恒定区的配体。例如，蛋白a、蛋白g、蛋白a/g或抗体亲和柱可用于结合恒定区和纯化包含fc片段的抗体。在一些实施方案中，异多聚体蛋白质使用蛋白a珠粒纯化，随后用monoq柱纯化。[0205]iv.使用方法[0206]本文所述的异多聚体蛋白质(例如，多特异性抗体)可用于治疗和诊断。[0207]本文还提供了包含本文所述的任一种异多聚体蛋白质、核酸、载体或宿主细胞的组合物(诸如药物组合物)。在一些实施方案中，异多聚体蛋白质可以配制在包含一种或多种药学上可接受的缓冲剂或赋形剂的药物组合物中。可向有需要的个体施用此类药物组合物以治疗疾病或疾患，预防疾病或疾患，或阻止疾病或疾患的症状发展。[0208]本文所述的异多聚体蛋白质的药物组合物可通过将具有所需纯度的异多聚体蛋白质与任选的药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂以冻干制剂或水溶液的形式混合来获得(remington'spharmaceuticalsciences第16版，osol,a.编辑(1980年))。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在采用的剂量和浓度下对接受者是无毒的，并且包括缓冲剂诸如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂(包括抗坏血酸和甲硫氨酸)；防腐剂(诸如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六烃季铵；氯化苯甲烃铵、氯化苄乙氧铵；苯酚、丁醇或苄醇；诸如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯的对羟基苯甲酸烷基酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3‑戊醇；及间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)的多肽；诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白的蛋白质；诸如聚乙烯吡咯烷酮的亲水性聚合物；诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸的氨基酸；单糖、二糖及其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；诸如edta的螯合剂；诸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇的糖类；诸如钠的成盐平衡离子；金属络合物(诸如zn‑蛋白质络合物)；和/或非离子型表面活性剂诸如tweentm、pluronicstm或聚乙二醇(peg)。wo97/04801中描述了适于皮下施用的冻干制剂。此类冻干制剂可用合适的稀释剂复溶成高蛋白质浓度，并且可将复溶的制剂施用于本文中待成像、诊断或治疗的个体。用于体内施用的药物组合物必须是无菌的。这很容易通过例如通过无菌过滤膜的过滤来实现。[0209]在一些实施方案中，提供了治疗有需要的个体的疾病的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的异多聚体蛋白质，所述异多聚体蛋白质包含：(a)第一多肽，其包含特异性结合第一靶标的第一结合结构域和第一ch3结构域；和(b)第二多肽，其包含特异性结合第二靶标的第二结合结构域和第二ch3结构域；其中第一ch3结构域包含相对于野生型ch3结构域在氨基酸位置354处利用大疏水氨基酸进行的取代，并且/或者第二ch3结构域包含相对于野生型ch3结构域在氨基酸位置347处利用带负电荷的氨基酸进行的取代，并且其中氨基酸残基编号基于eu编号。在一些实施方案中，大疏水氨基酸是y、f或w。在一些实施方案中，带负电荷的氨基酸是d或e。在一些实施方案中，氨基酸位置354处的大疏水氨基酸与第二ch3结构域中的氨基酸残基形成疏水相互作用。在一些实施方案中，第二ch3结构域在氨基酸位置349(例如，y349)处包含大疏水残基。在一些实施方案中，氨基酸位置347处的带负电荷的氨基酸与第一ch3结构域中的氨基酸残基形成离子键。在一些实施方案中，第一ch3结构域在氨基酸位置360(例如，k360)处包含带正电荷的残基。在一些实施方案中，第一和第二ch3结构域是人ch3结构域。在一些实施方案中，氨基酸位置354处的取代是s354y。在一些实施方案中，氨基酸位置347处的取代是q347e。在一些实施方案中，第一ch3结构域和第二ch3结构域还包含kih残基，诸如t366y或y407t。在一些实施方案中，第一靶标是肿瘤抗原(例如，cd20、her2或bcma)，并且第二靶标是cd3，或者第一靶标是cd3，并且第二靶标是肿瘤抗原(例如，cd20、her2或bcma)。在一些实施方案中，疾病是癌症。[0210]在一些实施方案中，提供了治疗有需要的个体的疾病的方法，所述方法包括向个体施用有效量的多特异性抗体，所述多特异性抗体包含：(a)第一重链，其从n末端至c末端包含：vh1、第一ch1、第一ch2和第一ch3结构域；(b)第一轻链，其从n末端至c末端包含：vl1和cl；(c)第二重链，其从n末端至c末端包含：vh2、第二ch1、第二ch2和第二ch3结构域；和(d)第二轻链，其从n末端至c末端包含：vl2和第二cl；其中vh1与vl1缔合形成特异性结合第一靶标的第一抗原结合位点，以及vh2与vl2缔合形成特异性结合第二靶标的第二抗原结合位点；其中第一ch3结构域包含相对于野生型ch3结构域在氨基酸位置354处利用大疏水氨基酸进行的取代，并且/或者第二ch3结构域包含相对于野生型ch3结构域在氨基酸位置347处利用带负电荷的氨基酸进行的取代；并且其中氨基酸残基编号基于eu编号。在一些实施方案中，大疏水氨基酸是y、f或w。在一些实施方案中，带负电荷的氨基酸是d或e。在一些实施方案中，氨基酸位置354处的大疏水氨基酸与第二ch3结构域中的氨基酸残基形成疏水相互作用。在一些实施方案中，第二ch3结构域在氨基酸位置349(例如，y349)处包含大疏水残基。在一些实施方案中，氨基酸位置347处的带负电荷的氨基酸与第一ch3结构域中的氨基酸残基形成离子键。在一些实施方案中，第一ch3结构域在氨基酸位置360(例如，k360)处包含带正电荷的残基。在一些实施方案中，第一和第二ch3结构域是人ch3结构域。在一些实施方案中，氨基酸位置354处的取代是s354y。在一些实施方案中，氨基酸位置347处的取代是q347e。在一些实施方案中，第一ch3结构域和第二ch3结构域还包含kih残基，诸如t366y或y407t。在一些实施方案中，vl1和vl2具有相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，vl1和vl2具有不同的氨基酸序列。在一些实施方案中，第一靶标是肿瘤抗原(例如，cd20、her2或bcma)，并且第二靶标是cd3，或者第一靶标是cd3，并且第二靶标是肿瘤抗原(例如，cd20、her2或bcma)。在一些实施方案中，疾病是癌症。[0211]在一些实施方案中，异多聚体蛋白质用于诊断测定。例如，异多聚体蛋白质可用于夹心测定，所述夹心测定涉及使用两种分子，每种分子能够结合待检测的样品的不同免疫原性部分或表位。在夹心测定中，测试样品分析物被固定在固体支持物上的异多聚体蛋白质的第一臂结合，此后异多聚体蛋白质的第二臂结合分析物，从而形成不溶性三部分复合物。异多聚体的第二个臂本身可以用可检测部分标记(直接夹心测定)，或者可以使用用可检测部分标记的抗免疫球蛋白抗体测量(间接夹心测定)。例如，夹心测定的一种类型是elisa测定，在这种情况下，可检测的部分是酶。[0212]v.试剂盒和制品[0213]还提供了可用于本文所述的任一种制备、诊断和治疗方法的试剂盒，包括包含本文所述的任一种异多聚体蛋白质(例如，多特异性抗体)的试剂盒。[0214]本技术的试剂盒在合适的包装中。合适的包装包括但不限于小瓶、瓶、罐、柔性包装(例如，密封的mylar或塑料袋)等。试剂盒可以任选地提供额外的组分，诸如试剂、缓冲液和解释信息。[0215]因此，本技术还提供了制品。制品可包括容器和插在容器上或伴随容器的标签或包装。合适的容器包括小瓶(诸如密封小瓶)、瓶、罐、软包装等。在一些实施方案中，容器容纳药物组合物，并且可具有无菌入口(例如，所述容器可以是具有皮下注射针头可刺穿的塞子的静脉注射溶液袋或小瓶)。标签或包装说明书标明所述组合物用于诊断(包括确定风险)、治疗或预防个体的疾病或疾患。标签可以指示各种组分的复溶和/或使用的方向。容纳药物组合物的容器可以是多用途小瓶，其允许复溶制剂的重复施用(例如2至6次施用)。包装说明书是指通常包含在诊断和/或治疗产品的商业包装中的说明书，其包含关于此类产品的适应症、用法、剂量、施用、禁忌症和/或使用警告的信息。另外，制品还可包括第二容器，其包含药学上可接受的缓冲液，诸如抑菌注射用水(bwfi)、磷酸盐缓冲盐水、林格氏(ringer's)溶液和葡萄糖溶液。其还可包括在商业和使用者看来所需的其它材料，包括其它缓冲液、稀释剂、过滤器、针头和注射器。[0216]试剂盒或制品可包括以足以在药房，例如医院药房和配制药房储存和使用的量包装的多个单位剂量的药物组合物和使用说明。[0217]实施例[0218]下面的实施例仅仅是本发明的示例，并因此不应该被认为是以任何方式限制本发明。以下实施例和详细描述是作为说明而非限制提供的。[0219]实施例1.cd20/cd3双特异性抗体的制备、纯化和表征[0220]根据图3的流程图制备和表征双特异性cd20/cd3抗体。[0221]在第一形式(图1的s1)中，制备了两种共同轻链cd20/cd3抗体。v2cd20/cd3抗体在第一重链中具有kih残基t366y，并且在第二重链中具有y407t残基。v4bcd20/cd3抗体在第一重链中具有t336y和s354y，并且在第二重链中具有y407t和q347e。[0222]以1:1:2或1:1:5的第一重链(h1):第二重链(h2):共同轻链比将编码重链和轻链的载体瞬时转染到expi293细胞或cho细胞中。培养并诱导宿主细胞分泌双特异性抗体。将含有双特异性抗体的细胞培养物的上清液以3000rpm离心10分钟，然后用0.45μm的膜过滤上清液样品。[0223]然后使用两步色谱方案(包括第一蛋白a纯化步骤和monoq步骤)从上清液样品中纯化出双特异性抗体。在蛋白a纯化步骤中，首先用10个柱体积(cv)的缓冲液a(pbsph＝7.4)平衡akta纯化系统。将上清液加载到蛋白a纯化柱上，并用10cv的缓冲液a洗涤该柱。用缓冲液b(0.1m甘氨酸，ph＝2.5)洗脱双特异性抗体，并收集并合并峰级分。将合并的抗体样品在pbs中透析两次。[0224]在monoq步骤中，首先将抗体样品交换到缓冲液a’(20mmtris‑cl,ph＝9)中。然后用缓冲液a’平衡akta纯化系统。抗体样品被加载到monoq柱上，随后用5cv的缓冲液a’洗涤该柱。使用由缓冲液a’和缓冲液b’((20mmtris‑cl,1mnacl,ph＝9)建立的盐梯度，用0‑25％的缓冲液b’在50分钟内以0.4ml/min的流速从monoq柱上洗脱双特异性抗体。收集并合并峰级分。然后将纯化的双特异性抗体缓冲液交换到pbs中。[0225]使用t细胞活化测定证实了来自monoq柱的纯化的双特异性抗体级分。简言之，将raji(人b淋巴细胞)和jurkat(人t淋巴细胞)细胞分别以1x105个细胞/孔接种到96孔板中。将稀释的双特异性抗体样品加入平板，并在37℃、5％co2孵育箱中孵育17小时。用含有0.1％bsa的pbs以1200rpm洗涤该板一次，持续5分钟。然后将cd69‑pe加入到平板，并在室温下孵育30分钟。随后用含有0.1％bsa的pbs以1200rpm洗涤该板一次，持续5分钟。在bdcalibur读板仪上于fl2通道中从平板读取cd69 信号。[0226]三批cd20/cd3双特异性抗体的表达水平和每个纯化步骤的收率如下表3所示。作为参考，利妥昔单抗以约130mg/l从同一表达系统中表达。图4显示了来自三种cd20/cd3双特异性抗体的monoq纯化步骤的色谱图。将s354y和q349e突变引入fc将双特异性抗体的总收率从67.8％(仅kih突变)提高到86.8％(kih s354y和q349e)。如图6所示，v4b构建体的高收率和提高的异二聚体形成率在不同批次的双特异性抗体制备中是可再现的。[0227]表3.cd20/cd3双特异性抗体的表达水平和纯化收率。[0228][0229]纯化的cd20/cd3v4b双特异性抗体的表征显示了高纯度(图5b、图5d、图5e)、t细胞活化活性(图5c)、热稳定性和抗聚集性(图5f)。[0230]实施例2.her2/cd3双特异性抗体的制备、纯化和表征[0231]包含一个抗her2fab的her2/cd3双特异性抗体[0232]包含一个抗her2fab、一个抗cd3fab和一个fc结构域的her2/cd3双特异性抗体(“her2‑b3/cd3bsab”，图8)是通过用表达her2‑b3hc‑v4b‑旋钮、cd3‑hc‑v4b‑孔和共同轻链的质粒共转染expi293细胞制备的。转染后96小时，表达水平被测定为152ug/ml。收集培养上清液，并在蛋白a柱上纯化igg。然后将纯化的样品加载到阳离子交换色谱柱(cex)上。梯度洗脱后，双特异性抗体作为通过cex检测到的主峰出现(图9)。通过十二烷基硫酸钠‑聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds‑page)进一步分析纯化的级分。sds‑page结果显示主cex峰的级分纯度相对较高(图10)。[0233]包含两个抗her2fab的her2/cd3双特异性抗体[0234]制备了包含两个抗her2fab的her2/cd3双特异性抗体(“her2‑b3‑v3/cd3”)(图11)。[0235]对肿瘤细胞具有高亲和力的双特异性抗体的抗肿瘤抗原臂通常可以杀死表达正常水平的抗原的健康非肿瘤细胞。为了消除这种类型的离瘤效应(off‑tumoreffect)，开发了新形式的双特异性抗体，其中肿瘤靶向臂具有两个拷贝的fab结构域，并因此对肿瘤抗原变为二价(图11)。在这种三结构域双特异性(tdb)形式(2:1)中，肿瘤结合区对肿瘤抗原的亲和力相对较低，因此其与具有较低密度的肿瘤抗原的健康细胞的结合更弱。[0236]用表达her2(2fabs)‑ch‑v4b‑旋钮、cd3‑ch‑v4b‑孔和共同轻链dna的质粒共转染expi293细胞。收集培养基，并在转染后96小时，使用probelife测定表达水平为158ug/ml。用蛋白a柱纯化双特异性抗体her2‑b3‑v3/cd3。然后将纯化的样品加载到阳离子交换柱(cex)上进行第二次纯化。梯度洗脱后，双特异性抗体作为主峰出现(图12)。纯化的级分通过sds‑page进一步分析(图13)。非还原性sds‑page结果表明，cex纯化后仅显示一条大小约为200kd的条带，这与her2‑b3‑v3/cd3(具有两个her2fab)的大小一致。还原性sds‑page结果清楚地显示双特异性抗体的三条链，这也与其相应的大小一致。[0237]实施例3.bcma/cd3双特异性抗体的制备、纯化和表征[0238]制备bcma/cd3双特异性抗体。从美洲驼噬菌体文库中淘选出的抗bcmavhh与人fc‑v4b‑旋钮连接，形成bcma‑fc链。bcma‑fc链与cd3‑hc‑v4b‑孔及其轻链一起形成了新的igg样双特异性抗体。两种bcma/cd3igg样双特异性抗体的示意图如图14所示。在图14的左边是bcma‑3e5/cd3，仅包含一个bcma‑vhh(3e5)。在图14的右边是bcma‑3e1b2/cd3，包含两个bcma‑vhh(3e1和3b2)。[0239]为了制备bcma/cd3双特异性抗体，用表达bcma(3e5)‑fc‑v4b‑旋钮(或bcma(3e1b2)‑fc‑v4b‑旋钮)、cd3‑ch‑v4b‑孔和cd3lc的质粒共转染expi293细胞。收集培养基，并使用probelife测定bcma‑3e5/cd3的表达水平为62ug/ml，并且bcma‑3e1b2/cd3的表达水平为54ug/ml。[0240]收集培养上清液，并在蛋白a柱上纯化两种双特异性抗体。对两种bcma‑fc/cd3双特异性抗体进行sds‑page(图15)。结果表明，bcma/cd3双特异性抗体均成功表达，并有一些cd3同二聚体形成(大小约为150kd；参见图15)。在还原性sds‑page结果中，基于它们的分子量检测到cd3‑vh‑v4b‑孔、bcma‑fc和共同轻链(图15)。[0241]进行进一步的实验来纯化和表征bcma/cd3双特异性抗体。首先，优化转染中表达三条链的三种质粒的比率。三种质粒比率的优化增加了双特异性抗体异二聚体的百分比。利用优化的质粒比率，表达bcma/cd3双特异性抗体，并在蛋白a柱上以及通过cex纯化bcma/cd3双特异性抗体。通过sds‑page评估bcma/cd3双特异性抗体纯度。[0242]实施例4.具有fc突变的cd20/cd3双特异性抗体的制备、纯化和表征[0243]产生了在fc区中具有突变的cd20/cd3双特异性抗体。针对抗cd20重链的突变是表4所示。针对抗cd3重链的突变在表5所示。[0244]表4.抗cd20重链fc突变。[0245][0246]表5.抗cd3重链fc突变。[0247][0248][0249]具有fc突变的抗cd20重链和抗cd3重链的所有13种组合都与其共同轻链一起重组表达。测量上清液中抗体的浓度，所述抗体浓度如表6所示。[0250]表6.突变体组合的igg上清液浓度。[0251][0252][0253]在进一步的实验中表征具有上述fc突变组合的cd20/cd3双特异性抗体。评估cd20/cd3双特异性抗体对t细胞活化的活性。鉴定并选择t细胞活化活性与cd20/cd3野生型(a1b1)相似或比其更高的fc突变体组合。[0254]将所选择的cd20/cd3突变体组合重组表达，纯化，通过sds‑page进行分析。鉴定并选择纯度(即，异二聚体百分比)与a1b1相似或比其更高的的fc突变体组合。[0255]使用下面实施例5中描述的方法评估所选择的cd20/cd3突变体组合的热稳定性和聚集潜力。通过差示扫描荧光测定法和静态光散射来评估热稳定性。通过动态光散射(dls)评估聚集潜力。鉴定并选择热稳定性与a1b1相似或比其更好并且聚集潜力与a1b1相似或比其更低的突变体组合。[0256]实施例5.材料和方法[0257]以下实施例展现了用于生产和表征双特异性抗体的材料和方法。[0258]通过转染expi293ftm细胞重组表达双特异性抗体[0259]如下所述，使用gibcotmexpifectaminetm293转染试剂盒(目录号a14524)表达双特异性抗体。[0260]对于每30‑ml转染，在25.5mlexpi293tm表达培养基中使用7.5×107个细胞。为了在第二天转染细胞，将细胞以2.0×106个活细胞/ml的密度接种，并在37℃下在空气中8％co2的潮湿气氛中以125rpm在定轨振荡器上旋转孵育。转染当天，使用自动细胞计数器或台盼蓝染料排除法测定细胞的数量和活力。为了进行转染，细胞的存活力必须大于95％。计算含有一次转染所需细胞数(每30‑ml转染7.5×107个细胞)的细胞悬浮液的体积。向每个无菌一次性125‑mlerlenmeyer摇瓶中加入适当体积的细胞悬液，并通过为每30‑ml的转染添加新鲜、预温热的expi293tm表达培养基，使体积达到25.5ml。将细胞放回孵育箱。[0261]对于每30‑ml的转染，如下制备脂质‑dna复合物：将30μg的于opti‑memtmi还原血清培养基(目录号31985‑062)中的质粒dna稀释至1.5ml的总体积，并轻轻混合。将80μlexpifectaminetm293试剂在opti‑memtmi培养基中稀释至总体积为1.5ml，并轻轻混合并在室温下孵育5分钟。孵育5分钟后，将稀释的dna加入到稀释的expifectaminetm293试剂中，获得3ml的总体积，并轻轻混合。将dna‑expifectaminetm293试剂混合物在室温下孵育20‑30分钟，以允许dna‑expifectaminetm293试剂复合物形成。[0262]在完成dna‑expifectaminetm293试剂复合物孵育后，从上述制备的脂质‑dna复合物向每个摇瓶中加入3mldna‑expifectaminetm293试剂复合物。向阴性对照烧瓶中加入3mlopti‑memtmi培养基，而不是dna‑expifectaminetm293试剂复合物。每个烧瓶含有28.5ml的总体积。将细胞在37℃的孵育箱中在空气中8％的co2的潮湿气氛中以125rpm在定轨振荡器上旋转孵育。[0263]转染后约16‑18小时，向每个烧瓶中加入150μlexpifectaminetm293转染增强剂1和1.5mlexpifectaminetm293转染增强剂2。每个125‑ml烧瓶中的最终体积约为30ml。转染后约72‑96小时开始收获培养基，并测定其重组蛋白表达。[0264]用蛋白a柱纯化双特异性抗体[0265]为了在蛋白a柱上纯化双特异性抗体，转染后72‑96小时，将表达培养基以3000rpm离心10分钟，然后用0.45μm的膜过滤上清液。[0266]如下使用纯蛋白纯化系统。平衡纯化系统，泵b填充有缓冲液b(0.1m甘氨酸，ph＝2.5)，并且泵a和样品泵填充有缓冲液a(pbs,ph＝7.4)。然后建立蛋白质a纯化柱(来自ge的hitrap蛋白ahp柱，目录号：17040201或17040301)，并用10个柱体积(cv)的缓冲液a进行平衡。将上清液通过样品泵加载到柱中，对于1ml柱，流速为1ml/分钟，并且对于5ml柱，流速为3ml/分钟。样品加载后，用10cv的缓冲液a洗涤该柱。用100％缓冲液b洗脱抗体，并用1/10体积的1mtrisph＝8收集峰级分。将柱用5cv的缓冲液b洗涤，然后用10cv的缓冲液a洗涤。将柱在4℃下用20％乙醇填充储存，并系统用20％乙醇填充储存。[0267]将洗脱的ab的选定的峰级分合并并在pbs中透析两次。然后纯化的抗体准备进行第二纯化步骤。[0268]通过阳离子交换色谱(cex)进行的第二纯化双特异性抗体[0269]将抗体以1:10稀释(在pbs中)至缓冲液1(20mmnaxh(3‑x)po4,ph＝7.4)。平衡纯化系统，泵b填充有缓冲液2(20mmnaxh(3‑x)po4,1mnacl,ph＝7.4)，并且泵a和样品泵填充有缓冲液1。设置porostmgopuretmhs预填充柱(thermofisher，目录号：a36637)并用缓冲液1进行平衡。[0270]将稀释的抗体样品通过样品泵以1.6ml/分钟的流速加载到柱，并在样品加载后用5cv的缓冲液1洗涤。对于盐梯度洗脱，在40分钟内以1.6ml/分钟的流速使用0‑20％的缓冲液2。收集峰级分(通常为1ml/小瓶)。将柱用5cv的缓冲液2洗涤，然后用10cv的缓冲液1洗涤。将柱在4℃下用20％乙醇填充储存，并在20％乙醇中平衡系统。合并峰级分，并针对pbs透析。[0271]sds‑page测定[0272]对于非还原性sds‑page，向样品中加入4倍的加载缓冲液，以获得1倍的样品准备加载。对于还原性sds‑page，向样品中加入8％体积的β‑巯基乙醇，充分混合，在95℃加热5分钟，然后将样品准备用于加载。将样品加载到凝胶孔，旁边是蛋白质标记(proteinmarker)。将样品在200v下运行50分钟。凝胶用instantbluetm蛋白质染色溶液染色1小时，然后用水洗涤一次。[0273]热稳定性(dsf/sls)和聚集潜力(dls)测定[0274]将纯化的双特异性抗体样品提交给uncle系统(unchainedlabs)进行分析。在25℃下测量动态光散射(dls)，并使用uncle分析软件计算和分析数据。对于差示扫描荧光测定法/静态光散射(dsf/sls)测定法，在25℃至95℃的监控下进行1℃/min的温度斜坡(temperatureramp)。uncle测量了266nm和473nm处的sls。tm和tagg也使用uncle分析软件进行了计算和分析。当前第1页12当前第1页12
技术领域：
：5.本技术涉及异多聚体蛋白质，诸如双特异性抗体、组合物、制备方法和使用方法。
背景技术：
：：6.通过在杂交瘤中共表达两种不同的igg分子来产生双特异性抗体的经典方法导致多达10种可能的重链与轻链的组合。这降低了收率，并带来了纯化的挑战。为了克服这些挑战，已经开发了多种促进异二聚体形成的双特异性抗体形式。许多已知的形式采用单链可变区(scfv)模块或类似的结构，所述模块或结构依赖于经工程化的接头来迫使抗原结合组分组装成所需的构型。然而，与天然抗体相比，许多这些双特异性抗体形式忍受不利的性质，包括易于聚集、生产困难、血清半衰期短和潜在的免疫原性。7.已经开发了几种天然抗体形式(即，由两条轻链和两条重链组成的抗体)的双特异性抗体设计。例如，重链fc‑fc界面可以用相互作用的氨基酸对(诸如旋钮进入孔(knobs‑into‑holes)(kih)残基、形成二硫键的半胱氨酸或具有相反静电荷的残基)来工程化，以便当它们共表达时，积极促进来自不同重链的异二聚体形成。然而，经典的kih策略仍然导致显著的同二聚体形成和双特异性抗体的低产量。8.本文提及的所有出版物、专利、专利申请和公开的专利申请的公开内容据此通过引用以其整体并入本文。技术实现要素：9.本技术提供了异多聚体蛋白质，诸如含fc的异二聚体蛋白质、多特异性抗体和多特异性免疫粘附素、其制备方法和使用方法。10.本技术的一个方面提供了异多聚体(例如，异二聚体)蛋白质，其包含含有第一重链恒定结构域3(ch3)结构域的第一多肽和含有第二ch3结构域的第二多肽，其中第一ch3结构域包含相对于野生型ch3结构域在氨基酸位置354处利用大疏水氨基酸进行的取代，并且/或者第二ch3结构域包含相对于野生型ch3结构域在氨基酸位置347处利用带负电荷的氨基酸进行的取代，并且其中氨基酸残基编号基于eu编号。在一些实施方案中，氨基酸位置354处的大疏水氨基酸与第二ch3结构域中的氨基酸残基形成疏水相互作用。在一些实施方案中，第二ch3结构域在氨基酸位置349(例如，y349)处包含大疏水残基。在一些实施方案中，氨基酸位置347处的带负电荷的氨基酸与第一ch3结构域中的氨基酸残基形成离子键。在一些实施方案中，第一ch3结构域在氨基酸位置360(例如，k360)处包含带正电荷的残基。在一些实施方案中，第一ch3结构域和第二ch3结构域是人ch3结构域。在一些实施方案中，第一ch3结构域包含选自由以下组成的组的取代：s354y、s354f和s354w。在一些实施方案中，第一ch3结构域包含s354y。在一些实施方案中，第二ch3结构域不包含对第一ch3结构域中s354的取代的补偿性取代(例如，y349处的取代)。在一些实施方案中，第二ch3结构域包含选自由以下组成的组的取代：q347e和q347d。在一些实施方案中，第二ch3结构域包含q347e。11.在根据上述任一种异多聚体蛋白质的一些实施方案中，第一ch3结构域和第二ch3结构域还包含钮入孔(kih)残基。在一些实施方案中，钮入孔残基是t366y和y407t。在一些实施方案中，第一ch3结构域包含t366y和s354y，并且第二ch3结构域包含y407t和q347e。在一些实施方案中，第一ch3结构域包含y407t和s354y，第二ch3结构域包含t366y和q347e。并且12.在根据上述任一种异多聚体蛋白质的一些实施方案中，第一多肽和/或第二多肽包含重链恒定结构域2(ch2)。在一些实施方案中，异多聚体蛋白质包含iggfc区。在一些实施方案中，iggfc区是igg1、igg2、igg3或igg4fc区。在一些实施方案中，第一多肽是抗体重链，并且/或者第二多肽是抗体重链。在一些实施方案中，异多聚体蛋白质包含一个或多个抗体轻链。13.在根据上述任一种异多聚体蛋白质的一些实施方案中，异多聚体蛋白质是多特异性(例如，双特异性)抗体。14.在根据上述任一种异多聚体蛋白质的一些实施方案中，异多聚体蛋白质包含：(a)第一重链，其从n末端至c末端包含：第一重链可变结构域(vh1)、第一重链恒定结构域1(ch1)、第一重链恒定结构域2(ch2)和第一ch3结构域；(b)第一轻链，其从n末端至c末端包含：第一轻链可变结构域(vl1)和第一轻链恒定结构域(cl)；(c)第二重链，其从n末端至c末端包含：第二重链可变结构域(vh2)、第二ch1、第二ch2和第二ch3结构域；和(d)第二轻链，其从n末端至c末端包含：第二轻链可变结构域(vl2)和第二cl；其中vh1与vl1缔合形成特异性结合第一靶标的第一抗原结合位点，vh2与vl2结合形成特异性结合第二靶标的第二抗原结合位点。在一些实施方案中，vl1和vl2具有相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，vl1和vl2具有不同的氨基酸序列。在一些实施方案中，第一靶标和第二靶标是相同的表位。在一些实施方案中，第一靶标和第二靶标是相同抗原的不同表位。在一些实施方案中，第一靶标和第二靶标是不同的抗原。在一些实施方案中，第一抗原结合位点特异性结合肿瘤抗原，并且第二抗原结合位点特异性结合cd3，或者第一抗原结合位点特异性结合cd3，并且第二抗原结合位点特异性结合肿瘤抗原。在一些实施方案中，第一抗原结合位点特异性结合cd20，并且第二抗原结合位点特异性结合cd3，或者第一抗原结合位点特异性结合cd3，并且第二抗原结合位点特异性结合cd20。在一些实施方案中，第一抗原结合位点特异性结合her2，并且第二抗原结合位点特异性结合cd3，或者第一抗原结合位点特异性结合cd3，并且第二抗原结合位点特异性结合her2。在一些实施方案中，异多聚体蛋白质包含：(a)第一重链，其从n末端至c末端包含：第三重链可变结构域(vh3)、第三ch1、vh1、第一ch1、第一ch2和第一ch3结构域；(b)第一轻链，其从n末端至c末端包含：第三轻链可变结构域(vl2)、第三cl、vl1和第一cl；其中vh3与vl3缔合形成特异性结合第三靶标的第三抗原结合位点。在一些实施方案中，第一抗原结合位点和第三抗原结合位点特异性结合相同的抗原。在一些实施方案中，第一抗原结合位点和第三抗原结合位点特异性结合her2，并且第二抗原结合位点特异性结合cd3。15.在根据上述任一种异多聚体蛋白质的一些实施方案中，异多聚体蛋白质包含：(a)第一重链，其从n末端至c末端包含：第一vhh、第一重链恒定结构域2(ch2)和第一ch3区；(b)第二重链，其从n末端至c末端包含：第一重链可变结构域(vh1)、第二ch1、第二ch2和第二ch3结构域；和(d)轻链，其从n末端至c末端包含：第一轻链可变结构域(vl1)和第一cl；其中vh1与vl1缔合形成特异性结合第一靶标的第一抗原结合位点，和特异性结合第二靶标的第一vhh。在一些实施方案中，第一抗原结合位点特异性结合cd3，并且第一vhh特异性结合肿瘤抗原，或者第一抗原结合位点特异性结合肿瘤抗原，并且第一vhh特异性结合cd3。在一些实施方案中，第一vhh特异性结合bcma。在一些实施方案中，第一重链从n末端至c末端包含：第二vhh、第一vhh、第一ch2和第一ch3结构域，其中第二vhh特异性结合第三靶标。在一些实施方案中，第一vhh和第二vhh特异性结合相同的抗原。在一些实施方案中，第一vhh和第二vhh特异性结合bcma。16.在根据上述任何一种异多聚体蛋白质的一些实施方案中，异多聚体蛋白质是免疫粘附素或抗体‑免疫粘附素嵌合体。17.本技术的另一个方面提供了包含抗体ch3结构域的多肽，其中ch3结构域包含相对于野生型ch3结构域在氨基酸位置354处利用大疏水氨基酸进行的取代和/或相对于野生型ch3结构域在氨基酸位置347处利用带负电荷的氨基酸进行的取代，并且其中与包含野生型ch3结构域的多肽相比，该多肽形成同二聚体的能力降低。在一些实施方案中，ch3结构域是人ch3结构域。在一些实施方案中，ch3结构域包含选自由以下组成的组的取代：s354y、s354f和s354w。在一些实施方案中，ch3结构域包含s354y。在一些实施方案中，ch3结构域包含选自由以下组成的组的取代：q347e和q347d。在一些实施方案中，ch3结构域包含q347e。在一些实施方案中，ch3结构域还包含旋钮进入孔残基，诸如t366y或s407t。在一些实施方案中，多肽还包含重链恒定结构域2(ch2)。在一些实施方案中，多肽包含抗体重链。18.在一些实施方案中，提供了包含seqidno:1‑4中任一个的ch3结构域的多肽。在一些实施方案中，提供了包含seqidno:1‑4中任一个的氨基酸序列的多肽。19.在一些实施方案中，提供了包含根据上述任何一种多肽的多肽的抗体(例如，双特异性抗体)。20.本技术的另一方面提供了产生特异性结合第一靶标和第二靶标的异多聚体蛋白质的方法，所述方法包括：(a)提供包含特异性结合第一靶标的第一结合结构域和第一ch3结构域的第一多肽；以及(b)提供包含特异性结合第二靶的第二结合结构域和第二ch3结构域的第二多肽；其中：(i)第一ch3结构域包含相对于野生型ch3结构域在氨基酸位置354处利用大疏水氨基酸进行的取代，并且/或者第二ch3结构域包含相对于野生型ch3结构域在氨基酸位置347处利用带负电荷的氨基酸进行的取代；或者(ii)第一ch3结构域包含相对于野生型ch3结构域在氨基酸位置347处利用带负电荷的氨基酸进行的取代，并且/或者第二ch3结构域包含相对于野生型ch3结构域在氨基酸位置354处利用大疏水氨基酸进行的取代；并且其中氨基酸残基编号基于eu编号。在一些实施方案中，一个ch3结构域中氨基酸位置354处的大疏水氨基酸与另一个ch3结构域中的氨基酸残基形成疏水相互作用。在一些实施方案中，另一个ch3结构域在氨基酸位置349(例如，y349)处包含大疏水残基。在一些实施方案中，一个ch3结构域中氨基酸位置347处的带负电荷的氨基酸与另一个ch3结构域中的氨基酸残基形成离子键。在一些实施方案中，另一个ch3结构域在氨基酸位置360(例如，k360)处包含带正电荷的残基。在一些实施方案中，第一ch3结构域和第二ch3结构域是人ch3结构域。在一些实施方案中，第一或第二ch3结构域包含选自由以下组成的组的取代：s354y、s354f和s354w。在一些实施方案中，第一或第二ch3结构域包含s354y。在一些实施方案中，第一或第二ch3结构域包含选自由以下组成的组的取代：q347e和q347d。在一些实施方案中，第一或第二ch3结构域包含q347e。在一些实施方案中，第一ch3结构域和第二ch3结构域还包含kih残基，诸如t366y和y407t。在一些实施方案中，第一ch3结构域包含t366y和s354y，并且第二ch3结构域包含y407t和q347e。在一些实施方案中，第一ch3结构域包含y407t和s354y，第二ch3结构域包含t366y和q347e。并且21.在一些实施方案中，提供了使用上述任何一种方法制备的异多聚体蛋白质。22.本技术的一个方面提供了一种或多种核酸，所述核酸编码根据上述任何一种异多聚体蛋白质的异多聚体蛋白质或根据上述任一种多肽的多肽。在一些实施方案中，提供了包含根据上述任一种核酸的一种或多种核酸的载体。在一些实施方案中，提供了包含根据上述任一种核酸的一种或多种核酸或根据上述任一种载体的载体的宿主细胞。23.本技术的一个方面提供了用于制备多特异性(例如，双特异性)抗体或异多聚体(例如，异二聚体)蛋白质的方法，所述方法包括：(a)在允许表达一种或多种核酸或载体的条件下，培养根据上述任一种宿主细胞的宿主细胞；以及(b)从宿主细胞培养物中回收多特异性抗体或异多聚体蛋白质。24.本技术的另一方面提供了药物组合物，其包含根据上述任一种异多聚体蛋白质的异多聚体蛋白质或根据上述任一种抗体的抗体，以及药学上可接受的赋形剂。在一些实施方案中，提供了用于治疗有需要的受试者的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的根据上述任一种药物组合物的药物组合物。25.还提供了包含上述任一种异多聚体蛋白质(例如，双特异性抗体)或用于上述任一种方法的试剂盒和制品。26.附图简述27.图1显示了两种双特异性抗体构建体的示意性结构。在一些实施方案中，双特异性抗体构建体的第一重链具有工程化残基，诸如q347e，其与第二重链中的天然残基(例如，k360)形成离子键；并且第二重链具有工程化残基，诸如s354y，其与第一重链中的天然残基(例如，y349)形成疏水相互作用。左边(s1)的构建体具有共同的轻链，右边(s2)的构造有两个不同的轻链。本文所述的工程化离子键和疏水相互作用可以与常规旋钮进入孔(kih)突变相组合，以促进异二聚体的形成。28.图2a显示了抗体中两条重链的ch3‑ch3界面的晶体结构的局部视图。第一重链中的s354(即，图中根据kabat编号的s375)不与第二重链中的残基形成任何接触。29.图2b显示了在第一重链中具有s354y突变(即，图中根据kabat编号的y375)的异二聚体fc的ch3‑ch3界面的模拟晶体结构的局部视图。s354y与第二重链中的y349(即，图中根据kabat编号的y370)形成疏水相互作用。30.图2c显示了第一重链中具有q347e突变(即，图中根据kabat编号的e368)的异二聚体fc的ch3‑ch3界面的模拟晶体结构的局部视图。q347e与第二重链中的k360(即，图中根据kabat编号的k383)形成离子键。q347可以与或者可以不与k360形成非常弱的氢键。31.图3显示了用于cd20/cd3双特异性抗体的生产和质量控制的示意性工作流程。32.图4显示了在monoq纯化后，monoq柱上的cd20/cd3抗体的色谱图。v2是具有kih(即，t366y和y407t)残基的共同轻链双特异性抗体。v4b是共同轻链双特异性抗体，其kih残基与v2相同，q347e和s354y突变分别在两条重链中。33.图5a显示了在蛋白a纯化后，monoq柱上的cd20/cd3v4b双特异性抗体的色谱图。图5b显示了monoq纯化级分的sds凝胶和蛋白质浓度。图5c显示了monoq纯化级分的t细胞活化测定的结果。图5d显示了纯化的cd20/cd3v4b双特异性抗体在还原条件下的毛细管电泳十二烷基硫酸钠(ce‑sds)的结果。图5e显示了纯化的cd20/cd3v4b双特异性抗体在非还原条件下的ce‑sds的结果。图5f显示了纯化的cd20/cd3v4b双特异性抗体的差示扫描荧光测定法(dsf)和静态光散射法(sls)的结果。34.图6显示了蛋白a纯化后monoq柱上的四批cd20/cd3v4b双特异性抗体的色谱图。35.图7显示了来自不同物种的igg恒定区序列的序列比对:人igg1(seqidno:5)、人igg2(seqidno:6)、人igg3(seqidno:7)、人igg4(seqidno:8)、鼠igg1(seqidno:9)、鼠igg2a(seqidno:10)、鼠igg3(seqidno:11)、大鼠igg1(seqidno:12)、大鼠igg2a(seqidno:13)、大鼠igg(seqidno:14)、牛igg1(seqidno:15)、牛igg2(seqidno:16)、猫igg(seqidno:17)和犬igg(seqidno:18)。氨基酸残基347、349、354和360在多个物种的igg分子中高度保守。36.图8显示了包含一个抗her2fab、一个抗cd3fab和一个fc结构域的her2‑b3/cd3双特异性抗体的示意图。37.图9显示了通过阳离子交换色谱(cex)进行的her2‑b3/cd3双特异性抗体的纯化。保留时间以分钟为单位显示于x轴上，相对蛋白质丰度以毫吸光度单位(mau)显示于y轴上。标记单个峰级分(即，a1‑a15和b15‑b6)。38.图10显示了通过cex纯化的her2‑b3/cd3双特异性抗体的级分的十二烷基硫酸钠‑聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds‑page)，如图9所示的。泳道1‑8显示标记为a1‑a8的主峰的级分，泳道9和10显示标记为a14和b7的小峰的第2和第3级分，泳道11显示蛋白a纯化后的her2‑b3/cd3双特异性抗体。泳道m显示了蛋白质标记的阶梯，蛋白质标记的千道尔顿(kd)质量显示在右边。39.图11显示了her2‑b3‑v3/cd3双特异性抗体的示意图，所述her2‑b3‑v3/cd3双特异性抗体包含两个抗her2fab、一个抗cd3fab和一个fc结构域。40.图12显示了her2‑b3‑v3/cd3双特异性抗体的cex纯化。样品预先在蛋白a柱上纯化。保留时间以分钟为单位显示于x轴上，相对蛋白质丰度以毫吸光度单位(mau)显示于y轴上。标记单个峰级分。41.图13显示了cex纯化后的her2‑b3‑v3/cd3双特异性抗体级分的sds‑page。泳道1显示了上清液中表达的her2‑b3‑v3/cd3。泳道2‑6显示了纯化的级分a3‑a7(非还原的)(参见图12)。泳道7‑11显示了纯化的级分a3‑a7(还原的)(参见图12)。泳道m显示了蛋白质标记的阶梯，并且蛋白质标记的千道尔顿(kd)质量显示在左边。组装的her2/cd3双特异性抗体(“her2/cd3bsab”)的位置，以及单个组分(即，具有两个fab“her2(2fab)hc”的抗her2重链、抗cd3重链“cd3hc”和轻链“共同lc”)显示于右侧。42.图14显示了bcma‑fc/cd3双特异性抗体的示意图。左边是bcma‑3e5/cd3，其由一个bcma‑3e5vhh结构域、一个cd3fab和一个fc结构域组成。右边一个是bcma‑3e1b2/cd3，其包含两个bcmavhh结构域(3e1和3b2)、一个cd3fab和一个fc结构域。43.图15显示了蛋白a纯化的bcma‑3e1b2/cd3和bcma‑3e5/cd3的sds‑page。泳道1显示非还原的bcma‑3e1b2/cd3，泳道2显示非还原的bcma‑3e5/cd3，泳道3显示还原的bcma‑3e1b2/cd3，并且泳道4显示还原的bcma‑3e5/cd3。泳道m显示了蛋白质标记的阶梯，并且蛋白质标记的千道尔顿(kd)质量显示在左边。bcma‑fc/cd3双特异性抗体组分的位置显示在右侧。44.图16显示了在fc区中具有工程化离子键和疏水相互作用的多特异性抗体构建体的示意性结构。双特异性抗体形式显示在顶行，并且三特异性和四特异性抗体形式显示在底行。如上所述，椭圆形结构获自美洲驼vhh文库。具体实施方式45.本技术提供了异多聚体(例如，异二聚体)蛋白质，其包含具有新型工程化离子键和/或疏水相互作用的抗体重链恒定结构域3(ch3)结构域，所述抗体重链恒定结构域3可与旋钮进入孔(kih)残基组合，促进异二聚体的形成。还提供了制备和使用异多聚体蛋白质的方法。当两种不同的含ch3的多肽共表达时，本文所述的制备方法可用于增强异二聚体的形成和阻碍同二聚体的形成。本文所述的基于ch3的异多聚体蛋白质策略适用于所有含fc的异多聚体蛋白质，诸如双特异性抗体和双特异性免疫粘附素。46.因此，本技术的一个方面提供了一种异多聚体蛋白质，其包含含有第一ch3结构域的第一多肽和含有第二ch3结构域的第二多肽，其中第一ch3结构域包含相对于野生型ch3结构域在氨基酸位置354处利用大疏水氨基酸进行的取代(例如，s354y)的取代，并且/或者第二ch3结构域包含相对于野生型ch3结构域在氨基酸位置347处利用带负电荷的氨基酸进行的取代(例如，q347e)，并且其中氨基酸残基编号基于eu编号。47.还提供了组合物(诸如药物组合物)、制备方法、治疗方法、试剂盒和制品。48.i.定义49.如本文中所用，“异多聚体”或“异多聚体蛋白质”是包含至少第一多肽和第二多肽的分子，其中第二多肽在氨基酸序列上与第一多肽相异在于至少一个氨基酸残基。在一些实施方案中，异多聚体对至少两种不同的配体或结合位点具有结合特异性。异多聚体可包含由第一多肽和第二多肽形成的“异二聚体”，或者可形成其中存在除了第一多肽和第二多肽之外的多肽的更高阶的三级结构(higherordertertiarystructure)。50.如本文中所用，“结合结构域”包括多肽的任何区域，其负责特异性结合目标分子(例如，抗原、配体、受体、底物或抑制剂)。示例性结合结构域包括抗体可变结构域、受体结合结构域、配体结合结构域和酶促结构域。51.如本文中所用，术语“特异性结合”、“特异性识别”或“特异于”是指可测量和可再现的相互作用，诸如靶标与抗体之间的结合，其决定了在包括生物分子在内的异质分子群体存在的情况下靶标的存在。例如，特异性识别靶标(其可以是表位)的抗体是以比其与其它靶标的结合更大的亲和力、亲合力、更容易和/或更长的持续时间结合该靶的抗体。在一些实施方案中，特异性识别抗原的抗体与抗原的一个或多个抗原决定簇反应，其中结合亲和力至少是其与其它靶标的结合亲和力的约10倍。52.本文中的术语“抗体”以最广义使用，并且包括全长抗体及其抗原结合片段。术语“抗体”包括单克隆抗体(包括全长4链抗体或具有免疫球蛋白fc区的仅有全长重链的抗体)、具有多表位特异性的抗体组合物、多特异性抗体(例如，双特异性抗体、双抗体和单链分子)以及抗体片段(例如，fab、f(ab’)2和fv)。本文设想的抗体包括单结构域抗体，诸如仅有重链的抗体。53.全长四链抗体包含两条重链和两条轻链。轻链和重链的可变区负责抗原结合。两条链中的可变区通常包含三个称为互补决定区(cdr)(轻链(lc)cdr，包括lc‑cdr1、lc‑cdr2和lc‑cdr3，重链(hc)cdr，包括hc‑cdr1、hc‑cdr2和hc‑cdr3)的高度可变的环。本文公开的抗体和抗原结合片段的cdr边界可以由kabat、chothia或al‑lazikani惯例(al‑lazikani1997；chothia1985；chothia1987；chothia1989；kabat1987；kabat1991)定义或鉴定。重链或轻链的三个cdr被间插在称为框架区(fr)的侧翼区段之间，所述框架区比cdr更高度保守，并形成支持高变环的支架。重链和轻链的恒定区不参与抗原结合，但表现出各种效应子功能。抗体根据其重链恒定区的氨基酸序列分类。抗体的五个主要类别或同种型是iga、igd、ige、igg和igm，其特征分别在于存在α、δ、ε、γ和μ重链。几个主要抗体类别被分为亚类，诸如igg1(γ1重链)、igg2(γ2重链)、igg3(γ3重链)、igg4(γ4重链)、iga1(α1重链)或iga2(α2重链)。54.抗体的“可变区”或“可变结构域”是指抗体重链或轻链的氨基末端结构域。重链和轻链的可变结构域可分别称为“vh”和“vl”。这些结构域通常是抗体的变化最大的部分(相对于同类的其它抗体)，并且包含抗原结合位点。来自骆驼科动物物种的仅有重链的抗体具有单个重链可变区，其被称为“vhh”。因此，vhh是一种特殊类型的vh。55.术语“仅有重链的抗体”或“hcab”是指功能性抗体，其包含重链，但缺少通常在4链抗体中发现的轻链。已知骆驼科动物(诸如骆驼、美洲驼或羊驼)会产生hcab。56.术语“单结构域抗体”或“sdab”是指具有三个互补决定区(cdr)的单一抗原结合多肽。单独的sdab能够与抗原结合，而不与相应的含cdr的多肽配对。在一些情况下，单结构域抗体是从骆驼hcab工程化而来的，并且它们的重链可变结构域在本文中被称为“vhh”(重链抗体的重链的可变结构域)。骆驼sdab是最小的已知抗原结合抗体片段之一(参见，例如，hamers‑casterman等人,nature363:446‑8(1993)；greenberg等人，nature374:168‑73(1995)；hassanzadeh‑ghassabeh等人，nanomedicine(lond),8:1013‑26(2013))。基本vhh从n末端至c末端具有以下结构：fr1‑cdr1‑fr2‑cdr2‑fr3‑cdr3‑fr4，其中fr1至fr4分别指框架区1至4，并且其中cdr1至cdr3是指互补决定区1至3。57.如本文中所用，术语“抗原结合片段”是指抗体片段，其包括例如双抗体、fab、fab’、f(ab’)2、fv片段、二硫化物稳定的fv片段(dsfv)、(dsfv)2、双特异性dsfv(dsfv‑dsfv’)、二硫化物稳定的双抗体(ds双抗体)、单链fv(scfv)、scfv二聚体(二价双抗体)；单结构域抗体(诸如vhh)，和由包含一个或多个cdr的抗体部分形成的多特异性抗体，或结合抗原但不包含完整抗体结构的任何其它抗体片段。抗原结合片段能够与亲本抗体或亲本抗体片段(例如，亲本scfv)所结合的相同抗原结合。在一些实施方案中，抗原结合片段可包含被移植到来自一个或多个不同的人抗体的框架区的来自特定人抗体的一个或多个cdr。抗体的木瓜蛋白酶消化产生了两个相同的抗原结合片段(称为“fab”片段)和残留的“fc”片段(名称反映了容易结晶的能力)。fab片段由完整的l链和h链的可变结构域(vh)以及一条重链的第一个恒定结构域(ch1)组成。就抗原结合而言，每个fab片段都是单价的，即，其只有单个抗原结合位点。抗体的胃蛋白酶处理产生单个大的f(ab′)2片段，其大致对应于两个具有不同抗原结合活性的二硫化物连接的fab片段，并且仍然能够交联抗原。fab’片段与fab片段相异在于在ch1结构域的羧基末端有一些额外的残基，包括一个或多个来自抗体铰链区的半胱氨酸。fab′‑sh在本文中是fab′的名称，其中恒定结构域的一个或多个半胱氨酸残基具有游离硫醇基。f(ab’)2抗体片段最初是以成对的fab’片段产生的，所述成对的fab’片段在其之间具有铰链半胱氨酸。抗体片段的其它化学偶联也是已知的。58.术语“恒定结构域”是指免疫球蛋白分子的相对于所述免疫球蛋白的另一部分(可变结构域)(其包含抗原结合位点)具有更保守的氨基酸序列的部分。恒定结构域包含重链的ch1、ch2和ch3结构域(统称为ch)和轻链的chl(或cl)结构域。59.来自任何哺乳动物物种的抗体(免疫球蛋白)的“轻链”可以根据它们的恒定结构域的氨基酸序列被分配至两种明显不同的类型(称为卡帕(“κ”)和兰姆达(“λ”))之一。[0060]“fv”是最小的抗体片段，其包含完整的抗原识别和结合位点。该片段由紧密非共价缔合的一个重链可变区结构域和一个轻链可变区结构域的二聚体组成。从这两个结构域的折叠产生了六个高变环(h链和l链各有3个环)，它们为抗原结合提供了氨基酸残基，并赋予抗体抗原结合特异性。然而，即便是单一可变结构域(或是仅包含对抗原具有特异性的三个cdr的fv的一半)也具有识别并结合抗原的能力，尽管其亲合力低于完整的结合位点。[0061]“单链fv”，也缩写为“sfv”或“scfv”，是包含连接成单个多肽链的vh和vl抗体结构域的抗体片段。优选地，scfv多肽还包含在vh结构域与vl结构域之间的多肽接头，这使得scfv能够形成抗原结合所需的结构。关于scfv的综述，参见pluckthuninthepharmacologyofmonoclonalantibodies，第113卷，rosenburg和moore编辑，springer‑verlag,newyork，第269‑315页(1994)。[0062]术语“双抗体”是指通过构建在vh结构域与vl结构域之间具有短接头(约5‑10个残基)的sfv片段(见前段)制备的小抗体片段，所述短接头使得实现v结构域的链间配对而不是链内配对，从而产生二价片段，即，具有两个抗原结合位点的片段。双特异性双抗体是两个“交叉”sfv片段的异二聚体，其中两种抗体的vh结构域和vl结构域存在于不同的多肽链上。例如，在ep404,097、wo93/11161、hollinger等人，proc.natl.acad.sci.usa90:6444‑6448(1993)中更详细地描述了双抗体。[0063]术语“特异性”是指抗原结合蛋白对抗原的特定表位的选择性识别。例如，天然抗体是单特异性的。如本文中所用，术语“多特异性”表示抗原结合蛋白具有多表位特异性(即，具有两个、三个或更多个抗原结合位点能够特异性结合一个生物分子上的两个、三个或更多个不同表位，或者能够特异性结合两个、三个或更多个不同生物分子上的表位)。如本文中所用，“双特异性”表示抗原结合蛋白具有两种不同的抗原结合特异性。除非另有说明，否则由列出的双特异性抗体结合的抗原的顺序是任意的。[0064]术语“嵌合抗体”是指这样的抗体以及此类抗体的片段，在所述抗体中重链和/或轻链的一部分与源于特定物种或属于特定抗体类或亚类的抗体中的相应序列等同或同源，immunol.22:161‑206(1985)。[0073]“ch3结构域”(也称为“c2”或“h3”结构域)包含fc区中残基c末端至ch2结构域的延伸(即从抗体序列的大约氨基酸残基341至c末端(通常在igg的氨基酸残基446或447处))。[0074]术语“旋钮进入孔”或“kih”是指ch3结构域中的一对工程化氨基酸残基，所述工程化氨基酸残基导致第一ch3结构域的接触表面的空间修饰，所述第一ch3结构域通过互补的空间修饰优先附着至第二ch3结构域的相应接触表面。此类空间修饰主要源自不同的氨基酸残基和侧链，例如，以产生“旋钮”或“孔”结构，它们互补形成“旋钮进入孔”二聚体。参见，例如，参见，例如，ridgway,j.b.,l.g.presta等人(1996).“‘knobs‑into‑holes’engineeringofantibodych3domainsforheavychainheterodimerization.”proteineng9(7):617‑21；atwell,s.,j.b.ridgway等人(1997).“stableheterodimersfromremodelingthedomaininterfaceofahomodimerusingaphagedisplaylibrary.”jmolbiol270(1):26‑35；merchant,a.m.,z.zhu等人(1998).“anefficientroutetohumanbispecificigg.”natbiotechnol16(7):677‑81；carter,p.(2001).“bispecifichumaniggbydesign.”jimmunolmethods248(1‑2):7‑15；以及美国专利第5,731,168号和第7,183,076号，所述文献通过引用并入本文。[0075]“分离的”异多聚体是指已经从其天然细胞培养环境的组分中鉴定以及分离和/或回收的异多聚体。其天然环境中的污染组分是会干扰异多聚体的诊断或治疗用途的物质，可包括酶、激素和其它蛋白质性质或非蛋白质性质的溶质。本发明的异多聚体通常被纯化至基本上同质。短语“基本上同质的”、“基本上同质的形式”和“基本同质性”用于表示产物基本上不含源自不需要的多肽组合(例如，同源多聚体)的副产物。就纯度而言，基本同质性意味着副产物的量不超过约10％、5％、1％、0.5％或更少，其中百分比以重量计。[0076]如本文中所用，术语“分离的核酸”旨在指基因组、cdna或合成来源的核酸或其某种组合，由于其来源，“分离的核酸”(1)不与其中天然地存在“分离的核酸”的多核苷酸的全部或一部分相结合，(2)与天然不与其连接的多核苷酸可操作地连接，或者(3)不会天然地作为更大序列的一部分存在。[0077]除非另有说明，否则“编码氨基酸序列的核苷酸序列”包括为彼此的简并形式且编码同一氨基酸序列的所有核苷酸序列。短语编码蛋白质或rna的核苷酸序列也可包括内含子至编码蛋白质的核苷酸序列在一些形式中可以包含一个或多个内含子的程度。[0078]术语“可操作地连接的”是指调控序列与异源核酸序列之间的导致后者表达的功能性键联。例如，当第一核酸序列与第二核酸序列处于功能关系时，第一核酸序列与第二核酸序列可操作地连接。例如，如果启动子影响编码序列的转录或表达，则启动子与编码序列可操作地连接。一般来说，可操作地连接的dna序列是连续的，并且在必要时在同一阅读框中连接两个蛋白质编码区。[0079]如本文中所用，“治疗(treatment)”或“治疗(treating)”是获得有益或期望的结果(包括临床结果)的方法。出于本发明的目的，有益的或期望的临床结果包括但不限于以下的一项或多项：减轻由疾病引起的一种或多种症状、降低疾病的程度、稳定疾病(例如，防止或延迟疾病的恶化)、防止或延迟疾病的传播、防止或延迟疾病的复发、延迟或减缓疾病的进展、改善疾病状态、提供疾病的缓解(部分或完全)、减少治疗疾病所需的一种或多种其它药物的剂量、延缓疾病的进展、提高或改善生活质量、体重增加和/或延长生存期。本发明的方法设想了治疗的这些方面中的任一个或多个方面。[0080]本文公开的抗体或组合物的“有效量”是足以实现明确说明的目的的量。“有效量”可以通过经验和与所述目的相关的已知方法来确定。[0081]如本文中所用，“药学上可接受的”或“药理学上相容的”是指在生物学上或其它方面不是不希望的材料，例如，所述材料可被掺入到向患者施用的药物组合物中，而不会引起任何明显的不希望的生物效应或者以有害的方式与包含其的组合物的任何另外的组分相互作用。药学上可接受的载体或赋形剂优选满足毒理学和生产测试的所要求的标准并且/或者包含在美国食品和药物管理局编制的非活性成分指南中。[0082]应当理解，本文所述的本发明的实施方案包括“由实施方案组成”和/或“基本上由实施方案组成”。[0083]本文中提及的“约”某一值或参数包括(并描述)针对该值或参数本身的变化。例如，提及“约x”的描述包括对“x”的描述。[0084]如本文中所用，提及“非”某一值或参数通常是指并描述“除某一值或参数外”。[0085]如本文和所附权利要求中所用，除非上下文另有明确规定，否则单数形式“一个/种(a)”、“一个/种(an)”和“该(the)”包括复数指代物。[0086]ii.异多聚体蛋白质[0087]本技术提供了异多聚体蛋白质，诸如异二聚体蛋白质，其包含含有第一抗体重链恒定结构域3(ch3)结构域的第一多肽和含有第二ch3结构域的第二多肽，其中第一ch3结构域和第二ch3结构域包含工程化疏水相互作用和静电相互作用。在一些实施方案中，第一ch3结构域和第二ch3结构域还包含旋钮进入孔(“kih”)残基。异多聚体蛋白质的示例性结构包括异二聚体(例如，双特异性免疫粘附素)、异三聚体(例如，抗体‑免疫粘附素嵌合体)、异四聚体(例如，双特异性抗体)和其它寡聚体结构。在一些实施方案中，异多聚体蛋白质是双特异性抗体，诸如共同轻链抗体或具有两个不同轻链的抗体。例如，参见，图1)。[0088]在一些实施方案中，提供了异多聚体蛋白质(例如，异二聚体蛋白质)，其包含含有第一ch3结构域的第一多肽和包含第二ch3结构域的第二多肽，其中第一ch3结构域包含与第二ch3结构域的天然氨基酸残基形成疏水相互作用的工程化氨基酸残基，并且第二ch3结构域包含与第一ch3结构域中的天然氨基酸残基形成离子键的工程化氨基酸残基。在一些实施方案中，提供了异多聚体蛋白质(例如，异二聚体蛋白质)，其包含含有第一ch3结构域的第一多肽和含有第二ch3结构域的第二多肽，其中第一ch3结构域包含与第二ch3结构域的第一天然氨基酸残基形成疏水相互作用的第一工程化氨基酸残基，以及与第二ch3结构域中的第二天然氨基酸残基形成离子键的第二工程化氨基酸残基。在一些实施方案中，第一ch3结构域和第二ch3结构域还包含kih残基。[0089]在一些实施方案中，提供了异多聚体蛋白质(例如，异二聚体蛋白质)，其包含含有第一ch3结构域的第一多肽和含有第二ch3结构域的第二多肽，其中第一ch3结构域包含相对于野生型ch3结构域在氨基酸位置354处利用大疏水氨基酸进行的取代，并且/或者第二ch3结构域包含相对于野生型ch3结构域在氨基酸位置347处利用带负电荷的氨基酸进行的取代，并且其中氨基酸残基编号基于eu编号。在一些实施方案中，提供了异多聚体蛋白质(例如，异二聚体蛋白质)，其包含含有第一ch3结构域的第一多肽和含有第二ch3结构域的第二多肽，其中第一ch3结构域包含相对于野生型ch3结构域在氨基酸位置354处利用大疏水氨基酸进行的取代，和/或相对于野生型ch3结构域在氨基酸位置347处利用带负电荷的氨基酸进行的的取代，并且其中氨基酸残基编号基于eu编号。在一些实施方案中，大疏水氨基酸是酪氨酸(y)、苯丙氨酸(f)或色氨酸(w)。在一些实施方案中，带负电荷的氨基酸是天冬氨酸(d)或谷氨酸(e)。在一些实施方案中，一个ch3结构域中氨基酸位置354处的大疏水氨基酸与另一个ch3结构域中的氨基酸残基形成疏水相互作用。在一些实施方案中，另一个ch3结构域在氨基酸位置349(例如，y349)处包含大疏水残基。在一些实施方案中，一个ch3结构域中氨基酸位置347处的带负电荷的氨基酸与另一个ch3结构域中的氨基酸残基形成离子键。在一些实施方案中，另一个ch3结构域在氨基酸位置360(例如，k360)处包含带正电荷的残基。在一些实施方案中，第一ch3结构域和第二ch3结构域还包含kih残基，诸如t366y和y407t。在一些实施方案中，第一和第二ch3结构域是人ch3结构域、鼠ch3结构域、大鼠ch3结构域、骆驼ch3结构域或兔ch3结构域。图7显示了来自不同物种的igg分子的fc区序列的序列比对。[0090]在一些实施方案中，提供了异多聚体蛋白质(例如，异二聚体蛋白质)，其包含含有第一ch3结构域的第一多肽和含有第二ch3结构域的第二多肽，其中第一ch3结构域包含大疏水氨基酸对s354的取代，并且/或者第二ch3结构域包含带负电荷的氨基酸对q347的取代，并且其中氨基酸残基编号基于eu编号。在一些实施方案中，提供了异多聚体蛋白质(例如，异二聚体蛋白质)，其包含含有第一ch3结构域的第一多肽和含有第二ch3结构域的第二多肽，其中第一ch3结构域包含大疏水氨基酸对s354的取代，和/或带负电荷的氨基酸对q347的取代，并且其中氨基酸残基编号基于eu编号。在一些实施方案中，大疏水氨基酸是y、f或w。在一些实施方案中，带负电荷的氨基酸是d或e。在一些实施方案中，一个ch3结构域中的氨基酸位置354处的大疏水氨基酸与另一个ch3结构域中的氨基酸残基形成疏水相互作用。在一些实施方案中，另一个ch3结构域在氨基酸位置349(例如，y349)处包含大疏水残基。在一些实施方案中，一个ch3结构域中氨基酸位置347处的带负电荷的氨基酸与另一个ch3结构域中的氨基酸残基形成离子键。在一些实施方案中，另一个ch3结构域在氨基酸位置360(例如，k360)处包含带正电荷的残基。在一些实施方案中，ch3结构域是人ch3结构域。在一些实施方案中，第一ch3结构域和第二ch3结构域还包含kih残基，诸如t366y和y407t。[0091]在一些实施方案中，提供了异多聚体蛋白质(例如，异二聚体蛋白质)，其包含含有第一人ch3结构域的第一多肽和含有第二人ch3结构域的第二多肽，其中第一ch3结构域包含s354y，第二ch3结构域包含q347e，并且其中氨基酸残基编号基于eu编号。在一些实施方案中，第一ch3结构域中的s354y与第二ch3结构域中的氨基酸残基形成疏水相互作用。在一些实施方案中，第二ch3结构域在氨基酸位置349(例如，y349)处包含大疏水残基。在一些实施方案中，第二ch3结构域中的q347e与第一ch3结构域中的氨基酸残基形成离子键。在一些实施方案中，第一ch3结构域在氨基酸位置360(例如，k360)处包含带正电荷的残基。在一些实施方案中，第一ch3结构域和第二ch3结构域还包含kih残基。在一些实施方案中，第二ch3结构域不包含y349的取代，例如y349s。[0092]本文所述的ch3结构域中相对于野生型ch3结构域在氨基酸位置354和347处的取代可以与ch3结构域中任何已知的突变和/或工程化残基(包括旋钮进入孔(“kih”)突变)组合，这可以促进异二聚体的形成。可使用与氨基酸位置354和347处的取代相容的任何kih残基，包括例如t366y和y407t。在一些实施方案中，异多聚体蛋白质不包含ch3结构域中的kih残基。在一些实施方案中，异多聚体蛋白质包含促进异二聚体形成的额外的非kih突变，诸如形成二硫键的半胱氨酸残基，和/或形成静电相互作用的工程化残基。参见，例如美国专利第8,592,562号。[0093]在一些实施方案中，提供了异多聚体蛋白质(例如，异二聚体蛋白质)，其包含含有第一人ch3结构域的第一多肽和含有第二人ch3结构域的第二多肽，其中第一ch3结构域包含s354y和t366y，第二ch3结构域包含q347e和y407t，并且其中氨基酸残基编号基于eu编号。在一些实施方案中，第一ch3结构域中的s354y与第二ch3结构域中的氨基酸残基形成疏水相互作用。在一些实施方案中，第二ch3结构域在氨基酸位置349(例如，y349)处包含大疏水残基。在一些实施方案中，第二ch3结构域中的q347e与第一ch3结构域中的氨基酸残基形成离子键。在一些实施方案中，第一ch3结构域在氨基酸位置360(例如，k360)处包含带正电荷的残基。在一些实施方案中，第二ch3结构域不包含y349的取代，例如y349s。在一些实施方案中，与野生型人ch3结构域相比，第一ch3和第二ch3不包含其它突变。[0094]在一些实施方案中，提供了异多聚体蛋白质(例如，异二聚体蛋白质)，其包含含有第一人ch3结构域的第一多肽和含有第二人ch3结构域的第二多肽，其中第一ch3结构域包含s354y和y407t，第二ch3结构域包含q347e和t366y，并且其中氨基酸残基编号基于eu编号。在一些实施方案中，第一ch3结构域中的s354y与第二ch3结构域中的氨基酸残基形成疏水相互作用。在一些实施方案中，第二ch3结构域在氨基酸位置349(例如，y349)处包含大疏水残基。在一些实施方案中，第二ch3结构域中的q347e与第一ch3结构域中的氨基酸残基形成离子键。在一些实施方案中，第一ch3结构域在氨基酸位置360(例如，k360)处包含带正电荷的残基。在一些实施方案中，第二ch3结构域不包含y349的取代，例如y349s。在一些实施方案中，与野生型人ch3结构域相比，第一ch3和第二ch3不包含其它突变。[0095]第一多肽是与第二多肽缔合的任何多肽。第一多肽和第二多肽在包括ch3‑ch3界面的界面处相互作用。在一些实施方案中，第一多肽和第二多肽中的每一种可包含一个或多个额外的结构域，诸如结合结构域(例如，抗体可变结构域、受体结合结构域、配体结合结构域或酶促结构域)和抗体恒定结构域(或其部分)，包括ch2、ch1、铰链和cl结构域。示例性第一多肽和第二多肽包括抗体重链多肽、将抗体恒定结构域与异源多肽的结合结构域组合的嵌合体(即，免疫粘附素，诸如受体‑fc融合多肽、配体‑fc融合多肽)，以及抗体可变结构域多肽(例如，双抗体、双特异性大体(maxibody)或双特异性肽体(peptibody))。[0096]在一些实施方案中，第一多肽和/或第二多肽包含ch2结构域。在一些实施方案中，第一多肽和/或第二多肽包含ch1结构域和ch2结构域。在一些实施方案中，第一多肽和第二多肽各自包含igg诸如人igg的fc区。在一些实施方案中，第一多肽和第二多肽各自包含igg1、igg2、igg3或igg4的fc区。igg分子的野生型fc区的示例性序列如图7所示。示例性突变fc序列如表1所示。本领域技术人员对对应于igg分子的各种结构域的确切氨基酸的理解可能不同。因此，本文概述的结构域的n末端或c末端可以延长或缩短1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或甚至10个氨基酸。此外，请注意，有多种已知的编号方案来指定igg中的氨基酸位置，这可能不同于本专利申请中使用的eu编号方案。在一些实施方案中，fc区来自iga、igd、ige或igm重链的恒定区。[0097]在一些实施方案中，提供了包含第一多肽和第二多肽的异多聚体蛋白质(例如，异二聚体蛋白质)，所述第一多肽包含seqidno:1的ch3结构域(例如，氨基酸116‑217)，所述第二多肽包含seqidno:2的ch3结构域(例如，氨基酸116‑217)。在一些实施方案中，提供了包含第一多肽和第二多肽的异多聚体蛋白质(例如，异二聚体蛋白质)，所述第一多肽包含seqidno:3的ch3结构域(例如，氨基酸116‑217)，所述第二多肽包含seqidno:4的ch3结构域(例如，氨基酸116‑217)。在一些实施方案中，提供了包含第一多肽和第二多肽的异多聚体蛋白质(例如，异二聚体蛋白质)，所述第一多肽包含seqidno:1的氨基酸序列，所述第二多肽包含seqidno:2的氨基酸序列。在一些实施方案中，提供了包含第一多肽和第二多肽的异多聚体蛋白质(例如，异二聚体蛋白质)，所述第一多肽包含seqidno:3的氨基酸序列，所述第二多肽包含seqidno:4的氨基酸序列。[0098]表1.示例性iggfc序列。[0099][0100][0101]本发明的示例性实施方案包括但不限于抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)、单特异性多价抗体、双特异性大体(即，scfv‑fc融合蛋白)、单体(即，fab‑fc)、肽体(即，与异二聚体fc分子的一个臂融合的一个肽，包括单价、二价、单特异性和双特异性肽体)、免疫粘附素、抗体‑免疫粘附素嵌合体、受体‑fc融合蛋白以及配体‑fc融合蛋白。[0102]在一些实施方案中，异多聚体蛋白质是抗体，诸如多特异性(例如，双特异性)抗体。在一些实施方案中，异多聚体蛋白质包含一个或多个抗体轻链。在一些实施方案中，异多聚体蛋白质是共同轻链抗体，即，包含两条相同轻链的双特异性抗体。在一些实施方案中，异多聚体蛋白质共是同可变轻链抗体，即，包含具有相同轻链可变区的两条轻链的双特异性抗体。在一些实施方案中，异多聚体蛋白质包含具有相同轻链可变区的轻链。在一些实施方案中，异多聚体蛋白质包含轻链，所述轻链包含源自相同亲本抗体的轻链可变区。在一些实施方案中，异多聚体蛋白质包含两条不同的轻链。在一些实施方案中，异多聚体蛋白质包含源自两种不同抗体的轻链。在一些实施方案中，异多聚体蛋白质包含λ轻链。在一些实施方案中，异多聚体蛋白质包含κ轻链。在一些实施方案中，异多聚体蛋白质包含λ轻链和κ轻链。共同轻链抗体，包括共同可变轻链抗体，是本领域已知的。参见，例如美国专利第8642745b2号和美国专利申请公布第2016/0319036a1号，所述美国专利和美国专利申请公布通过引用并入本文。任何已知的共同可变轻链策略可以与本文所述的基于ch3的异二聚化策略组合使用，以提供多特异性抗体。[0103]在一些实施方案中，异多聚体蛋白质是抗体，诸如多特异性(例如，双特异性)抗体，其包含结合第一抗原的第一抗原结合片段和结合第二抗原的第二抗原结合片段。在一些实施方案中，异多聚体蛋白质包含结合第一抗原的第一抗原结合片段和第二抗原结合片段，以及结合第二抗原的第三抗原结合片段。在一些实施方案中，异多聚体蛋白质包含结合肿瘤抗原的第一抗原结合片段和第二抗原结合片段，以及结合第二抗原(诸如cd3)的第三抗原结合片段。在一些实施方案中，异多聚体蛋白质包含对肿瘤抗原具有相对低的亲和力的肿瘤抗原结合区，因此其与具有较低的肿瘤抗原密度的健康细胞的结合弱得多。在一些实施方案中，第一抗原结合片段、第二抗原结合片段和/或第三抗原结合片段是fab。在一些实施方案中，第一抗原结合片段、第二抗原结合片段和/或第三抗原结合片段是vhh。在一些实施方案中，第一抗原结合片段、第二抗原结合片段和/或第三抗原结合片段是scfv。在一些实施方案中，多特异性抗体包含两个fab结构域。在一些实施方案中，多特异性抗体包含三个fab结构域。在一些实施方案中，多特异性抗体包含两个vhh结构域。在一些实施方案中，多特异性抗体包含三个vhh结构域。在一些实施方案中，多特异性抗体包含fab结构域和vhh结构域。在一些实施方案中，多特异性抗体包含两个fab结构域和vhh结构域。在一些实施方案中，多特异性抗体包含fab结构域和两个vhh结构域。本文描述的多特异性抗体的示例性结构如图16所示。[0104]在一些实施方案中，提供了多特异性(例如，双特异性)抗体，其包含：(a)第一重链，其从n末端至c末端包含：第一重链可变结构域(vh1)、第一重链恒定结构域1(ch1)、第一重链恒定结构域2(ch2)和第一ch3结构域；(b)第一轻链，其从n末端至c末端包含：第一轻链可变结构域(vl1)和第一轻链恒定结构域(cl)；(c)第二重链，其从n末端至c末端包含：第二重链可变结构域(vh2)、第二ch1、第二ch2和第二ch3结构域；和(d)第二轻链，其从n末端至c碳末端包含：第二轻链可变结构域(vl2)和第二cl；其中vh1与vl1缔合形成特异性结合第一靶标的第一抗原结合位点，以及vh2与vl2缔合形成特异性结合第二靶标的第二抗原结合位点；其中第一ch3结构域包含相对于野生型ch3结构域在氨基酸位置354处利用大疏水氨基酸的取代，并且/或者第二ch3结构域包含相对于野生型ch3结构域在氨基酸位置347处利用带负电荷的氨基酸的取代，并且其中氨基酸残基编号基于eu编号。在一些实施方案中，大疏水氨基酸是y、f或w。在一些实施方案中，带负电荷的氨基酸是d或e。在一些实施方案中，氨基酸位置354处的大疏水氨基酸与第二ch3结构域中的氨基酸残基形成疏水相互作用。在一些实施方案中，第二ch3结构域在氨基酸位置349(例如，y349)处包含大疏水残基。在一些实施方案中，氨基酸位置347处的带负电荷的氨基酸与第一ch3结构域中的氨基酸残基形成离子键。在一些实施方案中，第一ch3结构域在氨基酸位置360(例如，k360)处包含带正电荷的残基。在一些实施方案中，第一和第二ch3结构域是人ch3结构域、鼠ch3结构域、大鼠ch3结构域、骆驼ch3结构域或兔ch3结构域。在一些实施方案中，第一ch3结构域和第二ch3结构域还包含kih残基，诸如t366y和y407t。在一些实施方案中，多特异性抗体是嵌合的、人的或人源化的。在一些实施方案中，vl1和vl2具有相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，vl1和vl2具有不同的氨基酸序列。[0105]在一些实施方案中，提供了多特异性(例如，双特异性)抗体，其包含：(a)第一重链，其从n末端至c碳末端包含：vh1结构域、第一ch1结构域、第一ch2结构域和第一ch3结构域；(b)第一轻链，其从n末端至c末端包含：vl1结构域和第一cl结构域；(c)第二重链，其从n末端至c末端包含：vh2结构域、第二ch1结构域、第二ch2结构域和第二ch3结构域；和(d)第二轻链，其从n末端至c末端包含：vl2结构域和第二cl结构域；其中vh1与vl1缔合形成特异性结合第一靶标的第一抗原结合位点，以及vh2与vl2缔合形成特异性结合第二靶标的第二抗原结合位点；其中第一ch3结构域包含大疏水氨基酸对s354的取代，并且/或者第二ch3结构域包含带负电荷的氨基酸对q347的取代，并且其中氨基酸残基编号基于eu编号。在一些实施方案中，大疏水氨基酸是y、f或w。在一些实施方案中，带负电荷的氨基酸是d或e。在一些实施方案中，氨基酸位置354处的大疏水氨基酸与第二ch3结构域中的氨基酸残基形成疏水相互作用。在一些实施方案中，第二ch3结构域在氨基酸位置349(例如，y349)处包含大疏水残基。在一些实施方案中，氨基酸位置347处的带负电荷的氨基酸与第一ch3结构域中的氨基酸残基形成离子键。在一些实施方案中，第一ch3结构域在氨基酸位置360(例如，k360)处包含带正电荷的残基。在一些实施方案中，第一ch3结构域和第二ch3结构域还包含kih残基，诸如t366y和y407t。在一些实施方案中，多特异性抗体是嵌合的、人的或人源化的。在一些实施方案中，vl1和vl2具有相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，vl1和vl2具有不同的氨基酸序列。[0106]在一些实施方案中，提供了多特异性(例如，双特异性)抗体，其包含：(a)第一重链，其从n末端至c碳末端包含：vh1结构域、第一ch1结构域、第一ch2结构域和第一ch3结构域；(b)第一轻链，其从n末端至c末端包含：vl1结构域和第一cl结构域；(c)第二重链，其从n末端至c末端包含：vh2结构域、第二ch1结构域、第二ch2结构域和第二ch3结构域；和(d)第二轻链，其从n末端至c末端包含：vl2结构域和第二cl结构域；其中vh1与vl1缔合形成特异性结合第一靶标的第一抗原结合位点，以及vh2与vl2缔合形成特异性结合第二靶标的第二抗原结合位点；其中第一ch3结构域包含s354y和t366y，第二ch3结构域包含q347e和y407t，其中氨基酸残基编号基于eu编号。在一些实施方案中，第一ch3结构域的s354y与第二ch3结构域中的氨基酸残基形成疏水相互作用。在一些实施方案中，第二ch3结构域在氨基酸位置349(例如，y349)处包含大疏水残基。在一些实施方案中，第二ch3结构域的q347e与第一ch3结构域中的氨基酸残基形成离子键。在一些实施方案中，第一ch3结构域在氨基酸位置360(例如，k360)处包含带正电荷的残基。在一些实施方案中，第二ch3结构域不包含y349的取代，例如y349s。在一些实施方案中，与野生型人ch3结构域相比，第一ch3和第二ch3不包含其它突变。在一些实施方案中，多特异性抗体是嵌合的、人的或人源化的。在一些实施方案中，vl1和vl2具有相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，vl1和vl2具有不同的氨基酸序列。在一些实施方案中，第一抗原结合位点特异性结合cd3，并且第二抗原结合位点特异性结合肿瘤抗原，或者第一抗原结合位点特异性结合cd3，并且第二抗原结合位点特异性结合肿瘤抗原。在一些实施方案中，第一抗原结合位点特异性结合cd20，并且第二抗原结合位点特异性结合cd3，或者第一抗原结合位点特异性结合cd3，并且第二抗原结合位点特异性结合cd20。在一些实施方案中，第一抗原结合位点特异性结合her2，并且第二抗原结合位点特异性结合cd3，或者第一抗原结合位点特异性结合cd3，并且第二抗原结合位点特异性结合her2。[0107]在一些实施方案中，提供了多特异性(例如，双特异性)抗体，其包含：(a)第一重链，其从n末端至c碳末端包含：vh1结构域、第一ch1结构域、第一ch2结构域和第一ch3结构域；(b)第一轻链，其从n末端至c末端包含：vl1结构域和第一cl结构域；(c)第二重链，其从n末端至c末端包含：vh2结构域、第二ch1结构域、第二ch2结构域和第二ch3结构域；和(d)第二轻链，其从n末端至c末端包含：vl2结构域和第二cl结构域；其中vh1与vl1缔合形成特异性结合第一靶标的第一抗原结合位点，以及vh2与vl2缔合形成特异性结合第二靶标的第二抗原结合位点；其中第一ch3结构域包含s354y和y407t，第二ch3结构域包含q347e和t366y，其中氨基酸残基编号基于eu编号。在一些实施方案中，第一ch3结构域的s354y与第二ch3结构域中的氨基酸残基形成疏水相互作用。在一些实施方案中，第二ch3结构域在氨基酸位置349(例如，y349)处包含大疏水残基。在一些实施方案中，第二ch3结构域的q347e与第一ch3结构域中的氨基酸残基形成离子键。在一些实施方案中，第一ch3结构域在氨基酸位置360(例如，k360)处包含带正电荷的残基。在一些实施方案中，第二ch3结构域不包含y349的取代，例如y349s。在一些实施方案中，与野生型人ch3结构域相比，第一ch3和第二ch3不包含其它突变。在一些实施方案中，多特异性抗体是嵌合的、人的或人源化的。在一些实施方案中，vl1和vl2具有相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，vl1和vl2具有不同的氨基酸序列。在一些实施方案中，第一抗原结合位点特异性结合cd3，并且第二抗原结合位点特异性结合肿瘤抗原，或者第一抗原结合位点特异性结合cd3，并且第二抗原结合位点特异性结合肿瘤抗原。在一些实施方案中，第一抗原结合位点特异性结合cd20，并且第二抗原结合位点特异性结合cd3，或者第一抗原结合位点特异性结合cd3，并且第二抗原结合位点特异性结合cd20。在一些实施方案中，第一抗原结合位点特异性结合her2，并且第二抗原结合位点特异性结合cd3，或者第一抗原结合位点特异性结合cd3，并且第二抗原结合位点特异性结合her2。[0108]在一些实施方案中，提供了多特异性(例如，双特异性)抗体，其包含：(a)第一重链，其从n末端至c末端包含：第一vhh结构域(vhh1)、第一重链恒定结构域2(ch2)和第一ch3结构域；和(b)第二重链，其从n末端至c末端包含：第二vhh结构域(vhh2)、第二ch2和第二ch3结构域；其中vhh1特异性结合第一靶标，以及vhh2特异性结合第二靶标；其中第一ch3结构域包含相对于野生型ch3结构域在氨基酸位置354处利用大疏水氨基酸进行的取代，并且/或者第二ch3结构域包含相对于野生型ch3结构域在氨基酸位置347处利用带负电荷的氨基酸进行的取代，并且其中氨基酸残基编号基于eu编号。在一些实施方案中，大疏水氨基酸是y、f或w。在一些实施方案中，带负电荷的氨基酸是d或e。在一些实施方案中，氨基酸位置354处的大疏水氨基酸与第二ch3结构域中的氨基酸残基形成疏水相互作用。在一些实施方案中，第二ch3结构域在氨基酸位置349(例如，y349)处包含大疏水残基。在一些实施方案中，氨基酸位置347处的带负电荷的氨基酸与第一ch3结构域中的氨基酸残基形成离子键。在一些实施方案中，第一ch3结构域在氨基酸位置360(例如，k360)处包含带正电荷的残基。在一些实施方案中，第一和第二ch3结构域是人ch3结构域、鼠ch3结构域、大鼠ch3结构域、骆驼ch3结构域或兔ch3结构域。在一些实施方案中，第一ch3结构域和第二ch3结构域还包含kih残基，诸如t366y和y407t。在一些实施方案中，多特异性抗体是嵌合的、人的或人源化的。[0109]在一些实施方案中，提供了多特异性(例如，双特异性)抗体，其包含：(a)第一重链，其从n末端至c末端包含：第一vhh结构域(vhh1)、第一重链恒定结构域2(ch2)和第一ch3结构域；和(b)第二重链，其从n末端至c末端包含：第二vhh结构域(vhh2)、第二ch2和第二ch3结构域；其中vhh1特异性结合第一靶标，以及vhh2特异性结合第二靶标；其中第一ch3结构域包含大疏水氨基酸对s354的取代，并且/或者第二ch3结构域包含带负电荷的氨基酸对q347的取代，并且其中氨基酸残基编号基于eu编号。在一些实施方案中，大疏水氨基酸是y、f或w。在一些实施方案中，带负电荷的氨基酸是d或e。在一些实施方案中，氨基酸位置354处的大疏水氨基酸与第二ch3结构域中的氨基酸残基形成疏水相互作用。在一些实施方案中，第二ch3结构域在氨基酸位置349(例如，y349)处包含大疏水残基。在一些实施方案中，氨基酸位置347处的带负电荷的氨基酸与第一ch3结构域中的氨基酸残基形成离子键。在一些实施方案中，第一ch3结构域在氨基酸位置360(例如，k360)处包含带正电荷的残基。在一些实施方案中，第一ch3结构域和第二ch3结构域还包含kih残基，诸如t366y和y407t。在一些实施方案中，多特异性抗体是嵌合的、人的或人源化的。[0110]在一些实施方案中，提供了多特异性(例如，双特异性)抗体，其包含：(a)第一重链，其从n末端至c末端包含：第一vhh结构域(vhh1)、第一重链恒定结构域2(ch2)和第一ch3结构域；和(b)第二重链，其从n末端至c末端包含：第二vhh结构域(vhh2)、第二ch2和第二ch3结构域；其中vhh1特异性结合第一靶标，以及vhh2特异性结合第二靶标；其中第一ch3结构域包含s354y和t366y，第二ch3结构域包含q347e和y407t，并且其中氨基酸残基编号基于eu编号。在一些实施方案中，第一ch3结构域的s354y与第二ch3结构域中的氨基酸残基形成疏水相互作用。在一些实施方案中，第二ch3结构域在氨基酸位置349(例如，y349)处包含大疏水残基。在一些实施方案中，第二ch3结构域的q347e与第一ch3结构域中的氨基酸残基形成离子键。在一些实施方案中，第一ch3结构域在氨基酸位置360(例如，k360)处包含带正电荷的残基。在一些实施方案中，第二ch3结构域不包含y349的取代，例如y349s。在一些实施方案中，与野生型人ch3结构域相比，第一ch3和第二ch3不包含其它突变。在一些实施方案中，多特异性抗体是嵌合的、人的或人源化的。[0111]在一些实施方案中，提供了多特异性(例如，双特异性)抗体，其包含：(a)第一重链，其从n末端至c末端包含：第一vhh结构域(vhh1)、第一重链恒定结构域2(ch2)和第一ch3结构域；和(b)第二重链，其从n末端至c末端包含：第二vhh结构域(vhh2)、第二ch2和第二ch3结构域；其中vhh1特异性结合第一靶标，以及vhh2特异性结合第二靶标；其中第一ch3结构域包含s354y和y407t，第二ch3结构域包含q347e和t366y，并且其中氨基酸残基编号基于eu编号。在一些实施方案中，第一ch3结构域的s354y与第二ch3结构域中的氨基酸残基形成疏水相互作用。在一些实施方案中，第二ch3结构域在氨基酸位置349(例如，y349)处包含大疏水残基。在一些实施方案中，第二ch3结构域的q347e与第一ch3结构域中的氨基酸残基形成离子键。在一些实施方案中，第一ch3结构域在氨基酸位置360(例如，k360)处包含带正电荷的残基。在一些实施方案中，第二ch3结构域不包含y349的取代，例如y349s。在一些实施方案中，与野生型人ch3结构域相比，第一ch3和第二ch3不包含其它突变。在一些实施方案中，多特异性抗体是嵌合的、人的或人源化的。[0112]在一些实施方案中，提供了多特异性(例如，双特异性)抗体，其包含：(a)第一重链，其从n末端至c末端包含：vhh结构域、第一重链恒定结构域2(ch2)和第一ch3结构域；(b)第二重链，其从n末端至c碳末端包含：第一重链可变结构域(vh1)、第一ch1、第二ch2和第二ch3结构域；和(d)轻链，其从n末端至c末端包含：第一轻链可变结构域(vl1)和第一cl；其中vh1与vl1缔合形成特异性结合第一靶标的第一抗原结合位点，并且vhh结构域特异性结合第二靶标；其中第一ch3结构域包含相对于野生型ch3结构域在氨基酸位置354处利用大疏水氨基酸进行的取代，并且/或者第二ch3结构域包含相对于野生型ch3结构域在氨基酸位置347处利用带负电荷的氨基酸进行的取代，或者其中第二ch3结构域包含相对于野生型ch3结构域在氨基酸位置354处利用大疏水氨基酸进行的取代，并且/或者第一ch3结构域包含相对于野生型ch3结构域在氨基酸位置347处利用带负电荷的氨基酸进行的取代；并且其中氨基酸残基编号基于eu编号。在一些实施方案中，大疏水氨基酸是y、f或w。在一些实施方案中，带负电荷的氨基酸是d或e。在一些实施方案中，氨基酸位置354处的大疏水氨基酸与第二ch3结构域中的氨基酸残基形成疏水相互作用。在一些实施方案中，第二ch3结构域在氨基酸位置349(例如，y349)处包含大疏水残基。在一些实施方案中，氨基酸位置347处的带负电荷的氨基酸与第一ch3结构域中的氨基酸残基形成离子键。在一些实施方案中，第一ch3结构域在氨基酸位置360(例如，k360)处包含带正电荷的残基。在一些实施方案中，第一和第二ch3结构域是人ch3结构域、鼠ch3结构域、大鼠ch3结构域、骆驼ch3结构域或兔ch3结构域。在一些实施方案中，第一ch3结构域和第二ch3结构域还包含kih残基，诸如t366y和y407t。在一些实施方案中，多特异性抗体是嵌合的、人的或人源化的。[0113]在一些实施方案中，提供了多特异性(例如，双特异性)抗体，其包含：(a)第一重链，其从n末端至c末端包含：vhh结构域、第一重链恒定结构域2(ch2)和第一ch3结构域；(b)第二重链，其从n末端至c碳末端包含：第一重链可变结构域(vh1)、第一ch1、第二ch2和第二ch3结构域；和(d)轻链，其从n末端至c末端包含：第一轻链可变结构域(vl1)和第一cl；其中vh1与vl1缔合形成特异性结合第一靶标的第一抗原结合位点，并且vhh结构域特异性结合第二靶标；其中第一ch3结构域包含大疏水氨基酸对s354的取代，并且/或者第二ch3结构域包含带负电荷的氨基酸对q347的取代，或者其中第二ch3结构域包含大疏水氨基酸对s354的取代，并且/或者第一ch3结构域包含带负电荷的氨基酸对q347的取代；并且其中氨基酸残基编号基于eu编号。在一些实施方案中，大疏水氨基酸是y、f或w。在一些实施方案中，带负电荷的氨基酸是d或e。在一些实施方案中，氨基酸位置354处的大疏水氨基酸与第二ch3结构域中的氨基酸残基形成疏水相互作用。在一些实施方案中，第二ch3结构域在氨基酸位置349(例如，y349)处包含大疏水残基。在一些实施方案中，氨基酸位置347处的带负电荷的氨基酸与第一ch3结构域中的氨基酸残基形成离子键。在一些实施方案中，第一ch3结构域在氨基酸位置360(例如，k360)处包含带正电荷的残基。在一些实施方案中，第一ch3结构域和第二ch3结构域还包含kih残基，诸如t366y和y407t。[0114]在一些实施方案中，提供了多特异性(例如，双特异性)抗体，其包含：(a)第一重链，其从n末端至c末端包含：vhh结构域、第一重链恒定结构域2(ch2)和第一ch3结构域；(b)第二重链，其从n末端至c碳末端包含：第一重链可变结构域(vh1)、第一ch1、第二ch2和第二ch3结构域；和(d)轻链，其从n末端至c末端包含：第一轻链可变结构域(vl1)和第一cl；其中vh1与vl1缔合形成特异性结合第一靶标的第一抗原结合位点，并且vhh结构域特异性结合第二靶标；其中第一ch3结构域包含s354y和t366y，并且第二ch3结构域包含q347e和y407t，或者其中第二ch3结构域包含s354y和t366y，并且第一ch3结构域包含q347e和y407t；并且其中氨基酸残基编号基于eu编号。在一些实施方案中，第一ch3结构域的s354y与第二ch3结构域中的氨基酸残基形成疏水相互作用。在一些实施方案中，第二ch3结构域在氨基酸位置349(例如，y349)处包含大疏水残基。在一些实施方案中，第二ch3结构域的q347e与第一ch3结构域中的氨基酸残基形成离子键。在一些实施方案中，第一ch3结构域在氨基酸位置360(例如，k360)处包含带正电荷的残基。在一些实施方案中，第二ch3结构域不包含y349的取代，例如y349s。在一些实施方案中，与野生型人ch3结构域相比，第一ch3和第二ch3不包含其它突变。在一些实施方案中，多特异性抗体是嵌合的、人的或人源化的。在一些实施方案中，vhh特异性结合肿瘤抗原(例如，bcma)，并且第一抗原结合位点特异性结合cd3。[0115]在一些实施方案中，提供了多特异性(例如，双特异性)抗体，其包含：(a)第一重链，其从n末端至c末端包含：vhh结构域、第一重链恒定结构域2(ch2)和第一ch3结构域；(b)第二重链，其从n末端至c碳末端包含：第一重链可变结构域(vh1)、第一ch1、第二ch2和第二ch3结构域；和(d)轻链，其从n末端至c末端包含：第一轻链可变结构域(vl1)和第一cl；其中vh1与vl1缔合形成特异性结合第一靶标的第一抗原结合位点，并且vhh结构域特异性结合第二靶标；其中第一ch3结构域包含s354y和y407t，并且第二ch3结构域包含q347e和t366y，或者其中第二ch3结构域包含s354y和y407t，并且第一ch3结构域包含q347e和t366y；并且其中氨基酸残基编号基于eu编号。在一些实施方案中，第一ch3结构域的s354y与第二ch3结构域中的氨基酸残基形成疏水相互作用。在一些实施方案中，第二ch3结构域在氨基酸位置349(例如，y349)处包含大疏水残基。在一些实施方案中，第二ch3结构域的q347e与第一ch3结构域中的氨基酸残基形成离子键。在一些实施方案中，第一ch3结构域在氨基酸位置360(例如，k360)处包含带正电荷的残基。在一些实施方案中，第二ch3结构域不包含y349的取代，例如y349s。在一些实施方案中，与野生型人ch3结构域相比，第一ch3和第二ch3不包含其它突变。在一些实施方案中，多特异性抗体是嵌合的、人的或人源化的。在一些实施方案中，vhh特异性结合肿瘤抗原(例如，bcma)，并且第一抗原结合位点特异性结合cd3。[0116]在一些实施方案中，提供了多特异性(例如，双特异性或三特异性)抗体，其包含：(a)第一重链，其从n末端至c末端包含：第一重链可变结构域(vh1)、第一ch1、第二重链可变结构域(vh2)、第二ch1、第一ch2和第一ch3结构域；(b)第一轻链，其从n末端至c末端包含：第一轻链可变结构域(vl1)、第一cl、第二轻链可变结构域(vl2)和第二cl；(c)第二重链，其从n末端至c末端包含：第三重链可变结构域(vh3)、第三ch1、第二ch2和第二ch3结构域；和(d)第二轻链，其从n末端至c末端包含：第三轻链可变结构域(vl3)和第三cl；其中vh1与vl1缔合形成特异性结合第一靶标的第一抗原结合位点，以及vh2与vl2缔合形成特异性结合第二靶标的第二抗原结合位点，以及vh3与vl3缔合形成特异性结合第三靶标的第三抗原结合位点；其中第一ch3结构域包含相对于野生型ch3结构域在氨基酸位置354处利用大疏水氨基酸进行的取代，并且/或者第二ch3结构域包含相对于野生型ch3结构域在氨基酸位置347处利用带负电荷的氨基酸进行的取代，或者其中第二ch3结构域包含相对于野生型ch3结构域在氨基酸位置354处利用大疏水氨基酸进行的取代，并且/或者第一ch3结构域包含相对于野生型ch3结构域在氨基酸位置347处利用带负电荷的氨基酸进行的取代；并且其中氨基酸残基编号基于eu编号。在一些实施方案中，大疏水氨基酸是y、f或w。在一些实施方案中，带负电荷的氨基酸是d或e。在一些实施方案中，氨基酸位置354处的大疏水氨基酸与第二ch3结构域中的氨基酸残基形成疏水相互作用。在一些实施方案中，第二ch3结构域在氨基酸位置349(例如，y349)处包含大疏水残基。在一些实施方案中，氨基酸位置347处的带负电荷的氨基酸与第一ch3结构域中的氨基酸残基形成离子键。在一些实施方案中，第一ch3结构域在氨基酸位置360(例如，k360)处包含带正电荷的残基。在一些实施方案中，第一和第二ch3结构域是人ch3结构域、鼠ch3结构域、大鼠ch3结构域、骆驼ch3结构域或兔ch3结构域。在一些实施方案中，第一ch3结构域和第二ch3结构域还包含kih残基，诸如t366y和y407t。在一些实施方案中，多特异性抗体是嵌合的、人的或人源化的。在一些实施方案中，vl1、vl2和/或vl3具有相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，vl1、vl2和vl3具有不同的氨基酸序列。[0117]在一些实施方案中，提供了多特异性(例如，双特异性或三特异性)抗体，其包含：(a)第一重链，其从n末端至c末端包含：第一重链可变结构域(vh1)、第一ch1、第二重链可变结构域(vh2)、第二ch1、第一ch2和第一ch3结构域；(b)第一轻链，其从n末端至c末端包含：第一轻链可变结构域(vl1)、第一cl、第二轻链可变结构域(vl2)和第二cl；(c)第二重链，其从n末端至c末端包含：第三重链可变结构域(vh3)、第三ch1、第二ch2和第二ch3结构域；和(d)第二轻链，其从n末端至c末端包含：第三轻链可变结构域(vl3)和第三cl；其中vh1与vl1缔合形成特异性结合第一靶标的第一抗原结合位点，vh2与vl2缔合形成特异性结合第二靶标的第二抗原结合位点，以及vh3与vl3缔合形成特异性结合第三靶标的第三抗原结合位点；其中第一ch3结构域包含大疏水氨基酸对s354的取代，并且/或者第二ch3结构域包含带负电荷的氨基酸对q347的取代，或者其中第二ch3结构域包含大疏水氨基酸对s354的取代，并且/或者第一ch3结构域包含带负电荷的氨基酸对q347的取代；并且其中氨基酸残基编号基于eu编号。在一些实施方案中，大疏水氨基酸是y、f或w。在一些实施方案中，带负电荷的氨基酸是d或e。在一些实施方案中，氨基酸位置354处的大疏水氨基酸与第二ch3结构域中的氨基酸残基形成疏水相互作用。在一些实施方案中，第二ch3结构域在氨基酸位置349(例如，y349)处包含大疏水残基。在一些实施方案中，氨基酸位置347处的带负电荷的氨基酸与第一ch3结构域中的氨基酸残基形成离子键。在一些实施方案中，第一ch3结构域在氨基酸位置360(例如，k360)处包含带正电荷的残基。在一些实施方案中，第一ch3结构域和第二ch3结构域还包含kih残基，诸如t366y和y407t。在一些实施方案中，多特异性抗体是嵌合的、人的或人源化的。在一些实施方案中，vl1、vl2和/或vl3具有相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，vl1、vl2和vl3具有不同的氨基酸序列。[0118]在一些实施方案中，提供了多特异性(例如，双特异性或三特异性)抗体，其包含：(a)第一重链，其从n末端至c末端包含：第一重链可变结构域(vh1)、第一ch1、第二重链可变结构域(vh2)、第二ch1、第一ch2和第一ch3结构域；(b)第一轻链，其从n末端至c末端包含：第一轻链可变结构域(vl1)、第一cl、第二轻链可变结构域(vl2)和第二cl；(c)第二重链，其从n末端至c末端包含：第三重链可变结构域(vh3)、第三ch1、第二ch2和第二ch3结构域；和(d)第二轻链，其从n末端至c末端包含：第三轻链可变结构域(vl3)和第三cl；其中vh1与vl1缔合形成特异性结合第一靶标的第一抗原结合位点，vh2与vl2缔合形成特异性结合第二靶标的第二抗原结合位点，以及vh3与vl3缔合形成特异性结合第三靶标的第三抗原结合位点；其中第一ch3结构域包含s354y和t366y，并且第二ch3结构域包含q347e和y407t，或者其中第二ch3结构域包含s354y和t366y，并且第一ch3结构域包含q347e和y407t；并且其中氨基酸残基编号基于eu编号。在一些实施方案中，第一ch3结构域的s354y与第二ch3结构域中的氨基酸残基形成疏水相互作用。在一些实施方案中，第二ch3结构域在氨基酸位置349(例如，y349)处包含大疏水残基。在一些实施方案中，第二ch3结构域的q347e与第一ch3结构域中的氨基酸残基形成离子键。在一些实施方案中，第一ch3结构域在氨基酸位置360(例如，k360)处包含带正电荷的残基。在一些实施方案中，第二ch3结构域不包含y349的取代，例如y349s。在一些实施方案中，与野生型人ch3结构域相比，第一ch3和第二ch3不包含其它突变。在一些实施方案中，多特异性抗体是嵌合的、人的或人源化的。在一些实施方案中，vl1、vl2和/或vl3具有相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，vl1、vl2和vl3具有不同的氨基酸序列。在一些实施方案中，第一抗原结合位点和第二抗原结合位点特异性结合肿瘤抗原(例如，her2)，并且第三抗原结合位点特异性结合cd3。[0119]在一些实施方案中，提供了多特异性(例如，双特异性或三特异性)抗体，其包含：(a)第一重链，其从n末端至c末端包含：第一重链可变结构域(vh1)、第一ch1、第二重链可变结构域(vh2)、第二ch1、第一ch2和第一ch3结构域；(b)第一轻链，其从n末端至c末端包含：第一轻链可变结构域(vl1)、第一cl、第二轻链可变结构域(vl2)和第二cl；(c)第二重链，其从n末端至c末端包含：第三重链可变结构域(vh3)、第三ch1、第二ch2和第二ch3结构域；和(d)第二轻链，其从n末端至c末端包含：第三轻链可变结构域(vl3)和第三cl；其中vh1与vl1缔合形成特异性结合第一靶标的第一抗原结合位点，vh2与vl2缔合形成特异性结合第二靶标的第二抗原结合位点，以及vh3与vl3缔合形成特异性结合第三靶标的第三抗原结合位点；其中第一ch3结构域包含s354y和y407t，并且第二ch3结构域包含q347e和t366y，或者其中第二ch3结构域包含s354y和y407t，并且第一ch3结构域包含q347e和t366y；并且其中氨基酸残基编号基于eu编号。在一些实施方案中，第一ch3结构域的s354y与第二ch3结构域中的氨基酸残基形成疏水相互作用。在一些实施方案中，第二ch3结构域在氨基酸位置349(例如，y349)处包含大疏水残基。在一些实施方案中，第二ch3结构域的q347e与第一ch3结构域中的氨基酸残基形成离子键。在一些实施方案中，第一ch3结构域在氨基酸位置360(例如，k360)处包含带正电荷的残基。在一些实施方案中，第二ch3结构域不包含y349的取代，例如y349s。在一些实施方案中，与野生型人ch3结构域相比，第一ch3和第二ch3不包含其它突变。在一些实施方案中，多特异性抗体是嵌合的、人的或人源化的。在一些实施方案中，vl1、vl2和/或vl3具有相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，vl1、vl2和vl3具有不同的氨基酸序列。在一些实施方案中，第一抗原结合位点和第二抗原结合位点特异性结合肿瘤抗原(例如，her2)，并且第三抗原结合位点特异性结合cd3。[0120]在一些实施方案中，提供了多特异性(例如，双特异性或三特异性)抗体，其包含：(a)第一重链，其从n氮末端至c末端包含：第一vhh结构域(vhh1)、第二vhh结构域(vhh2)、第一ch2和第一ch3结构域；(b)第二重链，其从n末端至c末端包含：第三vhh结构域(vhh3)、第二ch2和第二ch3结构域；其中vhh1特异性结合第一靶标，vhh2特异性结合第二靶标，以及vhh3特异性结合第三靶标；其中第一ch3结构域包含相对于野生型ch3结构域在氨基酸位置354处利用大疏水氨基酸进行的取代，并且/或者第二ch3结构域包含相对于野生型ch3结构域在氨基酸位置347处利用带负电荷的氨基酸进行的取代，或者其中第二ch3结构域包含相对于野生型ch3结构域在氨基酸位置354处利用大疏水氨基酸进行的取代，并且/或者第一ch3结构域包含相对于野生型ch3结构域在氨基酸位置347处利用带负电荷的氨基酸进行的取代；并且其中氨基酸残基编号基于eu编号。在一些实施方案中，大疏水氨基酸是y、f或w。在一些实施方案中，带负电荷的氨基酸是d或e。在一些实施方案中，氨基酸位置354处的大疏水氨基酸与第二ch3结构域中的氨基酸残基形成疏水相互作用。在一些实施方案中，第二ch3结构域在氨基酸位置349(例如，y349)处包含大疏水残基。在一些实施方案中，氨基酸位置347处的带负电荷的氨基酸与第一ch3结构域中的氨基酸残基形成离子键。在一些实施方案中，第一ch3结构域在氨基酸位置360(例如，k360)处包含带正电荷的残基。在一些实施方案中，第一和第二ch3结构域是人ch3结构域、鼠ch3结构域、大鼠ch3结构域、骆驼ch3结构域或兔ch3结构域。在一些实施方案中，第一ch3结构域和第二ch3结构域还包含kih残基，诸如t366y和y407t。在一些实施方案中，多特异性抗体是嵌合的、人的或人源化的。[0121]在一些实施方案中，提供了多特异性(例如，双特异性或三特异性)抗体，其包含：(a)第一重链，其从n氮末端至c末端包含：第一vhh结构域(vhh1)、第二vhh结构域(vhh2)、第一ch2和第一ch3结构域；(b)第二重链，其从n末端至c末端包含：第三vhh结构域(vhh3)、第二ch2和第二ch3结构域；其中vhh1特异性结合第一靶标，vhh2特异性结合第二靶标，以及vhh3特异性结合第三靶标；其中第一ch3结构域包含大疏水氨基酸对s354的取代，并且/或者第二ch3结构域包含带负电荷的氨基酸对q347的取代，或其中第二ch3结构域包含大疏水氨基酸对s354的取代，并且/或者第一ch3结构域包含带负电荷的氨基酸对q347的取代；并且其中氨基酸残基编号基于eu编号。在一些实施方案中，大疏水氨基酸是y、f或w。在一些实施方案中，带负电荷的氨基酸是d或e。在一些实施方案中，氨基酸位置354处的大疏水氨基酸与第二ch3结构域中的氨基酸残基形成疏水相互作用。在一些实施方案中，第二ch3结构域在氨基酸位置349(例如，y349)处包含大疏水残基。在一些实施方案中，氨基酸位置347处的带负电荷的氨基酸与第一ch3结构域中的氨基酸残基形成离子键。在一些实施方案中，第一ch3结构域在氨基酸位置360(例如，k360)处包含带正电荷的残基。在一些实施方案中，第一ch3结构域和第二ch3结构域还包含kih残基，诸如t366y和y407t。在一些实施方案中，多特异性抗体是嵌合的、人的或人源化的。[0122]在一些实施方案中，提供了多特异性(例如，双特异性或三特异性)抗体，其包含：(a)第一重链，其从n氮末端至c末端包含：第一vhh结构域(vhh1)、第二vhh结构域(vhh2)、第一ch2和第一ch3结构域；(b)第二重链，其从n末端至c末端包含：第三vhh结构域(vhh3)、第二ch2和第二ch3结构域；其中vhh1特异性结合第一靶标，vhh2特异性结合第二靶标，以及vhh3特异性结合第三靶标；其中第一ch3结构域包含s354y和t366y，并且第二ch3结构域包含q347e和y407t，或者其中第二ch3结构域包含s354y和t366y，并且第一ch3结构域包含q347e和y407t；并且其中氨基酸残基编号基于eu编号。在一些实施方案中，第一ch3结构域的s354y与第二ch3结构域中的氨基酸残基形成疏水相互作用。在一些实施方案中，第二ch3结构域在氨基酸位置349(例如，y349)处包含大疏水残基。在一些实施方案中，第二ch3结构域的q347e与第一ch3结构域中的氨基酸残基形成离子键。在一些实施方案中，第一ch3结构域在氨基酸位置360(例如，k360)处包含带正电荷的残基。在一些实施方案中，第二ch3结构域不包含y349的取代，例如y349s。在一些实施方案中，与野生型人ch3结构域相比，第一ch3和第二ch3不包含其它突变。在一些实施方案中，多特异性抗体是嵌合的、人的或人源化的。[0123]在一些实施方案中，提供了多特异性(例如，双特异性或三特异性)抗体，其包含：(a)第一重链，其从n氮末端至c末端包含：第一vhh结构域(vhh1)、第二vhh结构域(vhh2)、第一ch2和第一ch3结构域；(b)第二重链，其从n末端至c末端包含：第三vhh结构域(vhh3)、第二ch2和第二ch3结构域；其中vhh1特异性结合第一靶标，vhh2特异性结合第二靶标，以及vhh3特异性结合第三靶标；其中第一ch3结构域包含s354y和y407t，并且第二ch3结构域包含q347e和t366y，或者其中第二ch3结构域包含s354y和y407t，并且第一ch3结构域包含q347e和t366y；并且其中氨基酸残基编号基于eu编号。在一些实施方案中，第一ch3结构域的s354y与第二ch3结构域中的氨基酸残基形成疏水相互作用。在一些实施方案中，第二ch3结构域在氨基酸位置349(例如，y349)处包含大疏水残基。在一些实施方案中，第二ch3结构域的q347e与第一ch3结构域中的氨基酸残基形成离子键。在一些实施方案中，第一ch3结构域在氨基酸位置360(例如，k360)处包含带正电荷的残基。在一些实施方案中，第二ch3结构域不包含y349的取代，例如y349s。在一些实施方案中，与野生型人ch3结构域相比，第一ch3和第二ch3不包含其它突变。在一些实施方案中，多特异性抗体是嵌合的、人的或人源化的。[0124]在一些实施方案中，提供了多特异性(例如，双特异性或三特异性)抗体，其包含：(a)第一重链，其从n末端至c末端包含：第一vhh结构域(vhh1)、第二vhh结构域(vhh2)、第一ch2和第一ch3结构域；(b)第二重链，其从n末端至c末端包含：第一重链可变结构域(vh1)、第一ch1、第二ch2和第二ch3结构域；和(c)轻链，其从n末端至c末端包含：第一轻链可变结构域(vl1)和第一cl；其中vh1与vl1缔合形成特异性结合第一靶标的第一抗原结合位点，vhh1特异性结合第二靶标，以及vhh2特异性结合第三靶标；其中第一ch3结构域包含相对于野生型ch3结构域在氨基酸位置354处利用大疏水氨基酸进行的取代，并且/或者第二ch3结构域包含相对于野生型ch3结构域在氨基酸位置347处利用带负电荷的氨基酸进行的取代，或者其中第二ch3结构域包含相对于野生型ch3结构域在氨基酸位置354处利用大疏水氨基酸进行的取代，并且/或者第一ch3结构域包含相对于野生型ch3结构域在氨基酸位置347处利用带负电荷的氨基酸进行的取代；并且其中氨基酸残基编号基于eu编号。在一些实施方案中，大疏水氨基酸是y、f或w。在一些实施方案中，带负电荷的氨基酸是d或e。在一些实施方案中，氨基酸位置354处的大疏水氨基酸与第二ch3结构域中的氨基酸残基形成疏水相互作用。在一些实施方案中，第二ch3结构域在氨基酸位置349(例如，y349)处包含大疏水残基。在一些实施方案中，氨基酸位置347处的带负电荷的氨基酸与第一ch3结构域中的氨基酸残基形成离子键。在一些实施方案中，第一ch3结构域在氨基酸位置360(例如，k360)处包含带正电荷的残基。在一些实施方案中，第一和第二ch3结构域是人ch3结构域、鼠ch3结构域、大鼠ch3结构域、骆驼ch3结构域或兔ch3结构域。在一些实施方案中，第一ch3结构域和第二ch3结构域还包含kih残基，诸如t366y和y407t。在一些实施方案中，多特异性抗体是嵌合的、人的或人源化的。[0125]在一些实施方案中，提供了多特异性(例如，双特异性或三特异性)抗体，其包含：(a)第一重链，其从n末端至c末端包含：第一vhh结构域(vhh1)、第二vhh结构域(vhh2)、第一ch2和第一ch3结构域；(b)第二重链，其从n末端至c末端包含：第一重链可变结构域(vh1)、第一ch1、第二ch2和第二ch3结构域；和(c)轻链，其从n末端至c末端包含：第一轻链可变结构域(vl1)和第一cl；其中vh1与vl1缔合形成特异性结合第一靶标的第一抗原结合位点，vhh1特异性结合第二靶标，以及vhh2特异性结合第三靶标；其中第一ch3结构域包含大疏水氨基酸对s354的取代，并且/或者第二ch3结构域包含带负电荷的氨基酸对q347的取代，或者其中第二ch3结构域包含大疏水氨基酸对s354的取代，并且/或者第一ch3结构域包含带负电荷的氨基酸对q347的取代；并且其中氨基酸残基编号基于eu编号。在一些实施方案中，大疏水氨基酸是y、f或w。在一些实施方案中，带负电荷的氨基酸是d或e。在一些实施方案中，氨基酸位置354处的大疏水氨基酸与第二ch3结构域中的氨基酸残基形成疏水相互作用。在一些实施方案中，第二ch3结构域在氨基酸位置349(例如，y349)处包含大疏水残基。在一些实施方案中，氨基酸位置347处的带负电荷的氨基酸与第一ch3结构域中的氨基酸残基形成离子键。在一些实施方案中，第一ch3结构域在氨基酸位置360(例如，k360)处包含带正电荷的残基。在一些实施方案中，第一ch3结构域和第二ch3结构域还包含kih残基，诸如t366y和y407t。在一些实施方案中，多特异性抗体是嵌合的、人的或人源化的。[0126]在一些实施方案中，提供了多特异性(例如，双特异性或三特异性)抗体，其包含：(a)第一重链，其从n末端至c末端包含：第一vhh结构域(vhh1)、第二vhh结构域(vhh2)、第一ch2和第一ch3结构域；(b)第二重链，其从n末端至c末端包含：第一重链可变结构域(vh1)、第一ch1、第二ch2和第二ch3结构域；和(c)轻链，其从n末端至c末端包含：第一轻链可变结构域(vl1)和第一cl；其中vh1与vl1缔合形成特异性结合第一靶标的第一抗原结合位点，vhh1特异性结合第二靶标，以及vhh2特异性结合第三靶标；其中第一ch3结构域包含s354y和t366y，并且第二ch3结构域包含q347e和y407t，或者其中第二ch3结构域包含s354y和t366y，并且第一ch3结构域包含q347e和y407t；并且其中氨基酸残基编号基于eu编号。在一些实施方案中，第一ch3结构域的s354y与第二ch3结构域中的氨基酸残基形成疏水相互作用。在一些实施方案中，第二ch3结构域在氨基酸位置349(例如，y349)处包含大疏水残基。在一些实施方案中，第二ch3结构域的q347e与第一ch3结构域中的氨基酸残基形成离子键。在一些实施方案中，第一ch3结构域在氨基酸位置360(例如，k360)处包含带正电荷的残基。在一些实施方案中，第二ch3结构域不包含y349的取代，例如y349s。在一些实施方案中，与野生型人ch3结构域相比，第一ch3和第二ch3不包含其它突变。在一些实施方案中，多特异性抗体是嵌合的、人的或人源化的。在一些实施方案中，vhh1和vhh2特异性结合肿瘤抗原(例如，bcma)，并且第一抗原结合位点特异性结合cd3。[0127]在一些实施方案中，提供了多特异性(例如，双特异性或三特异性)抗体，其包含：(a)第一重链，其从n末端至c末端包含：第一vhh结构域(vhh1)、第二vhh结构域(vhh2)、第一ch2和第一ch3结构域；(b)第二重链，其从n末端至c末端包含：第一重链可变结构域(vh1)、第一ch1、第二ch2和第二ch3结构域；和(c)轻链，其从n末端至c末端包含：第一轻链可变结构域(vl1)和第一cl；其中vh1与vl1缔合形成特异性结合第一靶标的第一抗原结合位点，vhh1特异性结合第二靶标，以及vhh2特异性结合第三靶标；其中第一ch3结构域包含s354y和y407t，并且第二ch3结构域包含q347e和t366y，或者其中第二ch3结构域包含s354y和y407t，并且第一ch3结构域包含q347e和t366y；并且其中氨基酸残基编号基于eu编号。在一些实施方案中，第一ch3结构域的s354y与第二ch3结构域中的氨基酸残基形成疏水相互作用。在一些实施方案中，第二ch3结构域在氨基酸位置349(例如，y349)处包含大疏水残基。在一些实施方案中，第二ch3结构域的q347e与第一ch3结构域中的氨基酸残基形成离子键。在一些实施方案中，第一ch3结构域在氨基酸位置360(例如，k360)处包含带正电荷的残基。在一些实施方案中，第二ch3结构域不包含y349的取代，例如y349s。在一些实施方案中，与野生型人ch3结构域相比，第一ch3和第二ch3不包含其它突变。在一些实施方案中，多特异性抗体是嵌合的、人的或人源化的。在一些实施方案中，vhh1和vhh2特异性结合肿瘤抗原(例如，bcma)，并且第一抗原结合位点特异性结合cd3。[0128]在一些实施方案中，提供了多特异性(例如，双特异性、三特异性或四特异性)抗体，其包含：(a)第一重链，其从n末端至c末端包含：第一vhh结构域(vhh1)、第二vhh结构域(vhh2)、第一ch2和第一ch3结构域；(b)第二重链，其从n末端至c末端包含：第三vhh结构域(vhh3)、第四vhh结构域(vhh4)、第二ch2和第二ch3结构域；其中vhh1特异性结合第一靶标，vhh2特异性结合第二靶标，vhh3特异性结合第三靶标，以及vhh4特异性结合第四靶标；其中第一ch3结构域包含相对于野生型ch3结构域在氨基酸位置354处利用大疏水氨基酸进行的取代，并且/或者第二ch3结构域包含相对于野生型ch3结构域在氨基酸位置347处利用带负电荷的氨基酸进行的取代，并且其中氨基酸残基编号基于eu编号。在一些实施方案中，大疏水氨基酸是y、f或w。在一些实施方案中，带负电荷的氨基酸是d或e。在一些实施方案中，氨基酸位置354处的大疏水氨基酸与第二ch3结构域中的氨基酸残基形成疏水相互作用。在一些实施方案中，第二ch3结构域在氨基酸位置349(例如，y349)处包含大疏水残基。在一些实施方案中，氨基酸位置347处的带负电荷的氨基酸与第一ch3结构域中的氨基酸残基形成离子键。在一些实施方案中，第一ch3结构域在氨基酸位置360(例如，k360)处包含带正电荷的残基。在一些实施方案中，第一和第二ch3结构域是人ch3结构域、鼠ch3结构域、大鼠ch3结构域、骆驼ch3结构域或兔ch3结构域。在一些实施方案中，第一ch3结构域和第二ch3结构域还包含kih残基，诸如t366y和y407t。在一些实施方案中，多特异性抗体是嵌合的、人的或人源化的。[0129]在一些实施方案中，提供了多特异性(例如，双特异性、三特异性或四特异性)抗体，其包含：(a)第一重链，其从n末端至c末端包含：第一vhh结构域(vhh1)、第二vhh结构域(vhh2)、第一ch2和第一ch3结构域；(b)第二重链，其从n末端至c末端包含：第三vhh结构域(vhh3)、第四vhh结构域(vhh4)、第二ch2和第二ch3结构域；其中vhh1特异性结合第一靶标，vhh2特异性结合第二靶标，vhh3特异性结合第三靶标，以及vhh4特异性结合第四靶标；其中第一ch3结构域包含大疏水氨基酸对s354的取代，并且/或者第二ch3结构域包含带负电荷的氨基酸对q347的取代，并且其中氨基酸残基编号基于eu编号。在一些实施方案中，大疏水氨基酸是y、f或w。在一些实施方案中，带负电荷的氨基酸是d或e。在一些实施方案中，氨基酸位置354处的大疏水氨基酸与第二ch3结构域中的氨基酸残基形成疏水相互作用。在一些实施方案中，第二ch3结构域在氨基酸位置349(例如，y349)处包含大疏水残基。在一些实施方案中，氨基酸位置347处的带负电荷的氨基酸与第一ch3结构域中的氨基酸残基形成离子键。在一些实施方案中，第一ch3结构域在氨基酸位置360(例如，k360)处包含带正电荷的残基。在一些实施方案中，第一ch3结构域和第二ch3结构域还包含kih残基，诸如t366y和y407t。在一些实施方案中，多特异性抗体是嵌合的、人的或人源化的。[0130]在一些实施方案中，提供了多特异性(例如，双特异性、三特异性或四特异性)抗体，其包含：(a)第一重链，其从n末端至c末端包含：第一vhh结构域(vhh1)、第二vhh结构域(vhh2)、第一ch2和第一ch3结构域；(b)第二重链，其从n末端至c末端包含：第三vhh结构域(vhh3)、第四vhh结构域(vhh4)、第二ch2和第二ch3结构域；其中vhh1特异性结合第一靶标，vhh2特异性结合第二靶标，vhh3特异性结合第三靶标，以及vhh4特异性结合第四靶标；其中第一ch3结构域包含s354y和t366y，第二ch3结构域包含q347e和y407t，并且其中氨基酸残基编号基于eu编号。在一些实施方案中，第一ch3结构域的s354y与第二ch3结构域中的氨基酸残基形成疏水相互作用。在一些实施方案中，第二ch3结构域在氨基酸位置349(例如，y349)处包含大疏水残基。在一些实施方案中，第二ch3结构域的q347e与第一ch3结构域中的氨基酸残基形成离子键。在一些实施方案中，第一ch3结构域在氨基酸位置360(例如，k360)处包含带正电荷的残基。在一些实施方案中，第二ch3结构域不包含y349的取代，例如y349s。在一些实施方案中，与野生型人ch3结构域相比，第一ch3和第二ch3不包含其它突变。在一些实施方案中，多特异性抗体是嵌合的、人的或人源化的。[0131]在一些实施方案中，提供了多特异性(例如，双特异性、三特异性或四特异性)抗体，其包含：(a)第一重链，其从n末端至c末端包含：第一vhh结构域(vhh1)、第二vhh结构域(vhh2)、第一ch2和第一ch3结构域；(b)第二重链，其从n末端至c末端包含：第三vhh结构域(vhh3)、第四vhh结构域(vhh4)、第二ch2和第二ch3结构域；其中vhh1特异性结合第一靶标，vhh2特异性结合第二靶标，vhh3特异性结合第三靶标，以及vhh4特异性结合第四靶标；其中第一ch3结构域包含s354y和y407t，第二ch3结构域包含q347e和t366y，并且其中氨基酸残基编号基于eu编号。在一些实施方案中，第一ch3结构域的s354y与第二ch3结构域中的氨基酸残基形成疏水相互作用。在一些实施方案中，第二ch3结构域在氨基酸位置349(例如，y349)处包含大疏水残基。在一些实施方案中，第二ch3结构域的q347e与第一ch3结构域中的氨基酸残基形成离子键。在一些实施方案中，第一ch3结构域在氨基酸位置360(例如，k360)处包含带正电荷的残基。在一些实施方案中，第二ch3结构域不包含y349的取代，例如y349s。在一些实施方案中，与野生型人ch3结构域相比，第一ch3和第二ch3不包含其它突变。在一些实施方案中，多特异性抗体是嵌合的、人的或人源化的。[0132]还提供了包含本文所述的第一ch3结构域和第二ch3结构域中任一个的多特异性抗体。在一些实施方案中，本技术提供了双特异性t细胞衔接子(bite)分子，其包含特异性结合肿瘤抗原的第一抗原结合片段、特异性结合cd3的第二抗原结合片段和本文所述的任一个突变fc区。在一些实施方案中，本技术提供了双特异性t细胞衔接子(bite)分子，其包含特异性结合肿瘤抗原的第一抗原结合片段和第二抗原结合片段、特异性结合cd3的第三抗原结合片段和本文所述的任一个突变fc区。在一些实施方案中，本技术提供了特异性结合cd20和cd3的多特异性(例如，双特异性或三特异性)抗体。在一些实施方案中，本技术提供了特异性结合her2和cd3的双特异性抗体。在一些实施方案中，本技术提供了特异性结合cd3和bcma的多特异性(例如，双特异性或三特异性)抗体。任何合适的抗原结合片段可用于本文所述的多特异性抗体，包括例如国际申请第pct/us2018/044778号或国际申请第pct/us2020/015311号中描述的抗cd20和抗cd3抗原结合片段。[0133]在一些实施方案中，异多聚体蛋白质是异多聚体免疫粘附素。免疫粘附素是抗体样分子，其将蛋白质(诸如细胞表面受体)的结合结构域或配体(“粘附素”)与免疫球蛋白恒定结构域的效应子功能组合在一起。免疫粘附素可拥有人抗体的许多有价值的化学和生物特性。由于免疫粘附素可以由具有与适当的人免疫球蛋白铰链和恒定结构域(fc)序列相连的所需特异性的人蛋白质序列构建，因此可以完全使用人组分来实现目标结合特异性。在一些实施方案中，异多聚体蛋白质是多特异性免疫粘附素，例如双特异性免疫粘附素，即，免疫粘附素的两个臂具有不同的特异性。[0134]在一些实施方案中，异多聚体蛋白质是抗体‑免疫粘附素嵌合体。这些分子将免疫粘附素的结合区与抗体的结合结构域组合在一起。已在例如berg等人，pnas(usa)88:4723‑4727(1991)和chamow等人，j.immunol.153:4268(1994)中描述了示例性抗体‑免疫粘附素嵌合体。[0135]在一些实施方案中，异多聚体蛋白质是免疫粘附素或抗体‑免疫粘附素嵌合体，其包含一个或多个非抗体片段的结合结构域，诸如配体结合结构域、受体结合结构域或酶结构域。如本文中所用，术语“配体结合结构域”是指任何天然细胞表面受体或其任何区域或衍生物(其至少保持定性配体结合能力，优选相应天然受体的生物活性)。在一些实施方案中，受体来自具有与免疫球蛋白超家族成员同源的细胞外结构域的细胞表面多肽。其它典型的受体不是免疫球蛋白超家族的成员，但仍被该定义特别地涵盖，它们是细胞因子受体、具有酪氨酸激酶活性的受体(受体酪氨酸激酶)、血细胞生成素和神经生长因子受体超家族的成员以及细胞粘附分子，例如，(e‑、l‑和p‑)选择素。[0136]术语“受体结合结构域”是指受体的任何天然配体，包括细胞粘附分子，或这种天然配体的任何区域或衍生物(其至少保持定性的受体结合能力，优选相应天然配体的生物活性)。该定义，除其它以外，特别地包括来自上述受体的配体的结合序列。[0137]在一些实施方案中，提供了多特异性(例如，双特异性)免疫粘附素，其包含：(a)第一多肽，其从n末端至c末端包含：特异性结合第一靶标的第一结合结构域、第一ch2结构域和第一ch3结构域；(b)第二多肽，其从n末端至c末端包含：特异性结合第二靶标的第二结合结构域、第二ch2结构域和第二ch3结构域；其中第一ch3结构域包含相对于野生型ch3结构域在氨基酸位置354处利用大疏水氨基酸进行的取代，并且/或者第二ch3结构域包含相对于野生型ch3结构域在氨基酸位置347处利用带负电荷的氨基酸进行的取代，并且其中氨基酸残基编号基于eu编号。在一些实施方案中，大疏水氨基酸是y、f或w。在一些实施方案中，带负电荷的氨基酸是d或e。在一些实施方案中，氨基酸位置354处的大疏水氨基酸与第二ch3结构域中的氨基酸残基形成疏水相互作用。在一些实施方案中，第二ch3结构域在氨基酸位置349(例如，y349)处包含大疏水残基。在一些实施方案中，氨基酸位置347处的带负电荷的氨基酸与第一ch3结构域中的氨基酸残基形成离子键。在一些实施方案中，第一ch3结构域在氨基酸位置360(例如，k360)处包含带正电荷的残基。在一些实施方案中，第一和第二ch3结构域是人ch3结构域、鼠ch3结构域、大鼠ch3结构域、骆驼ch3结构域或兔ch3结构域。在一些实施方案中，第一ch3结构域和第二ch3结构域还包含kih残基，诸如t366y和y407t。在一些实施方案中，第一结合结构域和第二结合结构域是受体结合结构域。在一些实施方案中，第一结合结构域和第二结合结构域是配体结合结构域。在一些实施方案中，第一结合结构域是受体结合结构域，第二结合结构域是配体结合结构域，或者第一结合结构域是配体结合结构域，第二结合结构域是受体结合结构域。[0138]在一些实施方案中，提供了多特异性(例如，双特异性)免疫粘附素，其包含：(a)第一多肽，其从n末端至c末端包含：特异性结合第一靶标的第一结合结构域、第一ch2结构域和第一ch3结构域；(b)第二多肽，其从n末端至c末端包含：特异性结合第二靶标的第二结合结构域、第二ch2结构域和第二ch3结构域；其中第一ch3结构域包含大疏水氨基酸对s354的取代，并且/或者第二ch3结构域包含带负电荷的氨基酸对q347的取代，并且其中氨基酸残基编号基于eu编号。在一些实施方案中，大疏水氨基酸是y、f或w。在一些实施方案中，带负电荷的氨基酸是d或e。在一些实施方案中，氨基酸位置354处的大疏水氨基酸与第二ch3结构域中的氨基酸残基形成疏水相互作用。在一些实施方案中，第二ch3结构域在氨基酸位置349(例如，y349)处包含大疏水残基。在一些实施方案中，氨基酸位置347处的带负电荷的氨基酸与第一ch3结构域中的氨基酸残基形成离子键。在一些实施方案中，第一ch3结构域在氨基酸位置360(例如，k360)处包含带正电荷的残基。在一些实施方案中，第一ch3结构域和第二ch3结构域还包含kih残基，诸如t366y和y407t。在一些实施方案中，第一结合结构域和第二结合结构域是受体结合结构域。在一些实施方案中，第一结合结构域和第二结合结构域是配体结合结构域。在一些实施方案中，第一结合结构域是受体结合结构域，第二结合结构域是配体结合结构域，或者第一结合结构域是配体结合结构域，第二结合结构域是受体结合结构域。[0139]在一些实施方案中，提供了多特异性(例如，双特异性)免疫粘附素，其包含：(a)第一多肽，其从n末端至c末端包含：特异性结合第一靶标的第一结合结构域、第一ch2结构域和第一ch3结构域；(b)第二多肽，其从n‑端到c末端包含：特异性结合第二靶标的第二结合结构域、第二ch2结构域和第二ch3结构域；其中：(i)第一ch3结构域包含s354y和t366y，第二ch3结构域包含q347e和y407t，或者(ii)第一ch3结构域包含s354y和y407t，第二ch3结构域包含q347e和t366y，并且其中氨基酸残基编号基于eu编号。在一些实施方案中，第一ch3结构域的s354y与第二ch3结构域中的氨基酸残基形成疏水相互作用。在一些实施方案中，第二ch3结构域在氨基酸位置349(例如，y349)处包含大疏水残基。在一些实施方案中，第二ch3结构域的q347e与第一ch3结构域中的氨基酸残基形成离子键。在一些实施方案中，第一ch3结构域在氨基酸位置360(例如，k360)处包含带正电荷的残基。在一些实施方案中，第二ch3结构域不包含y349的取代，例如y349s。在一些实施方案中，与野生型人ch3结构域相比，第一ch3和第二ch3不包含其它突变。在一些实施方案中，第一结合结构域和第二结合结构域是受体结合结构域。在一些实施方案中，第一结合结构域和第二结合结构域是配体结合结构域。在一些实施方案中，第一结合结构域是受体结合结构域，第二结合结构域是配体结合结构域，或者第一结合结构域是配体结合结构域，第二结合结构域是受体结合结构域。[0140]本文所述的多特异性抗体和多特异性免疫粘附素可以特异性结合表位、抗原或靶分子的任何合适的组合。在一些实施方案中，第一靶标、第二靶标、第三靶标和第四靶标是相同的表位。在一些实施方案中，第一靶标、第二靶标、第三靶标和/或第四靶标是相同抗原的不同表位。在一些实施方案中，第一靶标、第二靶标、第三靶标和第四靶标是不同的抗原。在一些实施方案中，第一靶、第二靶、第三靶和第四靶是不同的靶分子。[0141]在一些实施方案中，第一靶标、第二靶标、第三靶标和/或第四靶标是细胞表面分子。在一些实施方案中，第一靶标、第二靶标、第三靶标和/或第四靶标是肿瘤抗原。肿瘤抗原是由肿瘤细胞产生的蛋白质，其可以引发免疫反应，特别是t细胞介导的免疫反应。本发明靶向抗原的选择将取决于待治疗癌症的具体类型。示例性肿瘤抗原包括例如神经胶质瘤相关抗原、癌胚抗原(cea)、β‑人绒毛膜促性腺激素、甲胎蛋白(afp)、凝集素反应性afp、甲状腺球蛋白、rage‑1、mn‑caix、人端粒酶逆转录酶、ru1、ru2(as)、肠羧基酯酶、muthsp70‑2、m‑csf、前列腺酶、前列腺特异性抗原(psa)、pap、ny‑eso‑1、lage‑la、p53、前列腺素、psma、her2/neu、存活素和端粒酶、前列腺癌肿瘤抗原‑1(pcta‑1)、mage、elf2m、嗜中性粒细胞弹性蛋白酶、ephrinb2、cd22、胰岛素生长因子(igf‑i)、igf‑ii、igf‑i受体和间皮素。[0142]在一些实施方案中，肿瘤抗原包含一个或多个与恶性肿瘤相关的抗原性癌症表位。恶性肿瘤表达许多可作为免疫攻击的靶抗原的蛋白质。这些分子包括但不限于组织特异性抗原，诸如黑色素瘤中的mart‑1、酪氨酸酶和gp100以及前列腺癌中的前列腺酸性磷酸酶(pap)和前列腺特异性抗原(psa)。其它靶分子属于转化相关分子(诸如癌基因her2/neu/erbb‑2)的组。另一组靶抗原是瘤胎抗原(onco‑fetalantigen)，诸如癌胚抗原(cea)。在b细胞淋巴瘤中，肿瘤特异性独特型免疫球蛋白构成了真正的肿瘤特异性免疫球蛋白抗原，所述抗原是个体肿瘤所独有的。诸如cd19、cd20和cd37等b细胞分化抗原是b细胞淋巴瘤中靶抗原的其它候选者。[0143]在一些实施方案中，肿瘤抗原是肿瘤特异性抗原(tsa)或肿瘤相关抗原(taa)。tsa是肿瘤细胞所独有的，不会发生在身体的其它细胞上。taa不是肿瘤细胞所独有的，相反，其也在不能诱导对抗原的免疫耐受状态的条件下在正常细胞上表达。抗原在肿瘤上的表达可能在使免疫系统能够对抗原做出反应的条件下发生。taa可以是在胎儿发育过程中，当免疫系统不成熟且无法应答时，在正常细胞上表达的抗原，或者它们可以是正常情况下在正常细胞上以极低水平存在，但在肿瘤细胞上以高得多的水平表达的抗原。[0144]tsa或taa抗原的非限制性实例包括以下抗原：诸如mart‑1/melana(mart‑i)、gp100(pmel17)、酪氨酸酶、trp‑1、trp‑2等分化抗原和诸如mage‑1、mage‑3、bage、gage‑1、gage‑2、pl5等肿瘤特异性多谱系抗原；诸如cea等过表达的胚胎抗原；诸如p53、ras、her2/neu等过表达的癌基因和突变的肿瘤抑制基因；染色体易位导致的独特肿瘤抗原，诸如bcr‑abl、e2a‑prl、h4‑ret、igh‑igk、myl‑rar；以及病毒抗原，诸如eb病毒抗原ebva和人乳头瘤病毒(hpv)抗原e6和e7。其它基于蛋白质的大抗原包括tsp‑180、mage‑4、mage‑5、mage‑6、rage、ny‑eso、pl85erbb2、pl80erbb‑3、c‑met、nm‑23hi、psa、tag‑72、ca19‑9、ca72‑4、cam17.1、numa、k‑ras、β‑连环蛋白、cdk4、mum‑1、p15、p16、43‑9f、5t4、791tgp72、甲胎蛋白、β‑hcg、bca225、btaa、ca125、ca15‑3\ca27.29\bcaa、ca195、ca242、ca‑50、cam43、cd68\p1、co‑029、fgf‑5、g250、ga733\epcam、htgp‑175、m344、ma‑50、mg7‑ag、mov18、nb/70k、ny‑co‑1、rcas1、sdccag16、ta‑90\mac‑2结合蛋白\环孢素c相关蛋白、taal6、tag72、tlp和tps。[0145]在一些实施方案中，第一靶标、第二靶标、第三靶标和/或第四靶标是免疫检查点分子，诸如刺激性免疫检查点分子或抑制性免疫检查点分子。示例性刺激免疫检查点分子包括但不限于cd28、ox40、icos、gitr、4‑1bb、cd27、cd40、cd3、hvem和tcr(例如，mhci类或ii类分子)。示例性抑制性免疫检查点分子包括但不限于ctla‑4、tim‑3、a2a受体、lag‑3、btla、kir、pd‑1、ido、cd47及其配体，诸如b7.1、b7.2、pd‑l1、pd‑l2、hvem、b7‑h4、nktr‑218和sirp‑α受体。[0146]在一些实施方案中，第一靶标、第二靶标、第三靶标和/或第四靶标是免疫效应细胞(诸如t细胞、b细胞、巨噬细胞或天然杀伤细胞)上的抗原。在一些实施方案中，第一靶标、第二靶标、第三靶标或第四靶标是cd3。在一些实施方案中，第一靶标是cd3，第二靶标是肿瘤抗原，或者第一靶标是肿瘤抗原，第二靶标是cd3。在一些实施方案中，第一靶标是cd3，第二靶标和第三靶标是肿瘤抗原。[0147]还提供了本文所述的任一种异多聚体蛋白质的单个多肽。[0148]在一些实施方案中，提供了包含抗体ch3结构域的多肽，其中ch3结构域包含相对于野生型ch3结构域在氨基酸位置354处利用大疏水氨基酸进行的取代和/或相对于野生型ch3结构域在氨基酸位置347处利用带负电荷的氨基酸进行的取代，并且其中与包含野生型ch3结构域的多肽相比，该多肽形成同二聚体的能力降低。在一些实施方案中，大疏水氨基酸是y、f或w。在一些实施方案中，带负电荷的氨基酸是d或e。在一些实施方案中，ch3结构域是人ch3结构域、鼠ch3结构域、大鼠ch3结构域、骆驼ch3结构域或兔ch3结构域。在一些实施方案中，ch3结构域还包含kih残基，诸如t366y或y407t。在一些实施方案中，多肽包含ch2结构域。在一些实施方案中，多肽包含抗体重链。[0149]在一些实施方案中，提供了包含人抗体ch3结构域的多肽，其中ch3结构域包含大疏水氨基酸对s354的取代和/或带负电荷的氨基酸对q347的取代，并且其中与包含野生型ch3结构域的多肽相比，所述多肽形成同二聚体的能力降低。在一些实施方案中，ch3结构域包含选自由以下组成的组的取代：s354y、s354f和s354w。在一些实施方案中，ch3结构域包含选自由以下组成的组的取代：q347e和q347d。在一些实施方案中，ch3结构域还包含kih残基，诸如t366y或y407t。在一些实施方案中，多肽包含ch2结构域。在一些实施方案中，多肽包含抗体重链。[0150]本文还提供了上述任一种异多聚体蛋白质或多肽的变体和衍生物。[0151]在一些实施方案中，设想了本文提供的异多聚体蛋白质(例如，多特异性抗体)的氨基酸序列变体。例如，可能希望提高异多聚体蛋白质的结合亲和力和/或其它生物学特性。异多聚体蛋白质的氨基酸序列变体可以通过将适当的修饰引入到编码异多聚体蛋白质的核苷酸序列中或通过肽合成来制备。此类修饰包括例如异多聚体蛋白质氨基酸序列内残基的缺失和/或插入和/或取代。可进行缺失、插入和取代的任意组合以获得最终的构建体，前体条件是最终的构建体具有所需的特性，例如，抗原结合。[0152]在一些实施方案中，提供了具有一个或多个氨基酸取代的异多聚体蛋白质变体。用于取代诱变的目标位点包括多特异性抗体的cdr和fr。可将氨基酸取代引入到目标多特异性抗体中，并筛选产物的所需活性，例如，保持/提高抗原结合和裂解、降低免疫原性或改善adcc或cdc。[0153]保守取代如下表2所示。[0154]表2：保守取代[0155][0156]氨基酸可根据共同侧链性质分为不同的类别:[0157]a.疏水：正亮氨酸、met、ala、val、leu、ile[0158]b.中性亲水：cys、ser、thr、asn、gln[0159]c.酸性：asp、glu[0160]d.碱性：his、lys、arg[0161]e.影响链取向的残基：gly、pro[0162]f.芳族：trp、tyr、phe。[0163]非保守取代将需要用这些类别之一的成员替换另一个类别的。[0164]在一些实施方案中，可以在一个或多个cdr内发生取代、插入或缺失，只要此类改变不实质性降低多特异性抗体结合抗原的能力。例如，可以对cdr进行不实质性降低结合亲和力的保守性改变(例如，如本文提供的保守性取代)。此类改变可以在hvr“热点”或sdr的外部。[0165]一种可用于鉴定抗体中可以作为诱变靶位的残基或区域的方法称为“丙氨酸扫描诱变”，如由cunningham和wells(1989)science,244:1081‑1085所述。在此方法中，鉴定残基或靶残基的组(例如，带电荷的残基诸如arg、asp、his、lys和glu)，并用中性或带负电荷的氨基酸(例如，丙氨酸或聚丙氨酸)替代以确定抗体与抗原的相互作用是否受到影响。可以在对初始取代显示功能敏感性的氨基酸位置引入进一步的取代。可选地或另外地，可以确定抗原‑抗体复合物的晶体结构，以鉴定抗体与抗原之间的接触点。可以靶向或消除此类接触残基和邻近残基作为取代的候选者。可以筛选变体以确定它们是否包含所需的特性。[0166]氨基酸序列插入包括长度在一个残基至包含一百个或更多个残基的多肽的范围内的氨基‑和/或羧基‑末端融合，以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的实例包括具有n末端甲硫氨酰基残基的异多聚体蛋白质。异多聚体蛋白质的其它插入变体包括异多聚体蛋白质的n‑或c‑末端与酶(例如，对于adept)或多肽的融合，所述多肽延长了异多聚体蛋白质的血清半衰期。[0167]异多聚体蛋白质变体也被提供予氨基末端前导延伸。例如，氨基末端前导序列的一个或多个氨基酸残基存在于抗体的任一个或多个重链或轻链的氨基末端上。[0168]异多聚体蛋白质的共价修饰也包括在本发明的范围内。异多聚体蛋白质的共价修饰可通过使异多聚体蛋白质或其片段的靶向氨基酸残基与有机衍生剂反应而引入分子中，所述有机衍生剂能够与选定的侧链或者n‑或c‑末端残基反应。异多聚体蛋白质的另一种类型的共价修饰包括改变多肽的天然糖基化模式。例如，可以删除在原始异多聚体蛋白质中发现的一个或多个碳水化合物部分，并且/或者可以添加一个或多个在原始异多聚体蛋白质中不存在的糖基化位点。通过改变氨基酸序列使其包含一个或多个n连接的糖基化位点，可以方便地实现糖基化位点至异多聚体蛋白质中的添加。还可通过向原始异多聚体蛋白质序列(对于o‑连接的糖基化位点)中添加一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基或者用一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基进行取代来进行所述改变。例如，异多聚体蛋白质的氨基酸序列可通过dna水平上的变化，例如，通过在预选的碱基上突变编码异多聚体蛋白质的dna，使得产生将翻译成所需氨基酸的密码子来改变。增加异多聚体蛋白质上碳水化合物部分的数量的另一种方法是通过糖苷与多肽的化学或酶促偶联。这些方法描述于wo87/05330以及aplin和wriston,crccrit.rev.biochem，第259‑306页(1981)中。异多聚体蛋白质上存在的碳水化合物部分的去除可以通过化学或酶促方式完成。[0169]另一种类型的异多聚体蛋白质的共价修饰包括将异多聚体蛋白质连接到多种非蛋白质性质[0170]部分之一。适于异多聚体蛋白质衍生的部分包括但不限于水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性实例包括但不限于聚乙二醇(peg)、乙二醇/丙二醇的共聚物、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚‑1,3‑二氧戊环、聚‑1,3,6‑三噁烷、乙烯/马来酸酐共聚物、聚氨基酸(均聚物或无规共聚物)和葡聚糖或聚(正乙烯基吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、环氧丙烷/环氧乙烷共聚物、聚氧乙烯多元醇(例如，甘油)、聚乙烯醇及其混合物。聚乙二醇丙醛由于其在水中的稳定性，在生产中可能具有有利方面。聚合物可具有任何分子量，并且可以是支化的或未支化的。附接至异多聚体蛋白质上的聚合物的数量可以不同，如果附接了不止一个聚合物，则它们可以是相同或不同的分子。一般而言，可根据包括但不限于待改善的异多聚体蛋白质的特定性质或功能、异多聚体蛋白质衍生物是否将用于确定条件下的治疗等的考虑来确定用于衍生化的聚合物的数目和/或类型。[0171]iii.制备方法[0172]本技术还提供了制备异多聚体(例如，异二聚体)蛋白质，诸如多特异性抗体或免疫粘附素的方法。还提供了用于制备异多聚体蛋白质或其多肽的核酸、载体和宿主细胞。[0173]本文所述的异多聚体蛋白质可使用本领域任何已知的方法制备，所述方法包括下文和实施例中所述的方法。此类方法可包括培养包含编码第一和第二含有ch3的多肽的核酸的宿主细胞，使得所述多肽被细胞共表达。在某些实施方案中，编码第一和第二含有ch3的多肽的核酸以例如约1:1、1:2、2:1、1:3、3:1、1:4、4:1、1:5、5:1、1:6、6:1、1:7、7:1、1:8、8:1、1:9、9:1、1:10或10:1(摩尔∶摩尔)中的任一种比率提供给宿主细胞。在一些实施方案中，异多聚体蛋白质包含一个或多个抗体轻链。在一些实施方案中，异多聚体蛋白质包含由细胞共表达的第一重链、第二重链和共同轻链。在一些实施方案中，编码共同轻链的核酸和编码第一或第二重链的核酸以至少约1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1、7∶1、8∶1、9∶1或10∶1中的任一种的比率提供给宿主细胞。在一些实施方案中，编码第一重链的核酸、编码第二重链的核酸和编码共同轻链的核酸以约1∶1∶5的比率提供给宿主细胞。设想了改变核酸的比率可以增加异二聚体分子相对于同二聚体分子的产量。[0174]在一些实施方案中，提供了产生特异性结合第一靶标和第二靶标的异多聚体蛋白质的方法，所述方法包括：(a)提供包含特异性结合第一靶标的第一结合结构域和第一ch3结构域的第一多肽；以及(b)提供包含特异性结合第二靶的第二结合结构域和第二ch3结构域的第二多肽；其中：(i)第一ch3结构域包含相对于野生型ch3结构域在氨基酸位置354处利用大疏水氨基酸进行的取代，并且/或者第二ch3结构域包含相对于野生型ch3结构域在氨基酸位置347处利用带负电荷的氨基酸进行的取代；或者(ii)第一ch3结构域包含相对于野生型ch3结构域在氨基酸位置347处利用带负电荷的氨基酸进行的取代，并且/或者第二ch3结构域包含相对于野生型ch3结构域在氨基酸位置354处利用大疏水氨基酸进行的取代；并且其中氨基酸残基编号基于eu编号。在一些实施方案中，大疏水氨基酸是y、f或w。在一些实施方案中，带负电荷的氨基酸是d或e。在一些实施方案中，氨基酸位置354处的大疏水氨基酸与第二ch3结构域中的氨基酸残基形成疏水相互作用。在一些实施方案中，第二ch3结构域在氨基酸位置349(例如，y349)处包含大疏水残基。在一些实施方案中，氨基酸位置347处的带负电荷的氨基酸与第一ch3结构域中的氨基酸残基形成离子键。在一些实施方案中，第一ch3结构域在氨基酸位置360(例如，k360)处包含带正电荷的残基。在一些实施方案中，第一和第二ch3结构域是人ch3结构域。在一些实施方案中，氨基酸位置354处的取代是s354y。在一些实施方案中，氨基酸位置347处的取代是q347e。在一些实施方案中，第一ch3结构域和第二ch3结构域还包含kih残基，诸如t366y或y407t。[0175]在一些实施方案中，提供了产生特异性结合第一靶标和第二靶标的多特异性抗体的方法，所述方法包括：(a)提供第一重链，所述第一重链从n末端至c末端包含：vh1、第一ch1、第一ch2和第一ch3结构域；(b)提供第一轻链，所述第一轻链从n末端至c末端包含：vl1和cl；(c)第二重链，其从n末端至c末端包含：vh2、第二ch1、第二ch2和第二ch3结构域；以及(d)第二轻链，其从n末端至c末端包含：vl2和第二cl；其中vh1与vl1缔合形成特异性结合第一靶标的第一抗原结合位点，以及vh2与vl2缔合形成特异性结合第二靶标的第二抗原结合位点；其中：(i)第一ch3结构域包含相对于野生型ch3结构域在氨基酸位置354处利用大疏水氨基酸进行的取代，并且/或者第二ch3结构域包含相对于野生型ch3结构域在氨基酸位置347处利用带负电荷的氨基酸进行的取代；或者(ii)第一ch3结构域包含相对于野生型ch3结构域在氨基酸位置347处利用带负电荷的氨基酸进行的取代，并且/或者第二ch3结构域包含相对于野生型ch3结构域在氨基酸位置354处利用大疏水氨基酸进行的取代；并且其中氨基酸残基编号基于eu编号。在一些实施方案中，大疏水氨基酸是y、f或w。在一些实施方案中，带负电荷的氨基酸是d或e。在一些实施方案中，氨基酸位置354处的大疏水氨基酸与第二ch3结构域中的氨基酸残基形成疏水相互作用。在一些实施方案中，第二ch3结构域在氨基酸位置349(例如，y349)处包含大疏水残基。在一些实施方案中，氨基酸位置347处的带负电荷的氨基酸与第一ch3结构域中的氨基酸残基形成离子键。在一些实施方案中，第一ch3结构域在氨基酸位置360(例如，k360)处包含带正电荷的残基。在一些实施方案中，第一和第二ch3结构域是人ch3结构域。在一些实施方案中，氨基酸位置354处的取代是s354y。在一些实施方案中，氨基酸位置347处的取代是q347e。在一些实施方案中，第一ch3结构域和第二ch3结构域还包含kih残基，诸如t366y或y407t。在一些实施方案中，vl1和vl2具有相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，vl1和vl2具有不同的氨基酸序列。[0176]核酸[0177]本技术还提供了分离的核酸分子，其包含编码本文所述的异多聚体蛋白质(诸如多特异性抗体)的一条或多条多肽链的多核苷酸。[0178]寡核苷酸介导的诱变可用于制备编码第一或第二多肽的dna的取代变体。该技术是本领域所周知的，如adelman等人，dna,2:183(1983)中所描述的。简言之，通过将编码所需突变的寡核苷酸与dna模板杂交来改变第一或第二多肽dna，其中模板是含有未改变的或天然的异多聚体dna序列的质粒或噬菌体的单链形式。杂交后，使用dna聚合酶合成模板的完整第二互补链，从而并入寡核苷酸引物，并编码异多聚体dna中的选定改变。盒诱变可以如wells等人，gene34:315(1985)所述，通过用通过使互补寡核苷酸退火产生的合成突变片段替换目标dna区域来进行。pcr诱变也适用于制造第一或第二多肽dna的变体。[0179]在一些实施方案中，核酸分子包含编码异多聚体蛋白质的第一多肽或第二多肽的多核苷酸。在一些实施方案中，核酸分子包含编码异多聚体蛋白质的第一多肽的多核苷酸和编码异多聚体蛋白质的第二多肽的多核苷酸。在一些实施方案中，核酸分子包含编码多特异性抗体的重链或轻链的多核苷酸。在一些实施方案中，核酸分子包含编码多特异性抗体的重链和一条或多条轻链的多核苷酸。在一些实施方案中，第一核酸分子包含编码第一重链的第一多核苷酸，第二核酸分子包含编码第二重链的第二多核苷酸，以及第三核酸分子包含编码共同轻链的第三多核苷酸。在一些实施方案中，一种或多种核酸分子可操作地连接至启动子。在一些实施方案中，不同的核酸分子可操作地连接至不同的启动子。[0180]额外的启动子元件，例如增强子，调控转录起始的频率。通常，这些启动子位于起始位点上游30‑110bp的区域，尽管最近已显示许多启动子也包含起始位点下游的功能元件。启动子元件之间的间距通常是灵活的，因此当元件相对于彼此倒置或移动时，启动子功能得以保留。在胸苷激酶(tk)启动子中，在活性开始下降之前，启动子元件之间的间隔可以增加至相隔50bp。[0181]合适启动子的一个实例是立即早期巨细胞病毒(cmv)启动子序列。该启动子序列是强组成型启动子序列，其能够驱动与其有效连接的任何多核苷酸序列的高水平表达。合manual,coldspringharborlaboratory,newyork)以及其它病毒学和分子生物学手册中。可用作载体的病毒包括但不限于逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒和慢病毒。一般而言，合适的载体包含在至少一种生物体中起作用的复制起点、启动子序列、方便的限制性内切酶位点和一个或多个选择标记(参见，例如，wo01/96584；wo01/29058；和美国专利第6,326,193号)。[0192]通过一个或多个编码多肽的核酸表达异多聚体蛋白质可以通过将所述核酸插入合适的表达载体，使得所述核酸可操作地连接至5’和3’调控元件(包括例如启动子和3’非翻译区(utr))来实现。载体可以适合在真核宿主细胞中复制和整合。典型的克隆和表达载体包含转录和翻译终止子、起始序列和用于调控所需核酸序列表达的启动子。[0193]在一些实施方案中，选择经优化用于在cho细胞或cho衍生细胞或nso细胞中表达多肽的载体。例如，在runningdeer等人，biotechnol.prog.20:880‑889(2004)中描述了示例性的此类方法。[0194]为了评估多肽或其部分的表达，待引入细胞的表达载体也可以包含选择标记基因或报告基因或两者，以便于从寻求通过病毒载体转染或感染的细胞群中鉴定和选择表达细胞。在其它方面，选择标记可以携带在单独的dna片段上并用于共转染程序。选择标记和报告基因都可侧接适当的调控序列，以使得能够在宿主细胞中表达。有用的选择标记包括，例如，抗生素抗性基因，诸如neo等。[0195]报告基因用于鉴定潜在转染的细胞和评价调控序列的功能性。一般来说，报告基因是受体生物体或组织中不存在或不表达的基因，其编码其表达表现为一些易于检测的性质(例如，酶促活性)的多肽。在将dna引入受体细胞后的合适时间检测报告基因的表达。合适的报告基因可包括编码萤光素酶、β‑半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、分泌型碱性磷酸酶的基因或绿色荧光蛋白基因(例如，ui‑tel等人，2000febsletters479:79‑82)。合适的表达系统是公知的，并且可以使用已知技术制备或商业获得。一般来说，显示最高报告基因表达水平的具有最小5’侧翼区域的构建体被鉴定为启动子。此类启动子区域可以与报告基因连接，并用于评价剂的调节启动子驱动的转录的能力。[0196]宿主细胞[0197]本技术提供了包含本文所述的任一种异多聚体蛋白质(诸如多特异性抗体)、核酸分子或载体的分离的宿主细胞。[0198]本文所述的异多聚体蛋白质(诸如多特异性抗体)可在原核细胞(诸如细菌细胞)中或者在真核细胞(诸如真菌细胞(诸如酵母)、植物细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞)中表达。这种表达可以例如根据本领域已知的程序进行。可用于表达多肽的示例性真核细胞包括但不限于cos细胞，包括cos7细胞；293细胞，包括293‑6e细胞；cho细胞，包括cho‑s、dg44。lec13cho细胞和fut8cho细胞；per.细胞(crucell)；和nso细胞。合适的非哺乳动物宿主细胞包括原核生物(诸如大肠杆菌(e.coli)或枯草芽孢杆菌(b.subtillis))和酵母(诸如酿酒酵母(s.cerevisae)、裂殖酵母(s.pombe)；或乳酸克鲁维酵母(k.lactis))。在一些实施方案中，基于特定真核宿主细胞对抗体的重链和/或轻链进行所需翻译后修饰的能力来选择该所述特定真核宿主细胞。例如，在一些实施方案中，cho细胞产生的多肽相较于在293细胞中产生的相同多肽具有更高水平的唾液酸化。[0199]可以通过任何方法将一种或多种核酸引入所需的宿主细胞，所述方法包括但不限于磷酸钙转染、deae‑葡聚糖介导的转染、阳离子脂质介导的转染、电穿孔、转导、感染等。描述了非限制性的示例性方法描述于例如sambrook等人，molecularcloning,alaboratorymanual，第3版coldspringharborlaboratorypress(2001)中。根据任何合适的方法，核酸可以瞬时或稳定转染到所需的宿主细胞中。[0200]在一些实施方案中，在无细胞系统中产生异多聚体蛋白质。例如，在sitaraman等人，methodsmol.biol.498:229‑44(2009)；spirin,trendsbiotechnol.22:538‑45(2004)；endo等人，biotechnol.adv.21:695‑713(2003)中描述了非限制性示例性无细胞系统。[0201]纯化[0202]可使用标准技术从宿主细胞培养物中纯化异多聚体蛋白质。异多聚体蛋白质可以作为分泌蛋白从培养基中回收，尽管其也可以在没有分泌信号的情况下直接产生时从宿主细胞裂解物中回收。如果异多聚体蛋白质是膜结合的，则可以使用合适的去垢剂溶液将其从膜中释放出来。[0203]当异多聚体蛋白质除人来源的重组细胞外的重组细胞中产生时，其完全不含人来源的蛋白质或多肽。然而，有必要从重组细胞蛋白质或多肽中纯化异多聚体蛋白质，以获得就异多聚体蛋白质而言基本上同质的制剂。作为第一步骤，通常将培养基或裂解物离心以除去颗粒细胞碎片。[0204]具有抗体恒定结构域的异多聚体蛋白质可通过羟基磷灰石色谱、凝胶电泳、透析或亲和色谱方便地纯化。其它纯化技术包括但不限于色谱方法，诸如尺寸排阻、离子交换(例如，monoq)、疏水相互作用色谱、混合模式色谱(例如，反相/阴离子交换、反相/阳离子交换、亲水相互作用/阴离子交换、亲水相互作用/阳离子交换等)、硅胶色谱、肝素琼脂糖色谱、阴离子或阳离子交换树脂色谱(诸如聚天冬氨酸柱)、反相hplc、超速离心、乙醇沉淀、色谱聚焦、sds‑page和硫酸铵沉淀。合适的亲和配体包括结合抗体恒定区的配体。例如，蛋白a、蛋白g、蛋白a/g或抗体亲和柱可用于结合恒定区和纯化包含fc片段的抗体。在一些实施方案中，异多聚体蛋白质使用蛋白a珠粒纯化，随后用monoq柱纯化。[0205]iv.使用方法[0206]本文所述的异多聚体蛋白质(例如，多特异性抗体)可用于治疗和诊断。[0207]本文还提供了包含本文所述的任一种异多聚体蛋白质、核酸、载体或宿主细胞的组合物(诸如药物组合物)。在一些实施方案中，异多聚体蛋白质可以配制在包含一种或多种药学上可接受的缓冲剂或赋形剂的药物组合物中。可向有需要的个体施用此类药物组合物以治疗疾病或疾患，预防疾病或疾患，或阻止疾病或疾患的症状发展。[0208]本文所述的异多聚体蛋白质的药物组合物可通过将具有所需纯度的异多聚体蛋白质与任选的药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂以冻干制剂或水溶液的形式混合来获得(remington'spharmaceuticalsciences第16版，osol,a.编辑(1980年))。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在采用的剂量和浓度下对接受者是无毒的，并且包括缓冲剂诸如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂(包括抗坏血酸和甲硫氨酸)；防腐剂(诸如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六烃季铵；氯化苯甲烃铵、氯化苄乙氧铵；苯酚、丁醇或苄醇；诸如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯的对羟基苯甲酸烷基酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3‑戊醇；及间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)的多肽；诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白的蛋白质；诸如聚乙烯吡咯烷酮的亲水性聚合物；诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸的氨基酸；单糖、二糖及其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；诸如edta的螯合剂；诸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇的糖类；诸如钠的成盐平衡离子；金属络合物(诸如zn‑蛋白质络合物)；和/或非离子型表面活性剂诸如tweentm、pluronicstm或聚乙二醇(peg)。wo97/04801中描述了适于皮下施用的冻干制剂。此类冻干制剂可用合适的稀释剂复溶成高蛋白质浓度，并且可将复溶的制剂施用于本文中待成像、诊断或治疗的个体。用于体内施用的药物组合物必须是无菌的。这很容易通过例如通过无菌过滤膜的过滤来实现。[0209]在一些实施方案中，提供了治疗有需要的个体的疾病的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的异多聚体蛋白质，所述异多聚体蛋白质包含：(a)第一多肽，其包含特异性结合第一靶标的第一结合结构域和第一ch3结构域；和(b)第二多肽，其包含特异性结合第二靶标的第二结合结构域和第二ch3结构域；其中第一ch3结构域包含相对于野生型ch3结构域在氨基酸位置354处利用大疏水氨基酸进行的取代，并且/或者第二ch3结构域包含相对于野生型ch3结构域在氨基酸位置347处利用带负电荷的氨基酸进行的取代，并且其中氨基酸残基编号基于eu编号。在一些实施方案中，大疏水氨基酸是y、f或w。在一些实施方案中，带负电荷的氨基酸是d或e。在一些实施方案中，氨基酸位置354处的大疏水氨基酸与第二ch3结构域中的氨基酸残基形成疏水相互作用。在一些实施方案中，第二ch3结构域在氨基酸位置349(例如，y349)处包含大疏水残基。在一些实施方案中，氨基酸位置347处的带负电荷的氨基酸与第一ch3结构域中的氨基酸残基形成离子键。在一些实施方案中，第一ch3结构域在氨基酸位置360(例如，k360)处包含带正电荷的残基。在一些实施方案中，第一和第二ch3结构域是人ch3结构域。在一些实施方案中，氨基酸位置354处的取代是s354y。在一些实施方案中，氨基酸位置347处的取代是q347e。在一些实施方案中，第一ch3结构域和第二ch3结构域还包含kih残基，诸如t366y或y407t。在一些实施方案中，第一靶标是肿瘤抗原(例如，cd20、her2或bcma)，并且第二靶标是cd3，或者第一靶标是cd3，并且第二靶标是肿瘤抗原(例如，cd20、her2或bcma)。在一些实施方案中，疾病是癌症。[0210]在一些实施方案中，提供了治疗有需要的个体的疾病的方法，所述方法包括向个体施用有效量的多特异性抗体，所述多特异性抗体包含：(a)第一重链，其从n末端至c末端包含：vh1、第一ch1、第一ch2和第一ch3结构域；(b)第一轻链，其从n末端至c末端包含：vl1和cl；(c)第二重链，其从n末端至c末端包含：vh2、第二ch1、第二ch2和第二ch3结构域；和(d)第二轻链，其从n末端至c末端包含：vl2和第二cl；其中vh1与vl1缔合形成特异性结合第一靶标的第一抗原结合位点，以及vh2与vl2缔合形成特异性结合第二靶标的第二抗原结合位点；其中第一ch3结构域包含相对于野生型ch3结构域在氨基酸位置354处利用大疏水氨基酸进行的取代，并且/或者第二ch3结构域包含相对于野生型ch3结构域在氨基酸位置347处利用带负电荷的氨基酸进行的取代；并且其中氨基酸残基编号基于eu编号。在一些实施方案中，大疏水氨基酸是y、f或w。在一些实施方案中，带负电荷的氨基酸是d或e。在一些实施方案中，氨基酸位置354处的大疏水氨基酸与第二ch3结构域中的氨基酸残基形成疏水相互作用。在一些实施方案中，第二ch3结构域在氨基酸位置349(例如，y349)处包含大疏水残基。在一些实施方案中，氨基酸位置347处的带负电荷的氨基酸与第一ch3结构域中的氨基酸残基形成离子键。在一些实施方案中，第一ch3结构域在氨基酸位置360(例如，k360)处包含带正电荷的残基。在一些实施方案中，第一和第二ch3结构域是人ch3结构域。在一些实施方案中，氨基酸位置354处的取代是s354y。在一些实施方案中，氨基酸位置347处的取代是q347e。在一些实施方案中，第一ch3结构域和第二ch3结构域还包含kih残基，诸如t366y或y407t。在一些实施方案中，vl1和vl2具有相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，vl1和vl2具有不同的氨基酸序列。在一些实施方案中，第一靶标是肿瘤抗原(例如，cd20、her2或bcma)，并且第二靶标是cd3，或者第一靶标是cd3，并且第二靶标是肿瘤抗原(例如，cd20、her2或bcma)。在一些实施方案中，疾病是癌症。[0211]在一些实施方案中，异多聚体蛋白质用于诊断测定。例如，异多聚体蛋白质可用于夹心测定，所述夹心测定涉及使用两种分子，每种分子能够结合待检测的样品的不同免疫原性部分或表位。在夹心测定中，测试样品分析物被固定在固体支持物上的异多聚体蛋白质的第一臂结合，此后异多聚体蛋白质的第二臂结合分析物，从而形成不溶性三部分复合物。异多聚体的第二个臂本身可以用可检测部分标记(直接夹心测定)，或者可以使用用可检测部分标记的抗免疫球蛋白抗体测量(间接夹心测定)。例如，夹心测定的一种类型是elisa测定，在这种情况下，可检测的部分是酶。[0212]v.试剂盒和制品[0213]还提供了可用于本文所述的任一种制备、诊断和治疗方法的试剂盒，包括包含本文所述的任一种异多聚体蛋白质(例如，多特异性抗体)的试剂盒。[0214]本技术的试剂盒在合适的包装中。合适的包装包括但不限于小瓶、瓶、罐、柔性包装(例如，密封的mylar或塑料袋)等。试剂盒可以任选地提供额外的组分，诸如试剂、缓冲液和解释信息。[0215]因此，本技术还提供了制品。制品可包括容器和插在容器上或伴随容器的标签或包装。合适的容器包括小瓶(诸如密封小瓶)、瓶、罐、软包装等。在一些实施方案中，容器容纳药物组合物，并且可具有无菌入口(例如，所述容器可以是具有皮下注射针头可刺穿的塞子的静脉注射溶液袋或小瓶)。标签或包装说明书标明所述组合物用于诊断(包括确定风险)、治疗或预防个体的疾病或疾患。标签可以指示各种组分的复溶和/或使用的方向。容纳药物组合物的容器可以是多用途小瓶，其允许复溶制剂的重复施用(例如2至6次施用)。包装说明书是指通常包含在诊断和/或治疗产品的商业包装中的说明书，其包含关于此类产品的适应症、用法、剂量、施用、禁忌症和/或使用警告的信息。另外，制品还可包括第二容器，其包含药学上可接受的缓冲液，诸如抑菌注射用水(bwfi)、磷酸盐缓冲盐水、林格氏(ringer's)溶液和葡萄糖溶液。其还可包括在商业和使用者看来所需的其它材料，包括其它缓冲液、稀释剂、过滤器、针头和注射器。[0216]试剂盒或制品可包括以足以在药房，例如医院药房和配制药房储存和使用的量包装的多个单位剂量的药物组合物和使用说明。[0217]实施例[0218]下面的实施例仅仅是本发明的示例，并因此不应该被认为是以任何方式限制本发明。以下实施例和详细描述是作为说明而非限制提供的。[0219]实施例1.cd20/cd3双特异性抗体的制备、纯化和表征[0220]根据图3的流程图制备和表征双特异性cd20/cd3抗体。[0221]在第一形式(图1的s1)中，制备了两种共同轻链cd20/cd3抗体。v2cd20/cd3抗体在第一重链中具有kih残基t366y，并且在第二重链中具有y407t残基。v4bcd20/cd3抗体在第一重链中具有t336y和s354y，并且在第二重链中具有y407t和q347e。[0222]以1:1:2或1:1:5的第一重链(h1):第二重链(h2):共同轻链比将编码重链和轻链的载体瞬时转染到expi293细胞或cho细胞中。培养并诱导宿主细胞分泌双特异性抗体。将含有双特异性抗体的细胞培养物的上清液以3000rpm离心10分钟，然后用0.45μm的膜过滤上清液样品。[0223]然后使用两步色谱方案(包括第一蛋白a纯化步骤和monoq步骤)从上清液样品中纯化出双特异性抗体。在蛋白a纯化步骤中，首先用10个柱体积(cv)的缓冲液a(pbsph＝7.4)平衡akta纯化系统。将上清液加载到蛋白a纯化柱上，并用10cv的缓冲液a洗涤该柱。用缓冲液b(0.1m甘氨酸，ph＝2.5)洗脱双特异性抗体，并收集并合并峰级分。将合并的抗体样品在pbs中透析两次。[0224]在monoq步骤中，首先将抗体样品交换到缓冲液a’(20mmtris‑cl,ph＝9)中。然后用缓冲液a’平衡akta纯化系统。抗体样品被加载到monoq柱上，随后用5cv的缓冲液a’洗涤该柱。使用由缓冲液a’和缓冲液b’((20mmtris‑cl,1mnacl,ph＝9)建立的盐梯度，用0‑25％的缓冲液b’在50分钟内以0.4ml/min的流速从monoq柱上洗脱双特异性抗体。收集并合并峰级分。然后将纯化的双特异性抗体缓冲液交换到pbs中。[0225]使用t细胞活化测定证实了来自monoq柱的纯化的双特异性抗体级分。简言之，将raji(人b淋巴细胞)和jurkat(人t淋巴细胞)细胞分别以1x105个细胞/孔接种到96孔板中。将稀释的双特异性抗体样品加入平板，并在37℃、5％co2孵育箱中孵育17小时。用含有0.1％bsa的pbs以1200rpm洗涤该板一次，持续5分钟。然后将cd69‑pe加入到平板，并在室温下孵育30分钟。随后用含有0.1％bsa的pbs以1200rpm洗涤该板一次，持续5分钟。在bdcalibur读板仪上于fl2通道中从平板读取cd69 信号。[0226]三批cd20/cd3双特异性抗体的表达水平和每个纯化步骤的收率如下表3所示。作为参考，利妥昔单抗以约130mg/l从同一表达系统中表达。图4显示了来自三种cd20/cd3双特异性抗体的monoq纯化步骤的色谱图。将s354y和q349e突变引入fc将双特异性抗体的总收率从67.8％(仅kih突变)提高到86.8％(kih s354y和q349e)。如图6所示，v4b构建体的高收率和提高的异二聚体形成率在不同批次的双特异性抗体制备中是可再现的。[0227]表3.cd20/cd3双特异性抗体的表达水平和纯化收率。[0228][0229]纯化的cd20/cd3v4b双特异性抗体的表征显示了高纯度(图5b、图5d、图5e)、t细胞活化活性(图5c)、热稳定性和抗聚集性(图5f)。[0230]实施例2.her2/cd3双特异性抗体的制备、纯化和表征[0231]包含一个抗her2fab的her2/cd3双特异性抗体[0232]包含一个抗her2fab、一个抗cd3fab和一个fc结构域的her2/cd3双特异性抗体(“her2‑b3/cd3bsab”，图8)是通过用表达her2‑b3hc‑v4b‑旋钮、cd3‑hc‑v4b‑孔和共同轻链的质粒共转染expi293细胞制备的。转染后96小时，表达水平被测定为152ug/ml。收集培养上清液，并在蛋白a柱上纯化igg。然后将纯化的样品加载到阳离子交换色谱柱(cex)上。梯度洗脱后，双特异性抗体作为通过cex检测到的主峰出现(图9)。通过十二烷基硫酸钠‑聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds‑page)进一步分析纯化的级分。sds‑page结果显示主cex峰的级分纯度相对较高(图10)。[0233]包含两个抗her2fab的her2/cd3双特异性抗体[0234]制备了包含两个抗her2fab的her2/cd3双特异性抗体(“her2‑b3‑v3/cd3”)(图11)。[0235]对肿瘤细胞具有高亲和力的双特异性抗体的抗肿瘤抗原臂通常可以杀死表达正常水平的抗原的健康非肿瘤细胞。为了消除这种类型的离瘤效应(off‑tumoreffect)，开发了新形式的双特异性抗体，其中肿瘤靶向臂具有两个拷贝的fab结构域，并因此对肿瘤抗原变为二价(图11)。在这种三结构域双特异性(tdb)形式(2:1)中，肿瘤结合区对肿瘤抗原的亲和力相对较低，因此其与具有较低密度的肿瘤抗原的健康细胞的结合更弱。[0236]用表达her2(2fabs)‑ch‑v4b‑旋钮、cd3‑ch‑v4b‑孔和共同轻链dna的质粒共转染expi293细胞。收集培养基，并在转染后96小时，使用probelife测定表达水平为158ug/ml。用蛋白a柱纯化双特异性抗体her2‑b3‑v3/cd3。然后将纯化的样品加载到阳离子交换柱(cex)上进行第二次纯化。梯度洗脱后，双特异性抗体作为主峰出现(图12)。纯化的级分通过sds‑page进一步分析(图13)。非还原性sds‑page结果表明，cex纯化后仅显示一条大小约为200kd的条带，这与her2‑b3‑v3/cd3(具有两个her2fab)的大小一致。还原性sds‑page结果清楚地显示双特异性抗体的三条链，这也与其相应的大小一致。[0237]实施例3.bcma/cd3双特异性抗体的制备、纯化和表征[0238]制备bcma/cd3双特异性抗体。从美洲驼噬菌体文库中淘选出的抗bcmavhh与人fc‑v4b‑旋钮连接，形成bcma‑fc链。bcma‑fc链与cd3‑hc‑v4b‑孔及其轻链一起形成了新的igg样双特异性抗体。两种bcma/cd3igg样双特异性抗体的示意图如图14所示。在图14的左边是bcma‑3e5/cd3，仅包含一个bcma‑vhh(3e5)。在图14的右边是bcma‑3e1b2/cd3，包含两个bcma‑vhh(3e1和3b2)。[0239]为了制备bcma/cd3双特异性抗体，用表达bcma(3e5)‑fc‑v4b‑旋钮(或bcma(3e1b2)‑fc‑v4b‑旋钮)、cd3‑ch‑v4b‑孔和cd3lc的质粒共转染expi293细胞。收集培养基，并使用probelife测定bcma‑3e5/cd3的表达水平为62ug/ml，并且bcma‑3e1b2/cd3的表达水平为54ug/ml。[0240]收集培养上清液，并在蛋白a柱上纯化两种双特异性抗体。对两种bcma‑fc/cd3双特异性抗体进行sds‑page(图15)。结果表明，bcma/cd3双特异性抗体均成功表达，并有一些cd3同二聚体形成(大小约为150kd；参见图15)。在还原性sds‑page结果中，基于它们的分子量检测到cd3‑vh‑v4b‑孔、bcma‑fc和共同轻链(图15)。[0241]进行进一步的实验来纯化和表征bcma/cd3双特异性抗体。首先，优化转染中表达三条链的三种质粒的比率。三种质粒比率的优化增加了双特异性抗体异二聚体的百分比。利用优化的质粒比率，表达bcma/cd3双特异性抗体，并在蛋白a柱上以及通过cex纯化bcma/cd3双特异性抗体。通过sds‑page评估bcma/cd3双特异性抗体纯度。[0242]实施例4.具有fc突变的cd20/cd3双特异性抗体的制备、纯化和表征[0243]产生了在fc区中具有突变的cd20/cd3双特异性抗体。针对抗cd20重链的突变是表4所示。针对抗cd3重链的突变在表5所示。[0244]表4.抗cd20重链fc突变。[0245][0246]表5.抗cd3重链fc突变。[0247][0248][0249]具有fc突变的抗cd20重链和抗cd3重链的所有13种组合都与其共同轻链一起重组表达。测量上清液中抗体的浓度，所述抗体浓度如表6所示。[0250]表6.突变体组合的igg上清液浓度。[0251][0252][0253]在进一步的实验中表征具有上述fc突变组合的cd20/cd3双特异性抗体。评估cd20/cd3双特异性抗体对t细胞活化的活性。鉴定并选择t细胞活化活性与cd20/cd3野生型(a1b1)相似或比其更高的fc突变体组合。[0254]将所选择的cd20/cd3突变体组合重组表达，纯化，通过sds‑page进行分析。鉴定并选择纯度(即，异二聚体百分比)与a1b1相似或比其更高的的fc突变体组合。[0255]使用下面实施例5中描述的方法评估所选择的cd20/cd3突变体组合的热稳定性和聚集潜力。通过差示扫描荧光测定法和静态光散射来评估热稳定性。通过动态光散射(dls)评估聚集潜力。鉴定并选择热稳定性与a1b1相似或比其更好并且聚集潜力与a1b1相似或比其更低的突变体组合。[0256]实施例5.材料和方法[0257]以下实施例展现了用于生产和表征双特异性抗体的材料和方法。[0258]通过转染expi293ftm细胞重组表达双特异性抗体[0259]如下所述，使用gibcotmexpifectaminetm293转染试剂盒(目录号a14524)表达双特异性抗体。[0260]对于每30‑ml转染，在25.5mlexpi293tm表达培养基中使用7.5×107个细胞。为了在第二天转染细胞，将细胞以2.0×106个活细胞/ml的密度接种，并在37℃下在空气中8％co2的潮湿气氛中以125rpm在定轨振荡器上旋转孵育。转染当天，使用自动细胞计数器或台盼蓝染料排除法测定细胞的数量和活力。为了进行转染，细胞的存活力必须大于95％。计算含有一次转染所需细胞数(每30‑ml转染7.5×107个细胞)的细胞悬浮液的体积。向每个无菌一次性125‑mlerlenmeyer摇瓶中加入适当体积的细胞悬液，并通过为每30‑ml的转染添加新鲜、预温热的expi293tm表达培养基，使体积达到25.5ml。将细胞放回孵育箱。[0261]对于每30‑ml的转染，如下制备脂质‑dna复合物：将30μg的于opti‑memtmi还原血清培养基(目录号31985‑062)中的质粒dna稀释至1.5ml的总体积，并轻轻混合。将80μlexpifectaminetm293试剂在opti‑memtmi培养基中稀释至总体积为1.5ml，并轻轻混合并在室温下孵育5分钟。孵育5分钟后，将稀释的dna加入到稀释的expifectaminetm293试剂中，获得3ml的总体积，并轻轻混合。将dna‑expifectaminetm293试剂混合物在室温下孵育20‑30分钟，以允许dna‑expifectaminetm293试剂复合物形成。[0262]在完成dna‑expifectaminetm293试剂复合物孵育后，从上述制备的脂质‑dna复合物向每个摇瓶中加入3mldna‑expifectaminetm293试剂复合物。向阴性对照烧瓶中加入3mlopti‑memtmi培养基，而不是dna‑expifectaminetm293试剂复合物。每个烧瓶含有28.5ml的总体积。将细胞在37℃的孵育箱中在空气中8％的co2的潮湿气氛中以125rpm在定轨振荡器上旋转孵育。[0263]转染后约16‑18小时，向每个烧瓶中加入150μlexpifectaminetm293转染增强剂1和1.5mlexpifectaminetm293转染增强剂2。每个125‑ml烧瓶中的最终体积约为30ml。转染后约72‑96小时开始收获培养基，并测定其重组蛋白表达。[0264]用蛋白a柱纯化双特异性抗体[0265]为了在蛋白a柱上纯化双特异性抗体，转染后72‑96小时，将表达培养基以3000rpm离心10分钟，然后用0.45μm的膜过滤上清液。[0266]如下使用纯蛋白纯化系统。平衡纯化系统，泵b填充有缓冲液b(0.1m甘氨酸，ph＝2.5)，并且泵a和样品泵填充有缓冲液a(pbs,ph＝7.4)。然后建立蛋白质a纯化柱(来自ge的hitrap蛋白ahp柱，目录号：17040201或17040301)，并用10个柱体积(cv)的缓冲液a进行平衡。将上清液通过样品泵加载到柱中，对于1ml柱，流速为1ml/分钟，并且对于5ml柱，流速为3ml/分钟。样品加载后，用10cv的缓冲液a洗涤该柱。用100％缓冲液b洗脱抗体，并用1/10体积的1mtrisph＝8收集峰级分。将柱用5cv的缓冲液b洗涤，然后用10cv的缓冲液a洗涤。将柱在4℃下用20％乙醇填充储存，并系统用20％乙醇填充储存。[0267]将洗脱的ab的选定的峰级分合并并在pbs中透析两次。然后纯化的抗体准备进行第二纯化步骤。[0268]通过阳离子交换色谱(cex)进行的第二纯化双特异性抗体[0269]将抗体以1:10稀释(在pbs中)至缓冲液1(20mmnaxh(3‑x)po4,ph＝7.4)。平衡纯化系统，泵b填充有缓冲液2(20mmnaxh(3‑x)po4,1mnacl,ph＝7.4)，并且泵a和样品泵填充有缓冲液1。设置porostmgopuretmhs预填充柱(thermofisher，目录号：a36637)并用缓冲液1进行平衡。[0270]将稀释的抗体样品通过样品泵以1.6ml/分钟的流速加载到柱，并在样品加载后用5cv的缓冲液1洗涤。对于盐梯度洗脱，在40分钟内以1.6ml/分钟的流速使用0‑20％的缓冲液2。收集峰级分(通常为1ml/小瓶)。将柱用5cv的缓冲液2洗涤，然后用10cv的缓冲液1洗涤。将柱在4℃下用20％乙醇填充储存，并在20％乙醇中平衡系统。合并峰级分，并针对pbs透析。[0271]sds‑page测定[0272]对于非还原性sds‑page，向样品中加入4倍的加载缓冲液，以获得1倍的样品准备加载。对于还原性sds‑page，向样品中加入8％体积的β‑巯基乙醇，充分混合，在95℃加热5分钟，然后将样品准备用于加载。将样品加载到凝胶孔，旁边是蛋白质标记(proteinmarker)。将样品在200v下运行50分钟。凝胶用instantbluetm蛋白质染色溶液染色1小时，然后用水洗涤一次。[0273]热稳定性(dsf/sls)和聚集潜力(dls)测定[0274]将纯化的双特异性抗体样品提交给uncle系统(unchainedlabs)进行分析。在25℃下测量动态光散射(dls)，并使用uncle分析软件计算和分析数据。对于差示扫描荧光测定法/静态光散射(dsf/sls)测定法，在25℃至95℃的监控下进行1℃/min的温度斜坡(temperatureramp)。uncle测量了266nm和473nm处的sls。tm和tagg也使用uncle分析软件进行了计算和分析。当前第1页12当前第1页12
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