一种土壤激发菌剂固定化微球及其制备方法与流程

1.本发明涉及微生物固定化技术领域，具体涉及一种土壤激发菌剂固定化微球及其制备方法。


背景技术：

2.农作物的生产与热量、光照、降水等气候因素以及土壤因素息息相关，其中土壤因素是人为可控的重要因素之一。研究表明，有利于作物生产的土壤因素包括充足的营养元素、疏松的土壤结构、丰富的土壤生物类群等，其中土壤生物类群包括了土壤动物和土壤微生物。一些学者和科研人员通过将微生物制剂应用于田间，优化了土壤生物丰富度，改良了土壤结构和营养元素供应，促进了作物生长并提高了产量。
3.然而，传统的微生物制剂多为液态产品，体积大而笨重，不利于长时间保存和长距离运输，进而对微生物制剂的大规模田间应用提出挑战。目前市面上还未见广泛推广使用的固态微生物制剂产品。一种新型的轻型、耐保存的固态微生物制剂产品亟待被开发。
4.公开号为cn 112646801 a的专利申请公开一种微生物固定化微球的制备方法，用微生物固定化技术，以生物炭为载体，采用吸附-交联-包埋的方法制备菌剂，但是固定化微球菌剂保存六个月后，有效活菌数从425亿cfu/ml下降至仅大于1亿cfu/g，长时间保存有效活菌数较低。


技术实现要素：

5.本发明所要解决的技术问题在于现有技术中微生物固定化微球长时间保存有效活菌数较低，提供一种土壤激发菌剂固定化微球及其制备方法。
6.本发明通过以下技术手段实现解决上述技术问题：
7.一种土壤激发菌剂固定化微球，主要由激发菌剂包覆剂和交联助剂制成，所述激发菌剂包覆剂与交联助剂的质量比为1:1；所述激发菌剂包覆剂主要以下重量份数的原料制成：海藻酸钠10-15份、羧甲基纤维素钠0-5份、助构剂0-10份、激发菌剂菌体2.5-4份和水972-982份；所述羧甲基纤维素钠和助构剂不同时为0份；
8.所述交联助剂由10-40份氯化钙和960-990份水制成，所述助构剂为高岭土或凹凸棒土。
9.有益效果：本发明所用材料天然、绿色、环保、安全、无副作用，在干燥环境中可保存180天以上不降解，菌剂活力仍可保持90％以上。
10.海藻酸钠在钙离子作用下交联形成海藻酸钙凝胶，而在田间含磷环境中，磷酸根与钙离子的高亲和力使凝胶中的钙离子被夺取，进而导致凝胶的降解。若适逢潮湿的环境，则可有助于该过程的发生，使固定化微球在田间环境中可快速自然降解，释放土壤激发菌剂，激发土壤潜力。
11.若氯化钙的重量份数低于上述值，交联反应慢，时间长，包覆剂中的组分，特别是菌体会逸散到交联助剂中，效果变差，若氯化钙的重量份数高于上述值，氯化钙的消耗量
多，成本提高。
12.当添加羧甲基纤维素钠时，本发明中的羧甲基纤维素钠作为纤维素的羧甲基化衍生产物，有助于维持菌剂降解纤维素的活力，同时作为增稠剂可以更好的促进微球的形成。若不添加羧甲基纤维素钠或助构剂，形成的微球干燥后会坍缩成膜状而不能成球形。若助构剂的添加量超过上述值时，会过多地填充凝胶空隙，压缩用以保存菌体的空间，导致产品有效性降低。
13.本发明使用凹凸棒土或高岭土，作为吸附细菌和支撑凝胶结构的成分，可以提高形成微球的反应速率，且本发明中的微球可以保持颗粒形状而不扁平成膜。
14.优选地，所述激发菌剂包括产氮假单胞菌cgmcc 1.7377(pseudomonas azotoformans)和大肠埃希氏菌cgmcc 1.12873(escherichia coli)，二者的有效菌落形成单位(cfu)比例为1:1。
15.有益效果：本发明中所用菌剂为具有纤维素降解功能的细菌生物材料，所用羧甲基纤维素钠，对于所用的具有纤维素降解功能的激发菌剂具有刺激其纤维素降解能力的作用。
16.产氮假单胞菌cgmcc 1.7377天然可降解纤维素，纤维素酶基因修饰的大肠埃希氏菌cgmcc 1.12873。在常规营养条件下，纤维素不作为细菌首选的碳源，而在不含常规碳源(如蔗糖、葡萄糖等)、只含有纤维素时，可降解纤维素的细菌会特异性地分泌降解纤维素的酶，如纤维素酶等，这对于产品施用到田间即可发挥作用无疑是有利的。
17.上述土壤激发菌剂固定化微球的制备方法，包括以下步骤：
18.(1)激发菌剂菌体：将激发菌剂接种于液体培养基，于28-30℃或30-37℃、转速为180-230rpm条件下振荡培养20-22h，离心，获得激发菌剂菌体；
19.(2)将羧甲基纤维素钠或助构剂与海藻酸钠、水混合，杀菌后，得到无菌的激发菌剂包覆溶液；
20.(3)将步骤(1)中的激发菌剂菌体与步骤(2)中的激发菌剂包覆溶液混合，得到激发菌剂包覆剂，然后滴加到交联助剂中，常温静置交联，交联后得到固定化水凝微球；
21.(4)将步骤(3)得到的固定化水凝微球于无菌条件下风干，得到土壤激发菌剂固定化微球。
22.有益效果：本发明制备简单、操作简便、成本低廉，可规模化生产。
23.本发明中添加羧甲基纤维素钠的处理在滴入交联助剂时交联的速度更快，形成的微球更加圆润饱满，产品得到改进。
24.本发明中使用的凹凸棒土或高岭土，作为吸附细菌和支撑凝胶结构的成分，使相应的处理在滴入交联助剂的瞬间即可形成微球，反应效率极大提高，且形成的微球在干燥后仍可保持颗粒形状而不扁平成膜，同时较高的密度使微球迅速沉入交联助剂底部，保证了交联的顺利进行。
25.本发明所用材料天然、绿色、环保、安全、无副作用，在干燥环境中可保存180天以上不降解，并维持菌剂生活力。
26.海藻酸钠在钙离子作用下交联形成海藻酸钙凝胶，而在田间含磷环境中，磷酸根与钙离子的高亲和力使凝胶中的钙离子被夺取，进而导致凝胶的降解。若适逢潮湿的环境，则可有助于该过程的发生，使固定化微球在田间环境中可快速自然降解，释放土壤激发菌
剂，激发土壤潜力。
27.若氯化钙的重量份数低于上述值，交联反应慢，时间长，包覆剂中的组分，特别是菌体会逸散到交联助剂中，效果变差，若氯化钙的重量份数高于上述值，氯化钙的消耗量多，成本提高。
28.当添加羧甲基纤维素钠时，本发明中的羧甲基纤维素钠作为纤维素的羧甲基化衍生产物，有助于维持菌剂降解纤维素的活力，同时作为增稠剂可以更好的促进微球的形成。若不添加羧甲基纤维素钠或助构剂，形成的微球干燥后会坍缩成膜状而不能成球形。若助构剂的添加量超过上述值时，会过多地填充凝胶空隙，压缩用以保存菌体的空间，导致产品有效性降低。
29.本发明中包覆的菌剂对制备过程中的温度、酸碱性、生物洁净度等要求较高，本发明通过杀菌步骤排除了来自外界生物因素的干扰。
30.根据不同的激发菌剂菌体设置不同的培养温度。
31.优选地，所述步骤(1)中液体培养基为yep培养基。
32.优选地，所述yep培养基由以下重量份数的原料制成：蛋白胨10份，酵母提取物10份，牛肉浸粉5份，水975份。
33.优选地，所述步骤(1)中于4℃、5000rpm条件下离心10min。
34.优选地，所述步骤(2)中杀菌条件为：经过103.4kpa、121℃高温蒸气处理20-30min。
35.有益效果：本发明通过高温杀菌步骤可以更好的促进海藻酸钠和羧甲基纤维素钠在水中溶解并分布均匀。
36.优选地，所述步骤(3)中激发菌剂菌体与激发菌剂包覆溶液以200-1500rpm转速搅拌10-60min。
37.优选地，所述步骤(3)中将激发菌剂包覆剂加到交联助剂时，滴出位置距离交联助剂液面高度为1-10厘米。
38.优选地，所述步骤(4)中在常温、无菌、通风、干燥的环境中自然风干。
39.有益效果：既提供了温和的干燥环境，又要求了生物洁净度。
40.优选地，所述激发菌剂为产氮假单胞菌cgmcc 1.7377(pseudomonas azotoformans)，所述步骤(1)中培养温度为28-30℃。
41.优选地，所述激发菌剂为大肠埃希氏菌cgmcc 1.12873(escherichia coli)，所述步骤(1)中培养温度为30-37℃。
42.本发明的优点在于：本发明所用材料天然、绿色、环保、安全、无副作用，在干燥环境中可保存180天以上不降解，菌剂活力仍可保持90％以上。
43.海藻酸钠在钙离子作用下交联形成海藻酸钙凝胶，而在田间含磷环境中，磷酸根与钙离子的高亲和力使凝胶中的钙离子被夺取，进而导致凝胶的降解。若适逢潮湿的环境，则可有助于该过程的发生，使固定化微球在田间环境中可快速自然降解，释放土壤激发菌剂，激发土壤潜力。
44.若氯化钙的重量份数低于上述值，交联反应慢，时间长，包覆剂中的组分，特别是菌体会逸散到交联助剂中，效果变差，若氯化钙的重量份数高于上述值，氯化钙的消耗量多，成本提高。
45.本发明中的羧甲基纤维素钠作为纤维素的羧甲基化衍生产物，可以更好的促进微球的形成。若不添加羧甲基纤维素钠和助构剂，形成的微球干燥后会坍缩成膜状而不能成球形。若助构剂的添加量超过上述值时，会过多地填充凝胶空隙，压缩用以保存菌体的空间，导致产品有效性降低。
46.本发明中使用的凹凸棒土或高岭土，作为吸附细菌和支撑凝胶结构的成分，使相应的处理在滴入交联助剂的瞬间即可形成微球，反应效率极大提高，且形成的微球在干燥后仍可保持颗粒形状而不扁平成膜，同时较高的密度使微球迅速沉入交联助剂底部，保证了交联的顺利进行。
47.本发明中所用菌剂为具有纤维素降解功能的细菌生物材料，所用羧甲基纤维素钠，对于所用的具有纤维素降解功能的激发菌剂具有刺激其纤维素降解能力的作用。
48.产氮假单胞菌cgmcc 1.7377天然可降解纤维素，纤维素酶基因修饰的大肠埃希氏菌cgmcc 1.12873。在常规营养条件下，纤维素不作为细菌首选的碳源，而在不含常规碳源(如蔗糖、葡萄糖等)、只含有纤维素时，可降解纤维素的细菌会特异性地分泌降解纤维素的酶，如纤维素酶等，这对于产品施用到田间即可发挥作用无疑是有利的。
附图说明
49.图1为本发明对比例1、实施例1-实施例4中土壤激发菌剂固定化水凝微球的图像；其中a)对比例1；b)实施例1；c)实施例2；d)实施例3；e)实施例4。短的和长的标尺长度分别为5mm和10mm。
50.图2为本发明对比例1、实施例1-实施例4中自然风干干燥的土壤激发菌剂固定化微球的图像；其中a)对比例1；b)实施例1；c)实施例2；d)实施例3；e)实施例4。短的和长的标尺长度分别为5mm和10mm。
51.图3为实施例1和实施例2中土壤激发菌剂固定化水凝微球冷冻干燥后观察的电镜图像。其中a)微球表面电镜图像(125
×
)；b)微球表面电镜图像(10000
×
)；c)微球表面电镜图像(3000
×
)；d)微球内部结构电镜图像(137
×
)；a-c为实施例1，d为实施例2；
52.图4为对比例1、实施例1-实施例4交联时的图像；其中a)对比例1；b)实施例1；c)实施例2；d)实施例3；e)实施例4。每行的三张图片从左至右的交联时间分别为1分钟、3分钟和10分钟。
53.图5是本发明实施例3中土壤激发菌剂固定化微球对土壤激发菌剂菌活力的保持效果对比曲线，其中对照组为未固定化的土壤激发菌剂水悬液中的菌活力。
54.本发明中产氮假单胞菌cgmcc 1.7377(pseudomonas azotoformans)和大肠埃希氏菌cgmcc 1.12873(escherichia coli)为公知公用材料，均购买自中国普通微生物菌种保藏中心。
具体实施方式
55.为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
56.下述实施例中所用的试验材料和试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
57.实施例中未注明具体技术或条件者，均可以按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。
58.实施例1
59.土壤激发菌剂固定化微球，由土壤激发菌剂包覆剂和交联助剂交联固定化形成，其中土壤激发菌剂包覆剂包括以下重量份数的原料：海藻酸钠15份，羧甲基纤维素钠5份，菌剂3份，水977份，交联助剂1000份；交联助剂包括以下重量份数的原料：氯化钙20份，水980份。
60.上述土壤激发菌剂固定化微球的制备方法，具体包括以下步骤：
61.(1)以灭菌的通用yep液体培养基，取千分之一培养液体积的、处于对数生长期的菌种分别接入培养液中，利用温度为30℃、转速为220rpm的恒温振荡培养箱，振荡培养激发菌剂20小时；
62.(2)为确定产品对菌体存活力的影响，采用稀释后显微镜下细胞计数和稀释涂布平板的方法测定步骤(1)中液体培养基中的菌体数量，以温度为4℃、转速为5000rpm离心，富集得到土壤激发菌剂菌体；其中菌体包括大肠埃希氏菌cgmcc 1.12873菌体和产氮假单胞菌cgmcc 1.7377菌体，二者的有效菌落形成单位(cfu)比例为1:1；
63.(3)将海藻酸钠、羧甲基纤维素钠、凹凸棒土、高岭土和水按照上述质量比进行混合，经过103.4kpa、121℃高温蒸汽处理20分钟，使各组分材料充分溶解混合并灭菌，得到无菌的激发菌剂包覆溶液；
64.(4)将步骤(2)得到的土壤激发菌剂菌体与步骤(3)得到的无菌激发菌剂包覆溶液按照上述质量比进行混合，得到激发菌剂包覆剂；
65.由于培养的营养条件、温度、转速、时间等因素的差异，细菌的培养效果存在些许差异。在本发明实施例中，菌体的用量为每1000份包覆剂中含有10^10cfu菌体，实践经验发现，10^10cfu菌体的鲜重量一般在2.5-4.0g。在生产中，将菌体数量以重量份数的方式加以限制，更具可操作性和简便性。
66.(5)将步骤(4)得到的激发菌剂包覆剂逐滴加入到交联助剂中，常温静置交联2小时，得到土壤激发菌剂固定化水凝微球，如图1中b所示；
67.(6)将步骤(5)所得土壤激发菌剂固定化水凝微球置于常温、无菌、通风、干燥的环境中自然风干，得到干燥的土壤激发菌剂固定化微球，如图2中b所示。
68.实施例2
69.土壤激发菌剂固定化微球，由土壤激发菌剂包覆剂和交联助剂交联固定化形成，其中土壤激发菌剂包覆剂包括以下重量份数的原料：海藻酸钠15份，羧甲基纤维素钠5份，凹凸棒土5份，菌剂3份，水972份，交联助剂1000份；交联助剂包括以下重量份数的原料：氯化钙20份，水980份。
70.上述土壤激发菌剂固定化微球的制备方法，具体包括以下步骤：
71.(1)以灭菌的通用yep液体培养基，取千分之一培养液体积的、处于对数生长期的菌种分别接入培养液中，利用温度为30℃、转速为200rpm的恒温振荡培养箱，振荡培养激发菌剂20小时；
72.(2)为确定产品对菌体存活力的影响，采用采用稀释后显微镜下细胞计数和稀释
涂布平板的方法测定步骤(1)中液体培养基中的菌体数量，以温度为4℃、转速为5000rpm离心，富集得到土壤激发菌剂菌体；其中菌体包括大肠埃希氏菌cgmcc 1.12873菌体和产氮假单胞菌cgmcc 1.7377菌体，二者的有效菌落形成单位(cfu)比例为1:1；
73.(3)将海藻酸钠、羧甲基纤维素钠、凹凸棒土、高岭土和水按照上述质量比进行混合，经过103.4kpa、121℃高温蒸气处理30分钟，使各组分材料充分溶解混合并灭菌，得到无菌的激发菌剂包覆溶液；
74.(4)将步骤(2)得到的土壤激发菌剂菌体与步骤(3)得到的无菌激发菌剂包覆溶液按照上述质量比进行混合，得到激发菌剂包覆剂；
75.由于培养的营养条件、温度、转速、时间等因素的差异，细菌的培养效果存在些许差异。在本发明实施例中，菌体的用量为每1000份包覆剂中含有10^10cfu菌体，实践经验发现，10^10cfu菌体的鲜重量一般在2.5-4.0g。在生产中，将菌体数量以重量份数的方式加以限制，更具可操作性和简便性。
76.(5)将步骤(4)得到的激发菌剂包覆剂逐滴加入到交联助剂中，常温静置交联4小时，得到土壤激发菌剂固定化水凝微球，如图1中c所示；
77.(6)将步骤(5)所得土壤激发菌剂固定化水凝微球置于常温、无菌、通风、干燥的环境中自然风干，得到干燥的土壤激发菌剂固定化微球，如图2中c所示。
78.实施例3
79.本实施例与实施例1的区别之处在于：土壤激发菌剂包覆剂包括以下重量份数的原料：海藻酸钠15份，高岭土10份，菌剂3份，水972份，交联助剂1000份，其余原料及步骤与实施例1相同，得到的土壤激发菌剂固定化水凝微球和固定化微球分别如图1中d和图2中d所示。
80.实施例4
81.本实施例与实施例1的区别之处在于：土壤激发菌剂包覆剂包括以下重量份数的原料：海藻酸钠10份，羧甲基纤维素钠5份，高岭土10份，菌剂3份，水972份，交联助剂1000份，其余原料及步骤与实施例1相同，得到的土壤激发菌剂固定化水凝微球和固定化微球分别如图1中e和图2中e所示。
82.实施例5
83.本实施例与实施例1的区别之处在于：土壤激发菌剂包覆剂包括以下重量份数的原料：海藻酸钠15份，高岭土5份，菌剂3份，水977份，交联助剂1000份，其余原料及步骤与实施例1相同。
84.对比例1
85.本对比例与实施例1的区别之处在于：土壤激发菌剂包覆剂包括以下重量份数的原料：海藻酸钠15份，菌剂3份，水982份，交联助剂1000份，交联助剂包括以下重量份数的原料：氯化钙20份，水980份。
86.对比例1得到的土壤激发菌剂固定化水凝微球和固定化微球分别如图1中a和图2中a所示。
87.图3为实施例1和实施例2中土壤激发菌剂固定化水凝微球冷冻干燥后观察的电镜图像。
88.从图3(c)红色箭头所指示突出部分容易观察到一层光亮的膜结构，该膜结构是由
海藻酸钙和羧甲基纤维素钠形成的有机物薄膜，可以推断微球表面由一层有机物膜结构包覆，可有效隔离外界一般化学物质对菌剂的影响。从图3(d)可以观察到微球内部存在大量网状结构和空隙，网状结构支撑了微球的形态，空隙结构成为容纳菌体的空间。由于海藻酸钠和羧甲基纤维素钠材料自身的性质，决定了微球表层膜结构是亲水透气的，可维持菌剂较低的基础代谢需要。
89.所有实施例中菌剂的包覆率是由以下方法检测和统计的：
①
首先对培养液中的菌体浓度进行细胞计数检测，并计算得到10^10cfu菌体数目(n0)的体积，离心收集后加入到激发菌剂包覆溶液中，得到含有特定菌体数目的包覆剂；
②
向交联助剂中逐滴滴加包覆剂，得到土壤激发菌剂固定化水凝微球；
③
对反应后的交联助剂进行抽样，采用细胞技术的方法检测交联助剂中未被包覆的菌体浓度，乘以交联助剂体积得到未被包覆的菌体数目(nu)；
④
按照以下公式计算包覆率：包覆率(％)＝(n
0-nu)/n0*100。
90.检测交联助剂中未被包覆的细菌数目，结果表明，所有实施例中菌剂包覆率均达到99％以上。
91.图4为实施例1-实施例4、对比例1交联时的图像，每行的三张图片从左至右的交联时间分别为1分钟、3分钟和10分钟。可以看出添加羧甲基纤维素钠的实施例1、实施例2和实施例4形成的微珠不易拖尾，添加凹凸棒土或高岭土的实施例2-实施例4形成的微珠更迅速。
92.图5为实施例3中土壤激发菌剂固定化微球对土壤激发菌剂菌活力的保持效果对比曲线，其中菌剂在微球中的保存活力是按照以下方法统计和计算的：
①
微球干燥后，称取一定质量的微球(实际称取质量为0.1000g
±
0.0005g，且在微球干燥完成后即称重分装到无菌的ep管中保存，并标注实际重量)，投入到20ml无菌的0.2m磷酸盐缓冲溶液中，以30℃，200rpm振荡3h，以充分裂解微球，释放菌体；
②
从磷酸盐缓冲溶液中吸取部分溶液进行稀释涂布平板，计数和计算得到微球中的活菌数目nc；
③
将微球保存一段时间后，以步骤
①
和步骤
②
相同的方法，计数和计算得到微球中剩余活菌数目n
t
；
④
按照以下公式计算菌剂活力：菌剂活力(％)＝n
t
/nc*100。
93.从图5可以看出，经过180天储存后检测土壤激发菌剂固定化微球中菌剂菌活力情况，结果表明，菌剂活力仍可保持90％以上，有效维持了菌剂的有效性，同时便于存储和运输。本发明实施例2-实施例4中实施例3效果最佳。
94.以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。