利用表达聚谷氨酸合成酶的重组菌静息细胞和/或聚谷氨酸合成酶制备γ-聚谷氨酸的方法与流程

利用表达聚谷氨酸合成酶的重组菌静息细胞和/或聚谷氨酸合成酶制备
γ-聚谷氨酸的方法
技术领域
1.本发明属于生物技术领域，尤其是涉及利用表达聚谷氨酸合成酶的重组菌静息细胞和/或聚谷氨酸合成酶制备γ-聚谷氨酸的方法。


背景技术：

2.γ-聚谷氨酸(γ-pga)是一种由微生物合成的高分子聚合物，由d-glu和l-glu 以γ-羧基与α-氨基以酰胺键的形式缩合而成。γ-pga结构如式(1)所示：
[0003][0004]
市面所售的γ-pga是无特殊气味的白色粉末。它是一种生物安全的亲水性大分子聚合物，具有乳化、增稠、成膜、保湿、絮凝、黏合、无毒等性能，可广泛应用于日用品、环境治理、生物医学等领域，有很好的商业价值。在食品方面，它最早发现于日本发酵食品纳豆中，具有食品安全性，可作为冻干保护剂用于益生菌粉或发酵剂的制备，油炸面食中的油脂抑制因子，矿物吸附剂，增稠剂，苦味掩盖剂等。根据γ-聚谷氨酸独特的理化和生物学特性，人们不断开发其在水凝胶、保湿剂、成膜剂、增稠剂、分散剂、药物控释载体、基因载体、植入材料、纳米创伤敷料、化妆品、烟草、皮革制造工业、植物种子保护和食品添加剂等方面的应用。γ-聚谷氨酸作为生物多聚物絮凝剂对饮用水、废水处理以及食品发酵工业的下游工艺十分有用。γ-聚谷氨酸侧链的阴离子羧基可结合带正电性药物，实现控释和靶向作用，因此大力发展生产γ-pga是炙手可热的话题。所以为了满足各行各业的需求，找到快速制备γ-pga的有效方法成为燃眉之急。
[0005]
目前γ-聚谷氨酸生产主要有化学合成法、提取法和微生物发酵法3种。前两种方法相比较发酵法来说因合成的γ-聚谷氨酸副产物多且成本高等无法实现工业化应用。γ-pga目前报道较多的是由微生物发酵合成，对于微生物发酵来说菌株的筛选、改造以及发酵条件的优化是至关重要的。国内外有关微生物发酵法生产γ
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聚谷氨酸的报道中，报道较多的3种菌株为枯草芽孢杆菌，纳豆芽孢杆菌，解淀粉芽孢杆菌。
[0006]
已报道的生物法制备γ-聚谷氨酸均是菌种在发酵过程中的转化谷氨酸获得。基
于发酵法制备γ-聚谷氨酸耗时长(一般在70小时以上)，底物谷氨酸转化率低 (30-50％)，产物混杂在复杂的培养体系中，分离纯化困难。


技术实现要素：

[0007]
针对聚谷氨酸生物合成中存在的发酵法制备γ-聚谷氨酸耗时长(一般在70小时以上)，底物谷氨酸转化率低(30-50％)，产物混杂在复杂的培养体系中，分离纯化困难等问题，本发明提供利用表达聚谷氨酸合成酶的重组菌静息细胞和/或聚谷氨酸合成酶制备γ-聚谷氨酸的方法。
[0008]
利用本发明的方法，在优化反应体系中，利用表达聚谷氨酸合成酶的重组菌静息细胞或聚谷氨酸合成酶可以在3小时内将70％以上的谷氨酸转化生成相应的γ-聚谷氨酸，且γ-聚谷氨酸的分子量集中在10-25kda，属于低分子量的γ-聚谷氨酸。
[0009]
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
[0010]
本发明第一方面提供聚谷氨酸合成酶，也可以称之为pgsb，其氨基酸序列为：
[0011]
1)如seq id no.2所示，或，
[0012]
2)与seq id no.2所示序列同源性在90％以上的氨基酸序列。
[0013]
本发明第一方面提供的聚谷氨酸合成酶，获得方法如下：
[0014]
1)可以通过基因工程的方法人工合成；
[0015]
2)可以直接通过化学合成制备；
[0016]
3)可以将聚谷氨酸合成酶的编码基因克隆至表达载体，转化相应的感受态细胞获得能够表达所述聚谷氨酸合成酶的重组菌，利用重组菌表达pgsb。
[0017]
本发明第二方面提供聚谷氨酸合成酶的编码基因，其核苷酸序列为：
[0018]
1)如seq id no.1所示，或，
[0019]
2)与seq id no.1所示序列同源性在90％以上的氨基酸序列。
[0020]
本发明所述聚谷氨酸合成酶的编码基因可以采用生物技术领域常规技术手段获得。
[0021]
本发明第三方面提供一种包含本发明第一方面所述聚谷氨酸合成酶的核酸序列的重组表达载体。
[0022]
所述的重组表达载体可通过本领域常规方法获得，将本发明所述聚谷氨酸合成酶的编码核酸序列连接于各种市售空载载体上构建而成。所述的市售空载载体可以是本领域常规的各种质粒载体，只要所述重组表达载体可以在相应的表达宿主中正常复制，并表达相应的所述聚谷氨酸合成酶即可。
[0023]
本发明第四方面提供一种能够表达本发明第一方面所述聚谷氨酸合成酶的重组菌。
[0024]
能够表达聚谷氨酸合成酶的重组菌采用生物技术领域常规方法既可以构建。
[0025]
例如，本发明提供的一种构建方法为：可通过将已经构建好的重组表达载体转化至宿主细胞来制备能够表达所述聚谷氨酸合成酶的重组菌。所述宿主细胞为本领域的各种常规宿主细胞，只要所述的重组表达载体能够稳定地自行复制并能通过诱导剂诱导后有效表达目标蛋白质聚谷氨酸合成酶即可。例如宿主细胞可以选择为大肠杆菌、乳酸菌、枯草杆菌、酵母、短棒杆菌等，优选为大肠杆菌e.coli bl21(de3)。
[0026]
在本发明的一个实施方式中，提供一种能够表达聚谷氨酸合成酶的重组菌的获得方式：
[0027]
以本非谷氨酸依赖性枯草芽孢杆菌的基因组dna为模板，pcr扩增pgsb基因，用限制性内切酶bamh1和nco1分别对目的基因pgsb和质粒载体pet-22b进行双酶切，电泳分离，割胶回收，获得含有相同粘性末端的基因片段和线性化质粒片段，将两者用t4-dna连接酶连接，转化e.coli bl21(de3)感受态细胞，筛选阳性单克隆，获得重组菌株。
[0028]
本发明第五方面，提供利用表达聚谷氨酸合成酶的重组菌静息细胞和/或聚谷氨酸合成酶制备γ-聚谷氨酸的方法。所述方法为：
[0029]
利用表达聚谷氨酸合成酶的重组菌静息细胞和/或聚谷氨酸合成酶，以谷氨酸或谷氨酸钠为底物，转化制备γ-聚谷氨酸。
[0030]
在本发明的一个实施方式中，反应条件为：谷氨酸或谷氨酸钠1-20g/l，atp 浓度0.05-5mm，表达聚谷氨酸合成酶的重组菌静息细胞5-20g/l或聚谷氨酸合成酶1-10ug/l，ph 6-8，温度20-40℃。
[0031]
在本发明的一个实施方式中，利用表达聚谷氨酸合成酶的重组菌静息细胞和/ 或聚谷氨酸合成酶，以谷氨酸或谷氨酸钠为底物，转化制备γ-聚谷氨酸，需要的反应液由作为底物的谷氨酸或谷氨酸钠、atp、磷酸盐或tris-hcl缓冲液组成，具体为：作为底物的谷氨酸或谷氨酸钠和atp的终浓度比为2-15：1；磷酸盐或tris-hcl 缓冲液的浓度为20-100mm，ph6-8。
[0032]
在本发明的一个实施方式中，利用表达聚谷氨酸合成酶的重组菌静息细胞和/ 或聚谷氨酸合成酶，以谷氨酸或谷氨酸钠为底物，转化制备γ-聚谷氨酸，具体方法为：
[0033]
将37℃，200rpm过夜培养的表达聚谷氨酸合成酶的重组菌种子以5％的接种量转入lb培养基，于37℃、200rpm条件下培养至od600为1时，加入终浓度 0.7mm的iptg诱导表达。利用上述重组菌的全细胞(调整湿菌体浓度为6-18g/l)，在30-50℃，初始ph 6.0-8.0下单批次加入1-11g/l的底物谷氨酸，转化2-6h获得 0.251
--
8.074g/l的γ-聚谷氨酸，谷氨酸转化率为51.3％-73.4％；分批次加入总量 20g/l的谷氨酸，转化12h后可得16g/l的γ-聚谷氨酸，摩尔转化率为72.0％-90.1％。
[0034]
反应液经离心除菌体、浓缩、酒精或丙酮沉淀、洗涤除杂、烘干即可得到目标产物γ-聚谷氨酸粗产品。
[0035]
本发明中，静息游离细胞合成法是以微生物整体细胞作为反应催化剂，对外源底物进行结构修饰的微生物转化。该法在维持原生物催化反应条件温和、选择性强、无污染、成本低、副产物少等优点基础上，因微生物(酶)转化反应体系较发酵培养体系简化，有利于下游产物处理、降低提取成本等，总体生产成本降低，更利于工业化应用。
[0036]
目前现有技术中重组工程菌或代谢工程改造的菌株制备γ-聚谷氨酸，牵涉至少三个聚谷氨酸合成相关基因，如pgsbca或pgsbcae，而本技术涉及的重组菌株仅表达pgsb一个基因。
[0037]
本发明提供的利用表达聚谷氨酸合成酶的重组菌静息细胞和/或聚谷氨酸合成酶，以谷氨酸或谷氨酸钠为底物，转化制备γ-聚谷氨酸的方法，优化反应体系后，重组菌或聚谷氨酸合成酶能在3小时内将70％以上的谷氨酸转化生成相应的γ-聚谷氨酸，且γ-聚谷氨酸的分子在10-25kda，属于低分子量的γ-聚谷氨酸，可用做化妆品中的保湿剂，高效
保湿，促进吸收，增加皮肤弹性；可作为医药领域中的药物载体，降低药物引起的副作用等。本发明提供了一种低分子量γ-聚谷氨酸的高效合成方法。
[0038]
与现有技术相比，本发明方法合成反应条件温和反应体系简单、反应时间短、转化率高、无污染，大大加速了目标产物γ-聚谷氨酸的合成效率，而且产物分子量较均一，属于低分子量范围的γ-聚谷氨酸。
附图说明
[0039]
图1pgsb基因的pcr扩增图。m泳道：dna标记250bp iii generay 2502(中国上海)，泳道1：pgsb的pcr产物。
[0040]
图2重组质粒bamh1和nco1双酶切鉴定图。m泳道：dna标记250bp iiigeneray 2501(中国上海)，泳道1,2,3,4为挑选的菌株质粒的双酶切鉴定图，泳道 3和泳道4为正确的阳性质粒。
[0041]
图3重组酶促转化产物的薄层层析分析。泳道1:谷氨酸标品泳道2:产物水解前泳道3:产物酸水解后泳道4:产物酸水解后平行样。
[0042]
图4sds-page分析产物γ-pga的分子量。m泳道：蛋白marker(3595a)，泳道1：产物分子量。
具体实施方式
[0043]
本发明第一方面提供聚谷氨酸合成酶，也可以称之为pgsb，其氨基酸序列为：
[0044]
1)如seq id no.2所示，或，
[0045]
2)与seq id no.2所示序列同源性在90％以上的氨基酸序列。
[0046]
聚谷氨酸合成酶，获得方法可以通过基因工程的方法人工合成；也可以直接通过化学合成制备；还可以将聚谷氨酸合成酶的编码基因克隆至表达载体，转化相应的感受态细胞获得能够表达所述聚谷氨酸合成酶的重组菌，利用重组菌表达pgsb。
[0047]
本发明第二方面提供聚谷氨酸合成酶的编码基因，其核苷酸序列为：
[0048]
1)如seq id no.1所示，或，
[0049]
2)与seq id no.1所示序列同源性在90％以上的氨基酸序列。
[0050]
所述聚谷氨酸合成酶的编码基因可以采用生物技术领域常规技术手段获得。
[0051]
本发明第三方面提供一种包含本发明第一方面所述聚谷氨酸合成酶的核酸序列的重组表达载体。
[0052]
所述的重组表达载体可通过本领域常规方法获得，将本发明所述聚谷氨酸合成酶的编码核酸序列连接于各种市售空载载体上构建而成。所述的市售空载载体可以是本领域常规的各种质粒载体，只要所述重组表达载体可以在相应的表达宿主中正常复制，并表达相应的所述聚谷氨酸合成酶即可。
[0053]
本发明第四方面提供一种能够表达本发明第一方面所述聚谷氨酸合成酶的重组菌。
[0054]
能够表达聚谷氨酸合成酶的重组菌采用生物技术领域常规方法既可以构建。例如，本发明提供的一种构建方法为：可通过将已经构建好的重组表达载体转化至宿主细胞来制备能够表达所述聚谷氨酸合成酶的重组菌。所述宿主细胞为本领域的各种常规宿主细
胞，只要所述的重组表达载体能够稳定地自行复制并能通过诱导剂诱导后有效表达目标蛋白质聚谷氨酸合成酶即可。例如宿主细胞可以选择为大肠杆菌、乳酸菌、枯草杆菌、酵母、短棒杆菌等，优选为大肠杆菌e.coli bl21(de3)。
[0055]
在本发明的一个实施方式中，提供一种能够表达聚谷氨酸合成酶的重组菌的获得方式：以本非谷氨酸依赖性枯草芽孢杆菌的基因组dna为模板，pcr扩增pgsb 基因，用限制性内切酶bamh1和nco1分别对目的基因pgsb和质粒载体pet-22b 进行双酶切，电泳分离，割胶回收，获得含有相同粘性末端的基因片段和线性化质粒片段，将两者用t4-dna连接酶连接，转化e.coli bl21(de3)感受态细胞，筛选阳性单克隆，获得重组菌株。
[0056]
本发明第五方面，提供利用表达聚谷氨酸合成酶的重组菌静息细胞和/或聚谷氨酸合成酶制备γ-聚谷氨酸的方法。所述方法为：
[0057]
利用表达聚谷氨酸合成酶的重组菌静息细胞和/或聚谷氨酸合成酶，以谷氨酸或谷氨酸钠为底物，转化制备γ-聚谷氨酸。
[0058]
在本发明的一个实施方式中，反应条件为：谷氨酸或谷氨酸钠1-20g/l，atp 浓度0.05-5mm，表达聚谷氨酸合成酶的重组菌静息细胞5-20g/l或聚谷氨酸合成酶1-10ug/l，ph 6-8，温度20-40℃。
[0059]
在本发明的一个实施方式中，利用表达聚谷氨酸合成酶的重组菌静息细胞和/ 或聚谷氨酸合成酶，以谷氨酸或谷氨酸钠为底物，转化制备γ-聚谷氨酸，需要的反应液由作为底物的谷氨酸或谷氨酸钠、atp、磷酸盐或tris-hcl缓冲液组成，具体为：作为底物的谷氨酸或谷氨酸钠和atp的终浓度比为2-15：1；磷酸盐或tris-hcl 缓冲液的浓度为20-100mm，ph6-8。
[0060]
在本发明的一个实施方式中，利用表达聚谷氨酸合成酶的重组菌静息细胞和/ 或聚谷氨酸合成酶，以谷氨酸或谷氨酸钠为底物，转化制备γ-聚谷氨酸，具体方法为：
[0061]
将37℃，200rpm过夜培养的表达聚谷氨酸合成酶的重组菌种子以5％的接种量转入lb培养基，于37℃、200rpm条件下培养至od600为1时，加入终浓度 0.7mm的iptg诱导表达。利用上述重组菌的全细胞(调整湿菌体浓度为6-18g/l)，在30-50℃，初始ph 6.0-8.0下单批次加入1-11g/l的底物谷氨酸，转化2-6h获得 0.251
--
8.074g/l的γ-聚谷氨酸，谷氨酸转化率为51.3％-73.4％；分批次加入总量 20g/l的谷氨酸，转化12h后可得16g/l的γ-聚谷氨酸，摩尔转化率为72.0％-90.1％。
[0062]
反应液经离心除菌体、浓缩、酒精或丙酮沉淀、洗涤除杂、烘干即可得到目标产物γ-聚谷氨酸粗产品。
[0063]
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。
[0064]
实施例1重组菌的构建
[0065]
设计合成聚谷氨酸合成酶，也可以称之为pgsb，其氨基酸序列如seq id no.2 所示，聚谷氨酸合成酶的编码基因，其核苷酸序列如seq id no.1所示。
[0066]
根据ncbi数据库中bacillus licheniformis atcc 14580,complete genome (nc_006270.3)，用snapgene设计引物pgsb-f和pgsb-r(见表1)。
[0067]
表1引物pgsb-f和pgsb-r
[0068][0069]
以非谷氨酸依赖性枯草芽孢杆菌的基因组dna为模板，pcr扩增pgsb基因。 pgsb基因的pcr扩增图如图1所示。
[0070]
用限制性内切酶bamh1和nco1分别对目的基因pgsb和质粒载体pet-22b进行双酶切，电泳分离，割胶回收，获得含有相同粘性末端的基因片段和线性化质粒片段，将两者用t4-dna连接酶连接，转化e.coli bl21(de3)感受态细胞，筛选阳性单克隆，其中重组质粒bamh1和nco1双酶切鉴定图如图2所示，获得重组菌，本实施例中获得的重组菌称之为pet-22b-pgsb-bl21。
[0071]
实施例2
[0072]
重组菌游离细胞的制备
[0073]
将50％甘油保存的大肠菌株pet-22b-pgsb-bl21按照1％的接种量放置于摇床中活化过夜，摇床转速200rpm，温度37℃，活化培养基的配方是nacl 10g/l，酵母提取物5g/l，胰蛋白胨10g/l。
[0074]
将活化的种子按照2％的接种量移至摇瓶增值培养基，在37℃，200rpm的摇床中培养至菌体浓度od600＝0.6-0.8时，加入终浓度为0.4-0.8mm的异丙基硫代半乳糖苷及0.5-5mm的硫酸镁，在25℃诱导表达14-16h。低温离心(10000rpm，10min，4℃)收集菌体，倒置离心管30s，尽可能多的去除多余的菌液。再用0.1mol/l， ph 5-8的na2hpo
4-nah2po4缓冲液重悬菌体，轻轻搅匀，洗涤菌体2次，离心后将菌体重悬于相同的缓冲液中，保存于4℃冰箱中备用。
[0075]
实施例3
[0076]
重组菌游离细胞转化制备γ-聚谷氨酸案例1
[0077]
配置0.1mol/l ph 6.5的na2hpo
4-nah2po4缓冲液，用缓冲液重悬6g/l的重组菌游离细胞，轻轻吹匀，然后加入5g/l的底物谷氨酸钠和0.05mm的腺嘌呤核苷三磷酸，在16℃、200rpm的摇床中恒温振荡反应3h后，12000rpm 4℃离心20 min，取上清获得含有γ-聚谷氨酸的反应液，采用ctab法测定γ-聚谷氨酸的含量为2.57g/l，底物转化率为51.32％。
[0078]
实施例4
[0079]
利用表达聚谷氨酸合成酶的重组菌静息细胞和/或聚谷氨酸合成酶，以谷氨酸或谷氨酸钠为底物，转化制备γ-聚谷氨酸产物的鉴定
[0080]
对实施例3反应后的反应液进行鉴定的方法为：将反应液离心，12000rpm，4℃的离心机中离心20min，取上清获得含有γ-聚谷氨酸的反应液，用三倍体积的无水乙醇(浓度75％)沉淀上清液过夜，离心收集沉淀(若上清液体积较高，可以先放置烘箱蒸发掉过多的水分，浓缩一下，再使用乙醇沉降，可以避免使用过多体积的乙醇，减少不必要的浪费)，将沉淀物放置烘箱，去除剩余的乙醇，再用等体积的去离子水复溶沉淀物，目的是洗涤产物，去掉其他的杂质，沉淀过夜后离心收集上清液，接下来再次重复以上操作2次，尽可能的去
除杂质，最后放置烘箱中干燥，取出适量产物，进行产物鉴定。
[0081]
①
产物鉴定—薄层层析
[0082]
盐酸水解
[0083]
称取纯化后的产物0.3g，用去离子水配成10ml的水溶液，加入盐酸，将溶液的酸碱值调至成1.8-2.0的范围，将取5ml盐酸水解液放置磨口瓶中，盖上塞子，在90瓶的水浴锅中水解4-5h，水解完成，将盐酸水解液冷却至室温，用氢氧化钠中和溶液，并定容。
[0084]
活化层析版
[0085]
在产物水解过程中，处理所需要的层析版。在层析板的底物向上1cm处，用铅笔画一条直线，为点样线，在点样线上按照相同的距离点上标记点，方便确定后续每个样品的点样位置，随后将层析板放置烘箱中活化30分钟，烘箱温度 110-115℃。
[0086]
点样与展层
[0087]
取10μl的样品，逐步点在层析板的样孔位置，每点一次，用吹风机热风吹干，直至样品点完；将层析板放置在层析缸中，层析液为正丁醇：冰乙酸：水＝8；4； 2和0.3％的茚三酮粉末(层析液配制后需提前放置在层析缸中平衡，层析液不能太多，使得层析板的点样线不能被层析液淹没即可)，当层析液跑至距离层析板顶部1-2
㎝
时，停止展开，放入烘箱中烘干或者用吹风机吹干，观察并拍照。参考图 3，水解前样品的位置没有条带，水解后样品的条带位置与谷氨酸标品的条带位置一致，说明产物为γ-pga。
[0088]
②
产物鉴定—sds-page分子量的鉴定
[0089]
取适量的纯化后产物用少量的去离子水溶解，再加入蛋白的loading buffer，沸水中加热3min，采用15％的分离胶和5％的浓缩胶制作胶板，点样跑胶，结束后分别用0.5％的亚甲基蓝溶液和考马斯亮蓝r250染色，再脱色后观察并拍照，参考图4，发现所得到的产物的分子量的大小在20kd左右。
[0090]
以下实施例5、6、7中也采用同样的方法进行产物的鉴定。
[0091]
实施例5
[0092]
重组菌游离细胞转化制备γ-聚谷氨酸案例2
[0093]
配置0.1mol/l ph 6.5的na2hpo
4-nah2po4缓冲液，用缓冲液重悬12g/l的游重组菌游离细胞，轻轻吹匀，然后加入5g/l的底物谷氨酸钠，终浓度为0.1mm的腺嘌呤核苷三磷酸，在20℃、200rpm的摇床中恒温振荡反应3h，然后12000rpm， 4℃的离心机中离心20min，取上清获得含有γ-聚谷氨酸的反应液，采用ctab法测定γ-聚谷氨酸的含量为3.16g/l，底物转化率为63.21％。
[0094]
实施例6
[0095]
重组菌游离细胞转化制备γ-聚谷氨酸案例3
[0096]
配置0.1mol/l ph 6.5的na2hpo
4-nah2po4缓冲液，用缓冲液重悬12g/l的重组菌游离细胞，轻轻吹匀，然后加入5g/l的底物谷氨酸钠，终浓度为0.1mm的腺嘌呤核苷三磷酸，在25℃、200rpm的摇床中恒温振荡反应3h，然后12000rpm，4℃的离心机中离心20min，取上清获得含有γ-聚谷氨酸的反应液，采用ctab法测定γ-聚谷氨酸的含量为3.67g/l，底物转化率为73.4％。
[0097]
实施例7
[0098]
聚谷氨酸合成酶转化制备γ-聚谷氨酸案例1
[0099]
设计合成聚谷氨酸合成酶，也可以称之为pgsb，其氨基酸序列如seq id no.2 所示，聚谷氨酸合成酶的编码基因，其核苷酸序列如seq id no.1所示。
[0100]
配置0.1mol/l ph 6.5的na2hpo
4-nah2po4缓冲液，缓冲液中加入聚谷氨酸合成酶pgsb 5ug/l，轻轻吹匀，然后加入5g/l的底物谷氨酸，终浓度为0.1mm的腺嘌呤核苷三磷酸，在25℃、200rpm的摇床中恒温振荡反应3h，然后12000rpm，4℃的离心机中离心20min，取上清获得含有γ-聚谷氨酸的反应液，采用ctab法测定γ-聚谷氨酸的含量为3.74g/l，底物转化率为74.8％。
[0101]
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。