抑制糖原合成酶激酶-3β乙酰化的多肽及其编码基因以及它们的应用的制作方法

抑制糖原合成酶激酶
‑3β
乙酰化的多肽及其编码基因以及它们的应用
技术领域
1.本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及抑制糖原合成酶激酶
‑
3β乙酰化的多肽及其编码基因以及它们的应用。


背景技术：

2.糖原合成酶激酶
‑
3β(gsk
‑
3β)在中枢神经系统中高表达，gsk
‑
3β的过度激活在阿尔茨海默病(ad)等神经精神疾病、糖尿病等代谢性疾病中起关键作用。在ad患者的大脑和血浆中以及糖尿病病人的血浆中，gsk
‑
3β的活性显著增加。对于在ad大脑中观察到的两种特征病理，gsk
‑
3β通过上调β
‑
淀粉样蛋白切割酶
‑
1(bace1)和早老素
‑
1(ps1)促进β
‑
淀粉样蛋白(aβ)的产生，并介导aβ的毒性。gsk
‑
3β上调也会诱导tau蛋白过度磷酸化，损害神经元突触可塑性，并导致空间记忆损伤。gsk
‑
3β通过促进炎症损害神经元功能。抑制gsk
‑
3β可改善ad样小鼠模型中的突触和认知功能。然而，gsk
‑
3β在ad中异常上调的机制仍不清楚。
3.细胞内微管相关蛋白tau积累形成神经纤维缠结是ad的重要病理特征之一。tau的经典功能是促进微管组装并维持微管的稳定性。ad患者脑和脑脊液中tau蛋白异常积累与认知功能障碍程度正相关。降低内源性tau蛋白可改善aβ引起的兴奋性毒性和认知功能障碍。我们在之前的研究中巧合地发现，过表达tau蛋白显著提高了gsk
‑
3β酶活性。与此同时，另一项研究表明，敲除tau蛋白减弱了aβ诱导的gsk
‑
3β活化。gsk
‑
3β经过多种翻译后修饰调节激酶活性和蛋白稳定性。最近的一项研究表明，tau蛋白具有乙酰转移酶活性，并能诱导其自乙酰化。我们发现tau蛋白可以乙酰化和稳定β
‑
联环素，从而介导tau蛋白的抗凋亡功能。
4.基于上述研究结论，我们推测tau蛋白可能直接乙酰化gsk
‑
3β，从而上调gsk
‑
3β活性并与tau蛋白过度磷酸化形成恶性循环，导致ad的慢性进行性神经退变。基于上述推测，我们经过多项实验，证明了tau蛋白可以在体内和体外直接乙酰化gsk
‑
3β。tau蛋白对gsk
‑
3β在k15位点的乙酰化抑制了其泛素化相关的蛋白水解，改变了其活性依赖的磷酸化，从而上调了激酶活性。还发现gsk
‑
3βk15乙酰化加重了野生型gsk
‑
3β基础上的突触损伤、神经炎症、tau蛋白过度磷酸化和aβ的产生，并最终导致小鼠的认知功能障碍。
5.因此，抑制糖原合成酶激酶
‑
3β乙酰化也被认为是一种新的潜在的治疗ad的方案。


技术实现要素：

6.本发明的发明人通过深入研究发现，tau蛋白可以在体内和体外直接乙酰化gsk
‑
3β。tau蛋白对gsk
‑
3β在k15位点的乙酰化抑制了其泛素化相关的蛋白水解，改变了其活性依赖的磷酸化，从而上调了激酶活性。gsk
‑
3βk15乙酰化加重了野生型gsk
‑
3β基础上的突触损伤、神经炎症、tau蛋白过度磷酸化和aβ的产生，并最终导致小鼠的认知功能障碍。基于此，本发明的目的是提供一种抑制糖原合成酶激酶
‑
3β乙酰化的多肽，该多肽由糖原合成酶激酶
‑
3βk15基序结合区以及血脑屏障穿透区两部分组成；可在细胞和动物整体水平阻断tau
蛋白与糖原合成酶激酶
‑
3β结合、阻断tau蛋白对糖原合成酶激酶
‑
3β的乙酰化和激活作用；改善细胞的形态和功能、改善小鼠的学习记忆能力。
7.为此，第一方面，本发明提供了一种抑制糖原合成酶激酶
‑
3β乙酰化的多肽，所述多肽的序列为seq.id.no:1所示。
8.第二方面，本发明提供了编码上述抑制糖原合成酶激酶
‑
3β乙酰化的多肽的基因。
9.优选地，所述基因的核苷酸序列为seq.id.no:2所示。
10.第三方面，本发明提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含上述抑制糖原合成酶激酶
‑
3β乙酰化的多肽。
11.优选地，所述药物组合物还包含药学上可接受的赋形剂、载体、溶媒或它们的组合。
12.优选地，所述赋形剂选自稀释剂、填充剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、助流剂、造粒剂、润湿剂、乳化剂、螯合剂、抗氧化剂、防腐剂、稳定剂和包衣剂中的至少一种。
13.优选地，所述载体为含水运载体、水混溶性载体或非水运载体。
14.第四方面，本发明提供了如上所述的抑制糖原合成酶激酶
‑
3β乙酰化的的多肽或如上所述的药物组合物在制备用于抑制糖原合成酶激酶
‑
3β乙酰化的药物中的应用。
15.第五方面，本发明提供如上所述的抑制糖原合成酶激酶
‑
3β乙酰化的的多肽或如上所述的药物组合物在制备用于预防、治疗或减轻阿尔茨海默病的药物中的应用。
16.第六方面，本发明还提供了抑制有需要的患者体内糖原合成酶激酶
‑
3β乙酰化的方法，该方法包括向患者给药有效量的如上所述的抑制糖原合成酶激酶
‑
3β乙酰化的的多肽或如上所述的药物组合物。
17.本发明所述的抑制糖原合成酶激酶
‑
3β乙酰化的多肽，可在细胞和动物整体水平阻断tau蛋白与糖原合成酶激酶
‑
3β结合、阻断tau蛋白对糖原合成酶激酶
‑
3β的乙酰化和激活作用；改善细胞的形态和功能、改善小鼠的学习记忆能力。本发明所述的多肽可在预防和治疗阿尔茨海默病等糖原合成酶激酶
‑
3β激活相关的疾病中发挥作用。
附图说明
18.图1和图2是测试例1中在n2a细胞中过表达tau40或乙酰转移酶区缺陷型(tauk18
‑
)或空载体，并测量gsk
‑
3β乙酰化水平,蛋白水平及其活性的变化的结果；
19.图3是测试例1中采用免疫共沉淀法制备gsk
‑
3β并使用质谱法分析具体乙酰化位点的结果；并在细胞和tau转基因小鼠中验证质谱的结果。
20.图4是测试例1中gsk
‑
3βk15乙酰化对小鼠认知能力的影响的检测结果；
21.图5是测试例2中注射多肽后的3xtg
‑
ad小鼠脑中gsk
‑
3βk15乙酰化水平和tau蛋白磷酸化程度的检测结果；
22.图6是测试例2中注射多肽后的3xtg
‑
ad小鼠学习记忆功能的检测结果。
具体实施方式
23.以下结合附图对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
24.在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或
值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
25.本发明的发明人在研究过程中发现，tau蛋白可催化gsk
‑
3βk 15的乙酰化并上调激酶活性以及gsk
‑
3βk15乙酰化可导致小鼠学习记忆损伤。因此，进一步发现具有seq.id.no:1所示多肽序列的多肽能够有效抑制tau对gsk
‑
3βk15的乙酰化同时改善tau的过度磷酸化以及ad小鼠的学习记忆损伤。基于此，完成了本发明。
26.第一方面，本发明提供了一种抑制糖原合成酶激酶
‑
3β乙酰化的多肽，所述多肽的序列为seq.id.no:1所示。
27.seq.id.no:1：
28.faesckpvqqrrrrrrrr
29.在本发明中，所述多肽由gsk
‑
3βk15附近的同源序列在c端加入用于穿透细胞膜和血脑屏障的穿膜肽rrrrrrrr得到。
30.第二方面，本发明提供了编码上述抑制糖原合成酶激酶
‑
3β乙酰化的多肽的基因。
31.在优选的实施方式中，所述基因的核苷酸序列为seq.id.no:2所示。
32.seq.id.no:2
33.tttgcggagagctgcaagccggtgcagcagagaagaagaagaagaagaagaaga
34.第三方面，本发明提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含上述抑制糖原合成酶激酶
‑
3β乙酰化的多肽。
35.在优选的实施方式中，所述药物组合物还包含药学上可接受的赋形剂、载体、溶媒或它们的组合。
36.在优选的实施方式中，所述赋形剂选自稀释剂、填充剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、助流剂、造粒剂、润湿剂、乳化剂、螯合剂、抗氧化剂、防腐剂、稳定剂和包衣剂中的至少一种。
37.在优选的实施方式中，所述载体为含水运载体、水混溶性载体或非水运载体。
38.在优选的实施方式中，所述药物组合物可以是液体、固体、半固体、凝胶或喷雾剂型。
39.本发明公开的多肽通常被配制成适合于通过所需途径对患者给药的剂型。例如，适合于注射给药的剂型等。
40.第四方面，本发明提供了如上所述的抑制糖原合成酶激酶
‑
3β乙酰化的的多肽或如上所述的药物组合物在制备用于抑制糖原合成酶激酶
‑
3β乙酰化的药物中的应用。
41.第五方面，本发明提供如上所述的抑制糖原合成酶激酶
‑
3β乙酰化的的多肽或如上所述的药物组合物在制备用于预防、治疗或减轻阿尔茨海默病的药物中的应用。
42.第六方面，本发明还提供了抑制有需要的患者体内糖原合成酶激酶
‑
3β乙酰化的方法，该方法包括向患者给药有效量的如上所述的抑制糖原合成酶激酶
‑
3β乙酰化的的多肽或如上所述的药物组合物。
43.根据本发明，所述给药可以通过选自以下至少一种方式而实现：鼻服、吸入、局部、口服、肌内、皮下、经皮、腹腔、硬膜外、鞘内和静脉内途径。
44.以下将通过实施例对本发明进行详细描述，但本发明的保护范围并不局限于此。
45.实施例中使用的腺相关病毒aav
‑
camkii
‑
egfp
‑
2a
‑
vector
‑
3xflag，aav
‑
camkii
‑
egfp
‑
2a
‑
gsk
‑
3βwt
‑
3xflag，aav
‑
camkii
‑
egfp
‑
2a
‑
gsk
‑
3βk15q
‑
3xflag和aav
‑
syn
‑
egfp
‑
tau40是由和元生物公司包装制备。兔多克隆ace
‑
gsk3β(k15)抗体由上海文渊阁生物科技有限公司制备。放线菌酮(chx)购买自sigma
‑
aldrich公司(美国)。侧脑室给药用套管是购买自深圳市瑞沃德生命科技有限公司(型号62001)。
46.制备例
47.多肽faesckpvqqrrrrrrrr是由昊德生物科技有限公司(武汉)合成。采用质谱法测定多肽的纯度，保证其纯度为95％。
48.实施例1
49.对10个月龄的3xtg
‑
ad小鼠进行了为期1个月的侧脑室注射多肽faesckpvqqrrrrrrrr(1mm in 5μl)，每隔2天注射1次。
50.测试例1
51.本测试例用于说明和验证tau蛋白可催化gsk
‑
3βk 15的乙酰化并上调激酶活性以及gsk
‑
3βk15乙酰化可导致小鼠学习记忆损伤。
52.1、在n2a细胞中过表达tau40或乙酰转移酶区缺陷型(tauk18
‑
)或空载体(vec组)，并测量gsk
‑
3β乙酰化水平、蛋白水平及其活性的变化。结果如图1和图2所示。
53.在图1中，图1a表示蛋白质免疫印迹实验检测结果，图中表明n2a细胞中过表达tau40会显著增加gsk
‑
3β的乙酰化水平，乙酰转移酶区缺陷型(tauk18
‑
)则会逆转该效应。图1b表示为图1a的统计图。因此由图1可知，过表达tau蛋白质会显著升高gsk
‑
3β的乙酰化水平。
54.在图2中，图2n表示n2a细胞过表达tau40或乙酰转移酶区缺陷型(tauk18
‑
)或空载体之后gsk
‑
3β的酶活性的改变，图2o表示n2a细胞过表达tau40或乙酰转移酶区缺陷型(tauk18
‑
)或空载体并用放线菌酮(chx)抑制蛋白质合成后gsk
‑
3β的蛋白降解水平。图2p为图2o的统计图。由图2可知，过表达tau蛋白质可以同时升高gsk
‑
3β的酶活性(图2n)并减慢其降解速度(图2o，p)。
55.2、采用免疫共沉淀法制备gsk
‑
3β并使用质谱法分析具体乙酰化位点并在细胞和tau转基因小鼠中验证质谱的结果如图3所示。其中，图3a表示在过表达tau的hek293细胞中用免疫沉淀方法将gsk
‑
3β富集后进行质谱检测结果，结果显示在ttsfaesckpvqqpsafgsmk这个gsk
‑
3β的n端序列中存在乙酰化修饰，图3b为不同物种之间上述质谱发现的肽段的保守性的比较，发现该肽段具有高度保守性，图3c为在过表达tau的同时对gsk
‑
3β不同位点进行点突变后gsk
‑
3β乙酰化的改变，图3d表明免疫蛋白印迹实验结果，tau转基因小鼠海马组织中gsk
‑
3β乙酰化水平增加，图3e为为图3d的统计图，图3f为tau转基因小鼠海马组织中gsk
‑
3β乙酰化水平的免疫组织化学结果。
56.由图3可知，gsk
‑
3β的乙酰化主要发生在分子的n末端，gsk
‑
3β的n
‑
端序列ttsfaesckpvqqpsafgsmkvsrd在不同物种中高度保守(图3a)。通过对gsk
‑
3β在lys15、lys27和lys205位点进行突变，我们发现共表达的k15r突变体几乎消除了tau诱导的乙酰化，而在k27r和k205r位点的突变体并没有显著改变gsk
‑
3β的乙酰化水平(图3b,c)。gsk
‑
3β乙酰化增加也见于tau转基因小鼠(图3d
‑
f)。这些数据表明tau蛋白可以乙酰化gsk
‑
3β的lys15位点(gsk
‑
3βk15)。
57.3、为了研究gsk
‑
3βk15乙酰化对小鼠认知能力的影响，我们立体定向地将携带gsk
‑
3βwt、gsk
‑
3βk15q的腺相关病毒(adeno
‑
associated virus,aav)载体注入小鼠海马ca1亚区中。4周后，通过gfp成像(图4a)和免疫印迹(图4b)，证实了ca1中gsk
‑
3β的过表达。然后，分别采用新物体识别(nor)、morris水迷宫(mwm)和条件恐惧记忆(fc)方法检测了gsk
‑
3βk15乙酰化对学习记忆的影响。其中，vec组表示空载体组。
58.其中，图4c表示小鼠对新物体的识别指数，图4d表示小鼠对新物体的鉴别指数，图4e表示小鼠在水迷宫训练时期找到目标平台的潜伏期，图4f表示小鼠在水迷宫检测时期找到目标平台的潜伏期，图4g表示小鼠在水迷宫检测时期穿越平台的次数，图4h表示小鼠在水迷宫检测时期在目标象限滞留的时间百分比，图4i表示小鼠游泳的速度，图4j表示小鼠在场景恐惧实验中的僵直时间百分比，图4k表示小鼠在糖水偏好实验中饮用糖水占总饮水量的百分比，图4l表示小鼠在旷场实验中的运动距离，图4m表示小鼠在旷场实验中进入中心区域的次数，图4n表示小鼠在旷场实验中在中心区域滞留的时间，图4o表示小鼠在十字高架迷宫实验中滞留开放臂中的时间。由图可知，在nor实验中，gsk
‑
3βwt和gsk
‑
3βk15q小鼠对新物体的识别指数(图4c)和鉴别指数(图4d)均下降，且gsk
‑
3βk15q组比gsk
‑
3βwt组损伤更明显图3c,d)。在mwm实验中，与gsk
‑
3βwt和空载体组相比，gsk
‑
3βk15q小鼠在第4、5和6天表现出明显的学习缺陷(图4e)；第8天进行的记忆测试的结果显示，过表达gsk
‑
3βk15q导致小鼠空间记忆障碍(图4f
‑
i)。fc检测结果也显示，过表达gsk
‑
3βk15q导致小鼠恐惧记忆障碍(图4j)。这些结果表明，过表达gsk
‑
3βk15
‑
乙酰化诱导或加重了小鼠的学习记忆损伤。
59.测试例2
60.本测试例用于说明采用本发明所述的多肽能够有效抑制tau蛋白对gsk
‑
3βk15的乙酰化同时改善tau蛋白的过度磷酸化以及ad小鼠的学习记忆损伤。
61.对实施例1中注射序列为seq.id.no:1所示的多肽后的3xtg
‑
ad小鼠脑中gsk
‑
3βk15乙酰化水平、tau蛋白磷酸化程度以及小鼠的学习记忆功能进行检测。结果如图5
‑
6所示。其中，使用3xtg组表示3xtg
‑
ad小鼠检测结果，3xtg p1组表示注射多肽后的3xtg
‑
ad小鼠检测结果，wt组表示野生型小鼠测试结果。
62.其中，图5a表示注射多肽后的3xtg
‑
ad小鼠脑中gsk
‑
3βk15乙酰化水平、tau蛋白磷酸化水品，图5b为图5a的统计图。图5c表示小鼠海马组织中tau404位点磷酸化水平的免疫荧光结果。由图5可知，多肽faesckpvqqrrrrrrrr(简称p1)可显著降低gsk
‑
3βk15乙酰化水平以及tau蛋白的磷酸化程度。
63.图6a表示新事物识别实验中识别指数，图6b表示新事物识别实验中鉴别指数，图6c表示水迷宫实验训练时期找到平台的潜伏期，图6d表示水迷宫实验检测时期穿越平台的次数，图6e表示水迷宫实验检测时期在目标象限滞留时间，图6f表示小鼠游泳的速度。由图可知，在nor试验中，p1处理的小鼠对新物体的识别和鉴别指数增加(图6a,b)。在mwm学习试验中，p1处理的小鼠在第5天和第6天比未处理组的潜伏期更短(图6c)，提示p1可改善小鼠的学习能力。在mwm记忆试验中，p1处理可改善小鼠的记忆能力(图6d
‑
f)。这些结果表明，多肽faesckpvqqrrrrrrrr可有效抑制抑制gsk
‑
3βk15乙酰化并减轻3xtg
‑
ad小鼠的认知障碍。
64.以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于
本发明的保护范围。