一种检测胸膜肺炎放线杆菌和多杀性巴氏杆菌的引物组合、试剂盒及应用的制作方法

1.本发明涉及分子生物学技术领域，具体而言，涉及一种检测胸膜肺炎放线杆菌和多杀性巴氏杆菌的引物组合、试剂盒及应用。


背景技术：

2.胸膜肺炎放线杆菌(actinobacillus pleuropneumoniae，app)有两个生物型，其中生物i型是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nad)依赖性细菌，有13个血清型，是主要的致病血清型。猪感染app后，主要表现为胸膜肺炎，急性爆发后伴有很高的发病率和死亡率；康复后的病猪会伴有肺炎，导致生长停滞而且会长期带菌，成为其他健康猪的传染源。
3.多杀性巴氏杆菌(pasteurella multocida，pm)是人畜共患病巴氏杆菌病的主要病原，也是猪肺疫的病原。该病死亡率较高，主要引起成年猪的急性败血症，有时也可导致慢性呼吸道症状，致使猪群生长缓慢，严重影响饲料的报酬。
4.鉴于这两种疾病都会给养猪产业造成巨大损失，所以对其建立准确快速的诊断方法非常有意义。目前，我国对于这两种疾病的检测包括传统方法和分子生物学方法，前者包括血清学方法和病原分离，这两种方法费时费力，敏感性和特异性都比较差。而现有的分子生物学方法虽然通过对app、pm单重pcr可以一定程度上的提供检测的灵敏度和特异性，然而其检测灵敏度仍然不高，且需要通过两次扩增才能实现app、pm的检测。
5.鉴于此，特提出本发明。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于提供一种检测胸膜肺炎放线杆菌和多杀性巴氏杆菌的引物组合、试剂盒及应用以解决上述技术问题。
7.本发明是这样实现的：
8.本发明提供了一种检测胸膜肺炎放线杆菌和多杀性巴氏杆菌的引物组合，其包括用于检测胸膜肺炎放线杆菌的第一引物对，和/或用于检测多杀性巴氏杆菌的第二引物对；第一引物对具有如seq id no.1-2所示的序列，第二引物对具有如seq id no.3-4所示的序列。
9.发明人基于胸膜肺炎放线杆菌和多杀性巴氏杆菌的16s rrna基因序列，利用primer 5.0引物设计软件设计，进一步筛选出特异性好、灵敏度高的引物对。
10.第一引物对的序列如下：
11.seq id no.1：tggagggggataactacggg，上游引物；
12.seq id no.2：ctggaccgtgtctcagttcc，下游引物，扩增片段的大小为198bp；
13.第二引物对的序列如下：
14.seq id no.3：aactgcagctaataccgcgt，上游引物；
15.seq id no.4：ttaaaagttcgcctgcgtgc，下游引物，扩增片段的大小为436bp。
16.经过实验验证，上述检测引物组合检测app、pm的最低灵敏度可以达到5.11
×
102拷贝/μl、4.90
×
102拷贝/μl。
17.本发明还提供了一种检测胸膜肺炎放线杆菌和多杀性巴氏杆菌的试剂盒，其包括上述的引物组合。上述引物组合可以是冻干的试剂、溶液试剂、悬浮液等形态。
18.在本发明应用较佳的实施方式中，上述试剂盒还包括扩增反应缓冲液。扩增反应缓冲液可以选自市售的pcr反应缓冲液，例如hifitaq。
19.在其他实施方式中，上述试剂盒还包括水。
20.在本发明应用较佳的实施方式中，上述试剂盒还包括纳米粒子。纳米粒子为胶体金纳米粒子。
21.发明人发现：将纳米颗粒添加到pcr反应体系中，可以进一步地提高pcr体系的导热系数，改善引物与模板的结合反应，进而提高pcr体系的灵敏度和特异性。
22.在本发明应用较佳的实施方式中，上述纳米粒子的平均粒径为18-40nm；优选地，纳米粒子的平均粒径为18-23nm；更优选地，纳米粒子的平均粒径为20-23nm。
23.当纳米粒子的平均粒径为20-23nm时，加入两种检测引物对同时进行一次pcr扩增，其扩增出的产物条带最亮，也即选择平均粒径为20-23nm的纳米粒子可以更好的提高pcr体系的导热系数，改善引物与模板的结合反应，进而大幅提高pcr体系的灵敏度和特异性。
24.本发明还提供了一种胸膜肺炎放线杆菌和多杀性巴氏杆菌的试剂盒应用，上述应用以非疾病的诊断为目的，该应用包括：以待测样本的基因组为模板，采用上述的引物组合进行pcr扩增，pcr扩增前，还包括向反应液中加入纳米粒子。
25.待测样本包括不限于：猪舍环境样本等。该样本用于病原体的流行病溯源、流调等。
26.在本发明应用较佳的实施方式中，上述pcr扩增的退火温度为55℃-58℃；优选地，pcr扩增的退火温度为57℃。
27.当退火温度为55℃-58℃时，上述引物对可以同时扩增出app和pm目的片段，且扩增的产物在电泳图上片段清晰可辨，无杂带。而57℃为筛选出的更优的退火温度。
28.在一种可选的实施方式中，单独扩增app的最适退火温度为56℃，单独扩增pm的最适退火温度为58℃。
29.在本发明应用较佳的实施方式中，上述pcr扩增前，还包括向反应液中加入纳米粒子，纳米粒子的添加体积为1-2.5μl；纳米粒子的终浓度为100-105μg/μl。当纳米粒子的添加体积和浓度在上述范围内时，可以更好的提高pcr体系的导热系数，改善引物与模板的结合反应，进而大幅提高pcr体系的灵敏度和特异性。
30.在一种可选的实施方式中，上述纳米粒子的添加体积为2.5μl。
31.在本发明应用较佳的实施方式中，上述pcr扩增的反应体系包括：0.5-1μl的10-15mmol/l的第一引物对，0.5-1μl的10-15mmol/l的第二引物对和0.1-2μl的模板。
32.在本发明应用较佳的实施方式中，上述pcr扩增的反应条件为：95-99℃3min；95-96℃30-45s，退火温度55-57℃30-35s，70-72℃30-35s，共35个循环；70-72℃5-10min。
33.本发明具有以下有益效果：
34.本发明提供了一种胸膜肺炎放线杆菌和多杀性巴氏杆菌的检测引物组合，该检测
引物组合同时可以实现胸膜肺炎放线杆菌和多杀性巴氏杆菌高特异性检出。该检测引物稳定性强，可重复性好，可以适用多种检测场景下的快速检测。本发明还提供了一种新的试剂盒及其应用方法，相比于现有的方法，纳米粒子的添加可以更好地提高pcr体系的导热系数，改善引物与模板的结合反应，进而大幅提高pcr体系的灵敏度和特异性。本发明提供的引物组合及其试剂盒仅需一次pcr扩增并在一个pcr扩增体系下就可以同时实现猪胸膜肺炎放线杆菌、多杀性巴氏杆菌的检出，极大程度上节约了检测成本和检测时间，有利于检测效率的提高，可在日常工作中应用。
35.整体上，本发明提供的试剂盒及其应用更为简单易行，与荧光定量pcr方法相比，本发明提供的方法对于设备要求更低，更适于推广和应用。
附图说明
36.为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
37.图1为用于扩增app的第一引物对在不同退火温度下的扩增产物的电泳结果图；
38.图2为用于扩增app的第三引物对在不同退火温度下的扩增产物的电泳结果图；
39.图3为用于扩增pm的第二引物在不同退火温度下的扩增产物的电泳结果图；
40.图4为用于扩增pm的第四引物在不同退火温度下的扩增产物的电泳结果图；
41.图5为app、pm重组质粒的pcr验证结果图；
42.图6为添加不同直径的纳米粒子进行扩增反应后的电泳图；
43.图7为添加不同浓度的纳米粒子进行扩增反应后的电泳图；
44.图8为重组质粒普通pcr灵敏度验证结果图；
45.图9为重组质粒在添加了纳米粒子后的pcr灵敏度验证结果图；
46.图10为重组质粒特异性验证结果图；
47.图11为重组质粒重复性验证结果图。
具体实施方式
48.为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
49.以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
50.试验试剂及仪器
51.试剂：引物由上海生工生物工程有限公司合成；dl5000 dna marker购于大连宝生物；dp302细菌基因组dna提取试剂盒、质粒小提试剂盒、dna纯化回收试剂盒均购于北京天根生化科技有限公司，2
×
hifitaq高保真预混pcr反应体系购自北京四正柏生物技术有限公司，胶体金纳米颗粒购自加拿大cytodiagnostics公司，peasy-t1载体购于全式金生物技术有限公司。
52.仪器：美国赛默飞微量高速离心机，美国赛默飞abi veriti pcr仪，上海天能凝胶成像系统，上海天能水平电泳系统等，nanodrop2000。
53.病料：实验室自留的app、pm阳性样本。
54.实施例1
55.本实施例提供了引物的设计和筛选过程。
56.(1)引物的设计。
57.在ncbi网站上分别获得app的16s rrna、pm的16s rrna基因序列，利用primer 5.0引物设计软件设计引物，筛选出针对app、pm的引物各1对，其引物序列及扩增目的片段的大小见表1。引物序列由上海生工合成。
58.用于扩增app的第一引物对的序列如下：
59.seq id no.1：tggagggggataactacggg，上游引物；
60.seq id no.2：ctggaccgtgtctcagttcc，下游引物，扩增片段的大小为198bp。
61.用于扩增app的第三引物对的序列如下：
62.seq id no.5：actgagacacggtccagact，上游引物
63.seq id no.6：gtgccctttacgcccagtta，下游引物，扩增片段大小为260bp。
64.用于扩增pm的第二引物对的序列如下：
65.seq id no.3：aactgcagctaataccgcgt，上游引物；
66.seq id no.4：ttaaaagttcgcctgcgtgc，下游引物，扩增片段的大小为436bp。
67.用于扩增pm的第四引物对的序列如下：
68.seq id no.7：taaaggcctaccaagcctgc，上游引物；
69.seq id no.8：ctcgcaccctccgtattacc，下游引物，扩增片段的大小为288bp。
70.表1引物序列表。
[0071][0072]
(2)菌种的复苏。
[0073]
选用lb培养基，加入50ml/l犊牛血清和40mg/kg的nad，然后用灭菌棉签分别接种实验室留存的app、pm阳性样本，并做好标记，置于37℃培养箱中培养24h后放4℃冰箱保存备用。
[0074]
(3)扩增模板的制备。
[0075]
根据天根dp302细菌基因组dna提取试剂盒的说明书步骤，分别提取步骤(2)培养基中app的基因组和pm的基因组，放于4℃备用。
[0076]
(4)扩增体系。
[0077]
app、pm单重pcr反应体系为25μl:2
×
hifitaq高保真预混12.5μl，根据表1的4对引物，分别添加其上、下游引物(25pmol/l)各1.0μl，dna 1.0μl模板(5.4pg/μl)，ddh2o补至25μl。pcr反应程序：95℃5min；95℃45s，退火温度(设计52℃、54℃、56℃、58℃、60℃共5个退火温度实验组)35s，72℃35s，共35个循环；72℃10min。pcr结束后，分别取5μl的pcr扩增产物于2％的琼脂糖凝胶中进行电泳鉴定。app两对引物对和pm两对引物对的扩增结果分别参照图1、图2、图3和图4所示。m：dl5000marker，1:阴性对照(ddh2o)，2-6：52℃，54℃，56℃，58℃，60℃退火温度下的扩增产物的电泳结果图。
[0078]
结果显示，检测app的第一对检测引物和pm的第二对检测引物都能扩增出目的片段，分别为198bp、436bp。其最佳退火温度分别为56℃和58℃，且目的片段清晰，无杂带，说明该引物可以应用于实验室的单重pcr检测。用于扩增app的第三对引物无目的片段的扩增，用于扩增pm的第四对引物扩增结果有杂带，说明该引物不能用于实验室的单重pcr检测，予以排除。
[0079]
实验例1
[0080]
本实施例提供了重组质粒标准品的构建方法。
[0081]
采用普通pcr法，按照实施例1记载的最适退火温度分别扩增app、pm的目的片段，反应体系分别为50μl。扩增反应完成后，利用北京天根生化的胶回收试剂盒，对扩增产物进行胶回收纯化，与peasy-t1载体连接，然后从-80℃取50μl trans1-t1感受态细胞，加入5μl待连接的pcr产物，冰浴30min，42℃热休克90s，再冰浴2min，加入500μl不含抗生素的lb液体培养基，37℃250r/min震荡培养1h。之后用移液枪吸取30μl均匀涂布于含50μg/ml氨苄的lb固体平板上，37℃培养12h。从上述转化培养的平板中挑取白色单菌落，接种于15ml含氨苄的lb液体培养基，37℃250r/min震荡培养过夜(培养时间不超过16h)，离心去上清后收集菌体，提取质粒，提取步骤参照北京天根生化的小提质粒试剂盒。
[0082]
通过上述方法分别获得app和pm的重组质粒，利用实施例1最佳的退火温度和条件进行pcr鉴定。
[0083]
结果参照图5所示，两个重组质粒都能扩增出目的片段，并将构建好的质粒在菌种保护剂作用下保存于-80℃冰箱备用。
[0084]
m：dl5000 marker,1:阴性对照(ddh2o)，2:app重组质粒扩增电泳图；3.pm重组质粒扩增电泳图。
[0085]
实验例2
[0086]
本实施例建立了纳米pcr扩增体系。
[0087]
去离子水作为阴性对照，提取好的app和pm基因组(app的模板浓度为45ng/μl，pm的模板浓度为50ng/μl)，总反应体系为25μl，2
×
hifitaq 12.5μl，上下游引物(10mmol/l，包括第一引物对和第二引物对)各1μl，模板1μl，然后分别添加平均直径为18-20nm、20-23nm、20-40nm、40-60nm的胶体金纳米粒子进行pcr扩增，pcr扩增条件参照实施例1。
[0088]
pcr扩增产物上样电泳图参照图6所示，图6可知最佳的纳米平均直径为20-23nm。m：dl5000 marker；1：阴性对照，2-6：直径为18-20nm、20-23nm、20-40nm、40-60nm的纳米pcr
扩增结果。
[0089]
再用平均直径为20-23nm纳米的胶体金纳米粒子以1.0μl依次递增0.5μl至2.5μl，确定最佳纳米的反应量为2.5μl，纳米粒子浓度为100μg/μl，然后通过电泳图片进行结果分析。反应条件均为95℃3min；95℃45s，退火温度57℃35s，72℃35s，共35个循环；72℃10min。
[0090]
电泳图参照图7所示，图7可知，2.5μl添加量下，pcr扩增结果条带更亮。图7中，m：dl5000 marker；1：阴性对照，2-6：纳米浓度为1.0μl、1.5μl、2.0μl、2.5μl的纳米pcr扩增结果。
[0091]
实验例3
[0092]
本实验例进行pcr引物对的灵敏度验证实验。
[0093]
利用nanodrop 2000测量实验例1提取的app和pm的重组质粒，二者的初始浓度分别为5.11
×
109拷贝/μl和4.90
×
109拷贝/μl。分别10倍的倍比稀释两种质粒标准品。稀释度分别为10-3
、10-4
、10-5
、10-6
、10-7
、10-8
。
[0094]
按照实施例1提供的方法进行普通pcr，按照实验例2提供的pcr扩增体系进行pcr检测，扩增条件参照实验例2。
[0095]
扩增产物进行电泳，参照图8所示，普通pcr可检测到稀释倍数为10-5
，可检测得到的app的最小浓度为5.11
×
104拷贝/μl，pm的最小可检测得到的浓度为4.90
×
104拷贝/μl。m：dl5000 marker；1-6:稀释倍数分别为10-3
、10-4
、10-5
、10-6
、10-7
、10-8
的pcr扩增结果。pm扩增产物的条带大小为436bp，app扩增产物的条带大小为198bp。
[0096]
而按照实验例2提供的pcr扩增体系进行pcr检测，结果参照图9所示。可检测到稀释倍数为10-7
，app的最小浓度为5.11
×
102拷贝/μl，pm的最小可检测得到的浓度为4.90
×
102拷贝/μl。也即添加纳米粒子后的pcr反应体系的灵敏度比普通pcr高了100倍。表明本实验例建立的app、pm pcr反应体系敏感性较高。m：dl5000marker；1-6:稀释倍数分别为10-3
、10-4
、10-5
、10-6
、10-7
、10-8
的pcr扩增结果。
[0097]
实验例4
[0098]
本实验例进行pcr引物对的特异性验证实验。
[0099]
副猪嗜血杆菌、大肠杆菌、葡萄球菌、绿脓杆菌、奇异变形杆菌的dna模板为实验室自留，利用实施例1的扩增方法分别对app和pm重组质粒标准品、副猪嗜血杆菌、大肠杆菌、葡萄球菌、绿脓杆菌、奇异变形杆菌的dna模板进行扩增。结果参照图10所示，只有重组质粒标准品扩增出了app、pm的目的片段，副猪嗜血杆菌、大肠杆菌、葡萄球菌、绿脓杆菌、奇异变形杆菌的dna模板无扩增条带。表明本发明提供的pcr引物对特异性强。
[0100]
图10中，m：dl5000 marker；1:阴性对照(ddh2o),2:app、pm重组质粒标准品纳米双重pcr扩增图；3-7分别为副猪嗜血杆菌、大肠杆菌、葡萄球菌、绿脓杆菌、奇异变形杆菌dna模板的pcr扩增结果。
[0101]
实验例5
[0102]
本实验例进行pcr引物对的重复性验证实验。
[0103]
对实验室自留的3份app、pm都为阳性的样品进行验证，结果参照图11所示。3份均为阳性，表明该扩增方法重复性好，可以用于实验室日常检测。
[0104]
图11中，m：dl5000 marker；1：阴性对照(ddh2o)，2-4：不同样品的pcr扩增结果。
[0105]
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技
术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。