用于通过基因沉默的有害生物防治的数个植物细胞中的dsrna的产生1.相关申请案2.本技术案主张2019年3月14日提交的英国专利申请第1903521.1号的优先权，其内容通过引用完整并入本文中。3.序列表声明4.2020年3月12日创建的名为81321sequencelisting.txt的ascii文件包括73,728个字节，与本技术的提交同时提交，通过引用并入本文中。
技术领域：
：5.本发明的一些实施例中涉及在一宿主细胞中产生及扩增数个dsrna分子，以沉默数个有害生物靶基因。
背景技术：
：：6.基因组编辑技术的最新进展，使得通过编辑基因组中数十亿个核苷酸中的仅有一些核苷酸来改变数个活细胞中的数个dna序列成为可能。在过去的十年中，使用基因组编辑的所述数个工具及专业知识，例如在数个人类体细胞及多能细胞中，已经发展到所述方法当今被广泛开发为治疗人类疾病的一种策略的如此程度。所述基础过程取决于在基因组中创建一位点特异性dna双链断裂(dsb)，然后允许所述细胞的内源性dsb修复机制来修复所述断裂(例如通过非同源末端连接(non‑homologousend‑joining，nhej)或同源重组(homologousrecombination，hr)，其中后者可以允许使用外源提供的供体模板(donortemplate)对dna序列进行精确的一或多个核苷酸改变(porteus，annurevpharmacoltoxicol.，2016年，56:163至90)。7.三个主要方法使用数个细胞的诱变基因组编辑(mutagenicgenomeediting，nhej)，例如用于潜在疗法：(a)通过创建空间性精确的数个插入或数个缺失以敲除数个功能性遗传元件，(b)创建数个插入或数个缺失以补偿潜在的数个移码突变(frameshiftmutations)；因此重新激活数个部分或非功能基因(partly‑ornon‑functionalgenes)，以及(c)创建明确的数个基因缺失。尽管有几种不同的应用程序使用nhej进行编辑，但最广泛的编辑应用程序可能会利用同源重组(hr)进行基因组编辑，尽管这是一种罕见的事件，但由于同源重组(hr)依赖于外源提供的模板在所述修复过程中复制正确的所述序列，因此同源重组(hr)是高度精准的。8.当今，hr介导的基因组编辑的四个主要应用类型是：(a)基因校正(即，校正由单一基因中的数个点突变引起的数个疾病)，(b)功能基因校正(即，校正由散布在所述整个基因中的数个点突变引起的数个疾病)，(c)安全港基因添加(safeharborgeneaddition)(即，当不需要精确调节时或需要一转基因的数个超非生理水平(supranon‑physiologicallevels)时)，及(d)靶向的转基因添加(即，当精确调节时是必需的)(porteus，2016年，同上)。9.以前在各种真核生物(例如鼠类、人类、虾类、植物)中对所述rna分子进行基因组编辑的工作，主要集中在敲除mirna基因活性或改变它们在靶rna中的结合位点，例如：10.关于人类细胞中的基因组编辑，jiang等人(jiang等人,rnabiology，2014年，11(10):1243至9)使用crispr/cas9通过靶向数个hela细胞中的其5'区域从一个簇中去除人类mir‑93。在含有所述drosha加工位点(即drosha在一宿主细胞的所述细胞核中结合、切割并由此将初级mirna(pri‑mirna)加工成pre‑mirna的位置，其中所述drosha为一种双链rna特异性rnaseiii酶)及数个种子序列(即对于mirna与mrna结合必不可少的数个保守七分序列(conservedheptametricalsequences)，通常位于mirna的5′端的2至7位)的靶向的所述区域诱导各种小分子。根据jiang等人，即使是单一核苷酸缺失也会导致具有高度特异性的靶mirna的完全敲除。11.关于小鼠物种的基因组编辑，zhao等人(zhao等人，scientificreports，2014，4:3943)提供了一种在鼠细胞中使用crispr‑cas9系统的mirna抑制策略。zhao使用专门设计的数个sgrna通过所述cas9核酸酶在单一位点处切割所述mirna基因，从而敲除这些细胞中的mirna。12.关于植物基因组编辑，bortesi及fischer(bortesiandfischer，biotechnologyadvances，2015年，33:4至52)讨论了与数个zfn及数个talen相比的crispr‑cas9技术在数个植物中的使用，basak及nithin(basak及nithin，frontplantsci.，2015年，6:1001)教导crispr‑cas9技术已应用于拟南芥及烟草等数个模式植物以及小麦、玉米及水稻等数个作物中的数个蛋白质编码基因的敲除。13.除了破坏mirna活性或数个靶结合位点之外，还实现了使用数个人工mirna(amirna)介导的数个内源性及外源性靶基因的基因沉默(tiwari等人，plantmolbiol，2014年，86:1)。与mirna类似，amirna是单链的，长约21个核苷酸(nt)，并通过替换数个pre‑mirna中双链体的所述数个成熟mirna序列来进行设计(tiwari等人，2014年，同上)。这些amirna作为一转基因引入至一人工表达盒(包括一启动子、终止子等)(carbonell等人，plantphysiology，2014，pp.113.234989)中，通过小rna生物发生及沉默机制来进行加工并下调节靶表达。根据schwab等人(schwab等人，植物细胞，2006年，第18卷，1121至1133)，amirna在组织特异性或诱导型启动子下表达时具有活性，并可用于数个植物中的特异性基因沉默，特别是当几个相关但不相同的靶基因需要下调节时。14.senis等人(senis等人，nucleicacidsresearch，第2017年，第45(1)卷:e3)公开了将一无启动子的抗病毒rnai发夹工程改造成一内源性mirna基因座。具体而言，senis等人通过由序列特异性核酸酶(例如cas9或talen核酸酶)诱导的同源定向dna重组，将一amirna前体转基因(发夹pri‑amirna)插入到与一天然存在的mirna基因(例如mir122)相邻的位置。这种方法通过利用表达一天然mirna(mir122)的转录活性dna基因座使用无启动子及无终止子的数个amirna，即，所述内源启动子及终止子驱动及调节插入的所述amirna转基因的所述转录。15.之前已经描述了将rna及/或数个蛋白质引入至数个细胞的各种无dna方法。举例而言，在美国专利申请号20160289675中已经描述了使用电穿孔及脂质转染的rna转染。cho等人(cho等人，"heritablegeneknockoutincaenorhabditiselegansbydirectinjectionofcas9‑sgrnaribonucleoproteins"，genetics，2013年，195:1177至1180)描述了通过显微注射所述cas9蛋白及数个sgrna复合物来将数个cas9/sgrna核糖核蛋白(rnp)复合物直接地递送至数个细胞。kim(kim等人，"highlyefficientrna‑guidedgenomeeditinginhumancellsviadeliveryofpurifiedcas9ribonucleoproteins"，genomeres.，2014年，24:1012至1019)描述了通过电穿孔来递送cas9蛋白/sgrna复合物。zuris(zuris等人，"cationiclipid‑mediateddeliveryofproteinsenablesefficientprotein‑basedgenomeeditinginvitroandinvivo"，natbiotechnol.，2014年，doi:10.1038/nbt.3081)报导了通过脂质体来递送数个cas9蛋白相关sgrna复合物。技术实现要素：16.根据本发明一些实施例的一方面，提供了一种产生能够沉默一有害生物基因的一植物细胞中的一长dsrna分子的方法，所述方法包括：(a)在一植物基因组中选择一核酸序列，所述核酸序列编码一沉默分子，所述沉默分子以一植物基因作为一目标，所述沉默分子能够募集rna依赖型rna聚合酶(rdrp)；(b)修饰所述植物基因的一核酸序列，从而针对所述有害生物基因赋予一沉默特异性，使得包括所述沉默特异性的所述植物基因的一转录物与能够募集所述rdrp的所述沉默分子形成碱基互补，以产生能够沉默所述有害生物基因的所述长dsrna分子，从而产生能够沉默所述有害生物基因的所述植物细胞中的所述长dsrna分子。17.根据本发明一些实施例的一方面，提供了一种产生一植物细胞中的一长dsrna分子的方法，所述植物细胞中的所述长dsrna能够沉默一植物细胞中的一有害生物基因，所述方法包括：(a)在一基因组中选择一植物的一核酸序列，所述核酸序列编码一沉默分子，所述沉默分子以一植物基因作为一目标，所述沉默分子能够募集rna依赖型rna聚合酶(rdrp)；(b)修饰所述植物基因的一核酸序列，从而针对所述有害生物基因赋予一沉默特异性，使得包括所述沉默特异性的所述植物基因的一转录物与能够募集所述rdrp的所述沉默分子形成碱基互补，以产生所述植物细胞中的所述长dsrna分子，所述植物细胞中的所述长dsrna分子能够沉默所述植物细胞中的所述有害生物基因。18.根据本发明一些实施例的一方面，提供了一种产生能够沉默一有害生物基因的一植物细胞中的一长dsrna分子的方法，所述方法包括：(a)选择一植物基因的一核酸序列，所述植物基因的所述核酸序列与所述有害生物基因的一核酸序列显示一预定序列同源性；(b)修饰编码一rna分子的一植物内源核酸序列，从而针对所述植物基因赋予沉默特异性，使得能够募集rna依赖型rna聚合酶(rdrp)的数个小rna分子与所述植物基因的一转录物形成碱基互补，所述数个小rna分子是从所述rna分子加工而来，以产生能够沉默所述有害生物基因的所述长dsrna分子，从而产生能够沉默所述有害生物基因的所述植物细胞中的所述长dsrna分子。19.根据本发明的一些实施例的一方面，提供了一种产生一耐有害生物或抗有害生物植物的方法，所述方法包括产生一植物细胞中的一长dsrna分子，所述植物细胞中的所述长dsrna分子能够沉默根据本发明的一些实施例的一有害生物基因。20.根据本发明一些实施例的一方面，提供了一种植物，所述植物通过本发明一些实施例的所述方法所产生。21.根据本发明一些实施例的一方面，提供了一种细胞，所述细胞来自本发明一些实施例的所述植物。22.根据本发明的一些实施例的一方面，提供了一种种子，所述种子来自本发明的一些实施例的所述植物。23.根据本发明一些实施例的一方面，提供了一种产生一耐有害生物或抗有害生物植物的方法，所述方法包括：(a)育种本发明一些实施例的的植物；及(b)选择数个后代植物，所述数个后代植物表达能够抑制所述有害生物基因的所述长dsrna分子，并且不包括所述dna编辑剂，从而产生所述耐有害生物或抗有害生物植物。24.根据本发明一些实施例的一方面，提供了一种产生本发明一些实施例的一植物或植物细胞的方法，所述方法包括在允许繁殖的条件下培养所述植物或植物细胞。25.根据本发明的一些实施例，能够募集所述rdrp的所述沉默分子包括21个至24个核苷酸。26.根据本发明的一些实施例，能够募集所述rdrp的所述沉默分子包括21个核苷酸。27.根据本发明的一些实施例，能够募集所述rdrp的所述沉默分子包括22个核苷酸。28.根据本发明的一些实施例，能够募集所述rdrp的所述沉默分子包括23个核苷酸。29.根据本发明的一些实施例，能够募集所述rdrp的所述沉默分子包括24个核苷酸。30.根据本发明的一些实施例，能够募集所述rdrp的所述沉默分子由21个核苷酸组成。31.根据本发明的一些实施例，能够募集所述rdrp的所述沉默分子由22个核苷酸组成。32.根据本发明的一些实施例，能够募集所述rdrp的所述沉默分子由23个核苷酸组成。33.根据本发明的一些实施例，能够募集所述rdrp的所述沉默分子由24个核苷酸组成。34.根据本发明的一些实施例，能够募集所述rdrp的所述沉默分子选自：反式作用sirna(tasirna)、定相小干扰rna(phasirna)、微小rna(mirna)、小干扰rna(sirna))、短发夹rna(shrna)、piwi相互作用rna(pirna)、转运rna(trna)、小核rna(snrna)、核醣体rna(rrna)、小核仁rna(snorna)、细胞外rna(exrna)、重复衍生rna、自主及非自主的转座rna所组成的群组。35.根据本发明的一些实施例，mirna包括22个核苷酸的成熟小rna。36.根据本发明的一些实施例，所述mirna选自由：mir‑156a、mir‑156c、mir‑162a、mir‑162b、mir‑167d、mir‑169b、mir‑173、mir‑393a、mir‑393b、mir‑402、mir‑403、mir‑447a、mir‑447b、mir‑447c、mir‑472、mir‑771、mir‑777、mir‑828、mir‑830、mir‑831、mir‑831、mir‑833a、mir‑833a、mir‑840、mir‑845b、mir‑848、mir‑850、mir‑853、mir‑855、mir‑856、mir‑864、mir‑2933a、mir‑2933b、mir‑2936、mir‑4221、mir‑5024、mir‑5629、mir‑5648、mir‑5996、mir‑8166、mir‑8167a、mir‑8167b、mir‑8167c、mir‑87e6187d、mir‑8167f、mir‑8177及mir‑8182所组成的群组。37.根据本发明的一些实施例，所述植物基因是一非蛋白质编码基因。38.根据本发明的一些实施方式，所述植物基因是一编码基因。39.根据本发明的一些实施例，所述植物基因不编码具有一内在沉默活性的一分子。40.根据本发明的一些实施例，所述方法进一步包括将一dna编辑剂引入至所述植物细胞，所述dna编辑剂针对所述害虫基因赋予所述植物基因的一沉默特异性。41.根据本发明的一些实施例，步骤(b)的修饰包括将一dna编辑剂引入至所述植物细胞，所述dna编辑剂针对所述害虫基因赋予所述植物基因的一沉默特异性。42.根据本发明的一些实施例，所述植物基因编码针对一天然植物基因具有一内在沉默活性的一分子。43.根据本发明的一些实施例，所述方法进一步包括将一dna编辑剂引入至所述植物细胞，所述dna编辑剂将所述植物基因的一沉默特异性重定向至所述有害生物基因，所述有害生物基因和所述天然植物基因是不同的。44.根据本发明的一些实施例，所述方法进一步包括将一dna编辑剂引入至所述植物细胞，所述dna编辑剂将所述植物基因的一沉默特异性重定向至所述有害生物基因，所述有害生物基因和一天然植物基因是不同的。45.根据本发明的一些实施例，步骤(b)的修饰包括将一dna编辑剂引入至所述植物细胞，所述dna编辑剂将所述植物基因的一沉默特异性重定向至所述有害生物基因，所述有害生物基因和一天然植物基因是不同的。46.根据本发明的一些实施例，具有所述内在沉默活性的所述植物基因选自由:反式作用sirna(tasirna)、定相小干扰rna(phasirna)、微小rna(mirna)、小干扰rna(sirna)、短发夹rna(shrna)、piwi相互作用rna(pirna)、转运rna(trna)、小核rna(snrna)、核醣体rna(rrna)、小核仁rna(snorna)、细胞外rna(exrna)、自主及非自主转座rna所组成的群组。47.根据本发明的一些实施例，具有所述内在沉默活性的所述植物基因编码了一定相二级sirna产生分子。48.根据本发明的一些实施例，具有所述内在沉默活性的所述植物基因是一反式作用sirna(tas)产生分子。49.根据本发明的一些实施例，所述植物基因的所述沉默特异性通过测量有害生物基因的一转录水平来确定。50.根据本发明的一些实施例，所述植物基因的所述沉默特异性是由表型上确定的。51.根据本发明的一些实施例，所述由表型上确定的是通过确定所述植物的有害生物抗性来实现。52.根据本发明的一些实施例，所述植物基因的所述沉默特异性是由基因型上确定的。53.根据本发明的一些实施例，一植物基因型是在一植物表型之前确定的。54.根据本发明的一些实施例，一植物表型是在一植物基因型之前确定的。55.根据本发明的一些实施例，所述植物基因的所述沉默特异性通过测量所述有害生物基因的一转录水平来确定。56.根据本发明的一些实施例，确定的表型通过确定植物的害虫抗性来实现。所述由表型上确定的是通过确定所述植物的有害生物抗性来实现。57.根据本发明的一些实施例，预定的所述序列同源性包括75％至100％的同一性。58.根据本发明的一些实施例，能够募集所述rdrp的所述数个小rna分子包含21至24个核苷酸。59.根据本发明的一些实施例，能够募集所述rdrp的所述数个小rna分子包含21个核苷酸。60.根据本发明的一些实施例，能够募集所述rdrp的所述数个小rna分子包含22个核苷酸。61.根据本发明的一些实施例，能够募集所述rdrp的所述数个小rna分子包含23个核苷酸。62.根据本发明的一些实施例，能够募集所述rdrp的所述数个小rna分子包含24个核苷酸。63.根据本发明的一些实施例，能够募集所述rdrp的所述数个小rna分子由21个核苷酸组成。64.根据本发明的一些实施例，能够募集所述rdrp的所述数个小rna分子分子由22个核苷酸组成。65.根据本发明的一些实施例，能够募集所述rdrp的所述数个小rna分子由23个核苷酸组成。66.根据本发明的一些实施例，能够募集所述rdrp的所述数个小rna分子由24个核苷酸组成。67.根据本发明的一些实施例，能够募集所述rdrp的所述小rna分子选自微小rna(mirna)、小干扰rna(sirna)、短发夹rna(shrna)、piwi相互作用rna(pirna)、反式作用sirna(tasirna)、定相小干扰rna(phasirna)、转移rna(trna)、小核rna(snrna)、核醣体rna(rrna)、小核仁rna(snorna)、细胞外rna(exrna)、重复衍生rna及自主和非自主转座rna所组成的群组。68.根据本发明的一些实施例，所述rna分子不具有一内在沉默活性。69.根据本发明的一些实施例，该方法进一步包括将一dna编辑剂引入至所述植物细胞，所述dna编辑剂针对一植物基因赋予所述rna分子的一沉默特异性。70.根据本发明的一些实施例，所述rna分子针对一天然植物基因具有一内在沉默活性。71.根据本发明的一些实施例，所述方法进一步包括将一dna编辑剂引入至所述植物细胞，所述dna编辑剂将所述rna分子的所述沉默特异性重定向至所述植物基因，所述植物基因和所述天然植物基因是不同的。72.根据本发明的一些实施例，步骤(b)的修饰包括一dna编辑剂引入至所述植物细胞，所述dna编辑剂将所述rna分子的所述沉默特异性重定向至所述植物基因，所述植物基因和一天然植物基因是不同的。73.根据本发明的一些实施例，与所述有害生物基因的所述核酸序列显示出所述预定序列同源性的所述植物基因不编码一沉默分子。74.根据本发明的一些实施例，所述rna分子的所述沉默特异性是通过测量所述植物基因或所述有害生物基因的一转录水平来确定的。75.根据本发明的一些实施例，所述rna分子的所述沉默特异性是由表型上确定的。76.根据本发明的一些实施例，所述由表型上确定的是通过确定所述植物的有害生物抗性来实现。77.根据本发明的一些实施例，所述rna分子的所述沉默特异性是由基因型上确定的。78.根据本发明的一些实施例，一植物表型是在一植物基因型之前确定的。79.根据本发明的一些实施例，一植物基因型是在一植物表型之前确定的。80.根据本发明的一些实施例，所述dna编辑剂包含至少一sgrna。81.根据本发明的一些实施例，所述dna编辑剂包含至少一sgrna，所述至少一sgrna与一植物可表达启动子可操作地连接。82.根据本发明的一些实施例，所述dna编辑剂不包含一核酸内切酶。83.根据本发明的一些实施例，所述dna编辑剂包含一核酸内切酶。84.根据本发明的一些实施例，所述dna编辑剂是选自大范围核酸酶、锌指核酸酶(zfn)、转录激活因子样效应核酸酶(talen)、crispr‑核酸内切酶、dcrispr‑核酸内切酶和一归巢核酸内切酶。85.根据本发明的一些实施例，所述核酸内切酶包含cas9。86.根据本发明的一些实施方式，所述dna编辑剂以dna、rna或rnp的形式应用于细胞。87.根据本发明的一些实施方案，所述dna编辑剂与用于监测一植物细胞中表达的报告基因相连。88.根据本发明的一些实施方案，所述报导分子是一荧光蛋白。89.根据本发明的一些实施方式，所述植物细胞是一原生质体。90.根据本发明的一些实施方案，所述dsrna分子可由细胞rnai加工机器加工。91.根据本发明的一些实施方案，所述dsrna分子被加工成数个二级小rna。92.根据本发明的一些实施方案，所述dsrna和/或所述二级小rna包含针对一有害生物基因的一沉默特异性。93.根据本发明的一些实施例，所述有害生物是一无脊椎动物。94.根据本发明的一些实施例，所述有害生物选自由一病毒(virus)、一蚂蚁(ant)、一白蚁(termite)、一蜜蜂(bee)、一黄蜂(wasp)、一毛虫(caterpillar)、一蟋蟀(cricket)、一蝗虫(locust)、一甲虫(beetle)、一蜗牛(snail)、一蛞蝓(slug)、一线虫(nematode)、一臭虫(bug)、一苍蝇(fly)、一果蝇(fruitfly)、一粉虱(whitefly)、一蚊子(mosquito)、一蚱蜢(grasshopper)、一飞虱(planthopper)、一蠼螋(earwig)、一蚜虫(aphid)、一鳞片(scale)、一蓟马(thrip)、一蜘蛛(spider)、一螨虫(mite)、一木虱(psyllid)、一蜱虫(tick)、一飞蛾(moth)、一蠕虫(worm)、一蝎子(scorpion)及一真菌(fungus)所组成的群组。95.根据本发明的一些实施例，所述植物选自由一作物、一开花植物、一杂草和一树木所组成的群组。96.根据本发明的一些实施方案，所述植物是非转基因的。97.根据本发明的一些实施方式，所述植物是一转基因植物。98.根据本发明的一些实施方式，所述植物是非遗传修饰的(非转基因)。99.根据本发明的一些实施例，所述植物是遗传修饰的(gmo)。100.除非另有定义，本文使用的所有技术和/或科学术语与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同。尽管在本发明的数个范例的实践或测试中可以使用与本文所述的那些方法和材料相似或等效的数个方法和数个材料，但下文描述了示例性方法和/或材料。如有冲突，以专利说明书(包括定义)为准。此外，数个材料、数个方法和数个范例仅是说明性的，并不旨在进行必要的限制。附图说明101.本发明的一些实施例在此仅通过示例并参考附图来说明。现在具体详细地参考附图，强调所显示的细节是通过示例的方式并且出于对本发明的数个实施例的说明性讨论的目的。在这点上，结合附图的描述使本领域技术人员清楚可以如何实践本发明的实施例。102.在所述数个附图中：103.图1是说明用于通过基因组编辑诱导基因沉默(geneeditinginducedgenesilencing，geigs)进行靶基因扩增的第一提议模型(firstproposedmodel)(称为模型1)的一照片。根据这个模型(参见数个图式中的数个对应数字)：104.1、有害生物基因“x”为所述靶基因(当沉默时，所述有害生物则被控制)。105.2、通过同源性搜索来确定宿主相关基因‑x(植物基因“x”)。106.3、进行geigs以重定向针对植物基因“x”的一扩增器小rna(例如22ntmirnas)的所述沉默特异性。107.4、扩增器小geigsrna形成与rdrp(所述扩增酶)相关的一risc复合物。108.5、rdrp合成与植物基因“x”的所述转录物互补的一反义rna链，形成dsrna。109.6、所述植物基因“x”dsrna通过(数个)dicer或类似dicer的数个蛋白加工成二级srna。110.7、所述植物基因“x”dsrna被数个有害生物吸收。在所述有害生物中，所述植物dsrna‑x被加工成小rna，通过rnai下调节所述对应同源有害生物基因“x”。111.8、可能地，数个二级srna被数个有害生物吸收，并沉默所述靶基因“x”。112.图2是说明用于通过geigs进行靶基因扩增的第二提议模型(secondproposedmodel)(称为模型2)的一照片。根据这个模型(参见数个图式中的数个对应数字)：113.1、所述有害生物基因“x”为所述靶基因(当沉默时，所述有害生物则被控制)。114.2、进行geigs以重定向针对所述有害生物基因“x”的天然存在扩增的rnai前体沉默特异性(例如tas；扩增并加工成数个tasirna)。115.3、一野生型扩增器srna形成与rdrp(扩增酶)相关的一risc复合物。116.4、所述rdrp合成与所述扩增geigs前体的所述转录物本互补的一反义rna链，从而形成dsrna。117.5、所述扩增geigsdsrna通过dicer(s)加工成数个二级srna。118.6、geigsdsrna被所述有害生物吸收。在所述有害生物中，所述植物geigs‑dsrna被加工成小rna，通过rnai下调节所述对应同源有害生物基因“x”。119.7、可能地，来自geigs‑dsrna的二级srna(例如tas前体中的tasirna)也被所述有害生物吸收，并沉默所述靶基因“x”。120.图3a说明具有与所述有害生物序列同源的数个区域的所述植物中的数个内源基因的鉴定(每个模型1)。具体而言，af502391.1(大豆胞囊线虫(h.glycines)，seqidno：1)有害生物针对nm_001037071.1(拟南芥(a.thaliana)，seqidno：2)植物基因的比对。121.图3b说明基于mirna的geigs寡核苷酸，设计成携带靶向所述植物中所述同源区域的一下游区域的数个sirna序列(图3a中所述)。顶部：geigs寡核苷酸，seqidno：3(sirna以红色所示)。底部：与有害生物具有同源性的植物靶基因(seqidno：4)。同源有害生物序列(seqidno：1)以绿色所示。通过geigs‑sirna预测为靶向的所述序列以红色所示。122.图4a说明具有与所述有害生物序列同源的数个区域的所述植物中的数个内源基因的鉴定(每个模型1)。具体而言，af500024.1(大豆胞囊线虫，seqidno：5)有害生物针对nm_116351.7(拟南芥，seqidno：6)植物基因的比对。123.图4b说明基于mirna的geigs寡核苷酸，设计成携带靶向所述植物中的所述同源区域的一下游区域的数个sirna序列(图4a中所述)。顶部：geigs寡核苷酸，seqidno：7(sirna以红色所示)。底部：与所述有害生物具有同源性的靶基因(seqidno：8)。同源有害生物序列(seqidno：5)以绿色所示。通过geigs‑sirna预测为靶向的所述序列以红色所示。124.图5a说明具有与所述有害生物序列同源的数个区域的所述植物中的数个内源基因的鉴定(每个模型1)。具体而言，af469060.1(大豆胞囊线虫，seqidno：9)有害生物针对nm_001203752.2(拟南芥，seqidno：10)植物基因的比对。125.图5b说明基于mirna的geigs寡核苷酸，设计成携带靶向所述植物中的所述同源区域的一下游区域的数个sirna序列(图5a中所述)。顶部：geigs寡核苷酸，seqidno：11(sirna以红色所示)。底部：与所述有害生物具有同源性的靶基因(seqidno：12)。同源有害生物序列(seqidno：9)以绿色所示。通过geigs‑sirna预测为靶向的所述序列以红色所示。126.图6是产生数个geigs模板的计算流水线的一实施例流程图。所述计算geigs管道应用生物元数据(biologicalmetadata)，并能够自动产生数个geigsdna供体模板，用于最小限度地编辑数个内源性非编码rna基因(例如mirna基因)，从而获得一新的功能增益，即将其沉默能力重定向至感兴趣的靶基因表达。127.图7是用靶向所述pds基因的sirna替代内源性mirna的基因组编辑诱导基因沉默(genomeeditinginducedgenesilencing，geigs)的一实施例流程图，从而诱导所述内源性pds基因的基因沉默。为了引入所述修饰，正在使用一2组成部分的系统。首先，一crispr/cas9系统在一含有gfp的载体中，通过设计的数个特异性引导rna在选定的基因座中产生一剪切，以促进在所述位点中的同源dna修复(hdr)。其次，引入一供体序列(具有所述mirna序列所需要的修饰)作为用于所述hdr的一模板，以靶向新分配的数个基因。此系统正在用于原生质体转化中，通过facs富集(由于所述crispr/cas9载体中的所述gfp信号)，回收并再生为数个植物。128.图8a至图8c是说明所述pds基因的沉默引起光致漂白(photobleaching)的数个照片。烟草(nicotiana)(图8a至图8b)及拟南芥(arabidopsis)(图8c)植物中的所述pds基因的沉默引起本生烟(n.benthamiana)(图8b)及拟南芥(图8c，右侧)中的光致漂白。照片是在pds沉默后3周半后拍摄。129.图9a绘示出数个col‑0细胞中的hdr介导的数个基因组交换(hdr‑mediatedgenomicswaps)及用于pcr及此类数个交换的基因分型的数个引物的一范例的一示意图。所述crispr/cas9及sgrna靶向所数交换区域，从而产生一dsdna断裂。所述数个供体模板携带数个同源臂，用于通过同源定向修复(hdr)插入所述基因组位点(attas1b或attas3a)，从而引入所数需要的数个交换。交换区(swapregion)：经过修饰以靶向数个线虫基因序列。数个短箭头代表所述交换特异性或wt特异性正向引物及非特异性反向引物，所述wt特异性正向引物及非特异性反向引物适用于所有反应，用于pcr以说明数个基因组交换。所述反向引物被设计成在所述重组位点的下游进一步退火(anneal)，以避免所述供体模板的扩增反应。数个交换特异性正向引物被设计成它们仅在一交换发生时才允许扩增。一额外的正向引物被设计成用于仅对野生型(wt)序列进行对照pcr扩增。虚线代表pcr产物。椭圆表示用于sanger测序反应的所述反向引物。130.图9b至图9c绘示出使用数个wt引物所产生的数个pcr产物的数个电泳显微照片。所述非特异性反向引物及一wt特异性引物用于对从范例3所叙述的所有处理中提取的dna进行pcr。数个pcr产物在1.6％琼脂糖凝胶上运行。数个小箭头及数个数字表示预期的所述数个pcr产物的数个条带及数个大小。图9b代表attas1b基因座的数个pcr反应，以及图9c代表attas3a基因座的数个反应。y25：y25，copi复合物的β亚基；splicing：拼接因子；ribo3a：核醣体蛋白3a；spliceo：剪接体sr蛋白；wt：野生型；h2o：无模板，水阴性pcr对照组；mw：1kb加上分子量阶梯(neb)。131.图9d至图9e绘示出使用数个交换特异性引物所产生的数个pcr产物的数个电泳显微照片。所述非特异性反向引物及一交换特异性正向引物用于对从范例3的所有交换处理中提取的dna进行pcr。作为所述反应特异性的一对照，wtdna也用作模板。数个pcr产物在1.6％琼脂糖凝胶上运行。数个小箭头及数个数字表示预期的所述数个pcr产物的数个条带及数个大小。图9d代表在attas1b(tas1b)基因座交换的数个pcr反应，以及图9e代表在attas3a(tas3a)基因座交换的数个反应。y25：y25，copi复合物的β亚基；splicing：拼接因子；ribo3a：核醣体蛋白3a；spliceo：剪接体sr蛋白；wt：野生型；h2o：无模板，水阴性pcr对照；mw：1kb加上分子量阶梯(neb)。132.图9f至图9g绘示出数个pcr产物的一sanger测序反应的一方案。图9a中的所述非特异性反向引物用于每个pcr产物的sanger测序。数个箭头代表用于pcr扩增的所述数个特定正向引物。在hdr事件后所引入的数个其他核苷酸改变(不是源自所述反应中使用的所述引物)被突出地显示出并以灰色表示。数个色谱图显示出所述数个pcr产物的所述数个序列，所述数个序列与所述数个预测序列(上线)比对。图9f代表attas1b(tas1b)基因座处的数个交换的数个测序反应，以及图9g代表attas3a(tas3a)基因座处的数个交换的数个反应。y25：y25，copi复合物的β亚基；splicing：拼接因子；ribo3a：核醣体蛋白3a；spliceo：剪接体sr蛋白；wt：野生型。133.图10a至图10b绘示出在数个col‑0细胞中通过hdr介导的数个基因组交换所产生的dsrna的一有义(图10a)及反义(图10b)链的数个示意图。交换区：经过修饰以靶向数个线虫基因的序列。数个短箭头代表用于反转录pcr(rt‑pcr)及cdna产生的所述数个非特异性引物。额外的数个短箭头代表所述交换特异性引物及非特异性引物，在所有反应中都很常见，用于cdna的pcr(pcr)以证明交换表达。数个pcr反应被设计成使得所有pcr产物的所述长度都低于200个核苷酸。数个特定引物被设计成使得它们仅在发生交换时才允许扩增。所述数个虚线代表预期的所述数个pcr产物。所述椭圆表示用于数个sanger测序反应的所述数个引物。方向指示出数个转录物是从5′至3′。134.图10c至图10d绘示出检测attas1b数个有义及反义rna链的表达以检测含有数个交换的dsrna的数个pcr产物电泳的数个显微照片。进行数个rt‑pcr反应以产生cdna，并使用图10a至图10b中叙述的所述数个引物进行数个后续pcr反应。数个pcr产物在1.6％琼脂糖凝胶上运行。数个小箭头及数个数字表示预期的所述数个pcr产物的数个条带及数个大小。图10c代表attas1b有义rna转录物的数个pcr反应，图10d代表attas1b反义rna转录物的pcr反应。y25：y25，copi复合物的β亚基；wt：野生型；h2o：无模板，水阴性pcr对照；mw：1kb加上分子量阶梯(neb)。 rt：使用以反转录酶扩增的cdna作为模板的数个pcr反应。‑rt：数个反转录对照‑未使用反转录酶且未产生cdna。135.图10e至图10f绘示出检测attas3a数个有义及反义rna链的表达以检测含有数个交换的dsrna的数个pcr产物电泳的数个显微照片。进行数个rt‑pcr反应以产生cdna，并使用图10a至图10b中叙述的所述数个引物进行数个后续pcr反应。数个pcr产物在1.6％琼脂糖凝胶上运行。数个小箭头及数个数字表示预期的所述数个pcr产物的数个条带及数个大小。图10e代表attas3a有义rna转录物的数个pcr反应，图10f代表attas3a反义rna转录物的数个pcr反应。ribo3a：核醣体蛋白3a；wt：野生型。h2o：无模板，水阴性pcr对照。mw：1kb加上分子量阶梯(neb)。 rt：使用以反转录酶扩增的cdna作为模板进行数个pcr反应。‑rt：数个反转录对照‑未使用反转录酶且未产生cdna。136.图10g绘示出数个pcr产物的一sanger测序反应的一方案，其通过引入的数个交换来扩增rna的所述有义链。图10a中的所述非特异性正向引物用于每个pcr产物的sanger测序。数个箭头代表用于pcr扩增的所述特定反向引物。供体模板引入的数个其他核苷酸改变被突出地显示并以灰色表示。数个色谱图显示了所述数个pcr产物的所述数个序列，所述数个序列与所述数个预测序列比对。上图代表attas1b(tas1b)基因座中交换的表达证明的数个测序反应，下图代表attas3a(tas3a)基因座中交换的表达证明的反应。y25：y25，copi复合物的β亚基；ribo3a：核醣体蛋白3a；wt：野生型。137.图10h绘示出pcr产物的一sanger测序反应的一方案，其通过引入的数个交换来扩增rna的所述反义链。图10b中的所述非特异性反向引物用于每个pcr产物的sanger测序。数个箭头代表用于pcr扩增的所述特异性正向引物。供体模板引入的数个其他核苷酸改变被突出地显示并以灰色表示。数个色谱图显示出数个pcr产物的所述数个序列，所述数个序列与所述数个预测序列比对。上图代表attas1b(tas1b)基因座中交换的表达证明的数个测序反应，下图代表attas3a(tas3a)基因座中交换的表达证明的反应。y25：y25，copi复合物的β亚基；ribo3a：核醣体蛋白3a；wt：野生型。138.图10i绘示出扩增从tas1b及tas3a转录的野生型rna的所述有义及反义链的数个pcr产物的一sanger测序反应的一方案。对于数个有义转录物，来自图10a的所述非特异性正向引物用于每个pcr产物的sanger测序。对于数个反义转录物，来自图10b的所述非特异性反向引物用于每个pcr产物的sanger测序。数个箭头代表用于pcr扩增的所述数个正向引物。数个色谱图显示出所述数个pcr产物的所述数个序列，所述数个序列与具有注释的所述数个wt序列比对。139.图11a在下图中提供了一条形图，绘示出使用各种处理接种后n.benthamiana的数个叶片中tumv感染的数个水平，如通过数个tumv转录物水平的量化及gfp可视化测量相对表达来表示。对照及数个处理在同一叶片上同步地渗入(infiltratedside‑by‑side)。从左至右‑(1)使用含有tumv载体的农杆菌(n＝3；所述叶片的左侧)或不具有任何载体的农杆菌(n＝3；所述叶片的右侧)来渗入叶片。(2)使用含有过表达mir173的一载体的农杆菌(n＝3；左侧)或不含载体的农杆菌(n＝3；右侧)来渗入叶片。(3)使用过表达geigs‑虚拟(n＝3；左侧)或geigs‑tumv(n＝3；右侧)的一载体来渗入叶片。(4)使用含有过表达geigs‑虚拟的一载体的农杆菌(n＝3；左侧)或含有编码所述geigs‑tumv的载体的农杆菌(n＝2；右侧)来渗入叶片，两者都与含有过表达mir173的一载体的农杆菌来共同渗入叶片。上图中的数个显微照片是分析数个样品的数个代表性图片。tumv通过gfp信号进行监测，在紫外光下是可视化的。数个条形表示数个平均值；数个误差棒代表标准误差；*‑p值<0.05；**‑根据单因子变异数分析(one‑wayanova)及post‑hoctukeyhsd检测，p值<0.01。140.图11b提供的数个照片绘示出数个本氏烟草整个叶片，其中已经使用含有过表达geigs‑虚拟及mir173(中)或过表达geigs‑tumv及mir173(右)的数个载体的农杆菌来共同渗入所述数个本氏烟草整个叶片。使用不含载体的农杆菌来渗入对照叶片(左)。tumv通过gfp信号进行监测，在紫外光下是可视化的。141.图12a是一柱状图，提供了使用从数个本氏烟草叶片中提取的总rna喂养的数个线虫中核醣体蛋白3a的相对表达，经修饰成靶向核醣体蛋白3a的过表达mir390及tas3a的载体共同渗入所述叶片。使用来自过表达tas3awt骨架及mir390扩增器的外植体的rna喂养的数个线虫用作对照。使用肌动蛋白作为内源性标准化基因(endogenousnormalisergene)，通过qrt‑pcr对在3天内使用rna提取物喂养的数个线虫来进行分析。(数个误差棒代表标准误差；***‑p值<0.001)。142.图12b是一柱状图，提供了使用从本氏烟草叶中提取的总rna喂养的数个线虫中剪接体sr蛋白的相对表达，经修饰成靶向剪接体sr蛋白的过表达mir390及tas3a的载体共同渗入所述叶片。使用来自过表达tas3awt骨架及mir390扩增器的外植体的rna喂养的数个线虫用作对照。使用肌动蛋白作为内源性标准划基因，通过qrt‑pcr对在3天内用rna提取物喂养的数个线虫来进行分析。(数个误差棒代表标准误差；**‑p值<0.01)。143.图13a至图13d绘示出使用表达针对核醣体蛋白3a(图13a及图13b)及剪接体蛋白3a(图13c及图13d)的数个geigs设计的数个载体所渗入的数个本氏烟草叶片的rna序列分析(rna‑seqanalysis)(图13a及图13c)及小rna序列分析(smallrna‑seqanalysis)(图13b及图13d)，以及与geigs设计比对的mir390在48至72小时候渗入。每个图中的所述数个浅灰色矩形表示所述转录物上的所述mir390结合区域。每个图中的所述数个黑色方块表示对于所述数个靶基因的所述同源区域，所述同源区域产生靶向数个线虫中数个基因的所述二级sirna。每个图中的数个顶部色谱图表示所述有义链，而数个底部色谱图表示所述反义链。具体实施方式144.本发明的一些实施例中，涉及在一宿主细胞中产生及扩增dsrna分子以沉默数个有害生物靶基因。145.参照所附数个图式及所附说明可以更好地理解本发明的数个原理及操作。146.在详细解释本发明的至少一个实施例之前，应当理解，本发明的应用并不一定限于以下描述中所阐述的或由所述多个示例所举例说明的细节。本发明能够具有其他实施例，或者能够以各种方式被实践或执行。此外，应当理解，本文中采用的措词和术语是出于说明的目的，而不应被视为是限制性的。147.以前在各种生物体(例如鼠类、人类、植物)中对数个rna分子进行基因组编辑的努力，主要是使用转基因破坏mirna活性或数个靶结合位点。数个植物中的基因组编辑主要集中在使用crispr‑cas9技术、数个zfn及数个talen等核酸酶，以敲除在数个模式植物中的数个基因或数个插入。此外，已经描述了使用人工mirna转基因使内源及外源靶基因沉默的植物中的基因沉默(molnara等人，plantj.，2009年，58(1):165至74。doi：10.1111/j.1365‑313x.2008.03767.x，电子版2009年1月19日；borgesandmartienssen，naturereviewsmolecularcellbiology(aop)，2015年11月4日线上发布；doi:10.1038/nrm4085)。将所述数个人工mirna转基因引入至人工表达盒(包括一启动子、终止子、选择标记等)内的数个植物细胞并下调节靶表达。148.数个基因组编辑技术中的最新进展使得通过在诱导位点特异性双链断裂(dsb)后在所述基因组中的数个所需位置处编辑人类患者细胞中的一或多个几个核苷酸(例如通过基因组编辑(nhej及hr))来改变数个活细胞中的dna序列成为可能。虽然nhej主要(如果非排除性地)用于敲除目的，但hr用于引入数个特异性位点的精确编辑，例如数个点突变或校正天然存在或遗传传播的数个有害突变。149.数个成熟小rna(即数个dicer产物及数个非dicer产物)及dsrna(即数个dicer底物，例如数个小rna前体)可以介导有效的细胞基因敲降(geneknockdown)。数个mirna的所述生物发生涉及数个dsrna结构(例如发夹前体)的存在。然而，所述发夹rna可能不会被数个有害生物有效地吸收，因为：(i)由于其不稳定性(例如由切丁机加工)，故数量低；(ii)缺乏数个rna依赖型rna聚合酶(rdrp)的rna‑rna扩增阶段。因此，数个有害生物更容易受到摄入的数个小rna前体(例如dsrna)的影响。150.在将本发明付诸实践的同时，本发明人设计了一种基因编辑技术，所述基因编辑技术针对在数个植物细胞及数个组织中产生用于靶向数个有害生物基因的数个长dsrna分子。所述数个dsrna分子可以在数个细胞及数个组织之间移动及转移；因此，一旦在数个细胞中产生所述数个dsrna分子，所述数个dsrna分子就会发生在数个细胞之外。此外，所述数个dsrna分子可以通过摄入源自所述dsrna表达宿主(dsrna‑expressinghost)(例如数个植物叶片及数个茎部)的材料而于数个生物体之间转移。具体而言，数个本发明人已经开发了涉及两个模型中的一个模型的geigs系统。151.以下叙述的所述数个模型部分地基于wo2019/058255中所叙述的基因组编辑诱导基因沉默(geigs)技术，所述专利通过引用整体并入本文中。如本文所使用，短语“进行geigs”涉及使用所述geigs技术来重定向一沉默rna的沉默特异性，主要包括修饰编码一沉默rna的一核酸序列，使得编码的所述沉默rna靶向一选择的靶。根据一些实施例，通过在一细胞中诱导了编码所述沉默rna的所述核酸序列中的一双链断裂来进行geigs(例如，通过将一核酸内切酶表达或引入至所述细胞中，例如但不限于cas9)，并且提供一核酸模板，所述核酸模板包括编码所述沉默rna的所述核酸序列中的数个所需核苷酸改变。根据此数个实施例，然后当引入所述核酸模板的相关部分时，通过同源性依赖重组(homologydependentrecombination，hdr)将所述数个核苷酸改变引入至具有编码所述沉默rna的所述核酸序列中。根据一些实施例，所述核酸模板在编码所述沉默rna的所述核酸序列中引入数个核苷酸改变，使得所述沉默rna靶向一选择的靶序列。使用geigs改变了编码一mirna或一tasirna的一核酸序列中的数个核苷酸的数个范例在下文的范例1b及范例3中举例说明。152.在所述第一模型中，鉴定与一有害生物靶基因同源的一植物基因。执行geigs以针对所述植物基因(与所述有害生物靶基因同源)来重定向一小rna分子的所述沉默特异性。这种小rna分子(也称为一扩增器或引物小rna)与rdrp形成一复合物，且rdrp合成对于所述植物基因的所述转录物的一互补反义rna链，形成一dsrna。然后将所述dsrna进一步加工成数个二级小rna(srna)。重要的是，所述数个初级小rna、dsrna以及所述数个二级小rna分子(即新产生的所述数个dsrna的所述rnai加工产物，例如通过dicer样被所述有害生物吸收并可以介导有害生物基因沉默。基本上，通过使用geigs重新定向一扩增器小rna分子的所述靶向特异性，所述第一模型能够从之前没有形成一长dsrna的一序列中形成一新的长dsrna，从而产生一定相rna产生位点。由于所述基因座与一有害生物基因具有一天然相似性，因此一产生的长dsrna具有使所述有害生物内的所述对应基因沉默的能力。153.在所述第二模型中，geigs在一植物基因上进行，所述基因自然转化成双链rna形式(产生一长dsrna及数个定相rna的一自然扩增基因座，例如一天然存在的tas)，以将一沉默特异性重定向至一有害生物靶基因。最初，一天然沉默rna分子(在本文中也称为一扩增器或引物小rna；例如22ntmirna，例如mir‑173)被选择以使所述植物基因作为一靶，并能够与rdrp形成一复合物。rdrp合成与所述植物基因的所述转录物对应的一互补反义rna链，形成长一dsrna。然后将所述长dsrna进一步加工成数个二级srna(即新产生的所述数个dsrna的所述rnai加工产物，例如dicer样)。根据所述模型，所述长dsrna以及所述数个二级小rna分子被所述有害生物吸收并可以介导所述有害生物基因沉默。154.因此，本发明提供了在数个植物细胞及数个组织中的可扩增数个dsrna分子的形成，具有预计的更大数量以及更大的小rna群体，并因此具有更高的沉默效力。此外，从所述数个dsrna分子产生的所述多个二级小rna增加了有效靶标敲降的数个机会。通过数个本方法产生的所述dsrna分子被数个有害生物有效吸收，从而能够有效地沉默及安全地控制数个有害生物基因而不伤害所述数个植物。此外，本文所述的基因编辑技术没有实施所述数个经典分子遗传及转基因工具，所述数个经典分子遗传及转基因工具包括具有一启动子、终止子、选择标记的表达盒。155.因此，根据本发明的一方面，提供了一种产生能够沉默一有害生物基因的一植物细胞中的一长dsrna分子的方法，所述方法包括：156.(a)选择一植物基因的一核酸序列，所述植物基因的所述核酸序列与所述有害生物基因的一核酸序列具有一预定序列同源性；157.(b)修饰编码一rna分子的一植物内源核酸序列，从而针对所述植物基因赋予沉默特异性，使得能够募集rna依赖型rna聚合酶(rdrp)的数个小rna分子与所述植物基因的一转录物形成碱基互补，所述数个小rna分子是从所述rna分子加工而来，以产生能够沉默所述有害生物基因的所述长dsrna分子，158.从而产生能够沉默所述有害生物基因的所述植物细胞中的所述长dsrna分子。159.如本文所使用，术语“长dsrna分子(longdsrnamolecule)”是指数个多核糖核酸的数个双链序列，具有一第一链(有义链)及作为所述第一链的一反向互补的一第二链(反义链)，所述数个多核糖核酸通过碱基配对(例如，在碱基配对区域中彼此反向互补的两个序列)保持在一起，其中所述双链多核糖核酸可以是来自所述dicer家族的一酶的一基质，通常其中所述长dsrna分子至少为26bp或更长。所述两个链可以具有相同的长度或不同的长度，前提是所述两个链之间具有足够的序列同源性，以形成一稳定的双链结构，其中至少有80％、85％、90％、95％、97％、99％或100％在整个长度上互补。160.使用术语“互补(complementation)”、“互补性(complementarity)”或“互补的(complementary)”是指数个rna分子(或以加工的小rna形式存在的数个rna分子的至少一部分，或一双链多核苷酸的至少一条链或其部分，或一单链的多核苷酸的一部分)在生理条件下与所述靶rna(例如所述植物基因的转录物)或其一片段杂交，以实现rdrp介导的靶基因合成的调节或功能。举例而言，在一些实施例中，当与所述靶rna(或一给定靶基因的数个家族成员)中10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个、50个、51个、52个、53个、54个、55个、56个、57个、58个、59个、60个、70个、80个、90个、100个、150个、200个、300个、400个、500个或更数个连续核苷酸的一序列相比时，一rna分子具有100％的序列同一性或至少约30％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。161.如本文中所使用，当从5’读至3’的所述数个序列中的一个的每一个核苷酸与从3’读至5’的另一个序列的每一个核苷酸互补时，小rna分子或其加工的小rna形式称为显示出“完全互补性”。与一参考核苷酸序列完全互补的一核苷酸序列将显示出与所述参考核苷酸序列的反向互补序列一相同的序列。162.确定序列互补性的方法是本领域众所周知的，且包括但不限于本领域众所周知的数个生物信息学工具(例如，blast、多序列比对(multiplesequencealignment))。163.根据一实施例，所述长dsrna分子长于20bp。164.根据一实施例，所述长dsrna分子长于21bp。165.根据一实施例，所述长dsrna分子长于22bp。166.根据一实施例，所述长dsrna分子长于23bp。167.根据一实施例，所述长dsrna分子长于24bp。168.根据一实施例，所述长dsrna分子包括20至100,000bp。169.根据一实施例，所述长dsrna分子包括20至10,000bp。170.根据一实施例，所述长dsrna分子包括20至1,000bp。171.根据一实施例，所述长dsrna分子包括20至500bp。172.根据一实施例，所述长dsrna分子包括20至50bp。173.根据一实施例，所述长dsrna分子包括200至5000bp。174.根据一实施例，所述长dsrna分子包括200至1000bp。175.根据一实施例，所述长dsrna分子包括200至500bp。176.根据一实施例，所述长dsrna分子包括2000至100,000bp。177.根据一实施例，所述长dsrna分子包括2000至10,000bp。178.根据一实施例，所述长dsrna分子包括2000至5000bp。179.根据一实施例，所述长dsrna分子包括10,000至100,000bp。180.根据一实施例，所述长dsrna分子包括1,000至10,000bp。181.根据一实施例，所述长dsrna分子包括100至10,000bp。182.根据一实施例，所述长dsrna分子包括100至1,000bp。183.根据一实施例，所述长dsrna分子包括10至1,000bp。184.根据一实施例，所述长dsrna分子包括10至100bp。185.根据一实施例，所述长dsrna分子包括一突出端，即一dsrna分子(即单链rna)的一非双链区域。186.根据一实施例，所述长dsrna分子不包括一突出端。187.根据一实施例，本发明的所述长dsrna分子可被加工成能够与rna诱导的沉默复合物(risc)结合的数个小rna分子。因此，本发明的所述长dsrna分子可作为细胞内rnai加工机制的一底物(即可为一前体rna分子)并且可被核糖核酸酶加工，包括但不限于dicer蛋白家族(例如dcr1及dcr2)、dicer样蛋白家族(例如dcl1、dcl2、dcl3、dcl4)、argonaute蛋白家族(例如ago1、ago2、ago3、ago4)、trna切割酶(例如rny1、血管生成素(angiogenin)、rnasep、rnasep样、slfn3、elac1及elac2)及piwi相互作用rna(pirna)相关蛋白(例如ago3、aubergine、hiwi、hiwi2、hiwi3、piwi、alg1及alg2)转化为数个小rna分子，如下文所详细讨论。188.本文中所使用的术语“植物”包括数个整株植物、一嫁接植物、所述数个植物的祖先和子代以及数个植物部分，包含数个种子、数个幼苗、数个茎、数个根(包含数个块茎)、数个根茎、数个接穗以及数个植物细胞、组织以及器官。所述植物可以是任何形式，包含数个悬浮培养物、数个胚、数个分生组织、数个愈伤组织、数个叶片、数个配子体、数个孢子体、数个花粉以及数个小孢子。在本发明的所述数个方法中可能有用的数个植物包含属于绿色植物总科(superfamilyviridiplantee)的所有植物，特别是选自以下的单子叶(monocotyledonous)和双子叶(dicotyledonous)植物，包含一饲料(fodder)或豆科植物、观赏植物、粮食作物、乔木或灌木(shrub)，选自包括以下列表：相思树属(acaciaspp.)、槭树属(acerspp.)、猕猴桃属(actinidiaspp.)、七叶树属(aesculusspp.)、澳大利亚贝壳杉(agathisaustralis)、苦合欢(albiziaamara)、三色桫椤(alsophilatricolor)、须芒草(andropogonspp.)、落花生属(arachisspp.)、槟榔(arecacatechu)、香桂(asteliafragrans)、鹰嘴紫云英(astragaluscicer)、多小叶红苏木(baikiaeaplurijuga)、桦木属(betulaspp.)、芸苔属(brassicaspp.)、木榄(bruguieragymnorrhiza)、伯克苏木(burkeaafricana)、紫铆花(buteafrondosa)、粉质胚乳白花菜(cadabafarinosa)、朱缨花属(calliandraspp.)、野茶树(camelliasinensis)、美人蕉(cannaindica)、大麻(cannabis)、cannabissativa、汉麻(hemp)、工业汉麻(industrialhemp)、辣椒属(capsicumspp.)、决明属(cassiaspp.)、距豌豆(centroemapubescens)、木瓜属(chacoomelesspp.)、肉桂(cinnamomumcassia)、小果咖啡(coffeaarabica)、可乐豆木(colophospermummopane)、变异小冠花(coronilliavaria)、枸子(cotoneasterserotina)、山楂属(crataegusspp.)、黄瓜属(cucumisspp.)、柏木属(cupressusspp.)、银蕨(cyatheadealbata)、榅桲(cydoniaoblonga)、日本柳杉(cryptomeriajaponica)、香茅属(cymbopogonspp.)、银蕨(cyntheadealbata)、榅桲(cydoniaoblonga)、货贝黄檀(dalbergiamonetaria)、大叶骨碎补(davalliadivaricata)、金钱草属(desmodiumspp.)、新西兰树蕨(dicksoniasquarosa)、拢双黄茅(dibeteropogonamplectens)、迪奥豆属(diocleaspp.)、扁豆属(dolichosspp.)、直矛豆(dorycniumrectum)、金字塔稗(echinochloapyramidalis)、红景天属(ehraffiaspp.)、穇子(eleusinecoracana)、幽眉草属(eragrestisspp.)、刺桐属(erythrinaspp.)、桉属(eucalypfusspp.)、假乌木(eucleaschimperi)、绒毛状金茅(eulaliavi/losa)、荞麦属(pagopyrumspp.)、费约果(feijoasellowlana)、草莓属(fragariaspp.)、千斤拔属(flemingiaspp.)、河岸藤露览树(freycinetiabanksli)、东亚老鹤草(geraniumthunbergii)、银杏(ginagobiloba)、野黄豆(glycinejavanica)、墨西哥丁香属(gliricidiaspp.)、陆地棉(gossypiumhirsutum)、银禅属(grevilleaspp.)、鞘杆古夷布提木(guibourtiacoleosperma)、岩黄蓍属(hedysarumspp.)、牛鞭草(hemaffhiaaltissima)、黄茅(heteropogoncontoffus)、大麦(hordeumvulgare)、红荀茅(hyparrheniarufa)、小连翅(hypericumerectum)、hypeffheliadissolute、异花木蓝(indigoincamata)、鸢尾属(irisspp.)、雨伞草(leptarrhenapyrolifolia)、胡枝子属(lespedizaspp.)、万苣属(lettucaspp.)、银合欢(leucaenaleucocephala)、单罗得草(loudetiasimplex)、lotonusbainesli、百脉根属(lotusspp.)、硬皮豆(macrotylomaaxillare)、苹果属(malusspp.)、木薯(manihotesculenta)、紫苜蓿(medicagosaliva)、水杉(metasequoiaglyptostroboides)、香蕉(musasapientum)、香蕉(banana)、烟草属(nicotianumspp.)、驴食豆属(onobrychisspp.)、鸟足豆属(ornithopusspp.)、稻属(oryzaspp.)、非洲双翼豆(peltophorumafricanum)、狼尾草属(pennisetumspp.)、酪梨(perseagratissima)、碧冬煎属(petuniaspp.)、菜豆属(phaseolusspp.)、加拿利海枣(phoenixcanariensis)、新西兰剑麻(phormiumcookianum)、石楠属(photiniaspp.)、白云杉(piceaglauca)、松属(pinusspp.)、豌豆(pisumsativam)、新西兰罗汉松(podocarpustotara)、斑点普格纳西亚草(pogonarthriafleckii)、礼普格纳西亚草(pogonaffhriasquarrosa)、杨属(populusspp.)、瓜叶牧豆(prosopiscineraria)、花旗松(pseudotsugamenziesii)、星状老虎刺(pterolobiumstellatum)、西洋梨(pyruscommunis)、栎属(quercusspp.)、厚叶石斑木(rhaphiolepsisumbellata)、美味棒花棕(rhopalostylissapida)、纳塔尔漆树(rhusnatalensis)、欧洲醋栗(ribesgrossularia)、荼荐子属(ribesspp.)、刺槐(robiniapseudoacacia)、蔷薇属(rosaspp.)、悬钩子属(rubusspp.)、柳属(salixspp.)、红裂稃草(schyzachyriumsanguineum)、金松(sciadopitysvefficillata)、北美红杉(sequoiasempervirens)、巨杉(sequoiadendrongiganteum)、两色高梁(sorghumbicolor)、菠菜属(spinaciaspp.)、流苏状鼠尾粟(sporobolusfimbriatus)、苦豆草(stiburusalopecuroides)、矮柱花草(stylosanthoshumilis)、葫芦茶属(tadehagispp.)、落羽杉(taxodiumdistichum)、阿拉伯黄背草(themedatriandra)、三叶草属(trifoliumspp.)、小麦属(triticumspp.)、异叶铁杉(tsugaheterophylla)、越桔属(vacciniumspp.)、蚕豆属(viciaspp.)、葡萄(vitisvinifera)、锥穗沃森花(watsoniapyramidata)、马蹄莲(zantedeschiaaethiopica)、玉蜀黍(zeamays)、苋菜(amaranth)、洋蓟(artichoke)、芦笋(asparagus)、球花甘蓝(broccoli)、抱子甘蓝(brusselssprouts)、卷心菜、油菜(canola)、胡萝卜、花椰菜、芹菜、绿叶羽衣甘蓝(collardgreens)、亚麻(flax)、散叶甘蓝(kale)、小扁豆(lentil)、油籽油菜(oilseedrape)、秋葵、洋葱、马铃薯、水稻、大豆、稻草、甜菜、甘蔗、向日葵、西红柿、南瓜茶(squashtea)、树。或者，藻类和其它非绿色植物(non‑viridiplantae)可以用于本发明的一些实施例的方法。189.根据一具体的实施例，所述植物是一作物、一开花植物、一杂草或一桥木。190.根据一具体的实施例，所述植物是一木本(woody)植物物种，例如，猕猴桃(actinidiachinensis)(猕猴桃科(actinidiaceae))、木薯(manihotesculenta)(大戟科(euphorbiaceae))、北美鹅掌楸(firiodendrontulipifera)(木兰科(magnoliaceae))、杨树(populus)(杨柳科(salicaceae))、檀香树(santalumalbum)(檀香科(santalaceae))、榆树(ulmus)(榆科(ulmaceae))以及蔷薇科(rosaceae)(苹果、李、梨)和芸香科(rutaceae)(柑桔、小柠檬)的不同物种、裸子植物(例如，白云杉(piceaglauca)和火炬松(pinustaeda))、林木(例如，桦木科(betulaceae)、壳斗科(fagaceae)、裸子植物以及热带树种)、果树、灌木或草本植物(例如，香蕉、可可、椰子、咖啡、枣子、葡萄以及茶)以及油棕。191.根据一具体的实施例，所述植物是一热带作物，例如，咖啡、澳洲坚果、香蕉、菠萝、芋头、木瓜、芒果、大麦、豆类、木薯、鹰嘴豆、可可(巧克力)、豇豆、玉米(maize)(玉米(corn))、小米、水稻、高粱、甘蔗、甘薯、烟草、芋头、茶、山药。[0192]“谷物(grain)”、“种子”或“豆”是指一开花植物的繁殖单位，能够发育成另一种这样的植物。如本文中所使用，所述数个术语同义地且可互换地使用。[0193]根据一具体的实施例，所述植物是一植物细胞，例如一胚胎细胞悬浮液中的植物细胞。[0194]根据一具体的实施例，所述植物细胞是一原生质体。[0195]所述数个原生质体来源自任何植物组织，例如水果、数个花朵、数个根、数个叶、数个胚、胚细胞悬浮液、愈伤组织或幼苗组织。[0196]根据一具体的实施例，所述植物细胞是一胚发生细胞。[0197]根据一具体的实施例，所述植物细胞是一体细胞胚发生细胞。[0198]如本文所使用，术语“植物基因”是指所述植物中的任何基因，例如内源基因，所述内源基因可被修饰以针对一有害生物基因赋予沉默特异性。[0199]根据一实施例，所述植物基因是一非编码基因(例如非蛋白质编码基因)。[0200]根据一实施例，所述植物基因是一编码基因(例如蛋白质编码基因)。[0201]根据一实施例，所述植物基因(即表现出与所述有害生物基因的所述核酸序列具有同源性的所述预定序列)不编码一沉默分子。[0202]根据一实施例，所述植物基因不编码具有一内在沉默活性的一分子(例如rna分子，例如非编码rna分子，如下文所详细讨论)。[0203]根据一实施例，所述植物基因编码具有一内在沉默活性的一分子(例如rna分子，例如非编码rna分子，如下文所详细讨论)。[0204]如本文所使用，术语“有害生物(pest)”是指直接或间接伤害所述植物的生物。一直接作用包括例如，以植物叶子为食。间接作用包括例如，一疾病因子(例如一病毒、一细菌等)向所述植物的传播。在后一种情况下，所述有害生物是一病原体传播的载体。[0205]根据一些实施例，有害生物是一无脊椎有害生物，包括通过例如但不限于摄取及/或浸泡的数个方法对长dsrna敏感的一无脊椎有害生物。每种可能性代表本发明的一单独实施例。根据一些实施例，对26bp以上(可能地为26至50bp)的长dsrna敏感的一无脊椎有害生物。每种可能性代表本发明的一单独实施例。[0206]根据一实施例，所述有害生物是一无脊椎生物(invertebrateorganism)。[0207]数个示例性有害生物包括但不限于昆虫、线虫、蜗牛、蛞蝓、蜘蛛、毛虫(caterpillars)、蝎子、螨虫(mites)、蜱虫(ticks)、真菌等。[0208]数个有害生物包括但不限于选自鞘翅目(例如甲虫)、双翅目(例如苍蝇、蚊子)、膜翅目(例如锯蝇、黄蜂、蜜蜂及蚂蚁)、鳞翅目(例如蝴蝶及飞蛾)、食毛目(mallophaga)(例如虱子，例如咀嚼虱、咬虱及鸟虱)、半翅目(例如真正的臭虫)、同翅目包括胸口亚目(例如蚜虫、粉虱及介壳虫)、颈喙亚目(auchenorrhyncha)(例如蝉、叶蝉、树蝉、飞虱及沬蝉(spittlebugs))、鞘喙亚目(coleorrhyncha)(例如苔藓虫及甲虫)、直翅目(例如蚱蜢、蝗虫及蟋蟀，包括蚱蜢及蟋蟀)、缨翅目(例如蓟马)、革翅目(dermaptera)(例如耳螟)、等翅目(例如白蚁)、虱目(anoplura)(例如吸虱)、虹吸目(例如跳蚤)、毛翅目(如石蛾)等的昆虫。[0209]本发明的有害生物包括但不限于玉米：欧洲玉米螟(ostrinianubilalis)；球菜夜蛾(agrotisipsilon)；玉米穗虫(helicoverpazea)；秋粘虫(spodopterafrugiperda)；西南玉米螟(diatraeagrandiosella)；小玉米茎蛀虫(elasmopalpuslignosellus)；甘蔗螟虫(diatraeasaccharalis)；西部玉米根虫(diabroticavirgifera)；北方玉米根虫(diabroticalongicornisbarberi)；南方玉米根虫(diabroticaundecimpunctatahowardi)；叩头虫属金针虫(melanotusspp.)；北方蒙面金龟子(白蛴螬)(cyclocephalaborealis)；南方蒙面金龟子(白蛴螬)(cyclocephalaimmaculata)；日本甲虫(popilliajaponica)；玉米跳蚤甲虫(chaetocnemapulicaria)；玉米蝾螈(sphenophorusmaidis)；玉米叶蚜(rhopalosiphummaidis)；玉米根蚜(anuraphismaidiradicis)；蝾螈(blissusleucopterusleucopterus)；红腿蚱蜢(melanoplusfemurrubrum)；迁徙蚱蜢(melanoplussanguinipes)；玉米蛆(hylemyaplatura)；玉米斑潜叶虫(agromyzaparvicornis)；草蓟马(anaphothripsobscrurus)；窃蚁(solenopsismilesta)；二斑叶螨(tetranychusurticae)；高粱：高粱螟(chilopartellus)；秋粘虫(spodopterafrugiperda)；玉米穗虫(helicoverpazea)；小玉米茎蛀虫(elasmopalpuslignosellus)；粒状蠕虫(feltiasubterranea)；白蛴螬(phyllophagacrinita)；线虫(eleodes、conoderus及aeolusspp.)；谷叶甲虫(oulemamelanopus)；玉米跳蚤甲虫(chaetocnemapulicaria)；玉米蝾螈(sphenophorusmaidis)；玉米叶蚜(rhopalosiphummaidis)；黄色甘蔗蚜虫(siphaflava)；蝾螈(blissusleucopterusleucopterus)；高粱蠓(contariniasorghicola)；胭脂红叶螨(tetranychuscinnabarinus)；二斑叶螨(tetranychusurticae)；小麦：粘虫(pseudaletiaunipunctata)；秋粘虫(spodopterafrugiperda)；小玉米茎蛀虫(elasmopalpuslignosellus)；西部地老虎(agrotisorthogonia)；elasmopalpuslignosellus(elasmopalpuslignosellus)；谷叶甲虫(oulemamelanopus)；三叶草象鼻虫(hyperapunctata)；南方玉米根虫(diabroticaundecimpunctatahowardi)；俄罗斯小麦蚜虫；绿蚧(schizaphisgraminum)；英国粮蚜(macrosiphumavenae)；红腿蚱蜢(melanoplusfemurrubrum)；差异蚱蜢(melanoplusdifferentis)；迁徙蚱蜢(melanoplussanguinipes)；黑森瘿蚊(mayetioladestructor)；小麦蠓(sitodiplosismosellana)；小麦茎蛆(meromyzaamericana)；小麦鳞茎苍蝇(hylemyacoarctate)；烟草蓟马(frankliniellafusca)；小麦茎叶蜂(cephuscinctus)；小麦卷曲螨(aceriatulipae)；向日葵：向日葵芽蛾(suleimahelianthana)；向日葵蛾(homoeosomalectellum)；向日葵甲虫(zygogrammaexclamationis)；胡萝卜甲虫(bothyrusgibbosus)；葵花籽蠓(neolasiopteramurtfeldtiana)；棉花：棉虫(heliothisvirescens)；棉铃虫(helicoverpazea)；甜菜夜蛾(spodopteraexigua)；粉红铃虫(pectinophoragossypiella)；棉铃象鼻虫(anthonomusgrandis)；棉蚜(aphisgossypii)；棉跳蚤(pseudatomoscelisseriatus)；带翅粉虱(trialeurodesabutilonea)；褪泽植物臭虫(lyguslineolaris)；红腿蚱蜢(melanoplusfemurrubrum)；差异蚱蜢(melanoplusdifferentis)；洋葱蓟马(thripstabaci,)；烟草蓟马(franklinkiellafusca)；胭脂红叶螨(tetranychuscinnabarinus)；二斑叶螨(tetranychusurticae)；水稻：甘蔗螟(diatraeasaccharalis)；秋粘虫(spodopterafrugiperda)；玉米穗虫(helicoverpazea)；葡萄肖叶甲(colaspisbrunnea)；稻水象鼻虫(lissorhoptrusoryzophilus)；水稻象鼻虫(sitophilusoryzae)；稻叶蝉(nephotettixnigropictus)；蝾螈(blissusleucopterusleucopterus)；绿色臭虫(acrosternumhilare)；大豆：大豆活瓣(pseudoplusiaincludens)；天鹅绒毛虫(anticarsiagemmatalis)；绿色三叶草(plathypenascabs)；欧洲玉米螟(ostrinianubilalis)；黑地老虎(agrotisipsilon)；甜菜夜蛾(spodopteraexigua)；棉虫(heliothisvirescens)；棉铃虫(helicoverpazea)；墨西哥豆甲虫(epilachnavarivestis)；绿桃蚜(myzuspersicae)；马铃薯叶蝉(empoascafabae)；绿色臭虫(acrosternumhilare)；红腿蚱蜢(melanoplusfemurrubrum)；差异蚱蜢(melanoplusdifferentis)；玉米蛆(hylemyaplatura)；大豆蓟马(sericothripsvariabilis)；洋葱蓟马(thripstabaci)；草莓红蜘蛛(tetranychusturkestani)；二斑叶螨(tetranychusurticae)；大麦：欧洲玉米螟(ostrinianubilalis)；黑地老虎(agrotisipsilon)；绿蚧(schizaphisgraminum)；蝾螈(blissusleucopterusleucopterus)；绿色臭虫(acrosternumhilare)；棕色臭虫(euschistusservus)；玉米蛆(deliaplatura)；黑森瘿蚊(mayetioladestructor)；褐麦螨(petrobialatens)；油菜油菜：甘蓝蚜虫(brevicorynebrassicae)；跳蚤甲虫(phyllotretacruciferae)；宽领夜蛾(mamestraconfigurata)；小菜蛾(plutellaxylostella)；根蛆(deliassp.)。[0210]示例性线虫包含但不限于，穴居线虫(burrowingnematode)(穿孔线虫(radopholussimilis))、秀丽隐杆线虫(caenorhabditiselegans)、阿拉伯咖啡穿孔线虫(radopholusarabocoffeae)、咖啡根腐线虫(pratylenchuscoffeae)、根结线虫(root‑knotnematode)(根结线虫属(meloidogynespp.)、孢囊线虫(cystnematode)(异皮线虫属(heteroderaspp.)和球异皮线虫属(globoderaspp.))、根腐线虫(rootlesionnematode)(根腐线虫属(pratylenchusspp.))、甘薯茎线虫(stemnematode)(茎线虫(ditylenchusdipsaci))、松树萎蔫线虫(pinewiltnematode)(松材线虫(bursaphelenchusxylophilus))、肾形线虫(reniformnematode)(肾形线虫(rotylenchulusreniformis))、匕首线虫(xiphinemaindex)、假根瘤线虫(nacobbusaberrans)以及叶芽线虫(aphelenchoidesbesseyi)。[0211]示例性真菌包含但不限于，尖孢镰刀菌(fusariumoxysporum)、油菜茎基溃疡病菌(leptosphaeriamaculans)(和春油菜黑胫病(phomalingam))、油菜菌核病菌(sclerotiniasclerotiorum)、水稻稻瘟病菌(pyriculariagrisea)、藤仓赤霉菌(gibberellafujikuroi)念珠镰孢(fusariummoniliforme)、稻瘟病菌(magnaportheoryzae)、灰葡萄孢霉(botrytiscinereal)、柄锈双单孢菌属(pucciniaspp.)、禾谷镰孢(fusariumgraminearum)、禾本科布氏白粉菌(blumeriagraminis)、禾生球腔菌(mycosphaerellagraminicola)、炭疽菌属(colletotrichumspp.)、玉米黑粉菌(ustilagomaydis)、亚麻栅锈菌(melampsoralini)、豆薯层锈菌(phakopsorapachyrhizi)以及立枯丝核菌(rhizoctoniasolani)。[0212]根据一具体的实施例，所述有害生物是蚂蚁、白蚁、蜜蜂、黄蜂、毛虫、蟋蟀、蝗虫、甲虫、蜗牛、蛞蝓、线虫、臭虫(bug)、苍蝇、果蝇、粉虱、蚊子、蚱蜢、飞虱、螟虫、蚜虫、鳞片、蓟马、蜘蛛、螨虫、木虱、蜱虫、飞蛾、蠕虫及蝎子，及处于不同生命周期阶段的蚂蚁、蜜蜂、黄蜂、毛虫、甲虫、蜗牛、蛞蝓、线虫、臭虫、苍蝇、粉虱、蚊子、蚱蜢、蜈蚣、蚜虫、鳞片、蓟马、蜘蛛、螨虫、木虱及蝎子。[0213]根据一具体的实施例，所述有害生物处于其生命的任何生命周期阶段。[0214]根据一实施例，所述有害生物是一病毒。[0215]短语“沉默一害生物基因(silencingapestgene)”是指与未通过本发明设计的长dsrna分子靶向的一有害生物基因相比，将一多核苷酸或由其编码的多肽的表达水平降低至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或100％。[0216]用于测量一多核苷酸或由其编码的多肽的表达水平的数个测定包括但不限于rt‑pcr、西方墨点法(westernblot)、免疫组织化学(immunohistochemistry)及/或流式细胞术(flowcytometry)、测序(sequencing)或任何其他检测方法(如下文所进一步讨论)。[0217]优选地，所述有害生物基因的沉默引起所述有害生物的抑制、控制及/或死亡，从而限制所述有害生物对所述植物造成的损害。控制一有害生物包括但不限于杀死所述有害生物、抑制所述有害生物的发育、改变所述有害生物的繁殖力或生长，以使所述有害生物对所述植物造成较少损害、减少产生的后代数量、产生不适合的有害生物、产生更容易受到捕食者攻击的有害生物、或阻止所述有害生物吃所述植物。[0218]如本文所使用，术语“有害生物基因(pestgene)”是指对于生长、发育、繁殖或传染性必不可少的所述有害生物中的任何基因。所述基因可在所述有害生物的任何组织中表达，然而，在一具体的实施例中，靶向抑制所述有害生物的所述数个基因在所述有害生物的肠道组织的数个细胞、所述有害生物的中肠的数个细胞、肠腔或中肠内壁的数个细胞、所述有害生物的肠道微生物组的数个细胞及所述有害生物的免疫系统的数个细胞中表达。此类靶基因可参与例如肠道细胞代谢、生长、分化及免疫系统。[0219]通过所述数个本方法所靶向的示例性有害生物基因包括但不限于下表1a至b中所列出的所述数个基因。[0220]根据一具体的实施例，所述线虫基因包括类似放射线虫(radopholussimilis)数个基因钙网蛋白13(calreticulin13。crt)或胶原蛋白5(col‑5)。[0221]根据一具体的实施例，真菌基因包括尖孢镰刀菌(fusariumoxysporum)数个基因fow2、frp1及opr。[0222]根据一实施例，与受所述有害生物伤害且未施用本发明设计的长dsrna分子的一植物相比，沉默一有害生物基因(silencingapestgene)，减少了一植物中的数个疾病症状或减少了对所述植物至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或100％的损害(由所述有害生物引起)。[0223]测量一有害生物的控制的数个测定是本领域众所周知的，参见例如通过引用并入本文的美国专利号5,614,395。此类数个技术包括随时间测量平均病灶直径(averagelesiondiameter)、病原体生物量(pathogenbiomass)及数个腐烂植物组织的总体百分比(overallpercentageofdecayedplanttissues)。举例而言，参见通过引用并入本文的thomma等人(1998)plantbiology95:15107‑15111。另参见baum等人(2007)naturebiotech11:1322‑1326及wo2007/035650，同时提供了数个整株植物饲喂试验及数个玉米根饲喂试验。[0224]根据一实施例，所述方法包括选择一植物基因的一核酸序列，所述植物基因的所述核酸序列与所述有害生物基因的一核酸序列表现出一预定序列同源性。[0225]根据一实施例，所述植物基因的所述核酸序列与所述有害生物基因的所述核酸序列之间的所述序列同源性包括60％至100％、70％至80％、70％至90％、70％至100％、75％至100％、80％至90％、80％至100％、85％至100％、90％至100％或95％至100％同一性。[0226]根据一具体的实施例，所述序列同源性包括所述植物基因的所述核酸序列与所述有害生物基因的所述核酸序列之间的75％至100％同一性。[0227]根据一具体的实施例，所述序列同源性包括所述植物基因的所述核酸序列与所述有害生物基因的所述核酸序列之间的85％至100％同一性。[0228]根据一具体的实施例，所述序列同源性包括所述植物基因的所述核酸序列与所述有害生物基因的所述核酸序列之间的75％至100％同一性。[0229]根据一实施例，所述序列同源性包括所述植物基因的所述核酸序列与所述有害生物基因的所述核酸序列之间的至少50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。[0230]同源性(例如，同源性百分比、序列同一性 序列相似性)可使用计算成一对序列比对(pairwisesequencealignment)的任何同源性比较软件来确定。[0231]如本文所使用，在两个核酸或多肽序列的上下文中的“序列同一性”或“同一性”包括指在比对(aligned)时相同的两个序列中的所述数个残基。当序列同一性百分比用于数个蛋白质时，应认识到，不相同的数个残基位置通常因数个保守氨基酸取代(conservativeaminoacidsubstitutions)而不同，其中数个氨基酸残基被具有数个相似化学性质(例如电荷或疏水性)的数个其他氨基酸残基取代而因此不会改变所述分子的所述数个功能性质。当数个序列在数个保守取代(conservativesubstitutions)方面不同时，可以向上调整所述序列同一性百分比以校正所述取代的所述保守本质。通过此数个保守取代(suchconservativesubstitutions)而有所不同的数个序列被认为具有“序列相似性”或“相似性”。进行这种调整的数个手段是本领域技术人员众所周知的。一般而言，这涉及将一保守取代评分为一部分错配(partialmismatch)而不是一完全错配(fullmismatch)，从而增加所述序列同一性百分比。因此，举例而言，如果一相同氨基酸的评分为1，而一非保守取代的评分为0，则保守取代的评分介于0及1之间。数个保守取代的评分是例如根据henikoffs及henikoffjg的演演算法(aminoacidsubstitutionmatricesfromproteinblocks.proc.natl.acad.sci.，美国，1992年，89(22):10915至9)来计算的。[0232]可以使用任何同源性比较软件，包括例如国家生物技术信息中心(nationalcenterofbiotechnologyinformation，ncbi)的blastn软件，例如通过使用数个默认参数(defaultparameters)，来确定同一性(例如，同源性百分比)。[0233]根据本发明的一些实施例，所述同一性是一全局同一性(globalidentity)，即本发明的所述整个氨基酸或数个核酸序列的同一性，而不是其数个部分的同一性。[0234]根据本发明的一些实施例，术语“同源性(homology)”或“同源的(homologous)”是指两个或多个核酸序列的同一性；或两个或多个氨基酸序列的同一性；或一氨基酸序列与一或多个核酸序列的同一性。[0235]根据本发明的一些实施例，所述同源性是一全局同源性(globalhomology)，即本发明的所述整个氨基酸或核酸序列的同源性，而不是其数个部分的同源性。[0236]两个或多个序列之间的同源性或同一性程度可以使用各种已知的序列比较工具来确定。以下是可与本发明的一些实施例一起使用的此类工具的一非限制性描述。[0237]当从一多核苷酸序列开始并与其他多核苷酸序列进行比较时，emboss‑6.0.1needleman‑wunsch演演算法(可从emboss(dot)sourceforge(dot)net/apps/cvs/emboss/apps/needle(dot)html获得)可以与以下数个默认参数一起使用：(emboss‑6.0.1)间隙开启(gapopen)＝10；间隙扩展(gapextend)＝0.5；数据文件＝ednafull；总结(brief)＝是(yes)。[0238]根据本发明的一些实施例，与emboss‑6.0.1needleman‑wunsch演算法一起使用的所述数个参数是间隙开启(gapopen)＝10；间隙扩展(gapextend)＝0.2；数据文件＝ednafull；总结(brief)＝是(yes)。[0239]根据本发明的一些实施例，用于比较数个多核苷酸与数个多核苷酸的用于使用emboss‑6.0.1needleman‑wunsch演算法来确定同源性的所述阈值为80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。[0240]根据一些实施例，同源性程度的确定还需要采用smith‑waterman演算法(用于蛋白质‑蛋白质比较或核苷酸‑核苷酸比较)。[0241]gencore6.0smith‑waterman演算法的所述默认参数包括：model＝sw.model。[0242]根据本发明的一些实施例，用于使用smith‑waterman演算法确定同源性的所述阈值为80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。[0243]根据本发明的一些实施例，在执行与感兴趣的所述多肽或多核苷酸的所述全局同源性之前(例如整个序列有80％的全局同源性)，对通过与感兴趣的所述多肽或多核苷酸的局部同源性(localhomology)(例如超过60％的所述序列长度的60％同一性)预选的序列进行所述总体同源性。举例而言，数个同源序列是使用blast软件选择的，其中所述blastp及tblastn演算法作为所述第一阶段的数个过滤器，且所述针(needle)(emboss包)或frame 演算法比对用于所述第二阶段。局部同一性(数个blast比对)的定义非常宽松‑在60％的所述数个序列长度跨度上具有60％的同一性，因为它仅用作所述全局比对阶段的一过滤器。在所述特定实施例中(当使用所述局部同一性时)，不使用所述blast包的所述默认过滤(通过设置参数“‑ff”)。[0244]在所述第二阶段中，基于与所述核心基因多肽序列至少80％的全局同一性来定义数个同源物。根据一些实施例，所述同源性是一局部同源性或一局部同一性。[0245]数个局部比对工具包括但不限于美国国家生物技术信息中心(ncbi)的blastp、blastn、blastx或tblastn软件、fasta及smith‑waterman演算法。[0246]根据一具体的实施例，同源性是使用具有以下数个参数的blastn确定的：数个最大靶序列＝1000，期望阈值＝10，字大小(wordsize)＝11，匹配分数＝2，不匹配分数＝‑3，间隙存在成本＝5，间隙扩展成本＝2。[0247]根据一具体的实施例，通过鉴定与所述有害生物转录物具有“数个同源性延伸(homologystretches)”的数个植物转录物来选择表现出与所述有害生物基因的一核酸序列具有一预定序列同源性的一植物基因的一核酸序列。根据一具体的实施方案，所述同源性延伸是在所述整个植物转录物上的20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、35个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个、50个、100个、150个、200个、250个、300个、400个、500个、600个、700个、800个、900个、1000个、1500个、2000个、2500个、3000个、3500个、4000个、4500个、5000个、5500个、6000个、7000个、8000个、9000个、10,000个或更多个核苷酸(例如20个至50个核苷酸、20个至25个核苷酸，例如21个核苷酸)。在所述20个至50个核苷酸(例如21个核苷酸)内，所述植物转录物与所述有害生物转录物的同源性优选为75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％。[0248]根据一具体的实施例，当所述有害生物是一线虫(heteroderaglines)时，所述有害生物基因如保藏号af469060.1(大豆胞囊线虫泛素延伸蛋白(heteroderaglycinesubiquitinextensionprotein))所述，所述植物基因如nm_001203752.2(拟南芥泛素11(arabidopsisthalianaubiquitin11)(ubq11))所述。[0249]根据一具体的实施例，当所述有害生物是一线虫(heteroderaglines)时，所述有害生物基因如保藏号af500024.1(大豆胞囊线虫假定腺蛋白g8h07(heteroderaglycinesputativeglandproteing8h07))所述，植物基因如nm_116351.7(拟南芥糖基转移酶家族1蛋白(arabidopsisthalianaglycosyltransferasefamily1protein)(at4g01210))所述。[0250]根据一具体的实施例，当所述有害生物是一线虫(大豆胞囊线虫(heteroderaglycines))时，所述有害生物基因如保藏号af502391.1(大豆胞囊线虫假定腺蛋白g10a06(heteroderaglycinesputativeglandproteing10a06))所述，植物基因如nm_001037071.1(拟南芥bzip转录因子家族蛋白(arabidopsisthalianabziptranscriptionfactorfamilyprotein，tga1))所述。[0251]根据一实施例，所述方法包括修饰编码一rna分子的一植物内源核酸序列，以针对所述植物基因赋予沉默特异性，使得能够募集rna依赖型rna聚合酶(rdrp)的数个小rna分子与所述植物基因的一转录物形成碱基互补，所述数个小rna分子是从rna加而来的，以产生能够沉默所述有害生物基因的所述长dsrna分子。[0252]根据一实施例，所述rna分子是一非编码rna分子。[0253]如本文所使用，术语“非编码rna分子”是指未转译成一氨基酸序列且不编码一蛋白质的一rna序列。[0254]根据一实施例，编码所述rna分子的所述核酸序列位于一非编码基因(例如非蛋白质编码基因)中。所述基因组的示例性非编码部分包括但不限于数个内含子、数个非编码rna的数个基因、数个dna甲基化区、数个增强子及数个基因座控制区、数个绝缘子、数个s/mar序列、数个非蛋白质编码假基因(non‑protein‑codingpseudogenes)、数个转座子(transposons)、数个非自主转座元件(non‑autonomoustransposableelements)(例如alu、sines及突变的数个非编码转座子及反转录转座子)以及数个染色体着丝粒及端粒区域的数个简单重复。[0255]根据一实施例，编码所述rna分子的所述核酸序列位于普遍表达的一非编码基因中。[0256]根据一实施例，编码所述rna分子的所述核酸序列位于以一组织特异性方式(例如在一叶片、果实或花朵中)表达的一非编码基因中。[0257]根据一实施例，编码所述rna分子的所述核酸序列位于以一诱导方式表达的一非编码基因中。[0258]根据一实施例，编码所述rna分子的所述核酸序列位于受发育性调节的一非编码基因中。[0259]根据一实施例，编码所述rna分子的所述核酸序列位于数个基因之间，即位于基因间区域(intergenicregion)。[0260]根据一实施例，编码所述rna分子的所述核酸序列位于一非编码基因的一内含子内。[0261]根据一实施例，编码所述rna分子的所述核酸序列位于编码基因(例如蛋白质编码基因)中。[0262]根据一实施例，编码所述rna分子的所述核酸序列位于一编码基因(例如蛋白质编码基因)的一外显子内。[0263]根据一实施例，编码所述rna分子的所述核酸序列位于编码一编码基因(例如蛋白质编码基因)的一非转译区(utr)的一外显子内。[0264]根据一实施例，编码所述rna分子的所述核酸序列位于一编码基因(例如蛋白质编码基因)的一转译外显子内。[0265]根据一实施例，编码所述rna分子的所述核酸序列位于一编码基因(例如蛋白质编码基因)的一内含子内。[0266]根据一实施例，编码所述rna分子的所述核酸序列位于普遍表达的一编码基因内。[0267]根据一实施例，编码所述rna分子的所述核酸序列位于以一组织特异性方式(例如在一叶片、果实或花朵中)表达的一编码基因内。[0268]根据一实施例，编码所述rna分子的所述核酸序列位于以一诱导方式表达的一编码基因内。[0269]根据一实施例，编码所述rna分子的所述核酸序列位于发育性调节的一编码基因中。[0270]根据一实施例，所述rna分子(例如非编码rna分子)通常受到所述rna沉默加工机制或活性所影响。然而，本文还考虑了数个核苷酸的一些改变(例如，对于多达24个核苷酸activityrepression)是通过数个表观遗传相关因子(epigenetic‑relatedfactors)所介导的，例如数个甲基转移酶(methyl‑transferases)、甲基化靶dna(methylatetargetdna)及数个组蛋白(histones)。因此，在共转录基因沉默中，一小rna与一靶rna的所述关联(association)(小rna转录相互作用)破坏了所述靶新生转录物的稳定性，并招募了诱导染色质重塑成抑制基因活性及转录的一结构的数个dna及组蛋白修饰酶(dna‑andhistone‑modifyingenzymes)(即数个表观遗传因子)。此外，在共转录基因沉默中，数个染色质相关的长非编码rna支架(chromatin‑associatedlongnon‑codingrnascaffolds)可以独立于数个小rna招募数个染色质修饰复合物(chromatin‑modifyingcomplexes)。这些共转录沉默机制形成数个rna监视系统，所述数个rna监视系统检测及沉默不合适的数个转录事件，并通过数个自我增强表观遗传环(self‑reinforcingepigeneticloops)提供这些事件的一存储(如叙述于下述文献中:d.hoch及d.moazed,rna‑mediatedepigeneticregulationofgeneexpression,natrevgenet.(2015)16(2):71–84]。[0284]根据本发明的一实施例，所述rnai生物发生/加工机制(rnaibiogenesis/processingmachinery)产生所述rna沉默分子。[0285]根据本发明的一实施例，所述rnai生物发生/加工机制(rnaibiogenesis/processingmachinery)产生所述rna沉默分子，但尚未鉴定出具体的靶(specifictarget)。[0286]根据一实施例，所述rna分子(例如非编码rna分子)能够诱导rna干扰(rnai)。[0287]根据一实施例，所述rna分子(例如非编码rna分子或rna沉默分子)是由一前体(precursor)加工而成的。[0288]根据一实施例，所述rna分子(例如非编码rna分子或所述rna沉默分子)是由一单链rna(ssrna)前体加工而成的。[0289]根据一实施例，所述rna分子(例如非编码rna分子或所述rna沉默分子)是由一双链体结构的单链rna前体加工而成的。[0290]根据一实施例，所述rna分子(例如非编码rna分子或所述rna沉默分子)是由一dsrna前体(例如包括完美及不完美碱基配对)加工而成的。[0291]根据一实施例，所述rna分子(例如非编码rna分子或所述rna沉默分子)是由一非结构化rna前体加工而成的。[0292]根据一实施例，所述rna分子(例如非编码rna分子或所述rna沉默分子)是由一蛋白质编码rna前体加工而成的。[0293]根据一实施例，所述rna分子(例如非编码rna分子或所述rna沉默分子)是由一rna前体加工而成的。[0294]根据一实施例，所述rna分子(例如非编码rna分子或所述rna沉默分子)被加工并与rna诱导沉默复合物(rna‑inducedsilencingcomplex，risc)结合。[0295]根据一实施例，所述rna分子(例如非编码rna分子或rna沉默分子)被加工并与rnai加工机制结合，所述rnai加工机制例如为核糖核酸酶，包括但不限于dicer、ago2、所述dicer蛋白家族(例如dcr1及dcr2)、dicer样蛋白家族(dicer‑likeproteinfamily)(例如dcl1、dcl2、dcl3、dcl4)、argonaute蛋白家族(例如ago1、ago2、ago3、ago4)、数个trna切割酶(例如rny1、血管生成素、rna酶p、rna酶p样、slfn3、elac1及elac2)及piwi相互作用rna(pirna)相关蛋白(例如ago3、aubergine、hiwi、hiwi2、hiwi3、piwi、alg1及alg2)(如下文所进一步讨论的)。[0296]根据一实施例，dsrna可源自两种不同的数个互补rna，或源自本身折迭形成dsrna的单一rna。[0297]以下是数个rna沉默分子(例如非编码rna分子)的一详细叙述，所述数个rna沉默分子与rna诱导沉默复合物(risc)结合，并包括可根据本发明的数个具体实施例使用的一内在rnai活性(例如是数个rna沉默分子)。[0298]基于完全和不完全的配对rna(即双链rna；dsrna)、sirna以及shrna‑在数个细胞中数个长dsrna的存在刺激一核糖核酸酶iii酶(ribonucleaseiiienzyme)(称为dicer)的活性。dicer(也称为核糖核酸内切酶dicer或具有rnase基序的解螺旋酶(helicase))是一种在数个植物中通常被称为dicer样(dcl)蛋白的酶。不同植物具有不同数量的dcl基因，因此，例如，拟南芥(arabidopsis)基因组通常具有四个dcl基因，水稻具有八个dcl基因，且玉蜀黍基因组具有五个dcl基因。dicer参与将所述dsrna加工成数个短片段的dsrna(称为短干扰rna(sirna))的过程。源自dicer活性的sirna的长度通常为约21至约23个核苷酸，且包括具有两个3’核苷酸突出端的约19个碱基对双链体。[0299]根据一个实施例，使用长于21bp的数个dsrna前体。各种研究表明，长的dsrna可用于沉默基因表达而不会诱导应激反应或引起显着的脱靶作用‑例如参见(strat等人，nucleicacidsresearch，2006年，第34卷，第13号：3803至3810；bhargavaa等人，brainres.protoc.，2004年，13：115至125；diallom.等人，oligonucleotides，2003年，13：381至392；paddisonp.j.等人，proc.natlacad.sci.usa，2002年；99：1443至1448；trann.等人，febslett.，2004年，573：127至134)。[0300]术语“sirna”是指诱导所述rna干扰(rnai)途径的小的抑制性rna双链体(通常在18至30个碱基对之间)。通常，sirna被化学合成为21个聚体(mer)，具有一中心19bp双链体区域且在末端具有对称的2‑碱基3’‑突出端，尽管最近已经描述了化学合成的25至30个碱基长的rna双链体与在相同位置处具有21个聚体相比，效力可提高100倍。表明使用较长的rna触发rnai所获得的观察到的提高效力是由为dicer提供一基质(27个聚体)而不是一产物(21个聚体)引起的，这提高了所述sirna双链体进入risc的速度或效率。[0301]已经发现，所述3’‑突出端的位置(而不是组成)影响一sirna的效力，且在反义链上具有一3’‑突出端的不对称双链体通常比在有义链上具有所述3’‑突出端的不对称双链体更有效力(rose等人，2005年)。[0302]一双链干扰rna(例如，sirna)的数个链可以连接以形成一发夹(hairpin)或茎环(stem‑loop)结构(例如，一shrna)。因此，如上所述，本发明的一些实施例的所述rna沉默分子也可以是一短发夹rna(shrna)。[0303]如本文中所使用，术语短发夹rna(“shrna”)是指具有一茎环结构的一rna分子，包括互补序列的一第一及第二区域，互补程度和所述数个区域的方向足以使得在所述数个区域之间发生碱基配对，所述第一和第二区域通过一环区域连接，所述环是由于所述环区域内的数个核苷酸(或数个核苷酸类似物)之间缺乏碱基配对而导致的。所述环中的数个核苷酸数目是介于且包含3至23、或5至15、或7至13、或4至9、或9至11之间的数字，在所述环中的一些所述数个核苷酸可以参与所述环中的其他核苷酸的碱基配对交互作用。可以用于形成所述环的数个寡核苷酸序列的实例包含5’‑caagaga‑3及5’‑uuacaa‑3’(国际专利申请号wo2013126963和wo2014107763)。本领域技术人员将意识到，由此产生的单链寡核苷酸形成一茎环或发夹结构，包括能够与所述rnai机制相互作用的一双链区。[0304]本发明的一些实施例的所述rna沉默分子不必限于仅含有rna的那些分子，而是进一步包括数个化学修饰的核苷酸和非核苷酸。[0305]本发明考虑了各种类型的sirna，包含反式作用sirna(tasirna)、重复相关sirna(repeat‑associatedsirna，ra‑sirna)以及自然反义转录衍生sirna(natural‑antisensetranscript‑derived，nat‑sirna)。[0306]根据一具体的实施例，所述rna分子(例如非编码rna分子)是一定相小干扰rna(phasedsmallinterferingrna，phasirna)。数个“phasirna”源自由rdr6转化为dsrna并由dcl4加工的一mrna，例如拟南芥(arabidopsis)数个反式作用sirna(数个tasirna)(vazquez等人，2004年)。在一特殊情况下，数个phasirna也可能是数个草生殖组织中dcl5(以前称为dcl3b)的24个核苷酸产物(song等人，2012年)。一些phasirna的所述反式作用名称(trans‑actingname)(tasirnas)来自如以同源性依赖方式的数个mirnas般发挥功能的它们的能力，导致从非其源mrna的数个基因中的数个mrna的ago1依赖型沉默(参见下文)。[0307]根据一具体的实施例，所述rna分子(例如非编码rna分子)是一tasirna。“tasirna”是一类由数个非编码tas转录物以分阶段模式由mirna触发生成的数个二级sirna(peragine等人，2004；vazquez等人，2004年；allen等人，2005；yoshikawa等人，2005年)。术语“定相(phased)”仅表示数个所述数个小rna是从一特异性核苷酸开始以一头对尾排列(head‑to‑tailarrangement)精确生成的；这种配置是由mirna触发的起始，然后是dcl4催化的切割引起的。参与tasirna生物发生的所述数个主要蛋白质包括但不限于rdr6、基因沉默的抑制子3(suppressorofgenesilencing3，sgs3)、dcl4、ago1、ago7及double‑strandedrnabindingfactor4(peragine等人，2004年；vazquez等人，2004年；xie等人，2005年；adenot等人，2006年；montgomery等人，2008a；fukudome等人，2011年)。最重要的是，产生数个21个核苷酸的tasirna有两种机制，称为所述“one‑hit”或“two‑hit”途径。在所述单击机制(one‑hitmechanism)中，一单一mirna指导所述mrna靶标的裂解，触发所述片段39中的数个phasirna的产生，以到达(或下游)靶位点(allen等人，2005年)。所述单击mirna触发器(one‑hitmirnatrigger)的长度通常为22个核苷酸(chen等人，2010年；cuperus等人，2010年)。在所述双击模型中，使用一对21个核苷酸的mirna靶位点，其中仅在39个靶位点发生切割，触发数个phasirna片段(或靶位点上游)的产生(axtell等人，2006年)。[0308]根据一个实施例，沉默rna包含“pirna”，其是一类piwi相互作用rna，长度约为26及31个核苷酸。数个pirna通常通过与数个piwi蛋白质相互作用形成数个rna‑蛋白质复合物，即数个反义pirna通常加载至数个piwi蛋白质(例如piwi、ago3以及茄子(aubergine，aub))中。[0309]mirna‑accordingtoanotherembodimentthernasilencingmoleculemaybeamirna.[0310]mirna‑根据另一实施例，rna沉默分子可以是一mirna。[0311]术语“微小rna(microrna)”、“mirna”以及“mir”是同义词，是指长度约为19至24个核苷酸的数个非编码单链rna分子的一集合，其调节基因表达。数个mirna广泛存在于各种生物体(例如，昆虫、哺乳动物、植物、线虫)，且已显示其在发育、体内平衡以及疾病病原学中起作用。[0312]最初，所述pre‑mirna是以一长的非完全双链茎环rna的形式存在，进一步通过dicer将其加工成一sirna样双链体，包括成熟的引导链(mirna)和一大小相似的片段(称为乘客(passenger)链(mirna*))。所述mirna和mirna*可以源自所述pri‑mirna和pre‑mirna的相对臂。数个mirna*序列可以在克隆的mirna的文库中找到，但出现率通常低于mirna，因为在大多数情况下于所述细胞中是没有功能的及未降解的。[0313]尽管最初以一双链类型与mirna*存在，但所述mirna最终变成以一单链rna的形式并入一核糖核蛋白复合物中，称为rna诱导沉默复合物(rna‑inducedsilencingcomplex，risc)。各种蛋白质可以形成所述risc，其可以引起对mirna/mirna*双链体的特异性、所述靶基因的结合位点、mirna的活性(抑制或激活)以及所述mirna/mirna*双链体的哪一条链加载至所述risc的可变性。[0314]当将所述mirna：mirna*双链体的所述mirna链加载至所述risc中时，移除并降解所述mirna*。加载至所述risc中的所述mirna：mirna*双链体的所述链是5’末端不紧密配对的链。在所述mirna：mirna*的两端具有大致相等的5’配对的情况下，mirna和mirna*两者都可能具有基因沉默活性。[0315]所述risc根据所述mirna和所述mrna之间的高度互补性，特别是通过所述mirna的核苷酸2至8位(称为“种子序列”)来鉴定数个靶核酸。[0316]许多研究已经着眼于mirna与其mrna靶之间的所述碱基配对需求，用于实现有效的转译抑制(通过bartel(2004年，cell，116至281)综述)。数个计算研究分析了mirna在整个基因组上的结合，已表明在所述mirna的5’端处的碱基2至8位(也称为“种子序列”)在靶结合中的一特定作用，但发现通常为“a”的第一核苷酸的作用也被识别(lewis等人，2005年，cell，120至15)。同样地，krek等人使用核苷酸1至7位或2至8位来鉴定和验证数个靶(2005年，natgenet.，37至495)。在所述mrna中的所述数个靶位点可以在5’utr、3’utr或编码区域中。有趣的是，数个mirna可以通过识别相同或数个位点来调节相同的mrna靶。在大多数遗传识别的靶中存在数个mirna结合位点，可能表明数个risc的协同作用提供了最有效的转译抑制。[0317]mirna可能通过两种机制之一引导所述risc下调节基因表达：mrna剪切(cleavage)或转译抑制。如果所述mrna与所述mirna具有一定程度的互补性，则所述mirna可以指定所述mrna的剪切。当一mirna引导剪切时，切割通常在与所述mirna的残基10和11位配对的所述数个核苷酸之间。或者，如果所述mirna与所述mirna不具有必要的互补程度，则所述mirna可以抑制转译。由于动物在所述mirna和结合位点之间的互补性程度较低，因此转译抑制在动物中可能更为普遍。[0318]应注意的是，任何一对mirna和mirna*的所述5’和3’末端中可能存在可变性。此可变性可能是由于drosha和dicer的酶加工中相对于剪切位点的可变性所致。在mirna和mirna*的所述5’和3’末端处的可变性也可能是由于所述pri‑mirna和pre‑mirna的所述数个茎结构中的不匹配所致。所述数个茎链的不匹配可能引起大量不同的发夹结构。所述数个茎结构中的可变性也可能引起通过drosha和dicer剪切数个产物中的可变性。[0319]根据一实施例，mirna可以独立于dicer进行加工，例如，通过argonaute2进行加工。[0320]应理解的是，所述pre‑mirna序列可以包括45至90、60至80或60至70个核苷酸，而所述pri‑mirna序列可以包括45至30,000、50至25,000、100至20,000、1,000至1,500或80至100个核苷酸。[0321]反义‑反义是一单链rna，旨在通过与其mrna特异性杂交来防止或抑制一基因的表达。一靶rna的下调节可以使用一反义多核苷酸来实现，所述反义多核苷酸能够与用于编码所述靶rna的一mrna转录物特异性杂交。[0322]转座元件rna[0323]数个转座遗传元件(transposablegeneticelements，tes)包括大量dna序列，所有序列都能够通过一剪切及黏贴机制(cut‑and‑pastemechanism)(数个转座子)直接地或通过一rna中间体(反转录转座子)间接地移动至数个基因组中的数个新位点。根据数个te是否具有编码转座(transposition)所需蛋白质的数个orf，所述数个te分为数个自主及非自主类别。rna介导的基因沉默是基因组控制数个te活性及源自基因组遗传及表观遗传不稳定性的数个有害影响的机制之一。[0324]如上所述，所述rna分子(例如非编码rna分子)可能不包括一典型(内在)rnai活性(例如不是一典型rna沉默分子(canonicalrnasilencingmolecule)，或尚未鉴定出的其靶)。此类非编码rna分子包括：[0325]根据一个实施例，所述rna分子(例如非编码rna分子)是一转移rna(trna)。术语“trna”是指作为数个核酸的核苷酸序列与数个蛋白质的氨基酸序列之间的物理连接的一rna分子，以前称为可溶性rna或srna。trna的长度通常约为76至90个核苷酸。[0326]根据一个实施例，所述rna分子(例如非编码rna分子)是一核糖体rna(rrna)。术语“rrna”是指所述核糖体的rna组成部分，即小核糖体亚基(subunit)或大核糖体亚基。[0327]根据一个实施例，所述rna分子(例如非编码rna分子)是一小核rna(snrna或u‑rna)。术语“srna”或“u‑rna”是指在数个真核细胞中的细胞核的数个拼接斑点(splicingspeckle)和数个卡哈尔体(cajalbody)内发现的数个小rna分子。snrna的长度通常约为150个核苷酸。[0328]根据一个实施例，所述rna分子(例如非编码rna分子)是一小核仁rna(smallnucleolarrna，snorna)。术语“snorna”是指主要引导其他rna(例如，rrna、trna以及snrna)的化学修饰的数个小rna分子类别。snorna通常分为两类：c/d盒snorna的长度通常约为70至120个核苷酸，并与甲基化有关；且h/aca盒snorna的长度通常约为100至200核苷酸，并与假尿苷化(pseudouridylation)有关。[0329]与snorna相似的是scarna(即数个小卡哈尔体rna基因(smallcajalbodyrnagene))，其在rna成熟中的作用与snorna相似，但它们的靶是剪接体(spliceosomal)snrna，且它们对数个剪接体snrna前体(在所述细胞核的所述数个卡哈尔体中)进行位点特异性修饰。[0330]根据一个实施例，所述rna分子(例如非编码rna分子)是一细胞外rna(extracellularrna，exrna)。术语“exrna”是指存在于转录它们的数个细胞外部的rna种类(例如，外泌体rna(exosomalrna))。[0331]根据一实施例，rna分子(例如非编码rna分子)是一重复衍生rna(repeat‑derivedrna)。术语“重复衍生rna(repeat‑derivedrna)”是指由衍生自数个反向基因组重复(例如但不限于通过dna重组、基因组位点复制、数个转座事件(transpositionevents)等产生的dna)的dna编码的一rna。[0332]根据一个实施例，所述rna分子(例如非编码rna分子)是一长的非编码rna(longnon‑codingrna，lncrna)。术语“lncrna”或“长ncrna”是指通常长于200个核苷酸的非蛋白质编码转录物。[0333]根据一具体的实施例，与risc结合的数个rna分子(例如非编码rna分子)的非限制性实例包含但不限于微小rna(microrna，mirna)、piwi相互作用rna(pirna)、短干扰rna(sirna)、短发夹rna(shrna)、定相小干扰rna(phasirna)、反式作用sirna(tasirna)、小核rna(smallnuclearrna，snrna或urna)、转座元件rna(如自主及非自主转座rna)、转移rna(trna)、小核仁rna(snorna)、小卡哈尔体rna(scarna)、核糖体rna(rrna)、细胞外rna(exrna)、重复衍生rna(repeat‑derivedrna)以及长的非编码rna(lncrna)。[0334]根据一具体的实施例，与risc结合的数个rnai分子的非限制性实例包含但不限于小干扰rna(sirna)、短发夹rna(shrna)、微小rna(mirna)、piwi相互作用rna(pirna)以及反式作用sirna(tasirna)。[0335]根据一实施例，从本发明的一些实施例的所述rna分子(例如非编码rna分子)加工的数个小rna分子能够募集rna依赖型rna聚合酶(rna‑dependentrnapolymerase，rdrp)。[0336]术语“加工的(processed)”是指rna分子被剪切成能够与rna诱导沉默复合物(rna‑inducedsilencingcomplex，risc)结合的小rna形式的生源论(biogenesis)。举例而言，pre‑mirna被加工成一成熟mirna，例如通过dicer。[0337]如本文所使用，术语“小rna形式”或“数个小rna”或“数个小rna分子”是指能够与一靶rna杂交的所述成熟小rna，例如所述植物基因(或其片段)的转录物。[0338]根据一实施例，所述数个小rna的长度不超过250个核苷酸，例如包括20至250、20至200、20至150、20至100、20至50、20至40、20至30、20至25、20至26、30至100、30至80、30至60、30至50、30至40、50至150、50至100、50至80、50至70、100至250、100至200、100至150、150至250、150至200个核苷酸。[0339]根据一具体的实施例，所述小rna分子包括20至50个核苷酸。[0340]根据一具体的实施例，所述小rna分子包括20至30个核苷酸。[0341]根据一具体的实施例，所述小rna分子包括21至29个核苷酸。[0342]根据一具体的实施例，所述小rna分子包括21至24个核苷酸。[0343]根据一具体的实施例，所述小rna分子包括21个核苷酸。[0344]根据一具体的实施例，所述小rna分子包括22个核苷酸。[0345]根据一具体的实施例，所述小rna分子包括23个核苷酸。[0346]根据一具体的实施例，所述小rna分子包括24个核苷酸。[0347]根据一具体的实施例，所述小rna分子是由20至50个核苷酸组成。[0348]根据一具体的实施例，所述小rna分子是由20至30个核苷酸组成。[0349]根据一具体的实施例，所述小rna分子是由21至29个核苷酸组成。[0350]根据一具体的实施例，所述小rna分子是由21至24个核苷酸组成。[0351]根据一具体的实施例，所述小rna分子是由21个核苷酸组成。[0352]根据一具体的实施例，所述小rna分子是由22个核苷酸组成。[0353]根据一具体的实施例，所述小rna分子是由23个核苷酸组成。[0354]根据一具体的实施例，所述小rna分子是由24个核苷酸组成。[0355]根据一实施例，所述小rna分子包括一沉默活性(即为数个沉默分子)。[0356]如上所述，本发明的一些实施例的数个沉默分子(例如数个rna沉默分子)能够募集rna依赖型rna聚合酶(rna‑dependentrnapolymerase，rdrp)。[0357]术语“rna依赖型rna聚合酶(rna‑dependentrnapolymerase)”或“rdrp”是指从一rna模板催化rna复制的所述酶。[0358]根据一实施例，所述小rna分子包括针对所述rdrp的一扩增器或引物活性。[0359]根据一具体的实施例，能够募集所述rdrp的所述沉默分子选自由微小rna(mirna)、小干扰rna(sirna)、短发夹rna(shrna)、piwi相互作用rna(pirna)、反式作用sirna(tasirna))、定相小干扰rna(phasirna)、转移rna(trna)、小核rna(snrna)、核醣体rna(rrna)、小核仁rna(snorna)、细胞外rna(exrna)、重复衍生rna、自主及非自主转座rna所组成的群组。[0360]根据本发明的一些实施例，能够募集所述rdrp的所述沉默分子包括21至24个核苷酸。[0361]根据本发明的一些实施例，能够募集所述rdrp的所述沉默分子包括21个核苷酸。[0362]根据本发明的一些实施例，能够募集所述rdrp的所述沉默分子包括22个核苷酸。[0363]根据本发明的一些实施例，能够募集所述rdrp的所述沉默分子包括23个核苷酸。[0364]根据本发明的一些实施例，能够募集所述rdrp的所述沉默分子包括24个核苷酸。[0365]根据本发明的一些实施例，能够募集所述rdrp的所述沉默分子是由21个核苷酸组成。[0366]根据本发明的一些实施例，能够募集所述rdrp的所述沉默分子是由22个核苷酸组成。[0367]根据本发明的一些实施例，能够募集所述rdrp的所述沉默分子是由23个核苷酸组成。[0368]根据本发明的一些实施例，能够募集所述rdrp的所述沉默分子是由24个核苷酸组成。[0369]根据一具体的实施例，能够募集所述rdrp的所述沉默分子是mirna。[0370]根据一具体的实施例，所述mirna包括一21至25个核苷酸的成熟小rna[0371]根据一具体的实施例，所述mirna包括一21个核苷酸的成熟小rna。[0372]根据一具体的实施例，所述mirna包括一22个核苷酸的成熟小rna。[0373]根据一具体的实施例，所述mirna包括一23个核苷酸的成熟小rna。[0374]根据一具体的实施例，所述mirna包括一24个核苷酸的成熟小rna。[0375]根据一具体的实施例，所述mirna包括一25个核苷酸的成熟小rna。[0376]根据一具体的实施例，所述mirna是一21至25个核苷酸的成熟小rna。[0377]根据一具体的实施例，所述mirna是一21个核苷酸的成熟小rna。[0378]根据一具体的实施例，所述mirna包括一22个核苷酸的成熟小rna。[0379]根据一具体的实施例，所述mirna是一23个核苷酸的成熟小rna。[0380]根据一具体的实施例，所述mirna是一24个核苷酸的成熟小rna。[0381]根据一具体的实施例，所述mirna是一25个核苷酸的成熟小rna。[0382]示例性mirna包括但不限于mir‑156a、mir‑156c、mir‑162a、mir‑162b、mir‑167d、mir‑169b、mir‑173、mir‑393a、mir‑393b、mir‑402、mir‑403、mir‑447a、mir‑447b、mir‑447c、mir‑472、mir‑771、mir‑777、mir‑828、mir‑830、mir‑831、mir‑831、mir‑833a、mir‑833a、mir‑840、mir‑845b、mir‑848、mir‑850、mir‑853、mir‑855、mir‑856、mir‑864、mir‑2933a、mir‑2933b、mir‑2936、mir‑4221、mir‑5024、mir‑5629、mir‑5648、mir‑5996、mir‑8166、mir‑8167a、mir‑8167b、mir‑8167c、mir‑8167d、mir‑8167e、mir‑8167f、mir‑81777‑8182。[0383]如上所述，本发明一些实施例的所述方法包括修饰编码一rna分子的一植物内源核酸序列，以针对所述植物赋予基因沉默特异性。[0384]根据一实施例，当所述rna分子不具有一内在沉默活性时，所述方法进一步包括将针对所述植物基因赋予所述rna分子的一沉默特异性的一dna编辑剂引入所述植物细胞中。[0385]根据一实施例，当所述rna分子具有针对一天然植物基因的一内在沉默活性时，所述方法进一步包括将一dna编辑剂引入所述植物细胞中，所述dna编辑剂将所述rna分子的一沉默特异性重定向至针对所述植物基因，所述植物基因及所述天然植物基因是不同的。[0386]修饰数个核酸序列的数个方法在下文中详细讨论。[0387]根据一些实施例，例如在本文所述的第二模型中，一植物基因的一核酸序列被修饰，从而编码一长dsrna分子，所述长dsrna分子针对一有害生物基因赋予一沉默特异性。根据一些实施例，所述核酸序列编码针对一天然植物基因具有一内在沉默活性的一rna分子，使得所述修饰产生具有除了或代替所述内在沉默活性的一新沉默活性(例如针对一有害生物基因)的一沉默rna。每种可能性代表本发明的一单独实施例。[0388]因此，根据本发明的另一方面，提供了一种产生能够沉默一有害生物基因的一植物细胞中的一长dsrna分子的方法，所述方法包括：[0389](a)在一植物基因组中选择一核酸序列，所述核酸序列编码一沉默分子，所述沉默分子以一植物基因作为一目标，所述沉默分子能够募集rna依赖型rna聚合酶(rdrp)；[0390](b)修饰所述植物基因的一核酸序列，从而针对所述有害生物基因赋予一沉默特异性，使得包括所述沉默特异性的所述植物基因的一转录物与能够募集所述rdrp的所述沉默分子形成碱基互补，以产生能够沉默所述有害生物基因的所述长dsrna分子，[0391]从而产生能够沉默所述有害生物基因的所述植物细胞中的所述长dsrna分子。[0392]根据一实施例，所述植物基因不编码具有一内在沉默活性的一分子。[0393]根据一实施例，当所述植物基因不编码具有一内在沉默活性的一分子时，所述方法进一步包括将一dna编辑剂引入至所述植物细胞，所述dna编辑剂针对一有害生物基因赋予所述植物基因的一沉默特异性。[0394]根据一实施例，所述植物基因编码针对一天然植物基因具有一内在沉默活性的一分子。[0395]根据一实施例，具有一内在沉默活性的所述植物基因选自一微小rna(mirna)、一小干扰rna(sirna)、一短发夹rna(shrna)、一piwi相互作用rna(pirna)、一反式作用sirna(tasirna)、一定相小干扰rna(phasirna)、一转运rna(trna)、一小核rna(snrna)、一核醣体rna(rrna)、一小核仁rna(snorna)、一细胞外rna(exrna)、一重复衍生rna及一自主及非自主的转座rna。[0396]根据一些实施例，编码具有所述内在沉默活性的一rna的所述植物基因编码了定相二级产生sirna分子。[0397]如本文所使用，短语“定相二级sirna产生分子(phasedsecondarysirna‑producingmolecule)”是指能够与一初级沉默分子(例如一mirna)形成碱基互补的一rna转录物，所述初级沉默分子募集rna依赖型rna聚合酶(rdrp)，从而被转录至一长dsrna分子，然后再加工成数个二级沉默rna分子(即数个定相rna)。根据一些实施例，所述定相二级sirna产生分子是选自由一tasirna及一phasirna所组成的群组。[0398]根据一些实施例，所述定相二级sirna产生分子能够被加工成多个二级沉默rna分子，即至少两个二级沉默rna分子。根据一些实施例，编码所述定相二级sirna产生分子的所述基因的修饰步骤，包括仅修饰通过加工所述定相二级sirna产生分子而形成的所述数个二级沉默rna分子的一部分。根据一具体的实施例，编码所述定相二级sirna产生分子的所述基因的修饰步骤，包括仅修饰通过加工所述定相二级sirna产生分子形成的一个二级沉默rna分子。根据一些实施例，编码所述定相二级sirna产生分子的所述基因的修饰步骤，包括修饰通过加工所述所述定相二级sirna产生分子而形成的至少一个二级沉默rna分子。根据数个其他实施例，编码所述定相二级sirna产生分子的所述基因的修饰步骤，包括修饰通过加工所述定相二级sirna产生分子而形成的所有二级沉默rna分子。不希望受理论或机制的束缚，修饰了编码所述定相二级sirna产生分子的所述基因，使得所述数个二级沉默rna分子中的仅一个的所述沉默特异性针对一新靶(例如一有害生物rna)，足以诱导所述新靶的至少部分沉默。[0399]根据一些实施例，待修饰的所述二级沉默rna分子序列的长度是所述靶向有害生物内二级沉默分子的长度(例如，如果一tasirn在一有害生物内加工从而形成数个24nt二级srna，则针对一植物细胞中编码所述定相二级sirna产生分子的所述基因序列进行修饰，使得至少一个24nt序列靶向选择的所述有害生物rna)。根据一些实施例，修饰所述植物基因(例如编码一定相二级产生sirna分子的一植物基因)的一核酸序列以针对一有害生物基因赋予一沉默特异性的步骤包括修饰21至30nt的一序列，任选地为24nt，可能地为所述植物基因中的30nt，因此所述编码序列与通过所述有害生物基因编码的一rna基本上互补。每种可能性代表本发明的一单独实施例。不希望受理论或机制的束缚，修饰了编码所述定相二级sirna产生分子的所述基因，使得所述编码序列的30nt与所述有害生物基因互补，确保了(可能不同于在所述植物基因内加工的)所述长dsrna的加工，导致在所述有害生物中具有一功能性沉默活性的数个二级rna分子。根据一具体的实施例，具有所述内在沉默活性的所述植物基因是一反式作用sirna(tas)产生分子。[0400]根据一具体的实施例，所述植物基因包含针对所述沉默分子的一结合位点。[0401]根据一具体的实施例，所述植物基因包含针对mirna分子的一结合位点。[0402]根据一具体的实施例，mirna包括但不限于mir‑156a、mir‑156c、mir‑162a、mir‑162b、mir‑167d、mir‑169b、mir‑173、mir‑393a、mir‑393b、mir‑402、mir‑403、mir‑447a、mir‑447b、mir‑447c、mir‑472、mir‑771、mir‑777、mir‑828、mir‑830、mir‑831、mir‑831、mir‑833a、mir‑833a、mir‑840、mir‑845b、mir‑848、mir‑850、mir‑853、mir‑855、mir‑856、mir‑864、mir‑2933a、mir‑2933b、mir‑2936、mir‑4221、mir‑5024、mir‑5629、mir‑5648、mir‑5996、mir‑8166、mir‑8167a、mir‑8167b、mir‑8167c、mir‑8167d、mir‑87f6emir‑8177及mir‑8182。[0403]根据一实施例，当所述植物基因编码具有一内在沉默活性的一分子时，所述方法进一步包括将一dna编辑剂引入至所述植物细胞，所述dna编辑剂将所述植物基因的一沉默特异性重定向至所述有害生物基因，所述有害生物基因及所述天然植物基因是不同的。[0404]如本文所使用，术语“重定向一沉默特异性(redirectsasilencingspecificity)”是指将所述rna分子或所述植物基因的所述转录物的所述原始特异性重新编程为所述rna分子或所述植物基因转录物的一非天然靶。因此，所述rna分子或所述植物基因转录物的所述原始特异性被废除(即功能丧失)，而新的所述特异性是针对与所述天然靶不同的一靶(即分别为一植物或一有害生物的rna)，即获得功能增益。应理解的是，只有在所述rna分子或所述植物基因的转录物不具有内在沉默活性的情况下才会发生功能增益。[0405]如本文所使用，术语“天然植物rna”是指由一rna分子(例如非编码rna分子，例如沉默分子)天然结合的一rna序列。因此，本领域技术人员将所述天然植物rna(即一天然植物基因的转录物)视为所述rna分子(例如非编码rna，例如沉默分子)的一天然基质(即靶)。[0406]如本文所使用，术语“植物rna”或“植物靶rna”是指不被一rna分子(例如非编码rna，例如沉默分子)天然结合的一rna序列(编码的或非编码的)。因此，所述植物rna(即一植物基因的转录物)不是所述rna分子(例如非编码rna，例如沉默分子)的一天然基质(即靶标)。[0407]如本文所使用，术语“有害生物rna”或“有害生物靶rna”是指一rna序列，所述rna序列通过经设计的所述植物rna及/或产生的所述数个dsrna分子及数个二级小rna(通过加工dsrna产生)来沉默。因此，所述有害生物rna(即一有害生物基因的转录物)不是所述植物rna或所述dsrna或所述数个二级小分子的一天然基质(即靶)。[0408]如本文所使用，短语“沉默一基因(silencingagene)”是指来自所述靶基因的mrna及/或数个蛋白质产物的水平的不存在或可观察到的降低(例如由于共同转录及/或转录后基因沉默)。因此，与不被本发明设计的rna分子所靶向的一基因相比，一靶基因的沉默可以是5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％。[0409]沉默的所述数个结果可以通过检查从吸收了所述植物中设计的所述rna的一植物细胞或整株植物或其他生物体(例如有害生物)的所述数个外在特性来确认，或通过数个生化技术(如本文进一步讨论的)来确认。[0410]应理解的是，本发明的一些实施例的经设计的所述rna分子可以具有一些脱靶特异性效应(off‑targetspecificityeffect)，只要它不影响一农业上有价值的性状(例如所述植物的生物量、产量、生长等).[0411]一rna分子(例如沉默分子)与一靶rna的所述特异性结合可以通过计算演算法(例如blast)来确定，并通过包括例如北方印迹、原位杂交、quantigeneplexassay等来验证。[0412]根据一实施例，如果所述rna分子是一sirna或被加工成一sirna，则与其靶序列的所述互补性是在90％至100％(例如100％)的范围内。[0413]根据一实施例，如果所述rna分子是一mirna或pirna或被加工成一mirna或pirna，则与其靶序列的所述互补性是在33％至100％的范围内。[0414]根据一实施例，如果所述rna分子是一mirna，则与其靶序列的所述种子序列互补性(即来自5’端的第2至8个核苷酸)是在85‑100％(例如100％)的范围内。[0415]根据一实施例，与所述靶序列的所述互补性是加工的所述小rna形式的至少约33％(例如21至28nt的33％)。因此，例如，如果所述rna分子是一mirna，则33％的所述成熟mirna序列(例如21nt)包括种子互补(例如21nt中的7nt)。[0416]根据一实施例，与所述靶序列的所述互补性是加工的所述小rna形式的至少约45％(例如21至28nt的45％)。因此，例如，如果所述rna分子是一mirna，则45％的所述成熟mirna序列(例如21nt)包括种子互补(例如21nt中的9至10nt)。[0417]根据一实施例，所述rna分子或植物rna(即在修饰之前)通常被选择为具有分别针对所述植物rna或有害生物rna的所述序列的约10％、20％、30％、33％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或高达99％的互补性。[0418]根据一具体的实施例，所述rna分子或植物rna(即在修饰之前)通常被选择为分别针对所述植物rna或有害生物rna的所述序列具有不超过99％的互补性。[0419]根据一具体的实施例，所述rna分子或植物rna(即在修饰之前)通常被选择为分别针对所述植物rna或有害生物rna的所述序列具有不超过98％的互补性。[0420]根据一具体的实施例，所述rna分子或植物rna(即在修饰之前)通常被选择为分别针对所述植物rna或有害生物rna的所述序列具有不超过97％的互补性。[0421]根据一具体的实施例，所述rna分子或植物rna(即在修饰之前)通常被选择为分别针对所述植物rna或有害生物rna的所述序列具有不超过96％的互补性。[0422]根据一具体的实施例，所述rna分子或植物rna(即在修饰之前)通常被选择为分别针对所述植物rna或有害生物rna的所述序列具有不超过95％的互补性。[0423]根据一具体的实施例，所述rna分子或植物rna(即在修饰之前)通常被选择为分别针对所述植物rna或有害生物rna的所述序列具有不超过94％的互补性。[0424]根据一具体的实施例，所述rna分子或植物rna(即在修饰之前)通常被选择为分别针对所述植物rna或有害生物rna的所述序列具有不超过93％的互补性。[0425]根据一具体的实施例，所述rna分子或植物rna(即在修饰之前)通常被选择为分别针对所述植物rna或有害生物rna的所述序列具有不超过92％的互补性。[0426]根据一具体的实施例，所述rna分子或植物rna(即在修饰之前)通常被选择为分别针对所述植物rna或有害生物rna的所述序列具有不超过91％的互补性。[0427]根据一具体的实施例，所述rna分子或植物rna(即在修饰之前)通常被选择为分别针对所述植物rna或有害生物rna的所述序列具有不超过90％的互补性。[0428]根据一具体的实施例，所述rna分子或植物rna(即在修饰之前)通常被选择为分别针对所述植物rna或有害生物rna的所述序列具有不超过85％的互补性。[0429]根据一具体的实施例，所述rna分子或植物rna(即在修饰之前)通常被选择为分别针对所述植物rna或有害生物rna的所述序列具有不超过50％的互补性。[0430]根据一具体的实施例，所述rna分子或植物rna(即在修饰之前)通常被选择为分别针对所述植物rna或有害生物rna的所述序列具有不超过33％的互补性。[0431]根据一实施例，所述rna分子(例如rna沉默分子)或植物rna被设计成包括分别针对所述植物rna或有害生物rna的所述序列的至少约33％、40％、45％、50％、55％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或甚至100％的互补性。[0432]根据一具体的实施例，所述rna分子(例如rna沉默分子)或植物rna被设计成包括分别针对所述植物rna或有害生物rna的一最少33％的互补性(例如85％至100％种子匹配)。[0433]根据一具体的实施例，所述rna分子(例如rna沉默分子)或植物rna被设计成包括分别针对所述植物rna或有害生物rna的一最少40％的互补性。[0434]根据一具体的实施例，所述rna分子(例如rna沉默分子)或植物rna被设计成包括分别针对所述植物rna或有害生物rna的一最少45％的互补性。[0435]根据一具体的实施例，所述rna分子(例如rna沉默分子)或植物rna被设计成包括分别针对所述植物rna或有害生物rna的一最少50％的互补性。[0436]根据一具体的实施例，所述rna分子(例如rna沉默分子)或植物rna被设计成包括分别针对所述植物rna或有害生物rna的一最少55％的互补性。[0437]根据一具体的实施例，所述rna分子(例如rna沉默分子)或植物rna被设计成包括分别针对所述植物rna或有害生物rna的一最少60％的互补性。[0438]根据一具体的实施例，所述rna分子(例如rna沉默分子)或植物rna被设计成包括分别针对所述植物rna或有害生物rna的一最少70％的互补性。[0439]根据一具体的实施例，所述rna分子(例如rna沉默分子)或植物rna被设计成包括分别针对所述植物rna或有害生物rna的一最少80％的互补性。[0440]根据一具体的实施例，所述rna分子(例如rna沉默分子)或植物rna被设计成包括分别针对所述植物rna或有害生物rna的一最少85％的互补性。[0441]根据一具体的实施例，所述rna分子(例如rna沉默分子)或植物rna被设计成包括分别针对所述植物rna或有害生物rna的一最少90％的互补性。[0442]根据一具体的实施例，所述rna分子(例如rna沉默分子)或植物rna被设计成包括分别针对所述植物rna或有害生物rna的一最少91％的互补性。[0443]根据一具体的实施例，所述rna分子(例如rna沉默分子)或植物rna被设计成包括分别针对所述植物rna或有害生物rna的一最少92％的互补性。[0444]根据一具体的实施例，所述rna分子(例如rna沉默分子)或植物rna被设计成包括分别针对所述植物rna或有害生物rna的一最少93％的互补性。[0445]根据一具体的实施例，所述rna分子(例如rna沉默分子)或植物rna被设计成包括分别针对所述植物rna或有害生物rna的一最少94％的互补性。[0446]根据一具体的实施例，所述rna分子(例如rna沉默分子)或植物rna被设计成包括分别针对所述植物rna或有害生物rna的一最少95％的互补性。[0447]根据一具体的实施例，所述rna分子(例如rna沉默分子)或植物rna被设计成包括分别针对所述植物rna或有害生物rna的一最少96％的互补性。[0448]根据一具体的实施例，所述rna分子(例如rna沉默分子)或植物rna被设计成包括分别针对所述植物rna或有害生物rna的一最少97％的互补性。[0449]根据一具体的实施例，所述rna分子(例如rna沉默分子)或植物rna被设计成包括分别针对所述植物rna或有害生物rna的一最少98％的互补性。[0450]根据一具体的实施例，所述rna分子(例如rna沉默分子)或植物rna被设计成包括分别针对所述植物rna或有害生物rna的一最少99％的互补性。[0451]根据一具体的实施例，所述rna分子(例如rna沉默分子)或植物rna被设计成包括分别针对所述植物rna或有害生物rna的100％互补性。[0452]根据一具体的实施例，所述rna分子或植物rna(例如由rdrp合成的产物)的所述反义链被设计成包括针对所述有害生物rna的所述序列的至少约33％、40％、45％、50％、55％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、甚至100％的互补性。[0453]根据一具体的实施例，所述rna分子或植物rna(例如由rdrp合成的产物)的所述反义链被设计成包括针对所述有害生物rna的所述序列的一最少33％的互补性(例如85至100％种子匹配)。[0454]根据一具体的实施例，所述rna分子或植物rna(例如由rdrp合成的产物)的所述反义链被设计成包括针对所述有害生物rna的所述序列的一最少40％的互补性。[0455]根据一具体的实施例，所述rna分子或植物rna(例如由rdrp合成的产物)的所述反义链被设计成包括针对所述有害生物rna的所述序列的一最少45％的互补性。[0456]根据一具体的实施例，所述rna分子或植物rna(例如由rdrp合成的产物)的所述反义链被设计成包括针对所述有害生物rna的所述序列的一最少50％的互补性。[0457]根据一具体的实施例，所述rna分子或植物rna(例如由rdrp合成的产物)的所述反义链被设计成包括针对所述有害生物rna的所述序列的一最少55％的互补性。[0458]根据一具体的实施例，所述rna分子或植物rna(例如由rdrp合成的产物)的所述反义链被设计成包括针对所述有害生物rna的所述序列的一最少60％的互补性。[0459]根据一具体的实施例，所述rna分子或植物rna(例如由rdrp合成的产物)的所述反义链被设计成包括针对所述有害生物rna的所述序列的一最少70％的互补性。[0460]根据一具体的实施例，所述rna分子或植物rna(例如由rdrp合成的产物)的所述反义链被设计成包括针对所述有害生物rna的所述序列的一最少80％的互补性。[0461]根据一具体的实施例，所述rna分子或植物rna(例如由rdrp合成的产物)的所述反义链被设计成包括针对所述有害生物rna的所述序列的一最少85％的互补性。[0462]根据一具体的实施例，所述rna分子或植物rna(例如由rdrp合成的产物)的所述反义链被设计成包括针对所述有害生物rna的所述序列的一最少90％的互补性。[0463]根据一具体的实施例，所述rna分子或植物rna(例如由rdrp合成的产物)的所述反义链被设计成包括针对所述有害生物rna的所述序列的一最少91％的互补性。[0464]根据一具体的实施例，所述rna分子或植物rna(例如由rdrp合成的产物)的所述反义链被设计成包括针对所述有害生物rna的所述序列的一最少92％的互补性。[0465]根据一具体的实施例，所述rna分子或植物rna(例如由rdrp合成的产物)的所述反义链被设计成包括针对所述有害生物rna的所述序列的一最少93％的互补性。[0466]根据一具体的实施例，所述rna分子或植物rna(例如由rdrp合成的产物)的所述反义链被设计成包括针对所述有害生物rna的所述序列的一最少94％的互补性。[0467]根据一具体的实施例，所述rna分子或植物rna(例如由rdrp合成的产物)的所述反义链被设计成包括针对所述有害生物rna的所述序列的一最少95％的互补性。[0468]根据一具体的实施例，所述rna分子或植物rna(例如由rdrp合成的产物)的所述反义链被设计成包括针对所述有害生物rna的所述序列的一最少96％的互补性。[0469]根据一具体的实施例，所述rna分子或植物rna(例如由rdrp合成的产物)的所述反义链被设计成包括针对所述有害生物rna的所述序列的一最少97％的互补性。[0470]根据一具体的实施例，所述rna分子或植物rna(例如由rdrp合成的产物)的所述反义链被设计成包括针对所述有害生物rna的所述序列的一最少98％的互补性。[0471]根据一具体的实施例，所述rna分子或植物rna(例如由rdrp合成的产物)的所述反义链被设计成包括针对所述有害生物rna的所述序列的一最少99％的互补性。[0472]根据一具体的实施例，所述rna分子或植物rna(例如由rdrp合成的产物)的所述反义链被设计成包括针对所述有害生物rna的所述序列的100％互补性。[0473]为了诱导一rna分子或一植物rna的沉默活性及/或特异性或将一rna分子或一植物rna(例如rna沉默分子)的一沉默活性及/或特异性重定向至针对一植物rna或有害生物rna，使用一dna编辑剂来修饰编码一rna分子或所述植物rna(例如rna沉默分子)的所述基因。[0474]以下是用于将数个核酸改变引入至用于一基因的数个方法和数个dna编辑剂的各种非限制性实例的描述，以及根据本公开的数个具体实施例可以使用的用于实施所述数个方法和数个dna编辑剂的数个试剂。[0475]使用工程核酸内切酶进行基因组编辑‑这种方法是指一种反向遗传学方法，通常使用人工工程核酸酶在所述基因组中(数个)所需的位置切割并产生数个特定双链断裂(double‑strandedbreak，dsb)，然后通过数个细胞内源性过程对其进行修复，例如，同源重组(homologousrecombination，hr)或非同源末端连接(non‑homologousend‑joining，nhej)。nhej以一双链断裂(dsb)(有或没有最小的末端修饰)直接连接所述数个dna末端，而hr利用一同源供体序列作为一模板(即s期形成的姐妹染色单体)用于在所述断裂位点再生/复制缺失的dna序列。为了将数个特定核苷酸修饰引入至所述基因组dna，在hr期间必须存在含有所需序列的一供体dna修复模板(外源性提供的单链或双链dna)。[0476]基因组编辑不能使用传统的限制性核酸内切酶来进行，因为大多数限制性酶识别所述dna上的几个碱基对作为其靶，且这些序列通常会在所述基因组的许多位置中发现，从而导致多次切割，而这些切割并不限于一所需的位置。为了克服这一挑战并产生数个位点特定的(site‑specific)单链或双链断裂(dsb)，迄今为止已经发现了几种不同类别的核酸酶，并对其进行了生物工程。这些包括大范围核酸酶(meganuclease)、锌指核酸酶(zincfingernuclease，zfn)、转录激活因子样效应子核酸酶(transcription‑activatorlikeeffectornuclease，talen)以及crispr/cas9系统。[0477]大范围核酸酶(meganucleases)‑大范围核酸酶(也称为归巢核酸内切酶(homingendonucleases))通常分为至少五个家族：laglidadg家族、giy‑yig家族、his‑cys盒家族以及hnh家族以及pd‑(d/e)xk，所述至少五个家族涉及数个edxhd酶，且被一些人认为是一个单独的家族。。这些家族的特征在于数个结构模序(motif)，它们影响催化活性和识别序列。例如，所述laglidadg家族的数个成员的特征在于具有保存的laglidadg模序的一个或两个拷贝。这四个大范围核酸酶家族在数个保存的结构元素以及dna识别序列特异性和催化活性方面彼此很大程度地区分。大范围核酸酶通常在微生物物种中发现，并具有独特的特性，即具有数个非常长的识别序列(>14bp)，因此使其用于在一所需的位置处进行切割自然地具有非常高的特异性。[0478]这可以用来在基因组编辑中制造数个位点特异性双链断裂(dsb)。本领域技术人员可以使用这些天然存在的大范围核酸酶，但这种天然存在的大范围核酸酶的数量是有限的。为了克服这一挑战，诱变(mutagenesis)和高通量筛选方法已用于产生识别数个独特序列的数个大范围核酸酶变体。例如，已经融合了各种大范围核酸酶以产生识别一新序列的数个杂化(hybrid)酶。[0479]或者，可以改变所述大范围核酸酶的数个dna相互作用氨基酸以设计序列特异性大范围核酸酶(例如，参见美国专利号8,021,867)。可以使用例如在certo，mt等人(naturemethods，2012年，9：073至975)、美国专利号8,304,222、8,021,867、8,119,381、8,124,369、8,129,134、8,133,697、8,143,015、8,143,016、8,148,098或8,163,514中所述的方法设计大范围核酸酶，每个内容通过引用整体并入本文中。或者，可以使用商业上可获得的技术(例如，precisionbiosciences的定向核酸酶编辑器tm(directednucleaseeditortm)基因组编辑技术)来获得具有位点特异性切割特征的大范围核酸酶。[0480]zfns和talens‑两种不同的工程核酸酶，锌指核酸酶(zfn)和转录激活因子样效应子核酸酶(talen)均被证明能有效地产生数个靶向双链断裂(dsb)(christian等人，2010年；kim等人，1996年；li等人，2011年；mahfouz等人，2011年；miller等人，2010年)。[0481]基本上，zfn和talen限制性核酸内切酶技术利用一种非特异性dna切割酶，所述酶与一特定的dna结合域(分别是一系列的数个锌指域或数个tale重复序列)相连。通常，选择其dna识别位点和剪切位点彼此分开的一限制性酶。分开所述剪切部分然后连接至一dna结合域，从而产生对一所需的序列具有非常高特异性的一核酸内切酶。具有这种性质的一示例性限制酶是fokl。另外，fokl的优点是需要二聚化(dimerization)才能具有核酸酶活性，这意味着随着每个核酸酶伙伴识别一独特的dna序列，所述特异性会显着地增加。为了增强此效果，已经工程化了数个fok1核酸酶，其仅可以作为数个异二聚体(heterodimer)起作用且具有增加的催化活性。所述异二聚体起作用于核酸酶避免了不需要的同二聚体(homodimer)活性的可能性，因此增加了所述双链断裂(dsb)的特异性。[0482]因此，例如为了靶向一特定位点，数个zfn和数个talen被构建为数个核酸酶对，所述对中的每个分子设计为结合在所述靶位点处的数个相邻序列。在数个细胞中瞬时表达后，所述数个核酸酶与它们的数个靶位点结合，且所述数个foki域异二聚体化(heterodimerize)以产生一双链断裂(dsb)。通过所述非同源末端连接(nhej)途径修复这些双链断裂(dsb)通常会导致数个小缺失或数个小序列插入(插入缺失(indel))。由于通过nhej进行的每次修复都是独特的，因此使用一单个核酸酶对可以在所述靶位点处产生具有一系列的数个不同插入或缺失的一等位基因系列(allelicseries)。[0483]一般来说，在基因编辑中，nhej相对准确(在人类细胞中约85％的dsb从检测开始约30分钟内通过nhej修复)。错误的nhej是依赖的，因为当所述修复是准确的，所述核酸酶将继续切割，直到所述修复产物突变，且识别/切割位点/pam基序消失/突变、或瞬时引入的核酸酶不再存在。[0484]缺失的长度范围通常从几个碱基对到几百个碱基对，但是通过同时使用两对核酸酶在细胞培养中已成功地产生了较大的缺失(carlson等人，2012年；lee等人，2010年)。此外，当将与所述靶向的区域具有同源性的一dna片段与所述核酸酶对结合引入时，可以通过同源重组(hr)修复所述双链断裂(dsb)以产生多个特异性修饰(li等人，2011年；miller等人，2010年；urnov等人，2005年)。[0485]尽管多个zfn和多个talen的多个核酸酶部分具有相似的性质，但这些工程核酸酶之间的差异在于其dna识别肽。zfn依赖于cys2‑his2锌指(zincfinger)，而talen依赖于tale。这两者的这些dna识别肽域(domain)都具有一个特点，即它们天然存在于其蛋白质的组合中。多个cys2‑his2锌指通常存在于间隔为3bp的多个重复序列中，并存在于多种核酸相互作用蛋白的多个不同组合中。另一方面，多个tale存在于所述多个氨基酸和所述多个识别的核苷酸对之间具有一对一识别率的多个重复序列中。由于锌指和tale均以重复的模式发生，因此不同的组合可以尝试来创建各种各样的序列特异性。制备位点特异性锌指核酸内切酶的多个方法包含，例如，模块组装(其中与一三联体序列相关的多个锌指连成一行以覆盖所需的序列)、open(多个肽域的低严格性选择，相对于多个三联体(tripletnucleotide)核苷酸，然后进行多个肽组合的高严格性选择，相对于在多个细菌系统中的最终靶)、以及多个锌指文库的细菌单杂交筛选(one‑hybridscreening)等。zfn也可以从例如sangamobiosciencestm(richmond，加利福尼亚州)商业设计和获得。[0486]设计和获得数个talen的方法描述于例如reyon等人(naturebiotechnology，2012年5月；30(5)：460至5)、miller等人(natbiotechnol.，2011年，29：143至148)、cermak等人(nucleicacidsresearch，2011年，39(12)：e82)、以及zhang等人(naturebiotechnology，2011年，29(2)：149至53)。一种最近开发的基于网络的程序(称为梅奥手(mojohand))，通过梅奥医院(mayoclinic)引入，用于为基因组编辑应用程序设计多个tal和talen构建体(可以通过www(dot)talendesign(dot)org进入)。talen也可以从例如sangamobiosciencestm(richmond，加利福尼亚州)商业设计和获得。[0487]t‑gee系统(靶基因的基因组编辑引擎(targetgene’sgenomeeditingengine))‑提供了一种可编程的核蛋白分子复合物，其含有一多肽部分和一赋予特异性的核酸(specificityconferringnucleicacid，scna)，所述核酸在一靶细胞中进行体内组装，并能够与预定的所述靶核酸序列相互作用。所述可编程的核蛋白分子复合物能够特异性地修饰及/或编辑在所述靶核酸序列内的一靶位点及/或修饰所述靶核酸序列的功能。核蛋白组合物包括(a)用于编码一嵌合多肽的多核苷酸分子并包括(i)能够修饰所述靶位点的一功能域，和(ii)能够与赋予特异性的核酸相互作用的一连接域；以及(b)赋予特异性的核酸(scna)，其包括(i)与所述靶核酸在所述靶位点两侧的区域互补的一核苷酸序列，和(ii)能够特异性地附着于所述多肽的所述连接域的一识别区。所述组合物通过赋予特异性的核酸与一靶核酸的碱基配对，具有高度的特异性和分子复合物与所述靶核酸的结合能力，能够准确地、可靠地以及成本有效地修饰一预定的核酸序列靶。所述组合物的遗传毒性小、组装模块化、利用无需定制的单个平台、可在专用核心设施外独立使用、以及开发周期短且成本低。[0488]crispr‑cas系统及其所有变体(在本文中也称为“crispr”)‑许多细菌和古细菌(archea)含有基于内源性rna的适应性免疫系统，可降解入侵多个噬菌体和多个质粒的多个核酸。这些系统由多个成簇规律间隔短回文重复序列(clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeat，crispr)核苷酸序列组成，所述序列产生多个rna成分和crispr相关的(cas)多个基因(编码多个蛋白成分)。所述多个crisprrna(crrna)含有与多个特定病毒和质粒的dna很短的同源性，并引导cas核酸酶降解与相应的病原体互补的多个核酸。化脓性链球菌(streptococcuspyogenes)的ii型crispr/cas系统的研究指出，3个成分形成一rna/蛋白质复合物，且在一起足以满足序列特异性的核酸酶活性：所述cas9核酸酶，一种与所述靶序列含有20个碱基对同源性的crrna，且是一种反式激活的(trans‑activating)crrna(tracrrna)(jinek等人，science，2012年，337：816至821)。[0489]进一步证明，由在crrna和tracrrna之间的一融合组成的一合成嵌合引导rna(grna)可以在体外定向cas9以剪切与所述crrna互补的多个dna靶。还证明了cas9与多个合成grna的共同瞬时表达可以用于在多种不同物种中产生靶向的多个双链断裂(dsb)(cho等人，2013年；cong等人，2013年；dicarlo等人，2013年；hwang等人，2013a，b；jinek等人，2013年；mali等人，2013年)。[0490]用于基因组编辑的所述crispr/cas系统含有两个不同的组成部分：一sgrna和一内切核酸酶，例如，cas9。[0491]所述grna(在本文中也称为短引导rna(sgrna))通常是一20个核苷酸的序列，用于编码所述靶同源序列(crrna)和所述内源性细菌rna的一组合，所述组合在一单个嵌合转录物中将所述crrna连接至所述cas9核酸酶(tracrrna)。通过在所述sgrna序列和所述补体基因组dna之间的所述碱基配对，将所述sgrna/cas9复合物募集至所述靶序列。为了成功结合cas9，所述基因组靶序列还必须在所述靶序列之后紧接地含有所述正确的原间隔相邻基序(protospaceradjacentmotif，pam)序列。所述sgrna/cas9复合物的所述结合将所述cas9定位在所述基因组靶序列上，因此所述cas9可以切割所述dna的两条链，从而导致一双链断裂(dsb)。与数个zfn和数个talen一样，通过crispr/cas产生的所述数个双链断裂(dsb)可以进行同源重组或nhej，且在dna修复期间容易发生特异性序列修饰。[0492]所述cas9核酸酶具有两个功能域：ruvc和hnh，各自切割一不同的dna链。当这两个的这些域都具有活性时，所述cas9会在所述基因组dna中引起多个双链断裂(dsb)。[0493]crispr/cas的一显着优点是，此系统的高效率与容易产生多个合成grna的能力相结合。这产生了一种可以容易地被修饰以靶向在不同基因组位点的多个修饰及/或靶向在相同位点的多个不同修饰的系统。另外，已经建立了能够同时靶向多个基因的方案。携带所述突变的大多数细胞在所述多个靶向的基因中出现多个双等位基因突变(biallelicmutation)。[0494]然而，在所述sgrna序列与所述基因组dna靶序列之间的所述数个碱基配对相互作用中明显的灵活性允许不完全匹配至会被cas9切割的所述靶序列。[0495]含有一单个无活性催化域(ruvc‑或hnh‑)的所述cas9酶的多个修饰形式称为“切口酶(nickase)”。仅具有一个活性核酸酶域，所述cas9切口酶仅切割所述靶dna的一条链，从而产生一单链断裂或“切口(nick)”。一单链断裂或切口大多是通过单链断裂修复机制修复的，所述机制涉及蛋白质，例如但不仅限于parp(传感器)和xrcc1/ligiii复合物(接合(ligation))。如果一单链断裂(ssb)是通过多个拓扑异构酶(topoisomerase)i毒物或通过多个药物捕获rarp1在天然存在的ssb上产生的，则这些可能会持续存在，且当所述细胞进biol.，(2018年)13(2)：406至416；larussamf及qils.，molcellbiol。(2015年)35(22)：3800至9]。[0500]crispr的数个其他版本可以根据本发明的一些实施例来使用，所述crispr的数个其他版本包括基因组编辑，所述基因组编辑使用来自数个crispr系统的数个组件与数个其他酶一起在细胞dna或rna中直接地安装数个点突变。[0501]因此，根据一实施例，所述编辑剂是dna或rna编辑剂。[0502]根据一实施例，所述dna或rna编辑剂引发碱基编辑。[0503]本文所用的术语“碱基编辑(baseediting)”是指将数个点突变安装至细胞dna或rna中，而不会造成双链或单链dna断裂。[0504]在碱基编辑中，数个dna碱基编辑器通常包括一催化失效的cas核酸酶(catalyticallyimpairedcasnuclease)及对单链dna(ssdna)起作用的一碱基修饰酶之间的融合。在与其靶dna位点结合后，所述grna及靶dna链之间的碱基配对将导致“r环(rloop)”中的一小段单链dna发生置换。所述ssdna气泡内的dna碱基通过所述碱基编辑酶(例如脱氨酶)来修饰。为了提高数个真核细胞的效率，所述催化失效的核酸酶(catalyticallyimpairedcasnuclease)还在所述未编辑的dna链中产生一切口，诱导数个细胞使用所述编辑的链作为一模板来修复所述未编辑的链。[0505]已经描述了两类dna碱基编辑器：数个胞嘧啶碱基编辑器(cytosinebaseeditors，cbe)将一c‑g碱基对转换为一t‑a碱基对，以及数个腺嘌呤碱基编辑器(adeninebaseeditors，abe)将a‑t碱基对转换为g‑c碱基对。总体而言，数个cbe及数个abe可以介导所有四种可能的数个过渡突变(transitionmutations)(c至t、a至g、t至c、及g至a)。同样在rna中，靶向腺苷(targetedadenosine)转化为肌苷(inosine)，是同时使用反义及cas13引导rna靶向的数个方法。[0506]根据一实施例，所述dna或rna编辑剂包括一催化失活的核酸内切酶(catalyticallyinactiveendonuclease)(例如crispr‑dcas)。[0507]根据一实施例，所述催化失活的核酸内切酶是一不具有活性的cas9(例如dcas9)。[0508]根据一实施例，所述催化失活的核酸内切酶是一不具有活性的cas13(例如dcas13)。[0509]根据一实施例，所述dna或rna编辑剂包括能够进行表观遗传编辑(即提供数个化学变化至所述dna、rna或组蛋白)的一酶。[0510]数个示例性酶包括但不限于数个dna甲基转移酶、数个甲基化酶、数个乙酰转移酶。更具体地，数个示例性酶包括例如dna(cytosine‑5)‑甲基转移酶3a(dna(dnmt3a)、组蛋白乙酰转移酶p300(histoneacetyltransferasep300)、10‑11易位甲基胞嘧啶双加氧酶1(ten‑eleventranslocationmethylcytosinedioxygenase1，tet1)、赖氨酸(k)特异性脱甲基酶1a(lysine(k)‑specificdemethylase1a，lsd1)以及钙及整合素结合蛋白1(calciumandintegrinbindingprotein1，cib1)。[0511]除了所述催化失效的核酸酶(catalyticallydisablednuclease)之外，本发明的所述数个dna或rna编辑剂还可包括一核碱基脱氨酶及/或一dna糖基化酶抑制剂。[0512]根据一具体的实施例，所述dna或rna编辑剂包括be1(apobec1‑xten‑dcas9)、be2(apobec1‑xten‑dcas9‑ugi)或be3(apobec‑xten‑dcas9(a840h)‑ugi)，且包括与sgrna一起。apobec1是一脱氨酶全长或催化活性片段，xten是一蛋白质接头(proteinlinker)，ugi是尿嘧啶dna糖基化酶抑制剂，以防止随后的u:g错误匹配被修复回一c:g碱基对，dcas9(a840h)是一切口酶，其中所述dcas9被还原以恢复hnh结构域的所述催化活性，所述hnh结构域仅切割所述未编辑的链、模拟新合成的dna并产生所需的u:a产物。[0513]根据本发明的一些实施例，可用于碱基编辑的其他酶下述文献中详细说明，所述文献为rees及liu，naturereviewsgenetics(2018年)19:770至788，所述文献通过引用整体并入本文。[0514]有许多公开可用的工具可帮助选择及/或设计多个靶序列，以及生物信息学确定的不同物种中不同基因的多个独特sgrna列表，例如但不限于，fengzhang实验室的靶查找器(targetfinder)、michaelboutros实验室的靶查找器(e‑crisp)、rgen工具：cas‑offinder、casfinder：用于在基因组中识别特定cas9靶的灵活算法以及crispr最佳靶查找器(crisproptimaltargetfinder)。[0515]为了使用所述crispr系统，sgrna和一cas核酸内切酶(例如，cas9)都应在一靶细胞中表达或存在(例如，作为一核糖核蛋白复合物)。所述插入载体可以在一单个质粒上含有两个盒，或者所述多个盒由两个单独的质粒表达。多个crispr质粒是可商购的，例如，来自addgene的px330质粒(75sidneyst，suite550a·cambridge，ma02139)。svitashev等人(2015年，plantphysiology，169(2)：931至945)、kumar和jain(2015年，jexpbot，66：47至57)以及在美国专利申请公开第20150082478号中至少公开了使用成簇规律间隔短回文重复序列(crispr)相关的(cas)引导rna技术和一cas核酸内切酶修饰植物基因组，其内容通过引用整体并入本文中。可用于通过grna进行dna编辑的cas核酸内切酶包含但不限于，cas9、cpfl(zetsche等人，2015年，cell，163(3)：759至71)、c2c1、c2c2以及c2c3(shmakov等人，molcell.，2015年11月5日；60(3)：385至97)。[0516]“基因打靶的策略(hitandrun)”或“由内而外(in‑out)”涉及一两步骤的重组程序。在第一步骤中，使用含有一双正/负选择标记盒的一插入型载体来引入所需的序列改变。所述插入载体含有与所述靶向的基因座同源的一单个连续区域，且被修饰以携带感兴趣的突变。此靶向构建体在同源性区域内的一个位点处用一限制酶线性化，引入至所述多个细胞中，并进行阳性选择以分离同源重组介导的事件。携带所述同源序列的所述dna可以以一质粒、单链或双链寡核苷酸的形式提供。这些同源重组体含有一局部复制，所述局部复制由包含所述选择盒在内的中间载体序列隔开。在第二步骤中，对多个靶向的克隆进行负选择，以通过所述重复序列之间的染色体内重组鉴定丢失所述选择盒的多个细胞。所述局部重组事件去除所述重复，并取决于所述重组位点，等位基因保留所述引入的突变或恢复为野生型。最终结果是引入了所需的修饰，而没有保留任何外源性序列。[0517]“双重替换(double‑replacement)”或“标记和交换(tagandexchange)”策略：涉及一两步骤选择程序，类似于所述基因打靶的策略(hitandrun)方法，但需要使用两种不同的靶构建。在第一步骤中，将具有3’和5’同源臂的一标准靶向载体用在将要引入所述突变的位置附近插入一双正/负选择盒。将所述系统组件引入至所述细胞并施行阳性选择后，即可识别hr介导的事件。接下来，将含有与所需的突变具有一同源性区域的一第二靶向载体引入至多个靶向克隆，并施行阴性选择以去除所述选择盒并引入所述突变。最终的等位基因含有所需的突变，同时消除了不需要的外源性序列。phosphotransferase，hpt)。可以根据本教示使用的其他多个标记基因包含但不限于，庆大霉素乙酰转移酶(gentamycinacetyltransferase，accc3)抗性和博来霉素(bleomycin)和腐草霉素(phleomycin)抗性基因。[0534]应理解的是，所述酶nptii通过磷酸化使许多氨基糖苷类抗生素(aminoglycosideantibiotics)失活，例如，卡那霉素(kanamycin)、新霉素(neomycin)、遗传霉素(geneticin)(或g418)和巴龙霉素(paromomycin)。其中，卡那霉素、新霉素以及巴龙霉素用于多种植物物种。[0535]根据另一个实施例，所述报道子是一毒性选择标记。可以用作一报道子的一示例性毒性选择标记是但不限于，使用醇脱氢酶(alcoholdehydrogenase，adh1)基因进行的烯丙醇选择。adh1包括一组脱氢酶，其催化多个醇与多个醛或多个酮之间的相互转化以及nad 或nadp 的同时还原、分解多个组织内的多个酒精性有毒物质。带有降低的adh1表达的多个植物表现出对烯丙醇的耐受性增加。因此，具有降低的adh1的多个植物对烯丙醇的毒性作用具有抗性。[0536]无论使用何种dna编辑剂，都采用本发明的所述方法，使得用于编码所述rna分子或所述植物基因(例如，rna沉默分子)的所述基因通过一缺失、一插入或一点突变中的至少一个来修饰。[0537]根据一实施例，所述修饰是在所述非编码rna分子(例如rna沉默分子)的一结构化区域中。[0538]根据一实施例，所述修饰是在非编码rna分子(例如rna沉默分子)的一茎区域中。[0539]根据一实施例，所述修饰是在非编码rna分子(例如rna沉默分子)的一环区域中。[0540]根据一实施例，所述修饰是在非编码rna分子(例如rna沉默分子)的一茎区域及一环区域中。[0541]根据一实施例，所述修饰是在非编码rna分子(例如rna沉默分子)的一非结构化区域中。[0542]根据一实施例，所述修饰是在非编码rna分子(例如rna沉默分子)的一茎区域及一环区域以及一非结构化区域中。[0543]根据一具体的实施例，所述修饰包括约10至250个核苷酸、约10至200个核苷酸、约10至150个核苷酸、约10至100个核苷酸、约10至50个核苷酸、约1至50个核苷酸、约1至10个核苷酸、约50至150个核苷酸、约50至100个核苷酸、或约100至200个核苷酸的一修饰(与所述天然植物rna或天然rna分子(例如rna沉默分子)相比)。[0544]根据一个实施例，所述修饰包括最多1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、22个、24个、26个、28个、30个、32个、34个、36个、38个、40个、42个、44个、46个、48个、50个、60个、70个、80个、90个、100个、110个、120个、130个、140个、150个、160个、170个、180个、190个、200个或最多250个核苷酸的一修饰(与天然植物rna或天然rna分子(例如rna沉默分子)相比)。[0545]根据一实施例，所述修饰可以在一连续的核酸序列中(例如至少5个、10个、20个、30个、40个、50个、100个、150个、200个碱基)。[0546]根据一实施例，所述修饰可以是以一非连续的方式，例如遍及于一20个、50个、100个、150个、200个、500个、1000个的核酸序列。[0547]根据一具体的实施例，所述修饰包括一最多200个核苷酸的修饰。[0548]根据一具体的实施例，所述修饰包括一最多150个核苷酸的修饰。[0549]根据一具体的实施例，所述修饰包括一最多100个核苷酸的修饰。[0550]根据一具体的实施例，所述修饰包括一最多50个核苷酸的修饰。[0551]根据一具体的实施例，所述修饰包括一最多25个核苷酸的修饰。[0552]根据一具体的实施例，所述修饰包括一最多20个核苷酸的修饰。[0553]根据一具体的实施例，所述修饰包括一最多15个核苷酸的修饰。[0554]根据一具体的实施例，所述修饰包括一最多10个核苷酸的修饰。[0555]根据一具体的实施例，所述修饰包括一最多5个核苷酸的修饰。[0556]根据一实施例，所述修饰取决于所述rna分子(例如沉默分子)的所述结构。[0557]因此，当所述rna沉默分子含有一非必需结构(即所述rna沉默分子的一二级结构(secondarystructure)在其适当的生物发生及/或功能中不起作用)，或为纯dsrna时(即所述rna沉默分子具有一完全或几乎完全的dsrna)，引入一些修饰(例如，20至30个核苷酸，例如，1至10个核苷酸，例如，5个核苷酸)以重定向所述rna沉默分子的所述沉默特异性。[0558]根据另一个实施例，当所述rna沉默分子具有一必需结构(即所述rna沉默分子的所述适当的生物发生及/或活性取决于其二级结构)时，引入多个较大的修饰(例如，10至200个核苷酸，例如，50至150个核苷酸，例如，30个核苷酸以上且不超过200个核苷酸，30至200个核苷酸，35至200个核苷酸，35至150个核苷酸，35至100个核苷酸)以重定向所述rna沉默分子的所述沉默特异性。[0559]根据一个实施例，所述修饰使得所述rna沉默分子的识别/切割位点/pam模序被修饰以消除原始pam识别位点。[0560]根据一具体的实施例，所述修饰是在一pam基序中的至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多个核酸中。[0561]根据一实施例，所述修饰包括一插入。[0562]根据一具体的实施例，所述插入包括约10至250个核苷酸、约10至200个核苷酸、约10至150个核苷酸、约10至100个核苷酸、约10至50个核苷酸、约1至50个核苷酸、约1至10个核苷酸、约50至150个核苷酸、约50至100个核苷酸或约100至200个核苷酸的一插入(与所述天然植物rna或天然rna分子(例如rna沉默分子)相比)。[0563]根据一实施例，所述插入包括一最多1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、22个、24个、26个、28个、30个、32个、34个、36个、38个、40个、42个、44个、46个、48个、50个、60个、70个、80个、90个、100个、110个、120个、130个、140个、150个、160个、170个、180个、190个、200个或最多250个的核苷酸(与所述天然植物rna或天然rna分子(例如rna沉默分子)相比)。[0564]根据一具体的实施例，所述插入包括一最多200个核苷酸的插入。[0565]根据一具体的实施例，所述插入包括一最多150个核苷酸的插入。[0566]根据一具体的实施例，所述插入包括一最多100个核苷酸的插入。[0567]根据一具体的实施例，所述插入包括一最多50个核苷酸的插入。[0568]根据一具体的实施例，所述插入包括一最多25个核苷酸的插入。[0569]根据一具体的实施例，所述插入包括一最多20个核苷酸的插入。[0570]根据一具体的实施例，所述插入包括一最多15个核苷酸的插入。[0571]根据一具体的实施例，所述插入包括一最多10个核苷酸的插入。[0572]根据一具体的实施例，所述插入包括一最多5个核苷酸的插入。[0573]根据一实施例，所述修饰包括一缺失(deletion)。[0574]根据一具体的实施例，所述缺失包括约10至250个核苷酸、约10至200个核苷酸、约10至150个核苷酸、约10至100个核苷酸、约10至50个核苷酸、约1至50个核苷酸、约1至10个核苷酸的缺失、约50至150个核苷酸、约50至100个核苷酸或约100至200个核苷酸(与所述天然植物rna或天然rna分子(例如rna沉默分子)相比)。[0575]根据一实施例，所述缺失包括一最多1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、22个、24个、26个、28个、30个、32个、34个、36个、38个、40个、42个、44个、46个、48个、50个、60个、70个、80个、90个、100个、110个、120个、130个、140个、150个、160个、170个、180个、190个、200个或最多250个的核苷酸(与所述天然植物rna或天然rna分子(例如rna沉默分子)相比)。[0576]根据一具体的实施例，所述缺失包括一最多200个核苷酸的缺失。[0577]根据一具体的实施例，所述缺失包括一最多150个核苷酸的缺失。[0578]根据一具体的实施例，所述缺失包括一最多100个核苷酸的缺失。[0579]根据一具体的实施例，所述缺失包括一最多50个核苷酸的缺失。[0580]根据一具体的实施例，所述缺失包括一最多25个核苷酸的缺失。[0581]根据一具体的实施例，所述缺失包括一最多20个核苷酸的缺失。[0582]根据一具体的实施例，所述缺失包括一最多15个核苷酸的缺失。[0583]根据一具体的实施例，所述缺失包括一最多10个核苷酸的缺失。[0584]根据一具体的实施例，所述缺失包括一最多5个核苷酸的缺失。[0585]根据一实施例，所述修饰包括一点突变(pointmutation)。[0586]根据一具体的实施例，所述点突变包括约10至250个核苷酸、约10至200个核苷酸、约10至150个核苷酸、约10至100个核苷酸、约10至50个核苷酸、约1至50个核苷酸、约1至10个核苷酸、约50至150个核苷酸、约50至100个核苷酸或约100至200个核苷酸(与所述天然植物rna或天然rna分子(例如rna沉默分子)相比)。[0587]根据一实施例，所述点突变包括一最多1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、22个、24个、26个、28个、30个、32个、34个、36个、38个、40个、42个、44个、46个、48个、50个、60个、70个、80个、90个、100个、110个、120个、130个、140个、150个、160个、170个、180个、190个、200个或至多250个核苷酸的点突变(与天然植物rna或天然rna分子(例如rna沉默分子)相比)。[0588]根据一具体的实施例，所述点突变包括一最多200个核苷酸的点突变。[0589]根据一具体的实施例，所述点突变包括一最多150个核苷酸的点突变。[0590]根据一具体的实施例，所述点突变包括一最多100个核苷酸的点突变。[0591]根据一具体的实施例，所述点突变包括一最多50个核苷酸的点突变。[0592]根据一具体的实施例，所述点突变包括一最多25个核苷酸的点突变。[0593]根据一具体的实施例，所述点突变包括一最多20个核苷酸的点突变。[0594]根据一具体的实施例，所述点突变包括一最多15个核苷酸的点突变。[0595]根据一具体的实施例，所述点突变包括一最多10个核苷酸的点突变。[0596]根据一具体的实施例，所述点突变包括一最多5个核苷酸的点突变。[0597]根据一实施例，所述修饰包括一缺失、一插入及/或一点突变中任何的一组合。[0598]根据一实施例，所述修饰包括核苷酸置换(nucleotidereplacement)(例如核苷酸交换(nucleotideswapping))。[0599]根据一具体的实施例，所述交换(swapping)包括约10至250个核苷酸、约10至200个核苷酸、约10至150个核苷酸、约10至100个核苷酸、约10至50个核苷酸、约1至50个核苷酸、约1至10个核苷酸、约50至150个核苷酸、约50至100个核苷酸或约100至200个核苷酸(与所述天然植物rna或天然rna分子(例如rna沉默分子)相比)。[0600]根据一实施例，所述核苷酸交换(nucleotideswap)包括一最多1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、22个、24个、26个、28个、30个、32个、34个、36个、38个、40个、42个、44个、46个、48个、50个、60个、70个、80个、90个、100个、110个、120个、130个、140个、150个、160个、170个、180个、190个、200个或至多250个核苷酸的核苷酸置换(与所述天然植物rna或天然rna分子(例如rna沉默分子)相比)。[0601]根据一具体的实施例，所述核苷酸交换包括一最多200个核苷酸的核苷酸替换。[0602]根据一具体的实施例，所述核苷酸交换包括一最多150个核苷酸的核苷酸置换。[0603]根据一具体的实施例，所述核苷酸交换包括一最多100个核苷酸的核苷酸置换。[0604]根据一具体的实施例，所述核苷酸交换包括一最多50个核苷酸的核苷酸置换。[0605]根据一具体的实施例，所述核苷酸交换包括一最多25个核苷酸的核苷酸置换。[0606]根据一具体的实施例，所述核苷酸交换包括一最多20个核苷酸的核苷酸置换。[0607]根据一具体的实施例，所述核苷酸交换包括一最多15个核苷酸的核苷酸置换。[0608]根据一具体的实施例，所述核苷酸交换包括一最多10个核苷酸的核苷酸置换。[0609]根据一具体的实施例，所述核苷酸交换包括一最多5个核苷酸的核苷酸置换。[0610]根据一实施例，编码所述植物rna或rna分子(例如rna沉默分子)的所述基因通过与一选择的rna沉默序列(例如sirna)交换的一内源rna沉默分子(例如mirna)的一序列来修饰。[0611]根据一实施例，所述rna分子(例如rna沉默分子，例如数个mirna前体(数个pri/pre‑mirna)或数个sirna前体(dsrna))的引导链被修饰以保持结构的原创性并保持相同的碱基配对特征。[0612]根据一实施例，所述rna分子(例如rna沉默分子，例如数个mirna前体(pri/pre‑mirna)或数个sirna前体(dsrna))的所述过客链(passengerstrand)被修饰以保持结构的原创性并保持相同的碱基配对特征。[0613]如本文所使用，术语“结构的原创性”是指所述二级rna结构(即碱基配对谱)。保持结构的独创性对于所述非编码rna(例如rna沉默分子，如sirna或mirna)的正确及有效的生物发生(biogenesis)/加工(processing)是非常重要的，这些rna是结构依赖性的，而不是纯粹序列依赖性的。[0614]根据一实施例，所述rna(例如rna沉默分子)在所述引导链(沉默链)中被修饰以包括与所述靶rna(如上所述)约50至100％的互补性，而所述过客链(passengerstrand)被修饰以保留所述原始(未修饰)rna(例如非编码rna)结构。[0615]根据一实施例，所述rna序列(例如rna沉默分子)被修饰，使得所述种子序列(例如从5'端开始的2至8个mirna核苷酸)与所述靶序列互补。[0616]根据一具体的实施例，所述rna沉默分子(即rnai分子)被设计成使得rnai分子的一序列被修饰以保持结构的原创性并被数个细胞rnai加工及执行因子(cellularrnaiprocessingandexecutingfactors)所识别。[0617]根据一具体的实施例，所述rna分子例如非编码rna分子(即rrna、trna、lncrna、snorna等)被设计成使rnai分子的一序列被修饰以被数个细胞rnai加工及执行因子(cellularrnaiprocessingandexecutingfactors)所识别。[0618]应理解的是，额外的数个突变可以通过额外的数个编辑事件(即，同时或依次)而引入。[0619]可以使用数个dna递送方法(例如通过数个表达载体)或使用数个无dna方法将本发明的所述dna编辑剂引入数个植物细胞中。[0620]根据一实施例，sgrna(或任何其他使用的dna识别模块，取决于所使用的dna编辑系统)可以作为rna提供给细胞。[0621]因此，应理解的是，所述数个本技术涉及使用数个瞬时dna或无dna方法来引入所述dna编辑剂，例如rna转染(例如mrna sgrna转染)或核糖核蛋白(rnp)转染(例如蛋白质‑rna复合物转染)，例如cas9/sgrna核糖核蛋白(rnp)复合物转染)。[0622]举例而言，cas9可以作为一dna表达质粒、体外转录物(即rna)或作为与核糖核蛋白颗粒(rnp)中rna部分结合的一重组蛋白而引入。举例而言，sgrna可以作为一dna质粒或一体外转录物(即rna)递送。[0623]根据本教示，可以使用本领域已知的用于rna或rnp转染的任何方法，例如但不限于，显微注射(microinjection)(如通过cho等人所述，“在秀丽隐杆线虫中通过直接注射cas9‑sgrna核糖核蛋白进行可遗传的基因敲除(heritablegeneknockoutincaenorhabditiselegansbydirectinjectionofcas9‑sgrnaribonucleoproteins)”，genetics，2013年，195：1177至1180，通过引用并入本文中)、电穿孔(electroporation)(如通过kim等人所述，“通过递送纯化的cas9核糖核蛋白在人类细胞中进行的高效rna引导的基因组编辑(highlyefficientrna‑guidedgenomeeditinginhumancellsviadeliveryofpurifiedcas9ribonucleoproteins)”，genomeres.，2014年，24：1012至1019，通过引用并入本文中)、或脂质介导的转染，例如，使用脂质体(liposome)(如zuris等人所述，“阳离子脂质介导的蛋白质递送使得能够在体外和体内进行基于蛋白质的有效基因组编辑(cationiclipid‑mediateddeliveryofproteinsenablesefficientprotein‑basedgenomeeditinginvitroandinvivo)”，natbiotechnol.，2014年，doi：10.1038/nbt.3081，通过引用并入本文中)。rna转染的其他多个方法在美国专利申请号20160289675中描述，其全部内容通过引用并入本文中。[0624]本发明的多个rna转染方法的一优点是rna转染本质上是瞬时的且无载体(vector‑free)。一rna转基因可以作为一最小表达盒递送至一细胞并在其中表达，而不需要任何其他的序列(例如，多个病毒序列)。[0625]根据一个实施例，本发明的所述dna编辑剂使用多个表达载体引入至所述植物细胞中。[0626]本发明一些实施例的所述“表达载体”(在本文中也称为“一核酸构建体(construct)”、“载体”或“构建体”)包含提供此载体适于在原核生物、真核生物或优选两者中复制的多个附加序列(例如，穿梭载体(shuttlevector))。[0627]在根据本发明一些实施例的所述多个方法中有用的多个构建体可以使用本领域技术人员众所周知的重组dna技术来构建。所述多个核酸序列可以插入至多个载体中，所述多个载体可以是市售的、适于转化为多个植物且适于在多个转化的细胞中瞬时表达所述感兴趣的基因。所述遗传构建体可以是一表达载体，其中所述核酸序列可操作地(operably)连接至一个或多个调节序列，从而允许在所述多个植物细胞中表达。[0628]根据一个实施例，为了表达一功能性dna编辑剂，在所述剪切模块(cleavingmodule)(核酸酶)不是所述dna识别单元的一组成部分的情况下，所述表达载体可以用于编码所述剪切模块以及所述dna识别单元(例如，sgrna在crispr/cas的情况下)。[0629]或者，可以将所述剪切模块(核酸酶)和所述dna识别单元(例如，sgrna)克隆至多个单独的表达载体中。在这种情况下，必须将至少两个不同的表达载体转化至同一植物细胞中。[0630]或者，当不使用一核酸酶时(即不从一外源性的来源向所述细胞施加)，可以使用一单个表达载体克隆并表达所述dna识别单元(例如，sgrna)。[0631]多个典型的表达载体还可以含有一转录和翻译起始序列、转录和翻译终止子以及可选的一聚腺苷酸化信号(polyadenylationsignal)。[0632]根据一个实施例，所述dna编辑剂包括用于编码至少一个dna识别单元(例如，grna)的一核酸剂，所述dna识别单元在运作上(operatively)连接至在多个植物细胞中有活性的一顺式作用(cis‑acting)调节元件(例如，启动子)。[0633]根据一个实施例，所述核酸酶(例如，核酸内切酶)和所述dna识别单元(例如，sgrna)是从相同的表达载体编码的。这样的载体可以包括在多个植物细胞中有活性的一单个顺式作用调节元件(例如，启动子)，用于所述核酸酶和所述dna识别单元二者的表达。或者，所述核酸酶和所述dna识别单元可以各自可操作地连接至在多个植物细胞中有活性的一顺式作用调节元件(例如，启动子)。[0634]根据一个实施例，所述核酸酶(例如，核酸内切酶)和所述dna识别单元(例如，sgrna)是从不同的表达载体编码的，其中每个表达载体可操作地连接至在多个植物细胞中有活性的一顺式作用调节元件(例如，启动子)。[0635]如本文中所使用，短语“植物可表达的”或“在多个植物细胞中有活性的”是指一启动子序列，包含添加至其中或含在其中的任何其他调节元件，其至少能够诱导、赋予、激活或增强在一植物细胞、组织或器官中的表达，优选一单子叶或双子叶植物细胞、组织或器官。[0636]使用的所述植物启动子可以是一组成型启动子、一组织特异性启动子、一诱导型启动子、一嵌合(chimeric)启动子或一发育调控(developmentallyregulated)启动子。[0637]对于本发明一些实施例的所述多个方法有用的多个优选启动子的多个范例在表i、ii、iii以及iv中示出。[0638]表i：用于实施本发明的一些实施例的多个示例性组成型启动子[0639][0640][0641]表ii：用于实施本发明的一些实施例的数个示例性种子优选启动子[0642][0643][0644][0645]表iii：用于实施本发明的数个示例性花特异性启动子[0646][0647]表iv：用于实施本发明的数个替代水稻促进剂[0648][0649][0650][0651][0652]所述诱导型启动子是在一特定植物组织中，通过一发育阶段或通过一特定刺激(例如，多个胁迫条件，包括例如光、温度、化学物质、干旱、高盐、渗透压休克(osmoticshock)、氧化剂条件、或在致病性的情况下)诱导的一启动子，且包含但不限于来自豌豆rbcs基因的光诱导启动子、来自苜蓿(alfalfa)rbcs基因的启动子、在干旱中有活性的多个启动子dre、myc以及myb；在高盐和渗透胁迫(osmoticstress)中有活性的多个启动子int、inps、prxea、hahsp17.7g4以及rd21，以及在病原胁迫下有活性的多个启动子hsr203j和str246c。[0653]根据一个实施例，所述启动子是一病原体诱导型(pathogen‑inducible)启动子。这些启动子在感染一病原体(例如，细菌、真菌、病毒、线虫以及昆虫)后在多个植物中定向bombardment)将dna注入至植物细胞或组织中，klein等人，bio/technology，1988年，6：559至563；mccabe等人，bio/technology，1988年，6：923至926；sanford，physiol.plant，1990年，79：206至209；通过使用微量移液器系统(micropipettesystem)：neuhaus等人，theor.appl.genet.，1987年，75：30至36；neuhaus和spangenberg，physiol.plant.，1990年，79：213至217；美国专利号5,464,765：细胞培养、胚胎或愈伤组织的玻璃纤维或碳化硅晶须转化(glassfibersorsiliconcarbidewhiskertransformationofcellcultures，embryosorcallustissue)、或通过将dna与发芽的花粉直接孵育，dewet等人在胚珠组织的实验操作(experimentalmanipulationofovuletissue)中，chapman，g.p.、mantell，s.h.以及daniels，w.编辑，朗文(longman)，伦敦，1985年，第197至209页；以及ohta，proc.natl.acad.sci.，美国，1986年，83：715至719。[0666]所述农杆菌系统包含使用多个质粒载体，所述质粒载体含有整合至所述植物基因组dna中已定义的多个dna片段。所述植物组织的多个接种方法根据多个植物种类以及农杆菌递送系统而变化。一种广泛使用的方法是叶盘(leafdisc)法，其可以用任何组织外植体进行，这为启动整个植物的分化提供了良好的来源。horsch等人在植物分子生物学手册a5(plantmolecularbiologymanuala5)中，克鲁维尔学术出版社(kluweracademicpublishers)，多德雷赫特，1988年，第1至9页。一种辅助方法是将所述农杆菌递送系统与真空渗透结合使用。所述农杆菌系统在创建转基因双子叶植物中特别有效。[0667]根据一个实施例，一无农杆菌表达方法用于将多个外源基因引入至多个植物细胞中。根据一个实施例，所述无农杆菌的表达方法是瞬时的。根据一具体的实施例，一轰击方法用于将多个外源基因引入至多个植物细胞中。根据另一具体的实施例，一植物根的轰击用于将多个外源基因引入至多个植物细胞中。以下多个实例部分中讨论了可以根据本发明的一些实施例使用的一示例性轰击方法。[0668]此外，根据本发明的一些实施例的教示，可以使用各种克隆试剂盒(cloningkit)或基因合成。[0669]根据一个实施例，所述核酸构建体是一二元载体(binaryvector)。二元载体的多个实例是pbin19、pbi101、pbinar、pgptv、pcambia、pbib‑hyg、pbecks、pgreen或ppzp(hajukiewicz，p.等人，plantmol.biol.，25，989，1994年，以及hellens等人，trendsinplantscience，5，446，2000年)。[0670]在其他dna递送方法(例如，如以下所述的转染、电穿孔、轰击、病毒接种)中使用的其他多个载体的多个实例是：pge‑sgrna(zhang等人，nat.comms.，2016年，7：12697)、pjit163‑ubi‑cas9(wang等人，nat.biotechnol.，2004年，32，947至951)、pich47742：2x3不5s‑5’utr‑hcas9(stop)‑nost(belhan等人，plantmethods，2013年，11；9(1)：39)、pahc25(christensen，a.h.和p.h.quail，1996年，基于泛素启动子的载体在单子叶植物中用于可选择及/或可筛选标记基因的高水平表达(ubiquitinpromoter‑basedvectorsforhigh‑levelexpressionofselectableand/orscreenablemarkergenesinmonocotyledonousplants)，转基因研究(transgenicresearch)，5：213至218)、phbt‑sgfp(s65t)‑nos(sheen等人，蛋白质磷酸酶活性是玉米中光诱导基因表达所需要的，emboj.，12(9)，3497至3505，1993年)。[0671]根据一个实施例，本发明的一些实施例的所述方法还包括将多个供体寡核苷酸引入至所述植物细胞中。[0672]根据一个实施例，当所述修饰是一插入时，所述方法还包括将多个供体寡核苷酸引入至所述植物细胞中。[0673]根据一个实施例，当所述修饰是一缺失时，所述方法还包括将多个供体寡核苷酸引入至所述植物细胞中。[0674]根据一个实施例，当所述修饰是一缺失和插入时(例如，交换)，所述方法还包括将多个供体寡核苷酸引入至所述植物细胞中。[0675]根据一个实施例，当所述修饰是一点突变时，所述方法还包括将多个供体寡核苷酸引入至所述植物细胞中。[0676]如本文中所使用，术语“多个供体寡核苷酸(donoroligonucleotide)”或“多个供体寡核苷酸(donoroligo)”是指多个外源性核苷酸，即从外部引入至所述植物细胞中以在所述基因组中产生一精确的变化。根据一个实施例，所述多个供体寡核苷酸是合成的。[0677]根据一实施例，所述数个供体寡核苷酸是数个rna寡核苷酸。[0678]根据一实施例，所述数个供体寡核苷酸是数个dna寡核苷酸。[0679]根据一实施例，所述数个供体寡核苷酸是数个合成寡核苷酸。[0680]根据一实施例，所述数个供体寡核苷酸包括数个单链供体寡核苷酸(ssodn)。[0681]根据一实施例，所述数个供体寡核苷酸包括数个双链供体寡核苷酸(dsodn)。[0682]根据一实施例，所述数个供体寡核苷酸包括数个双链dna(dsdna)。[0683]根据一实施例，所述数个供体寡核苷酸包括双链dna‑rna双链体(dna‑rnaduplex)。[0684]根据一实施例，所述数个供体寡核苷酸包括双链dna‑rna杂交体。[0685]根据一实施例，所述数个供体寡核苷酸包括单链dna‑rna杂交体。[0686]根据一实施例，所述数个供体寡核苷酸包括单链dna(ssdna)。[0687]根据一实施例，所述数个供体寡核苷酸包括双链rna(dsrna)。[0688]根据一实施例，所述数个供体寡核苷酸包括单链rna(ssrna)。[0689]根据一实施例，所述数个供体寡核苷酸包括用于交换的所述dna或rna序列(如上文所讨论)。[0690]根据一实施例，所述数个供体寡核苷酸具有以一非表达载体形式或寡核苷酸形式。[0691]根据一实施例，所述数个供体寡核苷酸包括一dna供体质粒(例如环状或线性化质粒)。[0692]根据一实施例，所述数个供体寡核苷酸包括约50至5000个、约100至5000个、约250至5000个、约500至5000个、约750至5000个、约1000至5000个、约1500至5000个、约2000至5000个、约2500至5000个、约3000至5000个、约4000至5000个、约50至4000个、约100至4000个、约250至4000个、约500至4000个、约750至4000个、约1000至4000个、约1500至4000个、约2000至4000个、约2500至4000个、约3000至4000个、约50至3000个、约100至3000个、约250至3000个、约500至3000个、约750至3000个、约1000至3000个、约1500至3000个、约2000至3000个、约50至2000个、约100至2000个、约250至2000个、约500至2000个、约750至2000个、约1000至2000个、约1500至2000个、约50至1000个、约100至1000个、约250至1000个、约500至1000个、约750至1000个、约50至750个、约150至750个、约250至750个、约500至750个、约50至500个、约150至500个、约200至500个、约250至500个、约350至500个、约50至250个、约150至250个、或约200至250个核苷酸。[0693]根据一具体的实施例，包括所述ssodn(例如ssdna或ssrna)的所述数个供体寡核苷酸包括约200至500个核苷酸。[0694]根据一具体的实施例，包括所述dsodn(例如dsdna或dsrna)的所述数个供体寡核苷酸包括约250至5000个核苷酸。[0695]根据一个实施例，对于将一内源性rna沉默分子(例如，mirna)与一选择的rna沉默序列(例如，sirna)进行基因交换，所述表达载体、ssodn(例如，ssdna或ssrna)或dsodn(例如，dsdna或dsrna)不需在一植物细胞中表达，且可以作为一非表达模板。根据一具体的实施例，在这种情况下，如果以一dna形式提供，则仅需表达所述dna编辑剂(例如，多个cas9/sgrna模块)。[0696]根据一些实施例，对于在不使用一核酸酶的情况下对一内源性非编码rna分子(例如，rna沉默分子)进行基因编辑，可将所述dna编辑剂(例如，sgrna)在有或没有例如寡核苷酸供体dna或rna(如本文中所述)的情况下引入至所述真核细胞中。[0697]根据一个实施例，使用上述任何方法(例如，使用所述表达载体或rnp转染)将多个供体寡核苷酸引入至所述植物细胞中。[0698]根据一个实施例，将所述sgrna和所述多个dna供体寡核苷酸共同引入至所述植物细胞中(例如，通过轰击)。应理解的是，任何其他因子(例如，核酸酶)可以与之共同引[0699]根据一个实施例，将所述sgrna在所述多个dna供体寡核苷酸之前引入至所述植物细胞中(例如，在几分钟或几小时内)。应理解的是，任何其他因子(例如，核酸酶)可以在所述sgrna或所述多个dna供体寡核苷酸之前、同时或之后引入。[0700]根据一个实施例，将所述sgrna在所述多个dna供体寡核苷酸之后引入至所述植物细胞中(例如，在几分钟或几小时内)。应理解的是，任何其他因子(例如，核酸酶)可以在所述sgrna或所述多个dna供体寡核苷酸之前、同时或之后引入。[0701]根据一个实施例，提供了一种组合物，其包括用于基因组编辑的至少一个sgrna和多个dna供体寡核苷酸。[0702]根据一个实施例，提供了一种组合物，其包括用于基因组编辑的至少一个sgrna、一核酸酶(例如，核酸内切酶)以及多个dna供体寡核苷酸。[0703]有多种方法可以直接将dna转移至多个植物细胞中，且技术人员会知道选择哪种方法。在电穿孔中，所述多个原生质体短暂地暴露于一强电场中。在微量注射中，使用非常小的微量移液器将所述dna在机械上直接地注射至所述多个细胞中。在微粒轰击中，所述dna吸附在多个微粒上，例如，多个硫酸镁晶体或多个金或钨微粒，且所述多个微粒在物理上加速进入多个原生质体、多个细胞或多个植物组织。[0704]因此，在本发明的多个实施例中，可以通过本领域技术人员已知的任何方法将多个核酸的递送引入至一植物细胞中，例如包含但不限于：通过多个原生质体的转化(例如参见，美国专利号5,508,184)；通过干燥(desiccation)/抑制介导的dna摄取(例如参见，potrykus等人，1985年，mol.gen.genet.，199：183至8)；通过电穿孔(例如参见，美国专利号5,384,253)；通过与多个碳化硅纤维搅拌(例如参见，美国专利号5,302,523和5,464,765)；通过农杆菌介导的转化(例如参见，美国专利号5,563,055、5,591,616、5,693,512、5,824,877、5,981,840以及6,384,301)；通过加速多个dna涂覆的颗粒(例如参见，美国专利号5,015,580、5,550,318、5,538,880、6,160,208、6,399,861以及6,403,865)、以及通过多个纳米颗粒、多个纳米载体以及多个细胞穿透肽(wo201126644a2；wo2009046384a1；wo2008148223a1)将dna、rna、多个肽及/或多个蛋白质或多个核酸和多个肽的多个组合递送至多个植物细胞中的方法。[0705]其他转染方法包含使用多个转染试剂(例如，lipofectin、thermofisher)、多个树枝状聚合物(kukowska‑latallo，j.f.等人，1996年，proc.natl.acad.sci.usa(美国国家科学院学报)，93，4897至1902)、多个细胞穿透肽(等人，2005年，将细胞穿透肽内化至烟草原生质体中(internalisationofcell‑penetratingpeptidesintotobaccoprotoplasts)，biochimicaetbiophysicaacta，1669(2)：101至7)或多个多胺(zhang和vinogradov，2010年，用于大脑毛细血管内皮细胞的基因递送和转染的短生物可降解多胺(shortbiodegradablepolyaminesforgenedeliveryandtransfectionofbraincapillaryendothelialcells)，jcontrolrelease，143(3)：359至366)。[0706]根据一具体的实施例，将dna引入至多个植物细胞(例如，多个原生质体)中的所述方法包括聚乙二醇(peg)介导的dna摄取。有关更多详细信息，请参见karesch等人(1991年，plantcellrep.，9：575至578)；mathur等人(1995年，plantcellrep.，14：221至226)；negrutiu等人(1987年，plantcellmol.biol.，8：363至373)。然后将多个植物细胞(例如，多个原生质体)在允许它们生长多个细胞壁、开始分裂以形成一愈伤组织、发育多个幼芽和多个根、以及再生整个植物的条件下培养。[0707]稳定的转化后，进行植物繁殖。最常见的植物繁殖方法是通过种子。然而，通过种子繁殖进行再生的缺点在于，由于杂合性(heterozygosity)而导致所述作物中缺乏均匀性，因为多个种子是通过多个植物根据孟德尔规则所支配的多个遗传变异产生的。基本上，每个种子在基因上都是不同的，且每个都有自己的特定性状。因此，优选的是产生转化植物，使得再生植物具有与亲本转基因(parenttransgenic)植物相同的性状和特征。因此，优选的是通过微繁殖(micropropagation)再生所述转化植物，其提供在遗传上相同的转化植物的一快速、一致的繁殖。[0708]微繁殖是从一选定的亲本植物或品种中切除的一单块组织中生长多个新一代植物的一过程。此过程允许具有所需性状的多个植物大量繁殖。多个新产生的植物在遗传上与原始植物相同，且具有所述原始植物的所有特征。微繁殖(或克隆)可以在一短时间内大量产生高质量的植物材料，并在保留所述原始转基因或转化植物的所述多个特征提供多个选定品种的一快速繁殖。多个克隆植物的优点是植物繁殖的速度以及多个所产生植物的质量和均匀性。[0709]微繁殖是一多阶段的程序，需要在多个阶段之间改变培养基或生长条件。因此，所述微繁殖过程包括四个基本阶段：第一阶段，初始组织培养；第二阶段，组织培养繁殖；第三阶段，分化和植物形成；以及第四阶段，温室培养和硬化。在第一阶段期间(初始组织培养)，建立所述组织培养并证明无污染。在第二阶段期间，繁殖所述初始组织培养，直到产生一足够数量的组织样品以满足生产目标为止。在第三阶段期间，将在第二阶段中生长的所述多个组织样品分开并生长成多个单独的植株。在第四阶段期间，将多个转化植株转移至一温室进行硬化，在所述温室中所述植物对光的耐受性逐渐地增加，使其可以在自然环境中生长。[0710]尽管目前优选是稳定的转化，但是本发明的一些实施例还设想了多个叶细胞、多个分生细胞或所述整个植物的瞬时的转化。[0711]瞬时的转化可以通过上述任何直接dna转移方法或通过使用多个修饰的植物病毒的病毒感染来实现。[0712]已证明对多个植物宿主转化有用的多个病毒包含camv、tmv、trv以及bv。使用多个植物病毒的多个植物转化描述于美国专利号4,855,237(bgv)、ep‑a67,553(tmv)、日本公开申请号63‑14693(tmv)、epa194,809(bv)、epa278,667(bv)；以及gluzman，y.等人(分子生物学通讯：病毒载体(communicationsinmolecularbiology：viralvectors)，纽约冷泉港实验室(coldspringharborlaboratory)，第172至189页，1988年)中。用于在包含植物的许多宿主中表达外源dna的伪病毒颗粒(pseudovirusparticle)描述于wo87/06261中。[0713]通过以上参考文献以及通过dawson，w.o.等人(virology，1989年，172：285至292；takamatsu等人(emboj.，1987年，6：307至311)；french等人(science，1986年，231：1294至1297)；以及takamatsu等人(febsletters，1990年，269：73至76)证明了在多个植物中引入和表达多个非病毒外源性核酸序列的多个植物rna病毒的构建。[0714]当所述病毒是一dna病毒时，可以对所述病毒本身进行适当的修饰。或者，可以首先将所述病毒克隆至一细菌质粒中，以易于用所述外源dna构建所需的病毒载体。然后可以从所述质粒中切除所述病毒。如果所述病毒是一dna病毒，则一细菌的复制起点可以附着至所述病毒dna上，然后通过所述细菌复制。此dna的转录和翻译将产生外壳蛋白(coatprotein)，其将包埋(encapsidate)所述病毒dna。如果所述病毒是一rna病毒，则通常将所述病毒克隆为一cdna并插入至一质粒中。然后将所述质粒用于制造所有的构建。然后通过转录所述质粒的所述病毒序列产生所述rna病毒，并转译所述多个病毒基因以产生包埋所述病毒rna的所述(多个)外壳蛋白。[0715]通过以上参考文献以及美国专利号5,316,931中证明了用于在多个植物中引入和表达多个非病毒外源性核酸序列(例如，本发明的一些实施例的所述构建体中包括的序列)的多个植物rna病毒的构建。[0716]在一个实施例中，提供了一种植物病毒核酸，其中已经从一病毒核酸删除了所述天然外壳蛋白编码序列，已经插入了一非天然植物病毒外壳蛋白编码序列和一非天然启动子(优选为所述非天然病毒外壳蛋白编码序列的亚基因组启动子)，其能够在所述植物宿主中表达、包装所述重组植物病毒核酸以及确保所述宿主通过所述重组植物病毒核酸的一系统感染。或者，所述外壳蛋白基因可以通过在其内插入所述非天然核酸序列而失活，从而产生一蛋白质。所述重组植物病毒核酸可以含有一个或多个其他非天然亚基因组启动子。每个非天然亚基因组启动子能够在所述植物宿主中转录或表达多个相邻的基因或核酸序列，且不能彼此重组，也不能与多个天然亚基因组启动子重组。如果包含超过一个核酸序列，则可以在所述天然植物病毒亚基因组启动子或所述天然植物病毒亚基因组和一非天然植物病毒亚基因组启动子附近插入多个非天然(外源)核酸序列。所述多个非天然核酸序列在所述亚基因组启动子的控制下在所述宿主植物中转录或表达以产生多个所需的产物。[0717]在一第二实施例中，如在所述第一实施例中提供了一种重组植物病毒核酸，不同之处在于将所述天然外壳蛋白编码序列置于所述多个非天然外壳蛋白亚基因组启动子之一的附近而不是一非天然外壳蛋白编码序列。[0718]在一第三实施例中，提供了一种重组植物病毒核酸，其中所述天然外壳蛋白基因与其亚基因组启动子相邻，且一个或多个非天然亚基因组启动子已经插入所述病毒核酸中。所述多个插入的非天然亚基因组启动子能够在一植物宿主中转录或表达多个相邻基因，且不能彼此重组，也不能与多个天然亚基因组启动子重组。可以将多个非天然核酸序列插入所述多个非天然亚基因组植物病毒启动子附近，使得在所述多个亚基因组启动子的控制下在所述宿主植物中转录或表达所述多个序列以产生多个所需的产物。[0719]在一第四实施例中，如在所述第三实施例中提供了一种重组植物病毒核酸，不同之处在于将所述天然外壳蛋白编码序列通过一非天然外壳蛋白编码序列替换。[0720]所述多个病毒载体通过所述重组植物病毒核酸编码并通过所述多个外壳蛋白包埋以产生一重组植物病毒。所述重组植物病毒核酸或重组植物病毒用于感染多个合适的宿主植物。所述重组植物病毒核酸能够在所述宿主中复制、在所述宿主中系统传播以及在所述宿主中转录或表达(多个)外源基因(分离的核酸)，以产生所需的蛋白质。[0721]除上述之外，本发明的一些实施例的所述核酸分子还可以被引入至一叶绿体基因组，从而使叶绿体能够表达。[0722]将多个外源性核酸序列引入至所述叶绿素的所述基因组的技术是已知的。此技术包括以下多个步骤。首先，对多个植物细胞进行化学处理，以使每个细胞的叶绿素数量减少至约一个。然后，通过粒子轰击将所述外源性核酸引入至所述多个细胞中，目的是将至少一个外源性核酸分子引入至所述多个叶绿素中。选择所述外源性核酸，使其通过同源重组整合至所述叶绿素的基因组中，所述同源重组容易受所述叶绿素固有的多个酶影响。为此，所述外源性核酸除了包含一感兴趣的基因之外，还包含至少一个源自所述叶绿素的基因组的核酸片段(stretch)。另外，所述外源性核酸包含一可选择的标记，其通过多个顺序选择步骤来确定在此类选择之后所述多个叶绿素基因组的全部或实质上全部的拷贝将包含所述外源性核酸。与此技术有关的更多细节可在美国专利号4,945,050以及5,693,507找到，其通过引用并入本文中。因此，一多肽可以通过所述叶绿素的所述蛋白质表达系统产生并整合至所述叶绿素的内膜中。[0723]无论采用何种转化/感染方法，本教示进一步选择包括一基因组编辑事件的多个转化细胞。[0724]根据一具体的实施例，进行选择使得仅选择在所述特定基因座中包括一成功准确修饰(例如，交换、插入、缺失、点突变)的多个细胞。因此，不选择包括在一非预期基因座中包含一修饰(例如，一插入、缺失、点突变)的任何事件的多个细胞。[0725]根据一个实施例，可以通过检测一分子事件、通过检测一荧光报道子、或通过在选择物(例如，抗生素)存在的情况下生长，在表型水平上进行多个修饰细胞的选择。[0726]根据一个实施例，通过分析新产生的dsrna分子的所述生物发生(biogenesis)和发生(occurrence)来进行多个修饰细胞的选择。[0727]根据一个实施例，通过分析二级小rna分子(通过dsrna的进一步加工而产生)的所述生物发生和发生来进行多个修饰细胞的选择。[0728]根据一个实施例，通过分析新编辑的rna分子(例如新mirna版本的存在、新编辑的数个sirna、pirna、tasirna等的存在)的所述生物发生和发生来进行多个修饰细胞的选择。[0729]根据一个实施例，通过分析新编辑的植物rna转录物(即，修饰的植物基因)的所述生物发生和发生来进行多个修饰细胞的选择。[0730]根据一个实施例，通过分析分别针对一植物rna或一有害生物rna的所述修饰的rna分子(例如，rna沉默分子)或所述修饰的植物rna的所述沉默活性及/或特异性(通过验证在所述植物或生物体中用于编码所述靶rna的至少一个表型)来进行多个修饰细胞的选择，所述表型例如为植物叶片着色，例如，叶片和其他器官中叶绿素的部分或全部丧失(漂白)、存在/不存在坏死模式(nacroticpaterrn)、花色、果实性状(例如，保质期、硬度以及风味)、生长速率、植株尺寸(例如，矮化)、作物产量、生物胁迫耐受性(例如，抗病性、线虫死亡率、甲虫的产卵率或其他与细菌、病毒、真菌、寄生虫、昆虫、杂草以及栽培或本地植物相关的抗性表型)。[0731]根据一实施例，所述rna分子、所述植物rna、所述dsrna或由其加工的所述二级小rna的所述沉默特异性是由基因型上确定的(determinedgenotypically)，例如，通过一基因表达或缺乏表达。[0732]根据一实施例，所述rna分子、所述植物rna、所述dsrna或由其加工的所述二级小rna的所述沉默特异性是由表型上确定的(determinedphenotypically)。[0733]根据一实施例，所述植物的一表型是在一基因型之前确定的。[0734]根据一实施例，所述植物的一基因型是在一表型之前确定的。[0735]根据一实施例，通过分析所述rna分子(例如rna沉默分子)、所述植物rna、所述dsrna或由其加工的所述二级小rna针对一植物rna或一有害生物rna的所述沉默活性及/或特异性(通过测量所述植物rna或有害生物rna的一rna水平)来进行多个修饰细胞的选择。这可以使用本领域已知的任何方法来进行，例如通过北方墨点法、核酸酶保护分析、原位杂交或定量rt‑pcr。[0736]根据一个实施例，通过分析包括所述dna编辑事件的多个植物细胞或多个克隆来进行多个修饰细胞的选择，所述dna编辑事件在本文中也称为“突变”或“编辑”，取决于寻求的编辑类型，例如，插入、缺失、插入‑缺失(插入缺失(indel))、倒位(inversion)、取代及其组合。[0737]用于检测序列改变的方法在本领域中是众所周知的，包含但不限于，dna和rna测序(例如，次世代测序(nextgenerationsequencing))、电泳、一基于酶的错配检测测定法(enzyme‑basedmismatchdetectionassay)以及一杂交测定法，例如，pcr、rt‑pcr、rnase保护、原位杂交、引物延伸(primerextension)、南方墨点法、北方墨点法以及斑点印迹(dotblot)分析。也可以使用用于检测单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphisms，snp)的各种方法，例如，基于pcr的t7核酸内切酶、异源双链(hetroduplex)和sanger测序、或pcr后进行限制酶切(restrictiondigest)以检测(多个)独特限制位点的出现或消失。[0738]验证一dna编辑事件(例如，插入缺失(indel))的存在的另一种方法包括一错配剪切测定法，其利用识别和剪切错配dna的一结构选择酶(例如，内切核酸酶)。[0739]根据一个实施例，通过流式细胞术(facs)选择多个转化的细胞，所述流式细胞术选择表现出荧光(通过所述荧光报道子发射)的多个转化的细胞。在facs分选后，收集阳性选择的多个转化植物细胞群，其显示所述荧光标记，且可以使用一等分试样(aliquot)来测试如上所述的dna编辑事件。[0740]在使用抗生素选择标记的情况下，转化后，在选择(例如，抗生素)存在下培养多个植物细胞克隆，直到它们发展成多个集落(colony)，即多个克隆和多个微愈伤组织(micro‑calli)。如上所述，然后对所述愈伤组织的一部分细胞针对所述dna编辑事件进行分析(验证)。[0741]因此，根据本发明的一个实施例，所述方法进一步包括在所述多个转化的细胞中验证所述rna分子(例如rna沉默分子)、所述植物rna、所述dsrna或由其加工的所述二级小rna针对所述植物rna或有害生物rna的互补性。[0742]如上所述，所述rna分子(例如rna沉默分子)、所述植物rna、dsrna(例如其有义链或反义链)或由其加工的所述二级小rna，进行修饰后，针对所述植物或有害生物rna的所述序列具有至少约30％、33％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或甚至100％的互补性。[0743]设计的rna分子与一靶rna或有害生物的所述特异性结合可以通过本领域中已知的任何方法来确定，例如，通过计算算法(例如，blast)，并通过例如包含北方墨点法、原位杂交、quantigeneplex测定法等多个方法来验证。[0744]应理解的是，对于所述dna编辑事件，多个阳性克隆可以是纯合的(homozygous)或杂合的(heterozygous)。在一杂合细胞的情况下，所述细胞(例如，当二倍体时)可以包括一修饰基因的一拷贝和一非修饰基因的一拷贝。技术人员将根据预期用途选择所述克隆用于进一步的培养/再生。[0745]根据一个实施例，当需要一种瞬时方法时，针对缺少一dna编辑剂的情况(即丢失用于编码所述dna编辑剂的多个dna序列)，进一步分析和选择表现出存在所需的dna编辑事件的多个克隆。例如，这可以通过分析所述dna编辑剂的表达损失(例如，在所述mrna、蛋白质上)来进行，例如通过gfp或q‑pcr、hplc的荧光检测。[0746]根据一个实施例，当需要一种瞬时方法时，可以分析所述多个细胞是否缺少如本文中所述的核酸构建体或其部分，例如，用于编码所述dna编辑剂的核酸序列。这可以通过荧光显微镜、q‑pcr、facs或任何其他方法(例如，南方墨点法、pcr、测序、hplc)来确认。[0747]根据一个实施例，如下所述，对所述植物进行杂交，以获得缺乏所述dna编辑剂(例如，核酸内切酶)的一植物。[0748]多个阳性克隆可以被保存(例如，冷冻保存)。[0749]或者，多个植物细胞(例如，多个原生质体)可以首先通过生长成一组发育为一愈伤组织的多个植物细胞，然后通过使用多个植物组织培养方法从所述愈伤组织再生多个芽(愈伤组织再生(callogenesis))而再生为多个完整植物。多个原生质体向愈伤组织的生长和多个芽的再生需要所述组织培养基中多个植物生长调节剂的适当平衡，所述培养基必须针对每个植物物种进行定制。[0750]使用称为原生质体融合(fusion)的技术，多个原生质体也可以用于植物育种。通过使用一电场或一聚乙二醇溶液诱导来自不同物种的多个原生质体融合。此技术可以用于在组织培养中产生体细胞杂种。[0751]原生质体再生的方法是本领域众所周知的。几个因素会影响原生质体分离、培养以及再生，即所述基因型、所述供体组织及其前处理、用于原生质体分离的酶处理、原生质体培养方法、培养物、培养基以及物理环境。关于一全面的评论请参见maheshwari等人(1986年，原生质体和转化植物细胞的分化(differentiationofprotoplastsandoftransformedplantcells)：3至36，施普林格出版社(springer‑verlag)，柏林)。[0752]如技术人员认为合适的，可以对多个再生的植物进行进一步的育种(breeding)和选择。[0753]因此，本发明的多个实施例进一步涉及多个植物、多个植物细胞以及多个植物的加工产物，其包括能够沉默根据本教示产生的一有害生物基因的所述dsrna分子。[0754]根据本发明的一方面，提供了一种产生耐有害生物或抗植物的方法(amethodofgeneratingapesttolerantorresistantplant)，所述方法包括根据本发明的一些实施例的所述方法产生能够使一植物细胞中的一有害生物基因沉默的一长dsrna分子。[0755]根据本发明的一个方面，提供了一种产生一耐有害生物或抗有害生物植物的方法，所述方法包括：[0756](a)育种本发明的一些实施例的所述植物；及[0757](b)选择数个后代植物，所述数个后代植物表达能够抑制所述有害生物基因的所述长dsrna分子，并且不包括所述dna编辑剂，[0758]从而产生所述耐有害生物或抗有害生物植物。[0759]根据本发明的一方面，提供了一种产生本发明的一些实施例的所述植物或植物细胞的方法，包括在允许繁殖的条件下培养所述植物或植物细胞。[0760]根据一实施例，育种包括杂交(crossing)或自交(selfing)。[0761]本文中所使用的术语“杂交”是指多个雄性植物(或多个配子(gamete))对多个雌性植物(或多个配子)的受精(fertilization)。术语“配子”是指通过来自一配子体(gametophyte)的有丝分裂(mitosis)在多个植物中产生并参与有性生殖的单倍体(haploid)生殖细胞(卵或精子)，在此期间，异性的两个配子融合以形成一二倍体合子(diploidzygote)。所述术语通常包含指一花粉(pollen)(包含所述精子细胞)和一胚珠(ovule)(包含所述卵子)。因此，“杂交”通常是指一个个体的多个胚珠与来自另一个个体的花粉的受精，而“自交”是指一个体的多个胚珠与来自相同个体的花粉的受精。杂交被广泛用于植物育种中，且导致所述两个植物之间的基因组信息混合在一起，所述两个植物杂交来自母亲的一条染色体和来自父亲的一条染色体。这将导致在遗传上多个遗传性状的一新组合。[0762]如上所述，可以杂交所述植株以获得不含多个不需要因子的一植株，例如，dna编辑剂(例如，核酸内切酶)。[0763]根据本发明的一些实施例，所述植物是非转基因的。[0764]根据本发明的一些实施例，所述植物是一转基因植物。[0765]根据一实施例，所述植物是非遗传性修饰的(非转基因)。[0766]根据一实施例，所述植物是遗传性修饰的(geneticallymodified，gmo)。[0767]根据本发明的一方面，提供了本发明一些实施例的所述植物的一细胞。[0768]根据本发明的一方面，提供了本发明一些实施例的所述植物的一种子。[0769]根据一实施例，与不是通过数个本方法产生的数个植物相比(即与数个野生型植物相比)，通过数个本方法产生的所述数个植物提高至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％的针对有害生物的抗性或耐受性。[0770]据本发明，可以使用本领域中已知的任何用于评估一植物对一病原体的耐受性或抗性的方法。多个示例性方法包含但不限于，如ramírezv1、garcía‑andradej、verap.所述，降低拟南芥(arabidopsis)中的myb46表达导致增强对灰葡萄孢霉(botrytiscinereal)的抗性(plantsignalbehav.，2011年6月；6(6)：911至3，epub：2011年6月1日)；或如gallego‑giraldol.等人所述，苜蓿中hct的下调节促进了植物中防御反应的激活(newphytologist，2011年，190：627至639，doi：10.1111/j.1469‑8137.2010.03621.x)，两者均以引用方式并入本文中。[0771]根据进一步的实施例，提供了一种产生一植物细胞中的一长dsrna分子的方法，其中所述长dsrna能够沉默一感兴趣的靶基因，所述方法包括：(a)选择一植物基因与一第一核酸序列，所述植物基因与所述核酸序列显示出与所述感兴趣的靶基因的一核酸序列具有一预定的序列同源性；(b)修饰了编码一rna分子的一第二植物内源核酸序列，以针对所述第一植物基因赋予一沉默特异性，使得能够募集rna依赖型rna聚合酶(rdrp)的数个小rna分子与所述第一植物基因的一转录物形成碱基互补，所述数个小rna分子是从所述rna分子加工而来，以产生能够沉默所述感兴趣的靶基因的所述长dsrna分子。[0772]根据一些实施例，在使用上述方法之前，所述第一核酸序列不编码一沉默rna。根据一些实施例，在使用上述方法之前，所述长dsrna不是由所述第一核酸序列天然产生的。不希望受理论或机制的束缚，虽然上述方法中的所述第一核酸序列不一定天然产生长dsrna(或任何沉默rna)，但所述第二植物内源核酸序列的修饰产生一rna分子(例如mirna)。所述rna分子作为扩增器并与rdrp结合以从所述第一核酸序列的一rna转录物生成长dsrna。因此，实际上，根据一些实施例，上述方法能够从以前不产生长dsrna的一基因中来产生出一长dsrna。[0773]根据一些实施例，所述感兴趣的靶基因是所述植物细胞的一内源基因(endogenousgene)。根据数个其他实施例，所述感兴趣的靶基因是对于所述植物细胞的一外源基因(exogenousgenet)(例如一有害生物的一基因，例如无脊椎有害生物)。[0774]根据一些实施例，由所述第二植物内源核酸序列编码的所述rna分子是一mirna。[0775]根据一些实施例，与所述感兴趣的靶基因的一核酸序列的所述预定序列同源性包括至少两个片段的同源性，每个片段至少为28nt，每个片段与所述感兴趣的靶基因的所述序列具有至少90％的同源性。[0776]根据一些实施例，修饰一核酸序列包括使用一dna编辑剂，例如但不限于一crispr‑核酸内切酶(例如cas9)。根据一些实施例，所述dna编辑剂包括一cripsr‑内切核酸酶及一向导rna(guiderna)，其旨在切割一感兴趣的核酸序列(例如所述第二植物内源核酸的所述序列)。根据一些实施例，修饰一感兴趣的核酸序列包括使用一dna编辑剂(可能具有针对切割所述感兴趣的核酸的一向导rna)，并进一步将一额外核酸序列引入至所述植物细胞，所述额外核酸序列与待修饰的所述核酸序列相似，但待修饰的所述核酸序列包括所需的数个核苷酸改变。不希望受理论或机制的束缚，所述dna编辑剂切割所述感兴趣的核酸序列，并且通过同源依赖性重组(hdr)将所述部分额外核酸序列(包括所需的数个核苷酸改变)引入至所述感兴趣的核酸序列中。[0777]如本文中所使用的术语“约”是指±10％。[0778]术语“包括(comprises)”、“包括(comprising)”、“包含(includes)”、“包含(including)”、“具有(having)”及其词形变化意指“包含但不限于(includingbutnotlimitedto)”。[0779]术语“由……组成(consistingof)”是指“包含并限于”。[0780]术语“基本由……组成(consistingessentiallyof)”意味着组成、方法或结构可包含其它成分、步骤及/或部分，但只要其它成分、步骤及/或部分不实质性地改变所要求保护的组成、方法或结构的基本和新的特征。[0781]如本文中所使用的单数形式“一个/种(a)”、“一个/种(an)”以及“所述/该(the)”包含复数指代物，除非文中另有明确规定。例如，术语“一种化合物”或“至少一种化合物”可包括多种化合物，包括其混合物。[0782]在整个本技术中，本发明的不同的实施例可以范围形式呈现。应理解的是，范围形式的描述仅出于方便和简洁，不应解释为本发明范围的不可变更的限制。因此，范围的描述应视为具体公开了所有可能的子范围以及该范围的各个数值。例如，范围诸如1至6的描述应视为具体公开了诸如1至3、1至4、1至5、2至4、2至6、3至6等子范围，以及该范围的各个数，例如1、2、3、4、5和6。其不论范围宽度均适用。[0783]每当本文中规定一数值范围时，意指包含所述指定范围内的任何所述的数值(分数或整数)。所述短语第一标示数字和第二标示数字“之间的范围”和“从”第一标示数字“到”第二标示数字“的范围”在本文中互换使用，意指包含第一标示数字和第二标示数字和其间的所有分数和整数。[0784]如本文中所使用的术语“方法”是指用于完成给定任务的方式、手段、技术以及程序，包含但不限于化学、药理学、生物、生物化学以及医学领域从业人员已知或容易由他们从已知的方式、手段、技术和程序开发的方式、手段、技术以及程序。[0785]如本文中所使用的术语“治疗”包含消除、实质上抑制、减慢或逆转病情的进展、实质上改善病情的临床和美学症状或实质上预防病情的临床或美学症状的出现。[0786]应理解的是，为了清楚起见，在各个实施例的背景下描述的本发明的某些特征，也可在单一实施例中组合提供。相反，出于简洁起见，在单一实施例的背景下描述的本发明的不同特征，也可单独提供或以任何合适的亚组合提供或适用于本发明的任何其它描述的实施例。在不同实施例的情况下描述的某些特征不视为所述实施例的必需特征，除非该实施例在无所述要素时是无效的。[0787]在下面的数个范例中，提供对上文描述和随附权利要求书部分要求保护的本发明的不同实施例和方面的实验支持。[0788]应理解的是，本技术中公开的任何序列识别号(seqidno)可以是指一dna序列或一rna序列，这根据提及该seqidno的上下文，即使该seqidno仅以一dna序列格式或一rna序列格式表达。例如，seqidno：1以一dna序列格式表达(例如，用t表示胸腺嘧啶)，但它可以是指对应于一核酸序列的一dna序列，或是指一rna分子核酸序列的所述rna序列。同样地，尽管某些序列以一rna序列格式表达(例如，用u表示尿嘧啶)，但根据所述分子的实际类型，它可以是指包括一dsrna的一rna分子的序列，也可以是指对应于所示rna序列的一dna分子的序列。在任何情况下，可以设想具有与任何取代基一起公开的序列的dna和rna分子。[0789]范例[0790]现在参照以下实例，连同上文的描述，其以非限制性方式说明本发明。[0791]一般而言，本文中使用的命名和本发明中利用的实验室程序包含分子、生物化学、微生物和重组dna技术。文献中全面阐释了这样的技术。参见例如“molecularcloning：alaboratorymanual”，sambrook等人，1989年；“currentprotocolsinmolecularbiology”，第i至iii卷，ausubel，r.m.编辑，1994年；ausubel等人，“currentprotocolsinmolecularbiology”，johnwiley和sons，baltimore，马里兰，1989年；perbal，“apracticalguidetomolecularcloning”，johnwiley和sons，纽约，1988年；watson等人，“recombinantdna”，scientificamericanbooks，纽约；birren等人(编辑)“genomeanalysis：alaboratorymanualseries”，第1至4卷，冷泉港实验室出版社(coldspringharborlaboratorypress)，纽约，1998年，；如美国专利号4,666,828、4,683,202、4,801,531、5,192,659以及5,272,057；“cellbiology：alaboratoryhandbook”，第i至iii卷，cellis，j.e.编辑，1994年；“cultureofanimalcells‑amanualofbasictechnique”freshney，wiley‑liss，纽约，1994年，第三版；“currentprotocolsinimmunology”，第i至iii卷，coliganj.e.编辑，1994年；stites等人(编辑)，“basicandclinicalimmunology”(第8版)，appleton和lange，norwalk，ct，1994年；mishell和shiigi(编辑)，“selectedmethodsincellularimmunology”，w.h.freemanandco.，纽约，1980年中所示的方法；可得的免疫测定法大量描述于专利和科学文献中，参见例如美国专利号3,791,932、3,839,153、3,850,752、3,850,578、3,853,987、3,867,517、3,879,262、3,901,654、3,935,074、3,984,533、3,996,345、4,034,074、4,098,876、4,879,219、5,011,771以及和5,281,521，“oligonucleotidesynthesis”，gait，m.j.编辑，1984年；“nucleicacidhybridization”，hames，b.d.和higginss.j.编辑，1985年；“transcriptionandtranslation”，hames，b.d.和higginss.j.编辑，1984年；“animalcellculture”，freshney，r.i.编辑，1986年；“immobilizedcellsandenzymes”，irl出版社(irlpress)，1986年；“apracticalguidetomolecularcloning”，perbal，b.，1984年以及“methodsinenzymology”，第1至317卷，学术出版社(academicpress)；“pcrprotocols：aguidetomethodsandapplications”，学术出版社(academicpress)，加州圣地牙哥，1990年；marshak等人，“strategiesforproteinpurificationandcharacterization‑alaboratorycoursemanual”，cshl出版社(cshlpress)，1996年；其全部通过引用并入，如同在本文中完全阐述一样。在整个文件中提供其它一般参考文献。其中的程序被视为是本领域中众所周知的，并且为了方便读者而提供。其中所含的全部信息通过引用并入本文中。[0792]一般材料及实验步骤[0793]计算管道以生成geigs模板[0794]所述计算geigs管道应用了生物元数据(biologicalmetadate)，并能够自动产生多个geigsdna模板，所述模板用于最低程度编辑多个非编码rna基因(例如，多个mirna基因)，从而获得一新的功能，即将其沉默能力重定向至感兴趣的靶序列。[0795]如图6中所示，所述管道从填入和提交输入开始：(a)通过geigs沉默靶序列；(b)基因编辑所述宿主生物并表达所述geigs；(c)可以选择是否普遍表达所述geigs。如果需要特定geigs表达，则可以从几个选项中选择(特定于一特定组织、发育阶段、胁迫、热/冷休克等的表达)。[0796]当所有必需的输入提交后，所述计算过程将从在多个mirna数据集(例如，小rna测序、微阵列等)之间搜索并仅筛选符合输入标准的多个相关mirna开始。接下来，将选定的多个成熟mirna序列与所述靶序列进行比对，并筛选具有最高互补水平的mirna。然后修饰这些天然的靶互补成熟mirna序列，使其与所述靶的序列完全匹配。然后，所述修饰的多个成熟mirna序列通过预测sirna效能的一算法运行，并筛选出沉默得分最高的前20个。然后将这些最终修饰的mirna基因用于产生200至500ntssdna或250至5000ntdsdna序列，如下所示。[0797]基于在所述修饰的mirna两侧的所述基因组dna序列来设计200至500ntssdna寡核苷酸和250至5000ntdsdna片段。所述pre‑mirna序列位于所述寡核苷酸的中心。所述修饰的mirna的引导链(沉默)序列与所述靶100％互补。然而，所述修饰的乘客mirna链的所述序列进一步修饰以保留所述原始(未修饰的)mirna结构，保持相同的碱基配对外形。[0798]接下来，将多个差异性sgrna设计为特异性靶向所述原始未修饰的mirna基因，而不是所述修饰的交换形式。最后，在所述修饰的mirna基因和所述原始的mirna基因之间进行比较限制性酶切位点分析，并总结了多个差异性限制性位点。[0799]因此，所述管道输出包含：[0800](a)具有最低程度修饰的mirna的200至500ntssdna寡核苷酸或250至5000ntdsdna片段序列。[0801](b)特异性靶向所述原始mirna基因而非所述修饰的mirna基因的2至3个差异性sgrna。[0802](c)在所述修饰的mirna基因和原始的mirna基因之间的多个差异性限制性酶切位点的列表。[0803]通过geigs的dsrna设计[0804]模型1(所述数个数字对应于图1中的所述数个数字)：[0805]1、所述有害生物基因“x”为所述靶基因(沉默时，所述有害生物为被控制的)[0806]2、通过与有害生物基因“x”(植物基因“x”)的同源性搜索，以鉴定出一宿主相关基因‑x。根据一些实施例，如果所述植物基因x包括至少28nt的至少两个延伸(stretches)，每个延伸与有害生物基因x的所述序列具有至少90％的同源性，则根据模型1来鉴定出所述植物基因x。[0807]3、在数个植物细胞内进行geigs，以将一小rna分子(例如22ntmirna)的所述沉默特异性重定向至宿主相关基因‑x，从而使所述小rna分子作为rdrp介导转录的一扩增器，用于植物基因“x”的所述转录物。[0808]4、经使用geigs(本文也称为“小geigsrna”)重定向其沉默特异性的所述扩增小rna形成与rdrp(扩增酶)相关的一risc复合物。[0809]5、所述rdrp合成对于植物基因“x”的所述转录物的一互补反义rna链，形成一长dsrna。[0810]6、然后，所述长dsrna至少部分被所述数个植物细胞内的(数个)dicer或数个其他核酸酶加工成数个二级srna。在这些二级srna中，所述数个二级srna中的一些的沉默特异性是针对有害生物基因x。[0811]7、所述dsrna也至少部分地被数个有害生物吸收，可能在所述有害生物中被加工成数个srna，如上所述。[0812]8、除了例如产生的数个长dsrna外，可能来自所述数个植物细胞的数个二级srna也被数个有害生物吸收，并也沉默了所述靶基因“x”。[0813]模型2(所述数个数字对应于图2中的所述数个数字)：[0814]1、所述有害生物基因“x”为所述靶基因(沉默时，所述有害生物为被控制的)[0815]2、在数个植物细胞中进行geigs，以将一天然存在的rnai前体的所述沉默特异性重定向至针对所述有害生物基因“x”(例如tas基因；其被扩增成长dsrna并加工成其野生型的数个tasirna)，所述天然存在的rnai前体已知以其野生型形式(即其产生长dsrna)来扩增。所述转录物在图2中标记为“扩增的geigs前体(amplifiedgeigsprecursor)”。根据一些实施例，可与模型2一起使用的一rnai前体是形成长dsrna并加工成数个二级小rna的一rnai前体，例如但不限于加工成一反式作用sirna(tasirna)或一定相小干扰rna(phasirna)的一前体。通过使用一核酸内切酶(例如cas9)以诱导所述基因中的一双链断裂并提供通过使用同源依赖性重组(hdr)进行特异性重定向所需的更改将所述数个核苷酸引入至所述基因的一dna“geigs寡核苷酸”，基因组编辑诱导基因沉默(geigs)是对编码所述rnai前体的所述基因进行的。因此，根据所使用的所述“geigs寡核苷酸”，所述rnai前体的一部分(例如ttas)的所述特异性将改变成靶向有害生物基因x。重定向的所述rnai前体将被所述细胞dicer加工成所述数个二级小rna(例如数个tasirna)，所述数个二级小rna也将匹配所述有害生物基因x。在图2所示的所述范例中，所述数个tasirna中只有一个会被改变，导致一tas被加工成所述数个野生型及改变的tasirna。[0816]3、一野生型扩增小rna形成与rdrp(所述扩增酶)相关的一risc复合物。[0817]4、所述rdrp合成对于所述扩增的geigs前体的所述转录物的一互补反义rna链，形成长dsrna。[0818]5、所述扩增的geigsdsrna在植物细胞中被(数个)dicer或数个其他核酸酶至少部分加工成数个二级srna。在这些二级srna中，与geigs发生位置相对应的所述二级小rna的所述沉默特异性是针对有害生物基因x。[0819]6、未加工的所述数个geig长dsrna中的至少一部分被数个有害生物吸收，可能在所述有害生物中被加工成数个小rna，如上所述。[0820]7、可能在所述数个植物细胞内已经产生的数个二级srna(例如数个tas前体中的数个tasirna)也被所述有害生物吸收，并使所述靶基因“x”沉默。[0821]下面的表1a及表1b提供了可以被数个本方法(特别是模型1)靶向的数个示例性有害生物基因。下面的表2提供了可以被数个本方法(特别是模型2)靶向的数个示例性有害生物基因。表2还提供了建议由geigs(表示为“主干”)靶向的数个rnai前体，例如数个tasrna前体。表2提供了建议的数个小干扰rna(表示为“所需的sirna”)，可以使用geigs将其引入建议的所述骨架，从而使所述骨架能够在所述数个有害生物中被加工成这些sirna，从而影响所述数个靶基因的沉默。[0822]表1a：数个潜在有害生物靶基因的列表及其登录号(包括数个植物同源基因，根据模型1)[0823][0824][0825][0826]表1b：数个潜在有害生物靶基因的列表及其数个登录号[0827][0828][0829][0830]表2：数个潜在有害生物靶基因及其使用geigs进行基于tasirna的沉默的数个范例(每个模型2)[0831][0832][0833][0834][0835][0836][0837][0838]拟南芥及番茄的轰击及植物再生[0839]拟南芥根制备[0840]将经过氯气灭菌的多个拟南芥(cv.col‑0)种子播种在ms减蔗糖(minussucrose)平板上，在4℃的黑暗中催近发育(vernalised)3天，然后在25℃的恒定光照下垂直发芽(germinationvertically)。2周后，将根切成1cm的根段，并置于愈伤组织诱导培养基(callusinductionmedia，cim：1/2ms(含b5维生素)、2％葡萄糖、ph5.7、0.8％琼脂、2mg/liaa、0.5mg/l2，4‑d、0.05mg/l激动素(kinetin))平板上。在25℃的黑暗中培养6天后，将所述多个根段转移至多个滤纸圆盘上，并置于多个cimm平板上(1/2ms(不含维生素)、2％葡萄糖、0.4m甘露醇、ph5.7以及0.8％琼脂)4至6小时，以备于轰击。[0841]番茄外植体制备：[0842]数个番茄种子用商业漂白剂进行表面消毒20分钟，然后在无菌条件下使用无菌水洗涤3次。所述数个种子在发芽培养基(ms 维生素，0.6％琼脂糖，ph＝5.8)上培养并置于25℃下，16/8小时光照/黑暗循环。[0843]将8天大的数个番茄植株的数个子叶切成约1平方公分并置于轰击前培养物(ms 维生素、3％蔗糖、0.6％琼脂糖、ph＝5.8、1mg/lbap、0.2mg/liaa)上在25℃的黑暗中放置2天。然后，将数个外植体转移到一靶板的中心(含有ms 维生素、3％甘露醇、0.6％琼脂糖，ph＝5.8)4小时。[0844]轰击[0845]通过pds‑1000/he粒子递送(bio‑rad；pds‑1000/he系统#1652257)将多个质粒构建体引入至所述根组织，此程序需要进行以下概述的几个制备步骤。[0846]黄金储备制备[0847]将40mg0.6μm金(bio‑rad；cat：1652262)与1ml100％乙醇混合，进行脉冲(pulse)离心成团粒，并去除所述乙醇。将此洗涤程序重复另外两次。[0848]洗涤后，将所述团粒重悬于1ml无菌蒸馏水中，并分配至1.5ml试管(50μl等分试样工作体积)中。[0849]磁珠制备[0850]简而言之，进行以下操作：[0851]一般而言，一单个试管有足够的金轰击2盘的拟南芥根(每盘2发)，因此，每个试管分配在4个(1,100psi)基因枪破裂盘(biolisticrupturedisk)(bio‑rad；cat：1652329)之间。[0852]轰击需要同一样品的多个平板，为了保持样品的一致性并尽量减少整体准备工作，将试管合并，并相应地调整dna和cacl2/亚精胺(spermidine)混合物的体积。[0853]以下方案总结制备一个试管的金的过程，应根据所使用的试管的金的数量进行调整。[0854]所有后续过程均在4℃的一艾本德热混合器(eppendorfthermomixer)中进行。[0855]制备多个质粒dna样品，每个试管包括以1000ng/μl的浓度添加11μgdna。[0856](1)将493μlddh2o添加至1等份(7μl)亚精胺(sigma‑aldrich；s0266)中，最终浓度为0.1m亚精胺。将1250μl2.5mcacl2添加至所述亚精胺混合物中，涡旋振荡(vortexed)并置于冰上。[0857](2)将一试管预先准备好的金置于所述热混合器中，并以1400rpm的速度旋转。[0858](3)将11μldna添加至所述试管中、涡旋振荡并放回旋转的热混合器中。[0859](4)为了结合dna/金粒子，将70μl亚精胺cacl2混合物添加至每个试管中(在所述热混合器中)。[0860](5)将所述多个试管剧烈地涡旋振荡15至30秒，并置于冰上约70至80秒。[0861](6)将所述混合物以7000rpm离心1分钟，去除上清液并置于冰上。[0862](7)向每个试管中添加500μl100％乙醇，并通过移液(pipetting)和涡旋振荡重悬所述团粒。[0863](8)将所述多个试管以7000rpm离心1分钟。[0864](9)去除所述上清液，将所述团粒重悬于50μl100％乙醇中，并保存在冰上。[0865]宏载体(macrocarrier)制备[0866]以下操作是在一层流柜(laminarflowcabinet)中进行：[0867](1)灭菌和干燥多个宏载体(bio‑rad；1652335)、多个停止屏(stoppingscreen)(bio‑rad；1652336)以及多个宏载体磁盘架。[0868](2)将多个宏载体平放至所述多个宏载体磁盘架中。[0869](3)涡旋振荡多个涂覆dna的金混合物并分散(5μl)至每个基因枪破裂盘的中心上。[0870]允许乙醇蒸发。[0871]pds‑1000(氦粒子递送系统)[0872]简而言之，进行以下操作：[0873]将氦气瓶的调节阀调整至至少1300psi的输入(incoming)压力。通过按下vac/vent/hold开关并按住点火(fire)开关3秒产生真空。这确保将氦气排放至管路系统中。[0874]将多个1100psi破裂盘置入异丙醇中并混合以去除静电。[0875](1)将1个破裂盘置入所述磁盘固定盖(diskretainingcap)中。[0876](2)构建微载体发射组件(microcarrierlaunchassembly)(带有一停止屏和一含金微载体)。[0877](3)将拟南芥根愈伤组织有盖培养皿(petridish)置于所述发射组件下方6cm处。[0878](4)将真空压力设置为27英寸汞柱(水银)，并打开氦气阀(约1100psi)。[0879](5)释放真空；移除微载体发射组件和所述破裂盘固定盖。[0880](6)在同一组织上轰击(即每个平板轰击2次)。[0881](7)随后将多个轰击过的根置于25℃的黑暗中的多个cim平板上，再放置24小时。[0882]联合轰击(co‑bombardment)[0883]当轰击多个geigs质粒的多个组合时，将5μg(1000ng/μl)所述sgrna质粒与8.5μg(1000ng/μl)交换质粒混合，并将11μl此混合物添加至样品中。如果同时轰击更多的geigs质粒，则多个sgrna质粒与所使用的多个交换质粒的浓度比例为1∶1.7，并将11μg(1000ng/μl)此混合物添加至所述样品中。如果用与geigs交换不相关的多个质粒联合轰击，则以等比例混合，并将11μg(1000ng/μl)所述混合物添加至每个样品中。[0884]数个col‑0原生质体的转染[0885]数个拟南芥(col‑0)原生质体用编码crispr/cas9的数个载体及一供体模板转染，以实现hdr介导的数个交换(hdr‑mediatedswaps)。所述实验被设计为交换tas1b(attas1b_at1g50055)或tas3a(attas3a_at3g17185)基因中的数个序列，产生靶向上述线虫靶基因中数个30bp序列的数个srna。不希望受理论或机制的束缚，产生靶向所述线虫中数个30bp序列的一长dsrna的基本原理是确保当所述dsrna在线虫中加工成数个二级沉默rna时，即使在数个线虫中所形成的数个二级沉默rna的长度与在所述植物中所形成的数个二级沉默rna的长度不同的情况下产生数个功能性沉默rna。[0886]在所述tas1b基因座中设计了两个交换，在所述tas3a基因座中设计了两个交换。所述互换是相互独立的。所述donor模板(1kb)在数个质粒中合成(由美国twist合成)。[0887]使用一血细胞计数器及trypanblue(约：30μl原生质体、65μlmmg、5μl台盼蓝)测定所述原生质体浓度。所述数个原生质体是导向一2x106个细胞/ml的最终密度的数个稀释或浓缩的原生质体。[0888]对于peg转染，sgrnavector(crispr/cas，sgrna，mcherry):donorvector的摩尔比为1:20，相当于每次转染3.9μgsgrnavector及大约21.61μgdonorvector。向1ml的数个原生质体中缓慢加入1ml的peg溶液。制备新鲜的peg溶液(每5毫升2克peg4000(sigma)、0.2m甘露醇、0.5毫升1mcacl2)。数个试管在室温下避光孵育20分钟，然后加入4ml的w5，并通过倒置来混合数个试管。然后将原生质体离心沉淀重新悬浮在5mlpca(原生质体再生培养基)中以允许细胞分裂，有利于hdr。[0889]细胞分析[0890]质粒递送后24至72小时，收集数个细胞并重悬于d‑pbs培养基中。所述溶液中的一半用于分析荧光素酶活性(analysisofluciferaseactivity)，且一半用于分析小rna测序。根据制造商的说明，使用luciferaseassaysystem(promega,usa)进行双荧光素酶分析(analysisofdualluciferaseassay)。根据制造商的说明，使用总rna纯化试剂盒(norgenebiotekcorp.，加拿大)来提取总rna(totalrna)。进行所述小rna测序以鉴定这些样品中所需的成熟小rna。[0891]拟南芥植物再生[0892]对于芽再生，进行来自valvekens等人的改良方案(valvekens，d.等人，procnatlacadsci，美国，1988年，85(15)：5536至5540)。将轰击过的多个根置于多个幼苗诱导培养基(shootinductionmedia，sim)平板上，其包含1/2ms(含b5维生素)、2％葡萄糖、ph5.7、0.8％琼脂、5mg/l2ip、0.15mg/liaa。将多个平板留在25℃的光照下16小时‑23℃的黑暗中8小时的循环。10天后，将多个平板转移至多个ms平板(含3％蔗糖、0.8％琼脂)上1周，然后转移至多个新鲜的相似平板中。一旦多个植物再生，将它们从所述多个根上切除，并置于多个ms平板(含3％蔗糖、0.8％琼脂)上，直到进行分析。[0893]番茄轰击后培养与植株再生[0894]将轰击的数个外植体在25℃的黑暗中置于ms培养基(ms 维生素、3％蔗糖、0.4％琼脂凝胶、ph＝5.8、1mg/lbap、0.2mg/liaa)上两天。数个外植体被转移至16/8数个光/暗循环，并每2周进行亚培养。将数个再生芽转移至根诱导培养基(ms 维生素、3％蔗糖、2.25％gelrite、ph＝5.8、2mg/liba)。[0895]用水清洗数个生根植物，以取出所有的所述琼脂残留物，并放入及覆盖于土壤中。经过一周的驯化后，逐渐取下盖子，使数个植物变硬。[0896]基因分型(genotyping)[0897]根据制造商的建议，使用菲尔植物直接pcr试剂盒(phireplantdirectpcrkit)(thermoscientific)处理数个组织样品并扩增数个扩增子(amplicon)。用于这些扩增的数个寡核苷酸旨在扩增从所述geigs系统的所述修饰序列中的一区域至用作hdr模板的所述区域之外的所述基因组区域，以区分dna掺入。通过所述扩增子的数个不同酶切模式(由特异性选择的数个限制性内切酶给出)来确认修饰基因座中的数个不同修饰，。[0898]基因组pcr反应[0899]根据制造商的说明，使用rna/dna纯化试剂盒(norgen)处理数个细胞样品(a、b、c、d、e，如下面实施例3中所讨论的)的基因组dna。数个样品通过qubit进行定量，dna储存在‑20℃。[0900]所述交换区侧翼的一非特异性引物用于所述数个tas1b(attas1b_at1g50055)及tas3a(attas3a_at3g17185)序列。作为一阴性对照，使用野生型(wt)dna作为模板进行相同的数个交换特异性反应。作为一阳性pcr对照，对所有样品进行了针对wtdna的一特异性pcr。high‑fidelity2xmastermix用于数个pcr扩增。[0901]在0.8％琼脂糖凝胶上运行5μl的每个pcr反应。数个条带大小通过与分子量标记(mw)比较来估计：1kbplusdnaladder(neb)。[0902]为了确认数个交换，进行了一嵌套pcr反应(nestedpcr)。所述第一基因组pcr包括位于所述hdr区域侧翼的数个非特异性正向及反向引物。数个pcr产物用mili‑q超纯水稀释1/100，然后进行上述数个特异性交换pcr。所述嵌套方法(nestedapproach)中用于第一pcr的数个非特异性引物在所述嵌套引物的所述数个退火位点两侧具有数个退火位点。[0903]使用的数个引物：[0904]tas1b的非特异性引物：[0905]‑tas1b_wt_嵌合式_非_特异性_dna_r:5′‑accaatttgacccaaaaaggc‑3′(seqidno:63)[0906]tas1b的交换特异性引物：[0907]‑tas1b_剪接30_嵌合式_dna_f:5′‑gcagcagatcaatgaaattcaacg‑3′(seqidno:64)[0908]‑tas1b_y2530_嵌合式_dna_f:5′‑agccgcctctgtggattcttg‑3′(seqidno:65)[0909]tas3a的非特异性引物：[0910]‑tas3a_wt_嵌合式_非_特异性_dna_r:5′‑aaactcctcgccctcttggtg‑3′(seqidno:66)[0911]tas3a的交换特异性引物：[0912]‑tas3a_ribo3a30_嵌合式_dna_f:5′‑tcttcagcaccttcaccttacg‑3′(seqidno:67)[0913]‑tas3a_spliceo30_嵌合式_dna_f:5′‑tcctttttgaccaacatttgtttgt‑3′(seqidno:68)[0914]阳性对照反应[0915]wttas1b特异性：[0916]‑tas1b_wt_嵌合式_非_特异性_dna_r:5′‑accaatttgacccaaaaaggc‑3′(seqidno:69)[0917]‑tas1b_wt_嵌合式_dna_f:5′‑tggacttagaatatgctatgttggac‑3′(seqidno:70)[0918]wttas3a特异性：[0919]‑tas3a_wt_嵌合式_非_特异性_dna_r5′‑aaactcctcgcctcttggtg‑3′(seqidno:71)[0920]‑tas3a_wt_嵌合式_dna_f5′‑tctatctctacctctaattcgttcgag‑3′(seqidno:72)[0921]dna和rna分离[0922]将多个样品收集至液氮中，并保存在‑80℃中直至进行加工。使用塑料组织研磨器研杵(tissuegrinderpestle)(axygen，美国)在置于干冰中的多个试管中进行组织研磨。根据制造商的指示，使用rna/dna纯化试剂盒(cat.48700；norgenbiotekcorp.，加拿大)从磨碎的组织中分离dna和总rna。在所述rna部分为低260/230比例(＜1.6)的情况下，分离的rna用1μl糖原(glycogen)(cat.10814010；invitrogen，美国)10％v/v乙酸钠、3mph5.5(cat.am9740，invitrogen，美国)以及3倍体积的乙醇在‑20℃下沉淀过夜。将所述溶液在4℃下以最大速度离心30分钟。随后用70％乙醇洗涤2次，风干15分钟，并重悬于无核酸酶的水(cat.10977035；invitrogen，美国)中。[0923]rna提取[0924]根据制造商的说明，使用一rna/dna纯化试剂盒(norgen)处理数个细胞样品(a、b、c、d、e，如下面的实施例3中所述)以进行rna纯化。通过qubit来量化数个样品。rna储存于‑80℃。[0925]rna样品的dna酶处理[0926]使用rt‑pcr反应及随后的pcr来特异性寻找包括所述交换(<200bp)的数个小dsrna片段，以证明能够靶向数个线虫靶基因的dsrna的所述生物发生。为此，根据制造商的说明使用turbodna‑freekit(invitrogen)。进一步进行dnase处理并标准化样品浓度。[0927]反转录(reversetranscription，rt)和定量实时pcr(quantitativereal‑timepcr，qrt‑pcr)[0928]根据制造商的手册(ampd1；sigma‑aldrich，美国)，用dnasei处理1微克分离的总rna。所述样品按照高容量cdna反转录试剂盒(high‑capacitycdnareversetranscriptionkit)(cat.4368814；appliedbiosystems，美国)的指导手册进行反转录。[0929]对于基因表达，根据制造商的方案，在cfx96touchtm实时pcr检测系统(biorad，美国)和greenjumpstarttmtaqreadymixtm(s4438，sigma‑aldrich，美国)上进行定量实时pcr(qrt‑pcr)分析，并用bio‑radcfx管理程序(managerprogram)(3.1版)进行分析。[0930]数个rna样品的rt‑pcr，用于数个col‑0细胞中的数个tas1b及tas3a交换的表达分析[0931]对于rt‑pcr，通过qscriptflexcdna合成试剂盒(quantabiosciences)使用tas1b及tas3a的数个非特异性引物生成cdna。对所述有义链进行一次cdna反应，对tas1b及tas3a的所述反义链进行另一次反应。数个待处理的样品含有165ng/μlrna。[0932]对于所有rt‑pcr反应(相同处理，但使用h2o代替反转录酶)，使用没有反转录酶(‑rt对照)的阴性对照。这是为了确保下游pcr反应中的扩增不会因为dna残留而发生。对每个pcr反应进行一水阴性对照。每种处理的 rt/‑rt用rna制备一主混合物。制作了额外的预混液—(i)使用反转录酶及缓冲液( rt)及(ii)水及缓冲液(‑rt)用于所有样品。最终引物浓度：1μm。[0933]引物：[0934]tas1b[0935]‑tas1b有义：[0936]tas1b_rt_a_r:5′‑taacataaaaatattacaaatatcattccg‑3′(seqidno:93)[0937]‑tas1b反义：[0938]tas1b_rt_b_f:5′‑tcagagtagttatgattgataggatgg‑3′(seqidno:94)[0939]这些引物是用于处理a、b及e。[0940]tas3a[0941]‑tas3a有义：[0942]tas3a_rt_a_r:5′‑gctcaggagggatagacaagg‑3′(seqidno:95)[0943]‑tas3a反义：[0944]tas3a_rt_b_f:5′‑ctcgttttacagattctattctatctc‑3′(seqidno:96)[0945]这些引物是用于处理c、d及e。[0946]对cdna进行pcr以检测重定向至数个线虫靶标的tas1b及tas3a的表达[0947]为了检测从已重定向至数个靶线虫基因的tas1b或tas3a基因转录的dsrna，使用所述cdna作为一模板进行数个pcr反应，其中使用一个针对tas3a或tas1b的非特异性引物及另一个交换特异性(即仅结合在geigs介导的重定向后交换了数个核苷酸的相关tas序列)的引物。非特异性引物退火位点(unspecificprimerannealingsite)位于用于制备cdna的所述序列的稍下游。特异性引物退火位点(specificprimerannealingsite)位于距所述非特异性引物退火位点小于200bp的下游。分析dsrna两条链的表达的方法是相同的：有义(sense)及反义(antisene)。还对‑rtcdna反应进行了数个反应，以确保dnase处理后样品中的残留dna不会发生扩增。作为一阴性对照，每个反应也在wtdna上进行，以证明所述扩增是swap特异性的(swapspecific)。每个pcr反应都包括一个h2o阴性对照。5ul的每个cdnapcr反应用作模板。[0948]引物：[0949]tas3asense有义链特异性反应：[0950]‑核醣体蛋白3a特异性：[0951]tas3a_rna_非_特异性_a_f:5′‑tgaccttgtaagaccccatctc‑3′(seqidno:97)[0952]tas3a_rna_ribo3a30_特异性_a_r:5′‑aggagaaaattcgtaaggtgaagg‑3′(seqidno:98)[0953]‑wt特异性：[0954]tas3a_rna_非_特异性_a_f:5′‑tgaccttgtaagaccccatctc‑3′(seqidno:99)[0955]tas3a_rna_wt_特异性_a_r:5′‑ggtaggagaaaatgactcgaacg‑3′(seqidno:100)[0956]tas3a反义链特异性反应：[0957]‑核醣体蛋白3a特异性：[0958]tas3a_rna_非_特异性_b_r:5′‑caaccatacatcaataacaaacaaaag‑3′(seqidno:101)[0959]tas3a_rna_ribo3a30_特异性_b_f:5′‑atatagaatagatatcggcttcttcag‑3′(seqidno:102)[0960]‑wt特异性：[0961]tas3a_rna_非_特异性_b_r:5′‑caaccatacatcaataacaaacaaaag‑3′(seqidno:103)[0962]tas3a_rna_spliceo30_特异性_b_f:5′‑tcctttttgaccaacatttgtttgt‑3′(seqidno:104)[0963]tas1b有义链特异性反应：[0964]‑y25，copi复合物特异性的β亚基：[0965]tas1b_rna_非_特异性_a_f:5′‑gagtcattcatcggtatctaacc‑3′(seqidno:105)[0966]tas1b_rna_y2530_特异性_a_r:5′‑agccgcctctgtggattcttg‑3′(seqidno:106)[0967]‑wt特异性：[0968]tas1b_rna_非_特异性_a_f:5′‑gagtcattcatcggtatctaacc‑3′(seqidno:107)[0969]tas1b_rna_wt_特异性_a_r:5′‑tggacttagaatatgctatgttggac‑3′(seqidno:108)[0970]tas1b反义链特异性反应：[0971]‑y25，copi复合物特异性的β亚基：[0972]tas1b_rna_非_特异性_b_r:5′‑gcatatcctaaaatatgtttcgttaac‑3′(seqidno:109)[0973]tas1b_rna_y2530_特异性_b_f:5′‑tcgccaagaatccacagagc‑3′(seqidno:110)[0974]‑wt特异性：[0975]tas1b_rna_非_特异性_b_r:5′‑gcatatcctaaaatatgtttcgttaac‑3′(seqidno:111)[0976]tas1b_rna_wt_特异性_b_f:5′‑taagtccaacatagcatattctaagtc‑3′(seqidno:112)[0977]本氏烟草长dsrna对tumv沉默活性的研究[0978]植物材料[0979]nicotianabethamiana在长日条件下(16小时光照，8小时黑暗)在21℃下在土壤上生长4周直至处理。[0980]tumv‑gfp载体克隆[0981]tumv‑gfpcdna盒是从a.等人(a.，sánchez,f.，fereres,a.及ponz,f.，2008年)中所述的载体中扩增出来的。一生物安全病毒载体(biosafeviralvector)的数个外源蛋白的高表达是来自芜菁花叶病毒(turnipmosaicvirus)。西班牙农业研究杂志(spanishjournalofagriculturalresearch)，6(s1)，第48页)。使用引物组5'‑atgtttgaacgatcgggcccaagggacacgaagtgatccg‑3'(seqidno:113)及5'‑ctccaccatgttcccgggggcacagagtgttcaacccc‑3'(seqidno:114)进行扩增。根据制造商的方案，通过融合反应将所述扩增子克隆至含有nptii抗性基因的一二元载体(binaryvector)中，位于t‑dna区域。为了农杆菌浸润(agrobacteriuminfiltration)的目的，随后将所述载体转化至农杆菌菌株(agrobacteriumstrain)gv3101中。[0982]农杆菌诱导(agroinduction)及叶浸润(leafinfiltration)[0983]1、农杆菌的液体培养是在lb中生长。[0984]2、将数个细胞离心并用mma培养基(10mmmes、10mmmgcl2及200μm乙酰丁香酮，ph＝5.6)洗涤一次。[0985]3、将数个细胞离心并取出所述子细胞(sub)。将颗粒重悬在mma培养基中至od600＝0.5。[0986]4、培养物在黑暗中轻轻摇晃6小时。[0987]5、根据需要，以组合数个培养物(含有数个不同载体的细菌之间的比例为1:1，每种农杆菌含有表达一单一基因的一载体)。最终总农杆菌密度‑od600＝0.5。将tumv‑gfp载体添加至od600＝0.0001的一最终密度。[0988]、用一无针注射器将所述数个诱导培养物渗入4周龄的一本氏烟草植物的数个叶子。[0989]用于geigs‑dsrna沉默的数个基因序列[0990]‑attas1b(at1g50055)–seqidno:115[0991]‑geigs‑tumv–seqidno:116[0992]‑geigs‑tumv‑成熟sirna–seqidno:117[0993]‑geigs‑虚拟–seqidno:118[0994]‑geigs‑虚拟‑成熟sirna–seqidno:119[0995]‑mir173_at3g23125–seqidno:120[0996]‑mir173‑成熟mirna–seqidno:121[0997]拟南芥对tumv感染及疾病的保护研究[0998]植物材料[0999]从含有所需geigs序列的数个植物中收集的数个拟南芥种子进行氯气消毒，并以1粒种子/孔播种在数个ms‑s琼脂平板中。将两周大的数个幼苗转移至土壤中。数个植物在24℃下于数个16小时光照/8小时黑暗循环下生长。未修饰(数个植物)的野生型平行地生长及处理(grownandtreatedinparallel)，作为对照。[1000]植物接种与分析[1001]用于数个tumv载体的所述接种及分析植物的数个程序在本领域中已经很好地被建立且先前已经描述于[sardaru,p.etal.,molecularplantpathology(2018),19:1984‑1994]。4周龄的所述拟南芥幼苗，如前所述[sánchez,f.等人，1998年，virusresearch,55(2):207至219]来接种tumv，或如前所述[a.等人，2008年，西班牙农业研究杂志(spanishjournalofagriculturalresearch)，6(s1)，第48页]接踵tumv‑gfp，以表达数个病毒载体。在tumv的情况下，症状评分发生在接种后10至28天。在tumv‑gfp的情况下，gfp信号的分析发生在接种后7至14天。[1002]此外，接种后14天，收获生长在所述接种部位上方的数个新叶，并根据制造商的说明，使用总rna纯化试剂盒(norgenebiotekcorp.，加拿大)来提取总rna。进行小rna分析及rna测序(rna‑seq)，以分析这些样品的基因表达及小rna表达。[1003]番茄感染粉虱的研究[1004]植物材料[1005]数个番茄植物是生长来自收集自含有所需geigs序列的数个植物的数个种子中，每盆中的一株植物是在22℃下于数个16小时光照/8小时黑暗循环。未修饰(数个植物)的野生型平行地生长及处理(grownandtreatedinparallel)，作为对照。[1006]粉虱接种[1007]五只雌性粉虱被引入至一4周龄的番茄植株中。所述数个粉虱被放置在一个夹着一片叶子的笼子里。5天后，对死亡及存活的数个粉虱以及数个卵进行计数。[1008]此外，接种后5天，收获所述受感染的叶子，并提取总rna。死亡及存活的粉虱是分开收集的，并从中提取总rna。进行小rna分析及rna测序(rna‑seq)，以分析这些样品的基因表达及小rna表达。[1009]靶向一线虫基因的dsrna研究[1010]线虫[1011]数个植物寄生包囊线虫(plant‑parasiticcystnematodes)globoderarostochiensis(病理型ro1，从jameshuttoninstitute收藏中获得)在剑桥大学根据defra许可125034/359149/3保存。数个线虫保持在马铃薯栽培品种désirée(solanumtuberosumcultivardésirée)上。将50个囊肿与沙子：壤土的一50:50混合在一个7英寸直径的盆中。每盆种植一个块茎，并在20℃下定期浇水3个月。使植物干燥1个月，然后使用浮选法(flotation)及随后的嵌套筛分(nestedsieving)来从土壤中收集孢囊。通过与番茄根扩散液一起孵化，以从所述包囊中孵化出数个幼体，每2至3天更换一次，持续长达14天。孵化的数个幼体在4℃下存储在含有0.01％tween‑20的水中长达1周，然后用于数个后续分析。[1012]所使用的数个序列[1013]‑attas3a_at3g17185–seqidno:122[1014]‑geigs‑核醣体蛋白3a‑转录物‑seqidno:123[1015]‑geigs‑核醣体蛋白3a‑转录物‑seqidno:124‑表示与通过geigs设计所产生的所述靶基因同源的区域，以在数个线虫中产生sirna(即所述预期的加工sirna)[1016]‑geigs‑剪接体sr蛋白转录物‑seqidno:125[1017]‑geigs‑剪接体sr蛋白转录物‑seqidno:126‑表示与通过geigs设计所产生的所述靶基因同源的区域，以在数个线虫中产生sirna(即预期的加工sirna)[1018]‑mir390_at2g38325–seqidno:127[1019]用于喂养的rna制备[1020]使用tri‑reagent(sigma‑aldrich，美国)提取渗透的数个本氏烟草叶片(n.benthamianaleaves)的总rna，使用两次氯仿洗涤，并在异丙醇中过夜沉淀。回收的rna使用标准醋酸钠沉淀进一步清洗。[1021]根据制造商的说明，使用ultra0.5mlcentrifugalfilters3kdcutoff(merck，美国)清洗所有回收的rna，并用ddw清洗3次。使用nanodrop对rna进行定量。[1022]线虫喂养协议[1023]rna在1xm9及50mm章鱼胺(octopamine)中稀释至1.76μg/μl。每次重复将3500个j2在1.5mleppendorf中沉淀至大约5μl的体积。将25μlrna溶液加入线虫中，并在20℃下在一加热块中孵育，并以300rpm的速度旋转(最终rna浓度为1.47μg/μl)。72小时后，通过旋转线虫(10kg1分钟)进行洗涤，去除上清液。使用500μl无rnas酶的水重复洗涤3次。颗粒在液氮中快速冷冻并保持在‑80℃直至处理。[1024]线虫rna提取及纯化[1025]根据制造商的建议，使用direct‑zolrnaminiprep：zymoresearchcat.编号r2052来进行rna分离。[1026]使用一微管杵，将所述数个冷冻(液氮或干冰)组织样品(≤25毫克)在eppendorf中粉碎至粉末，然后将600μltri试剂添加到样品中并继续研磨直至完全均质。然后在室温下进行以下步骤并以10,000‑16,000xg离心30秒，除非另有说明：[1027]1、将等体积的乙醇(95‑100％)添加到在tri试剂或类似试剂中裂解的一样品中，并充分混合。[1028]2、将所述混合物转移到一收集管中的一zymo‑spintmiicrcolumn2中并离心。将所述管柱转移到一新的收集管中并丢弃流过的所述液体。[1029]3、dnasei处理在管柱内进行[1030](3a)将400μlrnawashbuffer添加到管柱中并离心。[1031](3b)在不含rnase的管中，加入5μldnasei(6u/μl)及75μldna消化缓冲液并混合。将所述混合物直接添加到所述管柱矩阵(columnmatrix)中。[1032](3c)在室温(20‑30℃)下孵育15分钟。[1033]4、将400μldirect‑zoltmrnaprewash添加到所述管柱中并离心。丢弃流出的所述液体并重复所述步骤。[1034]5、将700μlrnawashbuffer添加到所述管柱中，离心2分钟以确保完全去除洗涤缓冲液。将所述管柱小心地转移到不含rnase的管中。[1035]6、为了洗脱rna，将30μl不具有dna酶/rna酶的水直接加入所述管柱矩阵中并离心。[1036]7、使用nanodrop分光光度计/荧光计或qubit荧光计对rna进行定量，rna可能是立即使用的，或是冷冻保存在≤‑70℃下。[1037]qrtcdna文库制备[1038](quantabioscience：qscriptflexcdna合成试剂盒)[1039]1、将所有成分(不含酶)解冻、充分混合、离心(使用前)，并置于冰上(使用前)。[1040]2、将以下物质加入置于冰上的一0.2ml薄壁pcr管或96孔pcr反应板中：[1041]3、成分[1042][1043][1044](注意：对于一混合引物策略，使用2μloligodt。对于多个第一链反应，使用所述反应混合物和rt制备一主混合物，并以5μl分配到每个管中)。[1045]4、通过温和涡旋(gentlevortexing)来混合数个成分，然后离心10秒以收集数个内容物。[1046]5、在65℃下孵育5分钟，然后在冰中快速冷却。[1047]6、将下列物质添加至所述主rna模板混合物：[1048]成分体积qscriptflex反应混合(5x)4μlqscript反转录酶1μl总体积20.0μl[1049](注意：对于多个第一链反应，使用所述反应混合物和rt制备一主混合物，并以5μl分配到每个管中)。[1050]7、通过温和涡旋(gentlevortexing)来混合数个成分，然后以下述步骤培育：在42℃下60分钟、在85℃下5分钟、在4℃下保持。[1051]8、cdna合成完成后，再加入一额外的30μldh2o或te缓冲液[10mmtris(ph8.0)，0.1mmedta]，使用2μl至3μl进行数个20μlqrtpcr反应。cdna可以储存在‑20℃。[1052]sybrgreenjumpstarttaqready反应方案[1053]1、使用前将所有成分(酶除外)解冻、充分混合、离心。使用前置于冰上。[1054]2、将以下物质加入置于冰上的一0.2ml薄壁pcr管或96孔pcr反应板中：[1055]成分体积2xsybr主混合10μl特异性正向引物(10um)1μl特异性反向引物(10um)1μlcdna模板2μl至3μl无核酸酶dh2o可变的总体积20μl[1056]3、以下述步骤培育数个样品：在94℃下2分钟、在94℃下15秒、在55℃至60℃下60秒，35个至40个周期读取sybr信号。熔化曲线(meltingcurve)：95℃‑>65℃，在20℃下每个周期从连续收集信号；65℃‑>95℃每0.2秒。对于所述感兴趣的基因和所述内源性校准物，以技术性三次重复进行反应。[1057]引物序列[1058]‑剪接体sr蛋白：[1059]qrtspsr_fwdgctcaactgacaaagaatctctcac–seqidno:128[1060]qrtspsr_revttgaaaattgggtcaaagaaatgcg–seqidno:129[1061]‑核醣体蛋白3a：[1062]qrtrib3a_fwdgaacggtcgctacgattacga–seqidno:130[1063]qrtrib3a_revcaaacgctctgttgaacaggc–seqidno:131[1064]‑用于标准化的内源基因：[1065]nemaactin_09251_fttccagcagatgtggatcag–seqidno:132[1066]nemaactin_09251_rcggccttattcttcaagcac–seqidno:133[1067]数个生物信息学分析材料‑[1068]fastq格式的小rna原始数据使用具有数个参数“‑m18‑u4‑annnntggaattctcgggtgccaagg”(seqisno:138)的cutadapt2.8来处理，以修剪所述测序适配器，移除所述数个随机适配器，并仅保持长于18nt的数个读取。fastq格式的rna‑seq原始数据使用具有参数“‑m18‑aagatcggaagagcacacgtctgaactccagtca‑aagatcggaagagcgtcgtgtagggaaagagtgt”(seqisno:139)的cutadapt2.8来处理，以去除数个测序适配器，并保持长于18nt的数个读取。[1069]通过使用具有数个参数“‑‑genomesaindexnbases3”的star版本2.7.1a的所述数个靶序列所组成的一伪基因组来创建一比对索引，以容纳所述小伪基因组。[1070]将数个小rna适配器修剪读取(small‑rnaadapter‑trimmedreads)与使用具有数个参数“‑‑outsamtypebamunsorted‑‑outfiltermismatchnmax0‑‑alignintronmax1‑‑alignendstypeendtoend‑‑scoredelopen‑10000‑‑scoreinsopen‑10000”的star2.7.1a的伪基因组来进行比对。数个rna‑seq适配器修剪读取使用具有数个参数“‑‑outsamtypebamunsorted‑‑alignendstypeendtoend‑‑alignintronmax500”的相同资源进行比对。[1071]使用自定义python脚本将比对的数个小rna读取过滤到长度在20个至24个核苷酸之间，并将数个rna‑seq读取过滤到长度大于50个核苷酸。[1072]使用具有数个参数“genomecov‑bg‑scale{factor}”的bedtools2.29.2来计算针对所述数个靶序列的读取覆盖率，其中计算所述因子以将读取计数标准化为每百万读取(rpm)。[1073]使用适用于r版本1.25.0的所述sushi包来产生数个覆盖图。[1074]范例1a[1075]基因组编辑诱导基因沉默(geigs)[1076]为了设计多个geigs寡核苷酸，需要对多个模板非编码rna分子(多个前体)进行加工，并引起衍生出多个小沉默rna分子(多个成熟体(mature))。多个前体的两个来源及其相应的成熟序列用于产生多个geigs寡核苷酸。对于多个mirna，多个序列是从所述mirbase数据库中获得(kozomara，a.和griffiths‑jones，s.，nucleicacidsres，2014年，42：d68，)。多个tasirna前体和多个成熟体是从所述tasirnadb数据库中获得(zhang，c.等人，bioinformatics，2014年，30：1045，)。[1077]在多种宿主生物中选择多个沉默靶(数据未显示)。使用所述sirnarules软件(holen，t.，rna，2006年，12：1620，)设计针对这些靶的多个sirna。这些sirna分子中的每一个用于替换在每个前体中存在的所述多个成熟序列，从而产生多个“缺乏经验的(naive)”geigs寡核苷酸。使用所述viennarnapackagev2.6(lorenz，r.等人，viennarnapackage2.0，algorithmsformolecularbiology，2011年，6：26)将这些缺乏经验的序列的结构调整至尽可能接近所述野生型前体的结构。调整所述结构后，计算在所述野生型的寡核苷酸和所述修饰的寡核苷酸之间的多个序列的数量和二级结构的变化。这些计算对于鉴定多个潜在功能性的geigs寡核苷酸至关重要，所述多个寡核苷酸相对于所述野生型需要最低程度的序列变化。[1078]使用所述casot软件(xiao，a.等人，bioinformatics，2014年，30：1180，)产生针对所述多个野生型前体的多个crispr/cas9小引导rna(sgrna)。选择多个sgrna，其中用于产生所述geigs寡核苷酸的所述修饰会影响所述sgrna的所述pam区域，使其对所述修饰的寡核苷酸无效。[1079]范例1b[1080]内源性植物基因的基因沉默‑pds[1081]为了建立一高通量筛选以使用基因组编辑诱导的基因沉默(geigs)定量评估内源性基因沉默，本发明人考虑了几种潜在的视觉标记。本发明人选择集中于涉及色素积累的多个基因，例如，用于编码八氢番茄红素去饱和酶(phytoenedesaturase，pds)的基因。pds沉默会导致光致漂白(图8b)，这使得可以使用其在基因编辑后作为概念验证(proof‑of‑concept，poc)用作可靠的幼苗筛选。图8a至8c示出了对本生烟(n.benthamiana)和拟南芥(arabidopsis)植物进行pds沉默的一代表性实验。多个植物示出在具有少量类胡萝卜素的多个植物中观察到的特征性光致漂白表型。[1082]在所述poc实验中，选择多个sirna的步骤如下：[1083]为了使用geigs应用启动在拟南芥或本生烟中针对所述pds基因的所述rnai机制，需要鉴定靶向pds的有效的21至24bpsirna。为了找到多个活性的sirna序列，使用了两种方法：(1)筛选文献：由于pds沉默在许多植物中是一众所周知的测定方法，因此本发明人正在不同植物中鉴定多个特征化良好的短sirna序列，这些序列可能与拟南芥或本生烟中的所述基因100％匹配。(2)有许多公开的算法正在用来预测哪种sirna将对一特定基因启动基因沉默。由于这些算法的所述多个预测不是100％，因此本发明人仅使用了至少两种不同算法的结果的序列。[1084]为了使用沉默所述pds基因的多个sirna序列，本发明人正在使用所述crispr/cas9系统将它们与一已知的内源性非编码rna基因序列交换(例如，改变一mirna序列、改变一长dsrna序列、产生反义rna、改变trna等)。有许多特征化的非编码rna的数据库，例如，mirna；本发明人正在选择几种已知的拟南芥或本生烟的多个内源性非编码rna，例如，具有不同表达模式的多个mirna(例如，低构成性表达(constitutiveexpression)、高表达、应激诱导等)。例如，为了将所述内源性mirna序列与靶向所述pds基因的sirna交换，本发明人正在使用所述hr方法(同源重组(homologousrecombination))。使用hr，可以考虑两种选择：使用大约250至500nt的一供体ssdna寡核苷酸序列，其例如包含在中间的所述修饰的mirna序列，或使用携带1kb至4kb插入物的多个质粒，其与在所述植物基因组中附近的所述mirna几乎100％相同，除了2x21bp的所述mirna和所述*mirna改变为所述pds的所述sirna(在所述sirna上下游500至2000bp，如图7中所示)以外。所述转染包含以下多个构建体：用于追踪和富集多个阳性转化细胞的crispr：cas9/gfp传感器，引导所述cas9以产生一双链断裂(dsb)(通过取决于所述插入载体/寡核苷酸的hr来修复)的多个grna。所述插入载体/寡核苷酸含有围绕所述靶向的基因座的两个连续的同源性区域，所述多个区域被替换(即，mirna)并被修饰以携带所述感兴趣的突变(即，sirna)。如果使用质粒，则靶向的构建体包括或不包括多个限制性酶识别位点(restrictionenzymes‑recognitionsite)，并且用作一同源重组的模板，以所述选择的sirna替换所述mirna结束。转染至多个原生质体后，facs用于富集cas9/sgrna转染的事件，多个原生质体再生为多个植物，并对多个漂白的幼苗进行筛选和评分(见图5)。作为对照组，多个原生质体用携带一随机非pds靶向序列的一寡核苷酸转染。所述多个阳性编辑的植物预期产生靶向pds的多个sirna序列，因此，与没有grna的所述对照组相比，pds基因被沉默，幼苗被视为白色。需要注意的是，所述交换后，所述编辑的mirna仍将作为mirna被加工，因为保留了所述原始的碱基配对外形。然而，所述新编辑的经加工mirna与所述靶具有很高的互补性(例如，100％)，因此，实际上所述新编辑的小rna将作为sirna。[1085]范例1c[1086]拟南芥植物对tumv病毒感染的抗性[1087]所述拟南芥基因组的数个改变被设计成在功能性失调的数个非编码rna中引入沉默特异性，以靶向所述萝卜花叶病毒(turnipmosaicvirus，tumv)。这些序列(连同所述基因组位点的所述内容中的数个延伸同源臂)被引入至puc57载体，命名为donor。数个引导rna被引入至crispr/cas9载体系统，以便在所需基因座中产生一dna剪切(dnacleavage)。所述crispr/cas9载体系统通过基因轰击协议(genebombardmentprotocol)与所述donor载体共同引入至植物，以通过同源dna修复(hdr)引入所需的数个修饰。[1088]通过基因分型来确定它们的基因组中具有所需的数个改变的数个拟南芥幼苗，并接种带有tumv或tumv‑gfp的农杆菌，并对病毒反应进行评分。[1089]范例2[1090]番茄植株对粉虱感染(whiteflyinfestation)的抗性[1091]根据所述geigs2.0流程(在上面的“一般材料及实验程序”部分所讨论的)，所述番茄基因组的所述改变旨在产生数个非编码rna，以靶向粉虱中的所述必需基因。这些序列(连同所述基因组位点的所述内容中的数个延伸同源臂)被引入至puc57载体，命名为donor。数个引导rna被引入至crispr/cas9载体系统，以便在所需基因座中产生一dna剪切。这些是通过基因轰击协议与所述数个donor载体而共同引入至植物，以通过同源dna修复(hdr)引入所需的数个修饰。通过基因分型(genotyping)来确定具有所需基因组改变的数个番茄植株被引入至数个粉虱中并进行反应评分。[1092]范例3[1093]使用geigs对拟南芥原生质体中的反式激活沉默rna[1094]为了证明当使用geigs重定向tasirna的所述沉默特异性时的数个植物细胞中的同源依赖性重组(hdr)事件，使用表达所述crispr/cas9内切核酸酶、用于导致一dna断裂的一sgrna及一“供体”序列(也称为geigs供体)的数个载体在数个拟南芥原生质体中进行一转染测定，以通过geigs(在本文中也称为“交换”)引入所需的数个核苷酸改变。所述供体序列包括对应于具有所需的所述数个核苷酸改变的所述靶序列的一序列，两侧是数个同源臂(所述数个改变序列上游及下游约500个碱基对)，以促进所述hdr。[1095]geigs方法基本上是根据上文及wo2019/058255(通过引用并入本文)中描述的原理，并在下文中举例说明。简而言之，当包括所述geigs供体的一载体与一内切核酸酶(例如一cas9及靶向所述待编辑基因的一sgrna)一起引入至一细胞时，所述geigs‑oligo序列被引入至所述细胞的所述基因组(由hdr介导)，这样编辑的所述基因现在包括所需的数个改变(例如，编码可以转录为一长dsrna的一tas基因，其沉默活性已被重定向至一选择的目标)。[1096]两种基因被用作这种操作的数个骨架，都编码数个反式作用sirna(tas)产生分子—tas1b及tas3a(参见下文)。选择使用geigs引入的所述数个改变，使得它们产生长dsrna及小二级tasirna，所述长dsrna及小二级tasirna将会靶向及沉默所述线虫globoderarostochiensis中的数个必需基因。这些靶基因是根据之前的出版物选择的，这些出版物讨论了使用一rnai技术靶向所述数个基因时对一线虫的负面影响(参见下面的表3)。由于这些基因是在不同的线虫品系中鉴定的，它们的同源物是通过一blast搜索在globoderarostochiensis公开可用数据库(www(dot)parasite(dot)wormbase(dot)org/globodera_rostochiensis_prjeb13504/info/index/中鉴定的，使用选择的所述数个基因作为数个查询。[1097]表3‑线虫中的数个靶基因[1098][1099][1100]在所述数个基因序列中选择的数个sirna靶位点在所述下列序列中描述：[1101]gros_g05960:tggagcagcagatcaatgaaattcaacgac(seqidno:59)[1102]gros_g04462：attcgtaaggtgaaggtgctgaagaagccg(seqidno:60)[1103]gros_g04863：aaaaacaaacaaatgttggtcaaaaaggat(seqidno:61)[1104]gros_g00263：ccgctctgtggattcttggcgaatattgcg(seqidno:62)[1105]col‑0原生质体的转染[1106]如上所述，拟南芥(col‑0)原生质体用编码crispr/cas9及sgrna的一载体及包括一供体模板的一载体来转染，以实现hdr介导的数个交换(hdr‑mediatedswaps)。所述实验被设计成使得所述tas1b(attas1b_at1g50055)或tas3a(attas3a_at3g17185)数个基因中的数个序列被交换，产生长dsrna及数个小二级rna，它们靶向上述数个线虫靶基因中的数个30bp序列。在所述tas1b基因座中设计了两个交换，在所述tas3a基因座中设计了两个交换。数个交换是彼此独立的。[1107]在不同实验条件下使用的各种载体组合列于下表4中。使用了数个tas骨架及数个供体寡核苷酸的数个不同组合。在没有dna的情况下进行数个阴性对照转染(处理e)。[1108]表4–数个实验条件[1109][1110][1111]数个col‑0细胞中的tas1b及tas3a交换的基因组证据[1112]预计只有一小部分的数个转染细胞能够使用一hdr供体模板成功地修复dna双链断裂，从而产生一交换。如本领域众所周知的，这是由于数个hdr事件的所述低频率。因此，即使是所述转染样品也预期包括一大量未发生交换的数个细胞。[1113]为了证明所有加工过的所述数个样品都适用于pcr扩增，在从所有的处理(a至e)中获得的基因组dna上使用数个wt特异性引物来进行数个pcr反应。所述正向引物被设计成与预期发生数个交换的所述区域退火，而所述反向引物被设计成在所述重组位点的下游进一步退火(图9a，数个引物以数个箭头表示，预期的所述pct产物以一虚线绘示)。一引物组是针对wttas1b所设计的，另一组是针对wttas3a所设计的。针对wttas1b、y25及数个剪接因子交换处理(wt＝处理e)，获得了预期的所述数个pcr产物(594bp长)。以一类似的方式，针对wttas3a、核醣体蛋白3a及剪接体sr蛋白交换处理，获得了预期的所述数个pcr产物(574bp长)。正如所预期的(水，无模板)，数个阴性对照没有获得扩增(图9b至c)。[1114]然后使用在所述重组位点下游进一步退火的相同非特异性反向引物(wttas1b的一非特异性引物及wttas3a的一不同引物)及一交换特异性正向引物(图9a)进行数个特异性pcr反应。作为所述pcr反应特异性的一对照，wtdna用于每个引物对的一阴性对照(图9e至f)。对于tas1b的y25(587bp长)及剪接因子(584bp长)交换处理，获得了预期的所述数个特异性pcr产物。以一类似的方式，针对核醣体蛋白3a(568bp长)及剪接体sr蛋白(574bp长)交换处理，获得了预期的所述数个特异性pcr产物(图9d至e)。当wtdna用作所有pcr反应的一模板时，没有获得扩增，进一步证明了数个交换特异性引物的所述特异性。此外，正如所预期(水，无模板)，数个阴性对照没有获得扩增。[1115]使用所述非特异性反向引物对数个粗pcr产物进行进一步sanger测序(eurofins)。使用snapgene软件分析数个测序结果。预计会在所述数个特定引物结合位点之前检测由所述数个hdr交换而引入(而不是由所使用的所述数个引物而引入)的一些突变。数个测序反应证实了此数个突变的所述身份及位置。所述数个wt特异性产物也被发送至同时用于tas1b及tas3a的测序，遵循一类似的方法，也可以确认数个wt序列的身份(图9f)。数个结果证实了数个sgrna向导是有活性的，并且所有处理都发生了数个hdr交换，包括tas1b及tas3a基因座以及使用不同的供体寡核苷酸。[1116]当遵循一嵌套式pcr方法时获得了数个类似结果，其中在使用与所述主要方法相同的数个引物组执行一嵌套式特异性pcr反应之前进行一非特异性pcr反应。[1117]基因组pcr[1118]使用一rna/dna纯化试剂盒(如上所述)加工数个细胞样品(a、b、c、d、e)的基因组dna。[1119]如上所述，将所述交换区侧翼的一非特异性引物用于所述数个tas1b(attas1b_at1g50055)及tas3a(attas3a_at3g17185)序列。作为一阴性对照，使用作为模板的野生型(wt)dna进行相同的数个交换特异性反应。预期没有扩增。作为一阳性pcr对照，对所有样品进行了针对wtdna的一特异性pcr。[1120]还采用了一类似的替代方法来确认数个交换。进行了一嵌套式pcr反应(nestedpcrreaction)，而不是一单一pcr反应。所述第一基因组pcr包括位于所述hdr区域侧翼的数个非特异性正向及反向引物。用于所述嵌套式方法中的所述第一pcr的数个非特异性引物在所述数个嵌套式引物的所述退火位点侧翼具有数个退火位点。[1121]数个基因及数个序列[1122]下面的表5列出了(对于tas骨架及线虫靶基因的每个组合)所述geigs供体内的所述geigs‑oligo的所述区域，包括预期的所述数个交换，并将产生将靶向所述线虫中的所述基因的所述sirna。下面列出了所述数个野生型tas骨架、使用的所述数个sgrna及所述数个geigs供体设计的所述数个序列。[1123]所述数个geigs设计中的数个同源区域(即数个区域，所述数个区域旨在交换所述野生型区域以将所述tas长dsrna的沉默激活及特异性重定向至针对所述靶基因沉默)以下划线表示。在下面的所述数个序列中，插入所述供体载体中并包括具有数个同源臂的所述数个交换核苷酸的所述供体序列被称为例如geigs‑剪接因子‑供体。所述交换事件后所述数个tas基因的所述数个长dsrna转录物(将靶向所述线虫中的所述数个基因)被称为例如geigs‑剪接因子‑转录物。[1124]表5–交换的寡核苷酸[1125][1126][1127]每个表5的数个附加序列：[1128]‑attas1b_at1g50055–seqidno:73[1129]‑sgrna_attas1b(包括pam)–seqidno:74[1130]‑geigs‑剪接因子‑转录物‑seqidno:75[1131]‑geigs‑剪接因子‑转录物的geigs设计中的同源区域‑seqidno:76[1132]‑geigs‑剪接因子‑供体‑seqidno:77[1133]‑geigs‑剪接因子‑供体的geigs设计中的同源区域seqidno:78[1134]‑geigs‑y25‑转录物‑seqidno:79[1135]‑geigs‑y25‑转录物的geigs设计中的同源区域‑seqidno:80[1136]‑y25‑供体‑seqidno:81[1137]‑y25‑供体的geigs设计中的同源区区‑seqidno:82[1138]‑attas3a_at3g17185‑seqidno:83[1139]‑sgrna_attas3a(包括pam)‑seqidno:84[1140]‑geigs‑核醣体蛋白3a‑转录物‑seqidno:85[1141]‑geigs‑核醣体蛋白3a‑转录物的geigs设计中的同源区域‑seqidno:86[1142]‑geigs‑核醣体蛋白3a‑供体‑seqidno:87[1143]‑geigs‑核醣体蛋白3a‑供体的geigs设计中的同源区域‑seqidno：88[1144]‑geigs‑剪接体sr蛋白‑转录物‑seqidno:89[1145]‑geigs‑剪接体sr蛋白‑转录物的geigs设计中的同源区域‑seqidno：90[1146]‑geigs‑剪接体sr蛋白‑供体‑seqidno:91[1147]‑geigs‑剪接体sr蛋白‑供体的geigs设计中的同源区域‑seqidno:92[1148]范例4[1149]表达由geigs修饰的一tas基因的数个细胞中的长双链rna[1150]为了证明修饰编码一长dsrna的一植物基因的一核酸序列而导致所述细胞中的一修饰的dsrna，使用源自范例3中分析的所述数个原生质体的rna。使用数个特异性引物将rna反转录至靶测试基因座(在未设计为交换的一区域上)。然后，使用对所述交换区域特异的数个引物(以特异性扩增一交换的序列或一wt序列)，以研究长dsrna的存在作为预测的所述rna转录物的一有义及反义。[1151]从所有处理中提取rna并使用dna酶的处理以去除dna痕迹。然后使用非特异性引物对数个rna样品进行rt‑pcr以生成cdna。进行了两个不同的独立rt‑pcr( rt)反应以分别从tasdna的所述有义及反义链中产生cdna。tas1b及tas3a均遵循所述方法。使用所有相同的数个试剂进行数个反转录对照(‑rt)，但添加水而不是添加反转录酶。如果所述反应混合物中没有反转录酶，则不会产生cdna，因此，在后续数个pcr反应中获得的任何pcr产物都必须从dna酶处理的数个样品后保持完整的残留dna中扩增出来。[1152]使用一非特异性正向引物及一交换特异性反向引物(用于有义cdna)(图10a)或一非特异性反向引物及一交换特异性正向引物(用于反义cdna)(图10b)进行数个特异性pcr反应。数个pcr反应被设计成使得所有pcr产物的长度都低于200个核苷酸(图10a至b)。[1153]数个tas1b(图10c至图10d，数个右图)及tas3a序列(图10e至图10f，数个右图)的wt特异性pcr反应示出，来自经过处理的数个样品的所述rna适用于pcr扩增。在过处理的数个样品中，对于有义(tas1b为105bp，tas3a为133bp)及反义链(tas1b为147bp，tas3a为101bp)的wt基因座(tas1b及tas3a基因)获得了预期的所述数个pcr产物，显示出它们的共存以及所述数个样品中存在dsrna。数个干净‑rt反应(clean‑rtreactions)表示出成功地通过dna酶处理来从rna样品中去除了dna的所述痕迹。[1154]对经过处理的rna进行数个交换特异性rt‑pcr反应，并获得了对y25有义(98bp)及反义处理(149bp)的数个特异性差异扩增pcr产物(图10c至d，数个左图)。以相同的方式，获得了针对核醣体蛋白3a有义(130bp)及反义处理(118bp)的数个特异性差异扩增pcr产物(图10e至图10f，数个左图)。在使用水及无rt模板的数个阴性对照中未获得扩增。作为每个特异性pcr反应的一阴性对照，相同的所述数个主混液(mastermixes)来用于使用来自未处理的数个细胞中的rna作为一模板的pcr(处理e)。缺少所述预期大小的数个强条带表示出所述数个交换特异性引物的所述特异性，证明了来自所述交换基因座的rna表达。[1155]在所述有义方法的情况下使用所述非特异性正向引物(图10g)及在所述反义方法的情况下使用所述非特异性反向引物(图10h)来针对数个粗pcr产物进行sanger测序。预计会在所述特异性引物结合所述数个位点之前检测到通过hdr交换而引入(而不是通过所使用的引物而引入)的一些突变。数个测序反应证实了tas1by25交换及tas3a核醣体蛋白3a交换的此类突变的所述身份及位置(图10g至h)。数个wt特异性产品也遵循一类似的方法被送去同时针对tas1b及tas3a来测序，且wt序列的身份也可以被确认(图10i)。[1156]因此，在使用范例3的数个处理a及c来处理的所述数个细胞中成功地证明了含有交换的dsrna转录物的存在(即含有将其靶向所述y25靶基因的数个交换的tas1b的一dsrna，以及含有将其靶向所述核醣体蛋白3a靶基因的数个交换的tas3a的一dsrna)。[1157]范例5[1158]长dsrna在本氏烟草(nicotianabenthamiana)中靶向特异性改变的沉默活性[1159]以下所述实验证明了在使用dsrna时针对一所选的靶基因的沉默活性，其中靶向特异性(从其加工的数个小rna靶向特异性)已重定向至所选基因(例如使用hdr介导的沉默特异性重定向的geigs方法)。为此，通过渗透本氏烟草叶来使用一瞬时表达系统，其中具有：(1)具有gfp标记的一芜菁花叶病毒(turnipmosaicvirus，tumv)载体，及(2)用于过表达所述“geigs设计”的一载体‑编码基于tas1b作为一转录物的一tas基因，具有靶向tumv所必需的所述数个核苷酸改变，可以通过使用geigs将所述数个核苷酸变化引入至所述拟南芥基因组中的所述tas1b基因骨架来产生(以下也称为“geigs‑tumv”)。通过将已用各种载体转化的菌株gv3101的农杆菌细菌引入至叶片中来进行渗入。[1160]使用所述geigs方法产生“geigs设计”所需的所述数个寡核苷酸，如上文对于拟南芥所叙述，特别是–(1)用于切割tas1b的所述sgrna，(2)靶向tumv的所述sirna序列(通过所述geigs供体使用一hdr介导的交换而引入至tas1b骨架)，(3)包括对tas1b骨架的数个所需改变的所述geigs供体，如下所示：[1161](1)将用于切割tas1b的所述sgrna–seqidno:134。[1162](2)靶向tumv的所述sirna序列(通过所述geigs供体使用一hdr介导的交换将其引入至所述tas1b骨架)–seqidno:135。[1163](3)所述geigs供体，包括对tas1b骨架的数个所需改变‑seqidno:136。[1164](4)在具有(3)的所述供体的geigs之后将在拟南芥中表达的所述geigs寡核苷酸(设计成用于将(1)的所述成熟sirna序列引入至所述tas1b序列)‑seqidno：137。[1165]将一荧光gfp报告基因掺入至所述tumv的一复制组分中，能够监测所述tumv在所述叶片中的所述生长及传播，从而监测在所述病毒上的数个tumv特异性沉默分子的所述沉默功效。[1166]产生tas1b的rdrp依赖型转录的扩增器是mir173。因此，所述tumv‑gfp载体在具有/不具有所述mir173扩增器的情况下共同渗入(co‑infiltrated)，期望在存在扩增器时看到所述tumv靶向dsrna的沉默活性。[1167]作为一阴性对照，将用于过表达不具有特异性已知靶的一“geigs设计”的一载体(也称为“虚拟(dummy)”或“geigs‑虚拟”)渗入数个叶片中(即基于tas1b的dsrna，具有对应于那些在所述“geigs‑tumv”中改变但不对应于本氏烟草中任何已知基因的数个位置的数个核苷酸改变)。表达所述虚拟对照的所述数个载体或所述“geigs‑tumv”dsrna都在具有或不具有所述扩增器的情况下渗入所述数个叶片中。为了在数个处理之间保持数个渗透接种物的水平恒定，在不具有某些组分的数个处理中使用空的农杆菌(参见下表6)。[1168]表六:本氏烟草叶片渗入(同步分析)[1169][1170][1171]如图11a所示，将两种不同的处理同步地(sidebyside)渗入每个叶片中，测量所述叶片的每一侧的所述gfp水平(对应于tumv水平)(所述数个观察结果已通过一qrt‑pcr分析进一步证实))。每个处理至少重复3次，在紫外灯下观察，并牺牲一个数量以进行拍照。[1172]在一叶片(叶片1)中，表达( tumv)的一载体已渗入，与未渗入tumv(‑tumv)的一处理的所述数个gfp水平进行比较。正如所预期的，当不存在病毒时不具有背景荧光。在一第二叶片(叶子2)中，所述tumv‑gfp病毒在使用所述扩增器mir173( mir173)或不使用扩增器mir173(‑mir173)下渗入，说明了mir173本身对于所述病毒的所述复制没有影响(因为它对qrt‑pct相对表达的所述测量没有显著地影响)。在一第三叶片(叶子3)及一第四叶片(叶子4)中，表达所述tumv病毒的所述载体使用表达不靶向已知基因的dsrna(geigs‑虚拟)的一构建体渗入，或者使用改变的所述dsrna使其渗入靶向所述病毒(geigs‑tumv)。这是在不具有所述扩增器(叶子3)或具有所述扩增器(叶子4)的情况下完成的。[1173]如图11a中的相对表达所示，在存在所述扩增器(叶4)的情况下，相较于所述虚拟处理，观察到tumv转录物的一明显显著减少以及一视觉gfp信号减少。当渗入所述geigs‑tumv构建体(不具有扩增器)时，在叶片3中观察到gfp水平略有下降，这是通过qrt‑pcr分析确定的，因为变化太大而不被认为是显著的。[1174]通过使表达所述tumv‑gfp融合的所述载体、所述扩增器及表达一dsrna构建体的一载体(所述“geigs‑tumv”是靶向tumv或所述“geigs‑虚拟”，不靶向一已知基因，参见下表7)渗入，已经使用上述系统进行了整个叶片的渗入(图11b)。作为一对照，使用不具有载体的土壤杆菌所渗入的一叶片。当使用所述geigs‑tumvdsrna而不是使用所述geigs‑虚拟时，观察到数个gfp水平的一明显减少。这强调了所述geigs设计及扩增器基因对tumv复制的影响。[1175]表7:本氏烟草叶片渗入(整个叶片分析)[1176][1177]正如从一扩增器依赖型tasi‑rna途径的所述公认模型所预期的，这些结果证实了所述tas基因及所述扩增器在诱导沉默中的作用。所述数个结果进一步证实了在一植物中表达使用geigs改变的一dsrna的可行性，以沉默一有害生物中一选择的靶的基因表达(例如，通过将所需的数个核苷酸改变引入至编码所述dsrna的一基因中，从而将dsrna重定向至沉默一选择的靶)。[1178]范例6[1179]植物内靶向线虫基因的长dsrna的表达诱导在线虫中的其靶基因的沉默[1180]此实验旨在说明一沉默dsrna分子(例如从一tas基因表达的分子)，所述沉默dsrna分子在一植物中表达并已重新定向以靶向一有害生物基因(例如一线虫基因)，可以诱导所述有害生物(例如线虫)中其靶基因的沉默。[1181]为此，如上所述，通过农杆菌介导至所述数个叶片的方式将它们引入至所述数个叶片中，使用一瞬时表达系统在数个本氏烟草叶片中表达测试的所述dsrna分子。然后使用一叶片提取物喂养所述数个线虫，如下所述，并检查对靶基因表达的影响。[1182]所述分析是通过靶向所述线虫globoderarostochiensis中的所述核醣体蛋白3a及所述数个剪接体sr蛋白基因进行的。特别是，数个本氏烟草叶片被农杆菌渗入，所述农杆菌含有一种载体，所述载体过表达已引入数个核苷酸改变的一tas3a转录物。所述核苷酸改变至少部分地将所述tas3a转录物的所述沉默特异性重定向至这些线虫基因中的一个基因上。通过在所述基因中诱导一dna断裂(例如使用一内切核酸酶，如cas9及一特异性sgrna)并将这些改变通过具有包括所需的数个核苷酸改变的一geigs供体寡核苷酸的同源依赖性重组(hdr)来引入至所述基因，可以使用基因组编辑诱导基因沉默(geigs)将对应的数个改变引入至一植物细胞中的所述tas3a基因中。可用于将针对核醣体蛋白3a的特异性引入至所述tas3a基因中的一geigs寡核苷酸及一sgrna序列的数个序列由上文的范例3中提供。[1183]作为一对照，数个叶片也被tas3a的一野生型转录物渗入。通过所述对照tas3a渗入的数个叶片及被修饰以靶向线虫基因的所述tas3a都进一步通过所述扩增器mir390渗入。[1184]在48及72小时后，收集叶子，在ultra0.5mlcentrifugalfilters3kdcutoff(merck，美国)上提取及清洗总rna。如下所述，线虫globoderarostochiensis以此总rna喂养72小时并收集。提取rna并使用qrt‑pcr进行基因表达分析，使用肌动蛋白作为一内源性标准化基因。核醣体蛋白3a(图12a)及剪接体sr蛋白(图12b)在植物内喂养线虫测试中均已显示其表达水平显著地降低。所述核醣体蛋白3a具有以7×10‑5的一t检验显著所示的表达降低，剪接体sr蛋白具有以1.72×10‑3的一t检验显著所示的表达，代表所述数个靶基因已显著地沉默，并应显示出下一代线虫生长减少。[1185]这些结果表明，对tas3a进行的修饰导致靶向所述数个线虫基因的dsrna的形成，这可以靶向对此类的一dsrna敏感的数个病原体。[1186]用于喂养数个线虫的rna提取物也通过rna‑seq及小rna‑seq(cambridgegenomicservices，cambridge，uk；图13a至图13d)进行了分析。如方法中所述的来进行分析。将数个序列读取与旨在靶向核醣体蛋白3a(图13a及13b)及剪接体sr蛋白(图13c及图13d)的所述geigs设计的所述序列进行比对。同时在两条链(有义及反义)上来进行比对。数个分析证实了所述转录物的两条链皆存在，能够通过分析一长rnaseq读取(图13a及图13c)及短小rnaseq读取(图13b及图13d)来产生一长双链rna。由于rna‑seq分析是使用长度超过50个核苷酸的读取进行的，因此所述分析鉴定了长双链rna。此外，通过20个至24个核苷酸的过滤序列进行所述小rna分析，从而证明所述长dsrna的分阶段加工，证实了所述二级sirna的形成(图13b及图13d)。[1187]尽管已经结合本发明的特定实施例来描述本发明，但是显然地，对于本领域技术人员而言，许多替代、修改及变化将是显而易见的。因此，旨在涵盖落入所附权利要求书的精神及广泛范围内的所有这样的替代、修改及变化。[1188]本说明书中提及的所有出版物、专利及专利申请都通过引用整体并入本文，其程度与好像每个单独的出版物、专利或专利申请被具体地及单独地指示通过引用并入本文的程度相同。此外，在本技术中对任何参考文献的引用或标识均不应解释为承认所述参考文献可作为本发明的现有技术。在使用章节标题的程度上，不应将其解释为必然的限制。[1189]此外，本技术的任何优先权文件的全部内容通过引用并入本文。[1190]参考文献[1191]yadav,b.、veluthambi,k.及subramaniam,k.，2006年。molecularandbiochemicalparasitology。molecularandbiochemicalparasitology，148(2)，第219至222页。[1192]klink,v.、kim,k.、martins,v.、macdonald,m.、beard,h.、alkharouf,n.、lee,s.、park,s.及matthews,b.，2009年。acorrelationbetweenhost‑mediatedexpressionofparasitegenesastandeminvertedrepeatsandabrogationofdevelopmentoffemaleheteroderaglycinescystformationduringinfectionofglycinemax。planta，230(1)，第53至71页。[1193]li,j.、todd,t.、oakley,t.、lee,j.及trick,h.，2010年。host‑derivedsuppressionofnematodereproductiveandfitnessgenesdecreasesfecundityofheteroderaglycinesichinohe。planta，232(3)，第775至785页。[1194]li,j.、todd,t.及trick,h.，2009年。host‑derivedsuppressionofnematodereproductiveandfitnessgenesdecreasesfecundityofheteroderaglycinesichinohe。plantcellreports，29(2)，第113至123页。当前第1页12当前第1页12
技术领域：
：5.本发明的一些实施例中涉及在一宿主细胞中产生及扩增数个dsrna分子，以沉默数个有害生物靶基因。
背景技术：
：：6.基因组编辑技术的最新进展，使得通过编辑基因组中数十亿个核苷酸中的仅有一些核苷酸来改变数个活细胞中的数个dna序列成为可能。在过去的十年中，使用基因组编辑的所述数个工具及专业知识，例如在数个人类体细胞及多能细胞中，已经发展到所述方法当今被广泛开发为治疗人类疾病的一种策略的如此程度。所述基础过程取决于在基因组中创建一位点特异性dna双链断裂(dsb)，然后允许所述细胞的内源性dsb修复机制来修复所述断裂(例如通过非同源末端连接(non‑homologousend‑joining，nhej)或同源重组(homologousrecombination，hr)，其中后者可以允许使用外源提供的供体模板(donortemplate)对dna序列进行精确的一或多个核苷酸改变(porteus，annurevpharmacoltoxicol.，2016年，56:163至90)。7.三个主要方法使用数个细胞的诱变基因组编辑(mutagenicgenomeediting，nhej)，例如用于潜在疗法：(a)通过创建空间性精确的数个插入或数个缺失以敲除数个功能性遗传元件，(b)创建数个插入或数个缺失以补偿潜在的数个移码突变(frameshiftmutations)；因此重新激活数个部分或非功能基因(partly‑ornon‑functionalgenes)，以及(c)创建明确的数个基因缺失。尽管有几种不同的应用程序使用nhej进行编辑，但最广泛的编辑应用程序可能会利用同源重组(hr)进行基因组编辑，尽管这是一种罕见的事件，但由于同源重组(hr)依赖于外源提供的模板在所述修复过程中复制正确的所述序列，因此同源重组(hr)是高度精准的。8.当今，hr介导的基因组编辑的四个主要应用类型是：(a)基因校正(即，校正由单一基因中的数个点突变引起的数个疾病)，(b)功能基因校正(即，校正由散布在所述整个基因中的数个点突变引起的数个疾病)，(c)安全港基因添加(safeharborgeneaddition)(即，当不需要精确调节时或需要一转基因的数个超非生理水平(supranon‑physiologicallevels)时)，及(d)靶向的转基因添加(即，当精确调节时是必需的)(porteus，2016年，同上)。9.以前在各种真核生物(例如鼠类、人类、虾类、植物)中对所述rna分子进行基因组编辑的工作，主要集中在敲除mirna基因活性或改变它们在靶rna中的结合位点，例如：10.关于人类细胞中的基因组编辑，jiang等人(jiang等人,rnabiology，2014年，11(10):1243至9)使用crispr/cas9通过靶向数个hela细胞中的其5'区域从一个簇中去除人类mir‑93。在含有所述drosha加工位点(即drosha在一宿主细胞的所述细胞核中结合、切割并由此将初级mirna(pri‑mirna)加工成pre‑mirna的位置，其中所述drosha为一种双链rna特异性rnaseiii酶)及数个种子序列(即对于mirna与mrna结合必不可少的数个保守七分序列(conservedheptametricalsequences)，通常位于mirna的5′端的2至7位)的靶向的所述区域诱导各种小分子。根据jiang等人，即使是单一核苷酸缺失也会导致具有高度特异性的靶mirna的完全敲除。11.关于小鼠物种的基因组编辑，zhao等人(zhao等人，scientificreports，2014，4:3943)提供了一种在鼠细胞中使用crispr‑cas9系统的mirna抑制策略。zhao使用专门设计的数个sgrna通过所述cas9核酸酶在单一位点处切割所述mirna基因，从而敲除这些细胞中的mirna。12.关于植物基因组编辑，bortesi及fischer(bortesiandfischer，biotechnologyadvances，2015年，33:4至52)讨论了与数个zfn及数个talen相比的crispr‑cas9技术在数个植物中的使用，basak及nithin(basak及nithin，frontplantsci.，2015年，6:1001)教导crispr‑cas9技术已应用于拟南芥及烟草等数个模式植物以及小麦、玉米及水稻等数个作物中的数个蛋白质编码基因的敲除。13.除了破坏mirna活性或数个靶结合位点之外，还实现了使用数个人工mirna(amirna)介导的数个内源性及外源性靶基因的基因沉默(tiwari等人，plantmolbiol，2014年，86:1)。与mirna类似，amirna是单链的，长约21个核苷酸(nt)，并通过替换数个pre‑mirna中双链体的所述数个成熟mirna序列来进行设计(tiwari等人，2014年，同上)。这些amirna作为一转基因引入至一人工表达盒(包括一启动子、终止子等)(carbonell等人，plantphysiology，2014，pp.113.234989)中，通过小rna生物发生及沉默机制来进行加工并下调节靶表达。根据schwab等人(schwab等人，植物细胞，2006年，第18卷，1121至1133)，amirna在组织特异性或诱导型启动子下表达时具有活性，并可用于数个植物中的特异性基因沉默，特别是当几个相关但不相同的靶基因需要下调节时。14.senis等人(senis等人，nucleicacidsresearch，第2017年，第45(1)卷:e3)公开了将一无启动子的抗病毒rnai发夹工程改造成一内源性mirna基因座。具体而言，senis等人通过由序列特异性核酸酶(例如cas9或talen核酸酶)诱导的同源定向dna重组，将一amirna前体转基因(发夹pri‑amirna)插入到与一天然存在的mirna基因(例如mir122)相邻的位置。这种方法通过利用表达一天然mirna(mir122)的转录活性dna基因座使用无启动子及无终止子的数个amirna，即，所述内源启动子及终止子驱动及调节插入的所述amirna转基因的所述转录。15.之前已经描述了将rna及/或数个蛋白质引入至数个细胞的各种无dna方法。举例而言，在美国专利申请号20160289675中已经描述了使用电穿孔及脂质转染的rna转染。cho等人(cho等人，"heritablegeneknockoutincaenorhabditiselegansbydirectinjectionofcas9‑sgrnaribonucleoproteins"，genetics，2013年，195:1177至1180)描述了通过显微注射所述cas9蛋白及数个sgrna复合物来将数个cas9/sgrna核糖核蛋白(rnp)复合物直接地递送至数个细胞。kim(kim等人，"highlyefficientrna‑guidedgenomeeditinginhumancellsviadeliveryofpurifiedcas9ribonucleoproteins"，genomeres.，2014年，24:1012至1019)描述了通过电穿孔来递送cas9蛋白/sgrna复合物。zuris(zuris等人，"cationiclipid‑mediateddeliveryofproteinsenablesefficientprotein‑basedgenomeeditinginvitroandinvivo"，natbiotechnol.，2014年，doi:10.1038/nbt.3081)报导了通过脂质体来递送数个cas9蛋白相关sgrna复合物。技术实现要素：16.根据本发明一些实施例的一方面，提供了一种产生能够沉默一有害生物基因的一植物细胞中的一长dsrna分子的方法，所述方法包括：(a)在一植物基因组中选择一核酸序列，所述核酸序列编码一沉默分子，所述沉默分子以一植物基因作为一目标，所述沉默分子能够募集rna依赖型rna聚合酶(rdrp)；(b)修饰所述植物基因的一核酸序列，从而针对所述有害生物基因赋予一沉默特异性，使得包括所述沉默特异性的所述植物基因的一转录物与能够募集所述rdrp的所述沉默分子形成碱基互补，以产生能够沉默所述有害生物基因的所述长dsrna分子，从而产生能够沉默所述有害生物基因的所述植物细胞中的所述长dsrna分子。17.根据本发明一些实施例的一方面，提供了一种产生一植物细胞中的一长dsrna分子的方法，所述植物细胞中的所述长dsrna能够沉默一植物细胞中的一有害生物基因，所述方法包括：(a)在一基因组中选择一植物的一核酸序列，所述核酸序列编码一沉默分子，所述沉默分子以一植物基因作为一目标，所述沉默分子能够募集rna依赖型rna聚合酶(rdrp)；(b)修饰所述植物基因的一核酸序列，从而针对所述有害生物基因赋予一沉默特异性，使得包括所述沉默特异性的所述植物基因的一转录物与能够募集所述rdrp的所述沉默分子形成碱基互补，以产生所述植物细胞中的所述长dsrna分子，所述植物细胞中的所述长dsrna分子能够沉默所述植物细胞中的所述有害生物基因。18.根据本发明一些实施例的一方面，提供了一种产生能够沉默一有害生物基因的一植物细胞中的一长dsrna分子的方法，所述方法包括：(a)选择一植物基因的一核酸序列，所述植物基因的所述核酸序列与所述有害生物基因的一核酸序列显示一预定序列同源性；(b)修饰编码一rna分子的一植物内源核酸序列，从而针对所述植物基因赋予沉默特异性，使得能够募集rna依赖型rna聚合酶(rdrp)的数个小rna分子与所述植物基因的一转录物形成碱基互补，所述数个小rna分子是从所述rna分子加工而来，以产生能够沉默所述有害生物基因的所述长dsrna分子，从而产生能够沉默所述有害生物基因的所述植物细胞中的所述长dsrna分子。19.根据本发明的一些实施例的一方面，提供了一种产生一耐有害生物或抗有害生物植物的方法，所述方法包括产生一植物细胞中的一长dsrna分子，所述植物细胞中的所述长dsrna分子能够沉默根据本发明的一些实施例的一有害生物基因。20.根据本发明一些实施例的一方面，提供了一种植物，所述植物通过本发明一些实施例的所述方法所产生。21.根据本发明一些实施例的一方面，提供了一种细胞，所述细胞来自本发明一些实施例的所述植物。22.根据本发明的一些实施例的一方面，提供了一种种子，所述种子来自本发明的一些实施例的所述植物。23.根据本发明一些实施例的一方面，提供了一种产生一耐有害生物或抗有害生物植物的方法，所述方法包括：(a)育种本发明一些实施例的的植物；及(b)选择数个后代植物，所述数个后代植物表达能够抑制所述有害生物基因的所述长dsrna分子，并且不包括所述dna编辑剂，从而产生所述耐有害生物或抗有害生物植物。24.根据本发明一些实施例的一方面，提供了一种产生本发明一些实施例的一植物或植物细胞的方法，所述方法包括在允许繁殖的条件下培养所述植物或植物细胞。25.根据本发明的一些实施例，能够募集所述rdrp的所述沉默分子包括21个至24个核苷酸。26.根据本发明的一些实施例，能够募集所述rdrp的所述沉默分子包括21个核苷酸。27.根据本发明的一些实施例，能够募集所述rdrp的所述沉默分子包括22个核苷酸。28.根据本发明的一些实施例，能够募集所述rdrp的所述沉默分子包括23个核苷酸。29.根据本发明的一些实施例，能够募集所述rdrp的所述沉默分子包括24个核苷酸。30.根据本发明的一些实施例，能够募集所述rdrp的所述沉默分子由21个核苷酸组成。31.根据本发明的一些实施例，能够募集所述rdrp的所述沉默分子由22个核苷酸组成。32.根据本发明的一些实施例，能够募集所述rdrp的所述沉默分子由23个核苷酸组成。33.根据本发明的一些实施例，能够募集所述rdrp的所述沉默分子由24个核苷酸组成。34.根据本发明的一些实施例，能够募集所述rdrp的所述沉默分子选自：反式作用sirna(tasirna)、定相小干扰rna(phasirna)、微小rna(mirna)、小干扰rna(sirna))、短发夹rna(shrna)、piwi相互作用rna(pirna)、转运rna(trna)、小核rna(snrna)、核醣体rna(rrna)、小核仁rna(snorna)、细胞外rna(exrna)、重复衍生rna、自主及非自主的转座rna所组成的群组。35.根据本发明的一些实施例，mirna包括22个核苷酸的成熟小rna。36.根据本发明的一些实施例，所述mirna选自由：mir‑156a、mir‑156c、mir‑162a、mir‑162b、mir‑167d、mir‑169b、mir‑173、mir‑393a、mir‑393b、mir‑402、mir‑403、mir‑447a、mir‑447b、mir‑447c、mir‑472、mir‑771、mir‑777、mir‑828、mir‑830、mir‑831、mir‑831、mir‑833a、mir‑833a、mir‑840、mir‑845b、mir‑848、mir‑850、mir‑853、mir‑855、mir‑856、mir‑864、mir‑2933a、mir‑2933b、mir‑2936、mir‑4221、mir‑5024、mir‑5629、mir‑5648、mir‑5996、mir‑8166、mir‑8167a、mir‑8167b、mir‑8167c、mir‑87e6187d、mir‑8167f、mir‑8177及mir‑8182所组成的群组。37.根据本发明的一些实施例，所述植物基因是一非蛋白质编码基因。38.根据本发明的一些实施方式，所述植物基因是一编码基因。39.根据本发明的一些实施例，所述植物基因不编码具有一内在沉默活性的一分子。40.根据本发明的一些实施例，所述方法进一步包括将一dna编辑剂引入至所述植物细胞，所述dna编辑剂针对所述害虫基因赋予所述植物基因的一沉默特异性。41.根据本发明的一些实施例，步骤(b)的修饰包括将一dna编辑剂引入至所述植物细胞，所述dna编辑剂针对所述害虫基因赋予所述植物基因的一沉默特异性。42.根据本发明的一些实施例，所述植物基因编码针对一天然植物基因具有一内在沉默活性的一分子。43.根据本发明的一些实施例，所述方法进一步包括将一dna编辑剂引入至所述植物细胞，所述dna编辑剂将所述植物基因的一沉默特异性重定向至所述有害生物基因，所述有害生物基因和所述天然植物基因是不同的。44.根据本发明的一些实施例，所述方法进一步包括将一dna编辑剂引入至所述植物细胞，所述dna编辑剂将所述植物基因的一沉默特异性重定向至所述有害生物基因，所述有害生物基因和一天然植物基因是不同的。45.根据本发明的一些实施例，步骤(b)的修饰包括将一dna编辑剂引入至所述植物细胞，所述dna编辑剂将所述植物基因的一沉默特异性重定向至所述有害生物基因，所述有害生物基因和一天然植物基因是不同的。46.根据本发明的一些实施例，具有所述内在沉默活性的所述植物基因选自由:反式作用sirna(tasirna)、定相小干扰rna(phasirna)、微小rna(mirna)、小干扰rna(sirna)、短发夹rna(shrna)、piwi相互作用rna(pirna)、转运rna(trna)、小核rna(snrna)、核醣体rna(rrna)、小核仁rna(snorna)、细胞外rna(exrna)、自主及非自主转座rna所组成的群组。47.根据本发明的一些实施例，具有所述内在沉默活性的所述植物基因编码了一定相二级sirna产生分子。48.根据本发明的一些实施例，具有所述内在沉默活性的所述植物基因是一反式作用sirna(tas)产生分子。49.根据本发明的一些实施例，所述植物基因的所述沉默特异性通过测量有害生物基因的一转录水平来确定。50.根据本发明的一些实施例，所述植物基因的所述沉默特异性是由表型上确定的。51.根据本发明的一些实施例，所述由表型上确定的是通过确定所述植物的有害生物抗性来实现。52.根据本发明的一些实施例，所述植物基因的所述沉默特异性是由基因型上确定的。53.根据本发明的一些实施例，一植物基因型是在一植物表型之前确定的。54.根据本发明的一些实施例，一植物表型是在一植物基因型之前确定的。55.根据本发明的一些实施例，所述植物基因的所述沉默特异性通过测量所述有害生物基因的一转录水平来确定。56.根据本发明的一些实施例，确定的表型通过确定植物的害虫抗性来实现。所述由表型上确定的是通过确定所述植物的有害生物抗性来实现。57.根据本发明的一些实施例，预定的所述序列同源性包括75％至100％的同一性。58.根据本发明的一些实施例，能够募集所述rdrp的所述数个小rna分子包含21至24个核苷酸。59.根据本发明的一些实施例，能够募集所述rdrp的所述数个小rna分子包含21个核苷酸。60.根据本发明的一些实施例，能够募集所述rdrp的所述数个小rna分子包含22个核苷酸。61.根据本发明的一些实施例，能够募集所述rdrp的所述数个小rna分子包含23个核苷酸。62.根据本发明的一些实施例，能够募集所述rdrp的所述数个小rna分子包含24个核苷酸。63.根据本发明的一些实施例，能够募集所述rdrp的所述数个小rna分子由21个核苷酸组成。64.根据本发明的一些实施例，能够募集所述rdrp的所述数个小rna分子分子由22个核苷酸组成。65.根据本发明的一些实施例，能够募集所述rdrp的所述数个小rna分子由23个核苷酸组成。66.根据本发明的一些实施例，能够募集所述rdrp的所述数个小rna分子由24个核苷酸组成。67.根据本发明的一些实施例，能够募集所述rdrp的所述小rna分子选自微小rna(mirna)、小干扰rna(sirna)、短发夹rna(shrna)、piwi相互作用rna(pirna)、反式作用sirna(tasirna)、定相小干扰rna(phasirna)、转移rna(trna)、小核rna(snrna)、核醣体rna(rrna)、小核仁rna(snorna)、细胞外rna(exrna)、重复衍生rna及自主和非自主转座rna所组成的群组。68.根据本发明的一些实施例，所述rna分子不具有一内在沉默活性。69.根据本发明的一些实施例，该方法进一步包括将一dna编辑剂引入至所述植物细胞，所述dna编辑剂针对一植物基因赋予所述rna分子的一沉默特异性。70.根据本发明的一些实施例，所述rna分子针对一天然植物基因具有一内在沉默活性。71.根据本发明的一些实施例，所述方法进一步包括将一dna编辑剂引入至所述植物细胞，所述dna编辑剂将所述rna分子的所述沉默特异性重定向至所述植物基因，所述植物基因和所述天然植物基因是不同的。72.根据本发明的一些实施例，步骤(b)的修饰包括一dna编辑剂引入至所述植物细胞，所述dna编辑剂将所述rna分子的所述沉默特异性重定向至所述植物基因，所述植物基因和一天然植物基因是不同的。73.根据本发明的一些实施例，与所述有害生物基因的所述核酸序列显示出所述预定序列同源性的所述植物基因不编码一沉默分子。74.根据本发明的一些实施例，所述rna分子的所述沉默特异性是通过测量所述植物基因或所述有害生物基因的一转录水平来确定的。75.根据本发明的一些实施例，所述rna分子的所述沉默特异性是由表型上确定的。76.根据本发明的一些实施例，所述由表型上确定的是通过确定所述植物的有害生物抗性来实现。77.根据本发明的一些实施例，所述rna分子的所述沉默特异性是由基因型上确定的。78.根据本发明的一些实施例，一植物表型是在一植物基因型之前确定的。79.根据本发明的一些实施例，一植物基因型是在一植物表型之前确定的。80.根据本发明的一些实施例，所述dna编辑剂包含至少一sgrna。81.根据本发明的一些实施例，所述dna编辑剂包含至少一sgrna，所述至少一sgrna与一植物可表达启动子可操作地连接。82.根据本发明的一些实施例，所述dna编辑剂不包含一核酸内切酶。83.根据本发明的一些实施例，所述dna编辑剂包含一核酸内切酶。84.根据本发明的一些实施例，所述dna编辑剂是选自大范围核酸酶、锌指核酸酶(zfn)、转录激活因子样效应核酸酶(talen)、crispr‑核酸内切酶、dcrispr‑核酸内切酶和一归巢核酸内切酶。85.根据本发明的一些实施例，所述核酸内切酶包含cas9。86.根据本发明的一些实施方式，所述dna编辑剂以dna、rna或rnp的形式应用于细胞。87.根据本发明的一些实施方案，所述dna编辑剂与用于监测一植物细胞中表达的报告基因相连。88.根据本发明的一些实施方案，所述报导分子是一荧光蛋白。89.根据本发明的一些实施方式，所述植物细胞是一原生质体。90.根据本发明的一些实施方案，所述dsrna分子可由细胞rnai加工机器加工。91.根据本发明的一些实施方案，所述dsrna分子被加工成数个二级小rna。92.根据本发明的一些实施方案，所述dsrna和/或所述二级小rna包含针对一有害生物基因的一沉默特异性。93.根据本发明的一些实施例，所述有害生物是一无脊椎动物。94.根据本发明的一些实施例，所述有害生物选自由一病毒(virus)、一蚂蚁(ant)、一白蚁(termite)、一蜜蜂(bee)、一黄蜂(wasp)、一毛虫(caterpillar)、一蟋蟀(cricket)、一蝗虫(locust)、一甲虫(beetle)、一蜗牛(snail)、一蛞蝓(slug)、一线虫(nematode)、一臭虫(bug)、一苍蝇(fly)、一果蝇(fruitfly)、一粉虱(whitefly)、一蚊子(mosquito)、一蚱蜢(grasshopper)、一飞虱(planthopper)、一蠼螋(earwig)、一蚜虫(aphid)、一鳞片(scale)、一蓟马(thrip)、一蜘蛛(spider)、一螨虫(mite)、一木虱(psyllid)、一蜱虫(tick)、一飞蛾(moth)、一蠕虫(worm)、一蝎子(scorpion)及一真菌(fungus)所组成的群组。95.根据本发明的一些实施例，所述植物选自由一作物、一开花植物、一杂草和一树木所组成的群组。96.根据本发明的一些实施方案，所述植物是非转基因的。97.根据本发明的一些实施方式，所述植物是一转基因植物。98.根据本发明的一些实施方式，所述植物是非遗传修饰的(非转基因)。99.根据本发明的一些实施例，所述植物是遗传修饰的(gmo)。100.除非另有定义，本文使用的所有技术和/或科学术语与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同。尽管在本发明的数个范例的实践或测试中可以使用与本文所述的那些方法和材料相似或等效的数个方法和数个材料，但下文描述了示例性方法和/或材料。如有冲突，以专利说明书(包括定义)为准。此外，数个材料、数个方法和数个范例仅是说明性的，并不旨在进行必要的限制。附图说明101.本发明的一些实施例在此仅通过示例并参考附图来说明。现在具体详细地参考附图，强调所显示的细节是通过示例的方式并且出于对本发明的数个实施例的说明性讨论的目的。在这点上，结合附图的描述使本领域技术人员清楚可以如何实践本发明的实施例。102.在所述数个附图中：103.图1是说明用于通过基因组编辑诱导基因沉默(geneeditinginducedgenesilencing，geigs)进行靶基因扩增的第一提议模型(firstproposedmodel)(称为模型1)的一照片。根据这个模型(参见数个图式中的数个对应数字)：104.1、有害生物基因“x”为所述靶基因(当沉默时，所述有害生物则被控制)。105.2、通过同源性搜索来确定宿主相关基因‑x(植物基因“x”)。106.3、进行geigs以重定向针对植物基因“x”的一扩增器小rna(例如22ntmirnas)的所述沉默特异性。107.4、扩增器小geigsrna形成与rdrp(所述扩增酶)相关的一risc复合物。108.5、rdrp合成与植物基因“x”的所述转录物互补的一反义rna链，形成dsrna。109.6、所述植物基因“x”dsrna通过(数个)dicer或类似dicer的数个蛋白加工成二级srna。110.7、所述植物基因“x”dsrna被数个有害生物吸收。在所述有害生物中，所述植物dsrna‑x被加工成小rna，通过rnai下调节所述对应同源有害生物基因“x”。111.8、可能地，数个二级srna被数个有害生物吸收，并沉默所述靶基因“x”。112.图2是说明用于通过geigs进行靶基因扩增的第二提议模型(secondproposedmodel)(称为模型2)的一照片。根据这个模型(参见数个图式中的数个对应数字)：113.1、所述有害生物基因“x”为所述靶基因(当沉默时，所述有害生物则被控制)。114.2、进行geigs以重定向针对所述有害生物基因“x”的天然存在扩增的rnai前体沉默特异性(例如tas；扩增并加工成数个tasirna)。115.3、一野生型扩增器srna形成与rdrp(扩增酶)相关的一risc复合物。116.4、所述rdrp合成与所述扩增geigs前体的所述转录物本互补的一反义rna链，从而形成dsrna。117.5、所述扩增geigsdsrna通过dicer(s)加工成数个二级srna。118.6、geigsdsrna被所述有害生物吸收。在所述有害生物中，所述植物geigs‑dsrna被加工成小rna，通过rnai下调节所述对应同源有害生物基因“x”。119.7、可能地，来自geigs‑dsrna的二级srna(例如tas前体中的tasirna)也被所述有害生物吸收，并沉默所述靶基因“x”。120.图3a说明具有与所述有害生物序列同源的数个区域的所述植物中的数个内源基因的鉴定(每个模型1)。具体而言，af502391.1(大豆胞囊线虫(h.glycines)，seqidno：1)有害生物针对nm_001037071.1(拟南芥(a.thaliana)，seqidno：2)植物基因的比对。121.图3b说明基于mirna的geigs寡核苷酸，设计成携带靶向所述植物中所述同源区域的一下游区域的数个sirna序列(图3a中所述)。顶部：geigs寡核苷酸，seqidno：3(sirna以红色所示)。底部：与有害生物具有同源性的植物靶基因(seqidno：4)。同源有害生物序列(seqidno：1)以绿色所示。通过geigs‑sirna预测为靶向的所述序列以红色所示。122.图4a说明具有与所述有害生物序列同源的数个区域的所述植物中的数个内源基因的鉴定(每个模型1)。具体而言，af500024.1(大豆胞囊线虫，seqidno：5)有害生物针对nm_116351.7(拟南芥，seqidno：6)植物基因的比对。123.图4b说明基于mirna的geigs寡核苷酸，设计成携带靶向所述植物中的所述同源区域的一下游区域的数个sirna序列(图4a中所述)。顶部：geigs寡核苷酸，seqidno：7(sirna以红色所示)。底部：与所述有害生物具有同源性的靶基因(seqidno：8)。同源有害生物序列(seqidno：5)以绿色所示。通过geigs‑sirna预测为靶向的所述序列以红色所示。124.图5a说明具有与所述有害生物序列同源的数个区域的所述植物中的数个内源基因的鉴定(每个模型1)。具体而言，af469060.1(大豆胞囊线虫，seqidno：9)有害生物针对nm_001203752.2(拟南芥，seqidno：10)植物基因的比对。125.图5b说明基于mirna的geigs寡核苷酸，设计成携带靶向所述植物中的所述同源区域的一下游区域的数个sirna序列(图5a中所述)。顶部：geigs寡核苷酸，seqidno：11(sirna以红色所示)。底部：与所述有害生物具有同源性的靶基因(seqidno：12)。同源有害生物序列(seqidno：9)以绿色所示。通过geigs‑sirna预测为靶向的所述序列以红色所示。126.图6是产生数个geigs模板的计算流水线的一实施例流程图。所述计算geigs管道应用生物元数据(biologicalmetadata)，并能够自动产生数个geigsdna供体模板，用于最小限度地编辑数个内源性非编码rna基因(例如mirna基因)，从而获得一新的功能增益，即将其沉默能力重定向至感兴趣的靶基因表达。127.图7是用靶向所述pds基因的sirna替代内源性mirna的基因组编辑诱导基因沉默(genomeeditinginducedgenesilencing，geigs)的一实施例流程图，从而诱导所述内源性pds基因的基因沉默。为了引入所述修饰，正在使用一2组成部分的系统。首先，一crispr/cas9系统在一含有gfp的载体中，通过设计的数个特异性引导rna在选定的基因座中产生一剪切，以促进在所述位点中的同源dna修复(hdr)。其次，引入一供体序列(具有所述mirna序列所需要的修饰)作为用于所述hdr的一模板，以靶向新分配的数个基因。此系统正在用于原生质体转化中，通过facs富集(由于所述crispr/cas9载体中的所述gfp信号)，回收并再生为数个植物。128.图8a至图8c是说明所述pds基因的沉默引起光致漂白(photobleaching)的数个照片。烟草(nicotiana)(图8a至图8b)及拟南芥(arabidopsis)(图8c)植物中的所述pds基因的沉默引起本生烟(n.benthamiana)(图8b)及拟南芥(图8c，右侧)中的光致漂白。照片是在pds沉默后3周半后拍摄。129.图9a绘示出数个col‑0细胞中的hdr介导的数个基因组交换(hdr‑mediatedgenomicswaps)及用于pcr及此类数个交换的基因分型的数个引物的一范例的一示意图。所述crispr/cas9及sgrna靶向所数交换区域，从而产生一dsdna断裂。所述数个供体模板携带数个同源臂，用于通过同源定向修复(hdr)插入所述基因组位点(attas1b或attas3a)，从而引入所数需要的数个交换。交换区(swapregion)：经过修饰以靶向数个线虫基因序列。数个短箭头代表所述交换特异性或wt特异性正向引物及非特异性反向引物，所述wt特异性正向引物及非特异性反向引物适用于所有反应，用于pcr以说明数个基因组交换。所述反向引物被设计成在所述重组位点的下游进一步退火(anneal)，以避免所述供体模板的扩增反应。数个交换特异性正向引物被设计成它们仅在一交换发生时才允许扩增。一额外的正向引物被设计成用于仅对野生型(wt)序列进行对照pcr扩增。虚线代表pcr产物。椭圆表示用于sanger测序反应的所述反向引物。130.图9b至图9c绘示出使用数个wt引物所产生的数个pcr产物的数个电泳显微照片。所述非特异性反向引物及一wt特异性引物用于对从范例3所叙述的所有处理中提取的dna进行pcr。数个pcr产物在1.6％琼脂糖凝胶上运行。数个小箭头及数个数字表示预期的所述数个pcr产物的数个条带及数个大小。图9b代表attas1b基因座的数个pcr反应，以及图9c代表attas3a基因座的数个反应。y25：y25，copi复合物的β亚基；splicing：拼接因子；ribo3a：核醣体蛋白3a；spliceo：剪接体sr蛋白；wt：野生型；h2o：无模板，水阴性pcr对照组；mw：1kb加上分子量阶梯(neb)。131.图9d至图9e绘示出使用数个交换特异性引物所产生的数个pcr产物的数个电泳显微照片。所述非特异性反向引物及一交换特异性正向引物用于对从范例3的所有交换处理中提取的dna进行pcr。作为所述反应特异性的一对照，wtdna也用作模板。数个pcr产物在1.6％琼脂糖凝胶上运行。数个小箭头及数个数字表示预期的所述数个pcr产物的数个条带及数个大小。图9d代表在attas1b(tas1b)基因座交换的数个pcr反应，以及图9e代表在attas3a(tas3a)基因座交换的数个反应。y25：y25，copi复合物的β亚基；splicing：拼接因子；ribo3a：核醣体蛋白3a；spliceo：剪接体sr蛋白；wt：野生型；h2o：无模板，水阴性pcr对照；mw：1kb加上分子量阶梯(neb)。132.图9f至图9g绘示出数个pcr产物的一sanger测序反应的一方案。图9a中的所述非特异性反向引物用于每个pcr产物的sanger测序。数个箭头代表用于pcr扩增的所述数个特定正向引物。在hdr事件后所引入的数个其他核苷酸改变(不是源自所述反应中使用的所述引物)被突出地显示出并以灰色表示。数个色谱图显示出所述数个pcr产物的所述数个序列，所述数个序列与所述数个预测序列(上线)比对。图9f代表attas1b(tas1b)基因座处的数个交换的数个测序反应，以及图9g代表attas3a(tas3a)基因座处的数个交换的数个反应。y25：y25，copi复合物的β亚基；splicing：拼接因子；ribo3a：核醣体蛋白3a；spliceo：剪接体sr蛋白；wt：野生型。133.图10a至图10b绘示出在数个col‑0细胞中通过hdr介导的数个基因组交换所产生的dsrna的一有义(图10a)及反义(图10b)链的数个示意图。交换区：经过修饰以靶向数个线虫基因的序列。数个短箭头代表用于反转录pcr(rt‑pcr)及cdna产生的所述数个非特异性引物。额外的数个短箭头代表所述交换特异性引物及非特异性引物，在所有反应中都很常见，用于cdna的pcr(pcr)以证明交换表达。数个pcr反应被设计成使得所有pcr产物的所述长度都低于200个核苷酸。数个特定引物被设计成使得它们仅在发生交换时才允许扩增。所述数个虚线代表预期的所述数个pcr产物。所述椭圆表示用于数个sanger测序反应的所述数个引物。方向指示出数个转录物是从5′至3′。134.图10c至图10d绘示出检测attas1b数个有义及反义rna链的表达以检测含有数个交换的dsrna的数个pcr产物电泳的数个显微照片。进行数个rt‑pcr反应以产生cdna，并使用图10a至图10b中叙述的所述数个引物进行数个后续pcr反应。数个pcr产物在1.6％琼脂糖凝胶上运行。数个小箭头及数个数字表示预期的所述数个pcr产物的数个条带及数个大小。图10c代表attas1b有义rna转录物的数个pcr反应，图10d代表attas1b反义rna转录物的pcr反应。y25：y25，copi复合物的β亚基；wt：野生型；h2o：无模板，水阴性pcr对照；mw：1kb加上分子量阶梯(neb)。 rt：使用以反转录酶扩增的cdna作为模板的数个pcr反应。‑rt：数个反转录对照‑未使用反转录酶且未产生cdna。135.图10e至图10f绘示出检测attas3a数个有义及反义rna链的表达以检测含有数个交换的dsrna的数个pcr产物电泳的数个显微照片。进行数个rt‑pcr反应以产生cdna，并使用图10a至图10b中叙述的所述数个引物进行数个后续pcr反应。数个pcr产物在1.6％琼脂糖凝胶上运行。数个小箭头及数个数字表示预期的所述数个pcr产物的数个条带及数个大小。图10e代表attas3a有义rna转录物的数个pcr反应，图10f代表attas3a反义rna转录物的数个pcr反应。ribo3a：核醣体蛋白3a；wt：野生型。h2o：无模板，水阴性pcr对照。mw：1kb加上分子量阶梯(neb)。 rt：使用以反转录酶扩增的cdna作为模板进行数个pcr反应。‑rt：数个反转录对照‑未使用反转录酶且未产生cdna。136.图10g绘示出数个pcr产物的一sanger测序反应的一方案，其通过引入的数个交换来扩增rna的所述有义链。图10a中的所述非特异性正向引物用于每个pcr产物的sanger测序。数个箭头代表用于pcr扩增的所述特定反向引物。供体模板引入的数个其他核苷酸改变被突出地显示并以灰色表示。数个色谱图显示了所述数个pcr产物的所述数个序列，所述数个序列与所述数个预测序列比对。上图代表attas1b(tas1b)基因座中交换的表达证明的数个测序反应，下图代表attas3a(tas3a)基因座中交换的表达证明的反应。y25：y25，copi复合物的β亚基；ribo3a：核醣体蛋白3a；wt：野生型。137.图10h绘示出pcr产物的一sanger测序反应的一方案，其通过引入的数个交换来扩增rna的所述反义链。图10b中的所述非特异性反向引物用于每个pcr产物的sanger测序。数个箭头代表用于pcr扩增的所述特异性正向引物。供体模板引入的数个其他核苷酸改变被突出地显示并以灰色表示。数个色谱图显示出数个pcr产物的所述数个序列，所述数个序列与所述数个预测序列比对。上图代表attas1b(tas1b)基因座中交换的表达证明的数个测序反应，下图代表attas3a(tas3a)基因座中交换的表达证明的反应。y25：y25，copi复合物的β亚基；ribo3a：核醣体蛋白3a；wt：野生型。138.图10i绘示出扩增从tas1b及tas3a转录的野生型rna的所述有义及反义链的数个pcr产物的一sanger测序反应的一方案。对于数个有义转录物，来自图10a的所述非特异性正向引物用于每个pcr产物的sanger测序。对于数个反义转录物，来自图10b的所述非特异性反向引物用于每个pcr产物的sanger测序。数个箭头代表用于pcr扩增的所述数个正向引物。数个色谱图显示出所述数个pcr产物的所述数个序列，所述数个序列与具有注释的所述数个wt序列比对。139.图11a在下图中提供了一条形图，绘示出使用各种处理接种后n.benthamiana的数个叶片中tumv感染的数个水平，如通过数个tumv转录物水平的量化及gfp可视化测量相对表达来表示。对照及数个处理在同一叶片上同步地渗入(infiltratedside‑by‑side)。从左至右‑(1)使用含有tumv载体的农杆菌(n＝3；所述叶片的左侧)或不具有任何载体的农杆菌(n＝3；所述叶片的右侧)来渗入叶片。(2)使用含有过表达mir173的一载体的农杆菌(n＝3；左侧)或不含载体的农杆菌(n＝3；右侧)来渗入叶片。(3)使用过表达geigs‑虚拟(n＝3；左侧)或geigs‑tumv(n＝3；右侧)的一载体来渗入叶片。(4)使用含有过表达geigs‑虚拟的一载体的农杆菌(n＝3；左侧)或含有编码所述geigs‑tumv的载体的农杆菌(n＝2；右侧)来渗入叶片，两者都与含有过表达mir173的一载体的农杆菌来共同渗入叶片。上图中的数个显微照片是分析数个样品的数个代表性图片。tumv通过gfp信号进行监测，在紫外光下是可视化的。数个条形表示数个平均值；数个误差棒代表标准误差；*‑p值<0.05；**‑根据单因子变异数分析(one‑wayanova)及post‑hoctukeyhsd检测，p值<0.01。140.图11b提供的数个照片绘示出数个本氏烟草整个叶片，其中已经使用含有过表达geigs‑虚拟及mir173(中)或过表达geigs‑tumv及mir173(右)的数个载体的农杆菌来共同渗入所述数个本氏烟草整个叶片。使用不含载体的农杆菌来渗入对照叶片(左)。tumv通过gfp信号进行监测，在紫外光下是可视化的。141.图12a是一柱状图，提供了使用从数个本氏烟草叶片中提取的总rna喂养的数个线虫中核醣体蛋白3a的相对表达，经修饰成靶向核醣体蛋白3a的过表达mir390及tas3a的载体共同渗入所述叶片。使用来自过表达tas3awt骨架及mir390扩增器的外植体的rna喂养的数个线虫用作对照。使用肌动蛋白作为内源性标准化基因(endogenousnormalisergene)，通过qrt‑pcr对在3天内使用rna提取物喂养的数个线虫来进行分析。(数个误差棒代表标准误差；***‑p值<0.001)。142.图12b是一柱状图，提供了使用从本氏烟草叶中提取的总rna喂养的数个线虫中剪接体sr蛋白的相对表达，经修饰成靶向剪接体sr蛋白的过表达mir390及tas3a的载体共同渗入所述叶片。使用来自过表达tas3awt骨架及mir390扩增器的外植体的rna喂养的数个线虫用作对照。使用肌动蛋白作为内源性标准划基因，通过qrt‑pcr对在3天内用rna提取物喂养的数个线虫来进行分析。(数个误差棒代表标准误差；**‑p值<0.01)。143.图13a至图13d绘示出使用表达针对核醣体蛋白3a(图13a及图13b)及剪接体蛋白3a(图13c及图13d)的数个geigs设计的数个载体所渗入的数个本氏烟草叶片的rna序列分析(rna‑seqanalysis)(图13a及图13c)及小rna序列分析(smallrna‑seqanalysis)(图13b及图13d)，以及与geigs设计比对的mir390在48至72小时候渗入。每个图中的所述数个浅灰色矩形表示所述转录物上的所述mir390结合区域。每个图中的所述数个黑色方块表示对于所述数个靶基因的所述同源区域，所述同源区域产生靶向数个线虫中数个基因的所述二级sirna。每个图中的数个顶部色谱图表示所述有义链，而数个底部色谱图表示所述反义链。具体实施方式144.本发明的一些实施例中，涉及在一宿主细胞中产生及扩增dsrna分子以沉默数个有害生物靶基因。145.参照所附数个图式及所附说明可以更好地理解本发明的数个原理及操作。146.在详细解释本发明的至少一个实施例之前，应当理解，本发明的应用并不一定限于以下描述中所阐述的或由所述多个示例所举例说明的细节。本发明能够具有其他实施例，或者能够以各种方式被实践或执行。此外，应当理解，本文中采用的措词和术语是出于说明的目的，而不应被视为是限制性的。147.以前在各种生物体(例如鼠类、人类、植物)中对数个rna分子进行基因组编辑的努力，主要是使用转基因破坏mirna活性或数个靶结合位点。数个植物中的基因组编辑主要集中在使用crispr‑cas9技术、数个zfn及数个talen等核酸酶，以敲除在数个模式植物中的数个基因或数个插入。此外，已经描述了使用人工mirna转基因使内源及外源靶基因沉默的植物中的基因沉默(molnara等人，plantj.，2009年，58(1):165至74。doi：10.1111/j.1365‑313x.2008.03767.x，电子版2009年1月19日；borgesandmartienssen，naturereviewsmolecularcellbiology(aop)，2015年11月4日线上发布；doi:10.1038/nrm4085)。将所述数个人工mirna转基因引入至人工表达盒(包括一启动子、终止子、选择标记等)内的数个植物细胞并下调节靶表达。148.数个基因组编辑技术中的最新进展使得通过在诱导位点特异性双链断裂(dsb)后在所述基因组中的数个所需位置处编辑人类患者细胞中的一或多个几个核苷酸(例如通过基因组编辑(nhej及hr))来改变数个活细胞中的dna序列成为可能。虽然nhej主要(如果非排除性地)用于敲除目的，但hr用于引入数个特异性位点的精确编辑，例如数个点突变或校正天然存在或遗传传播的数个有害突变。149.数个成熟小rna(即数个dicer产物及数个非dicer产物)及dsrna(即数个dicer底物，例如数个小rna前体)可以介导有效的细胞基因敲降(geneknockdown)。数个mirna的所述生物发生涉及数个dsrna结构(例如发夹前体)的存在。然而，所述发夹rna可能不会被数个有害生物有效地吸收，因为：(i)由于其不稳定性(例如由切丁机加工)，故数量低；(ii)缺乏数个rna依赖型rna聚合酶(rdrp)的rna‑rna扩增阶段。因此，数个有害生物更容易受到摄入的数个小rna前体(例如dsrna)的影响。150.在将本发明付诸实践的同时，本发明人设计了一种基因编辑技术，所述基因编辑技术针对在数个植物细胞及数个组织中产生用于靶向数个有害生物基因的数个长dsrna分子。所述数个dsrna分子可以在数个细胞及数个组织之间移动及转移；因此，一旦在数个细胞中产生所述数个dsrna分子，所述数个dsrna分子就会发生在数个细胞之外。此外，所述数个dsrna分子可以通过摄入源自所述dsrna表达宿主(dsrna‑expressinghost)(例如数个植物叶片及数个茎部)的材料而于数个生物体之间转移。具体而言，数个本发明人已经开发了涉及两个模型中的一个模型的geigs系统。151.以下叙述的所述数个模型部分地基于wo2019/058255中所叙述的基因组编辑诱导基因沉默(geigs)技术，所述专利通过引用整体并入本文中。如本文所使用，短语“进行geigs”涉及使用所述geigs技术来重定向一沉默rna的沉默特异性，主要包括修饰编码一沉默rna的一核酸序列，使得编码的所述沉默rna靶向一选择的靶。根据一些实施例，通过在一细胞中诱导了编码所述沉默rna的所述核酸序列中的一双链断裂来进行geigs(例如，通过将一核酸内切酶表达或引入至所述细胞中，例如但不限于cas9)，并且提供一核酸模板，所述核酸模板包括编码所述沉默rna的所述核酸序列中的数个所需核苷酸改变。根据此数个实施例，然后当引入所述核酸模板的相关部分时，通过同源性依赖重组(homologydependentrecombination，hdr)将所述数个核苷酸改变引入至具有编码所述沉默rna的所述核酸序列中。根据一些实施例，所述核酸模板在编码所述沉默rna的所述核酸序列中引入数个核苷酸改变，使得所述沉默rna靶向一选择的靶序列。使用geigs改变了编码一mirna或一tasirna的一核酸序列中的数个核苷酸的数个范例在下文的范例1b及范例3中举例说明。152.在所述第一模型中，鉴定与一有害生物靶基因同源的一植物基因。执行geigs以针对所述植物基因(与所述有害生物靶基因同源)来重定向一小rna分子的所述沉默特异性。这种小rna分子(也称为一扩增器或引物小rna)与rdrp形成一复合物，且rdrp合成对于所述植物基因的所述转录物的一互补反义rna链，形成一dsrna。然后将所述dsrna进一步加工成数个二级小rna(srna)。重要的是，所述数个初级小rna、dsrna以及所述数个二级小rna分子(即新产生的所述数个dsrna的所述rnai加工产物，例如通过dicer样被所述有害生物吸收并可以介导有害生物基因沉默。基本上，通过使用geigs重新定向一扩增器小rna分子的所述靶向特异性，所述第一模型能够从之前没有形成一长dsrna的一序列中形成一新的长dsrna，从而产生一定相rna产生位点。由于所述基因座与一有害生物基因具有一天然相似性，因此一产生的长dsrna具有使所述有害生物内的所述对应基因沉默的能力。153.在所述第二模型中，geigs在一植物基因上进行，所述基因自然转化成双链rna形式(产生一长dsrna及数个定相rna的一自然扩增基因座，例如一天然存在的tas)，以将一沉默特异性重定向至一有害生物靶基因。最初，一天然沉默rna分子(在本文中也称为一扩增器或引物小rna；例如22ntmirna，例如mir‑173)被选择以使所述植物基因作为一靶，并能够与rdrp形成一复合物。rdrp合成与所述植物基因的所述转录物对应的一互补反义rna链，形成长一dsrna。然后将所述长dsrna进一步加工成数个二级srna(即新产生的所述数个dsrna的所述rnai加工产物，例如dicer样)。根据所述模型，所述长dsrna以及所述数个二级小rna分子被所述有害生物吸收并可以介导所述有害生物基因沉默。154.因此，本发明提供了在数个植物细胞及数个组织中的可扩增数个dsrna分子的形成，具有预计的更大数量以及更大的小rna群体，并因此具有更高的沉默效力。此外，从所述数个dsrna分子产生的所述多个二级小rna增加了有效靶标敲降的数个机会。通过数个本方法产生的所述dsrna分子被数个有害生物有效吸收，从而能够有效地沉默及安全地控制数个有害生物基因而不伤害所述数个植物。此外，本文所述的基因编辑技术没有实施所述数个经典分子遗传及转基因工具，所述数个经典分子遗传及转基因工具包括具有一启动子、终止子、选择标记的表达盒。155.因此，根据本发明的一方面，提供了一种产生能够沉默一有害生物基因的一植物细胞中的一长dsrna分子的方法，所述方法包括：156.(a)选择一植物基因的一核酸序列，所述植物基因的所述核酸序列与所述有害生物基因的一核酸序列具有一预定序列同源性；157.(b)修饰编码一rna分子的一植物内源核酸序列，从而针对所述植物基因赋予沉默特异性，使得能够募集rna依赖型rna聚合酶(rdrp)的数个小rna分子与所述植物基因的一转录物形成碱基互补，所述数个小rna分子是从所述rna分子加工而来，以产生能够沉默所述有害生物基因的所述长dsrna分子，158.从而产生能够沉默所述有害生物基因的所述植物细胞中的所述长dsrna分子。159.如本文所使用，术语“长dsrna分子(longdsrnamolecule)”是指数个多核糖核酸的数个双链序列，具有一第一链(有义链)及作为所述第一链的一反向互补的一第二链(反义链)，所述数个多核糖核酸通过碱基配对(例如，在碱基配对区域中彼此反向互补的两个序列)保持在一起，其中所述双链多核糖核酸可以是来自所述dicer家族的一酶的一基质，通常其中所述长dsrna分子至少为26bp或更长。所述两个链可以具有相同的长度或不同的长度，前提是所述两个链之间具有足够的序列同源性，以形成一稳定的双链结构，其中至少有80％、85％、90％、95％、97％、99％或100％在整个长度上互补。160.使用术语“互补(complementation)”、“互补性(complementarity)”或“互补的(complementary)”是指数个rna分子(或以加工的小rna形式存在的数个rna分子的至少一部分，或一双链多核苷酸的至少一条链或其部分，或一单链的多核苷酸的一部分)在生理条件下与所述靶rna(例如所述植物基因的转录物)或其一片段杂交，以实现rdrp介导的靶基因合成的调节或功能。举例而言，在一些实施例中，当与所述靶rna(或一给定靶基因的数个家族成员)中10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个、50个、51个、52个、53个、54个、55个、56个、57个、58个、59个、60个、70个、80个、90个、100个、150个、200个、300个、400个、500个或更数个连续核苷酸的一序列相比时，一rna分子具有100％的序列同一性或至少约30％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。161.如本文中所使用，当从5’读至3’的所述数个序列中的一个的每一个核苷酸与从3’读至5’的另一个序列的每一个核苷酸互补时，小rna分子或其加工的小rna形式称为显示出“完全互补性”。与一参考核苷酸序列完全互补的一核苷酸序列将显示出与所述参考核苷酸序列的反向互补序列一相同的序列。162.确定序列互补性的方法是本领域众所周知的，且包括但不限于本领域众所周知的数个生物信息学工具(例如，blast、多序列比对(multiplesequencealignment))。163.根据一实施例，所述长dsrna分子长于20bp。164.根据一实施例，所述长dsrna分子长于21bp。165.根据一实施例，所述长dsrna分子长于22bp。166.根据一实施例，所述长dsrna分子长于23bp。167.根据一实施例，所述长dsrna分子长于24bp。168.根据一实施例，所述长dsrna分子包括20至100,000bp。169.根据一实施例，所述长dsrna分子包括20至10,000bp。170.根据一实施例，所述长dsrna分子包括20至1,000bp。171.根据一实施例，所述长dsrna分子包括20至500bp。172.根据一实施例，所述长dsrna分子包括20至50bp。173.根据一实施例，所述长dsrna分子包括200至5000bp。174.根据一实施例，所述长dsrna分子包括200至1000bp。175.根据一实施例，所述长dsrna分子包括200至500bp。176.根据一实施例，所述长dsrna分子包括2000至100,000bp。177.根据一实施例，所述长dsrna分子包括2000至10,000bp。178.根据一实施例，所述长dsrna分子包括2000至5000bp。179.根据一实施例，所述长dsrna分子包括10,000至100,000bp。180.根据一实施例，所述长dsrna分子包括1,000至10,000bp。181.根据一实施例，所述长dsrna分子包括100至10,000bp。182.根据一实施例，所述长dsrna分子包括100至1,000bp。183.根据一实施例，所述长dsrna分子包括10至1,000bp。184.根据一实施例，所述长dsrna分子包括10至100bp。185.根据一实施例，所述长dsrna分子包括一突出端，即一dsrna分子(即单链rna)的一非双链区域。186.根据一实施例，所述长dsrna分子不包括一突出端。187.根据一实施例，本发明的所述长dsrna分子可被加工成能够与rna诱导的沉默复合物(risc)结合的数个小rna分子。因此，本发明的所述长dsrna分子可作为细胞内rnai加工机制的一底物(即可为一前体rna分子)并且可被核糖核酸酶加工，包括但不限于dicer蛋白家族(例如dcr1及dcr2)、dicer样蛋白家族(例如dcl1、dcl2、dcl3、dcl4)、argonaute蛋白家族(例如ago1、ago2、ago3、ago4)、trna切割酶(例如rny1、血管生成素(angiogenin)、rnasep、rnasep样、slfn3、elac1及elac2)及piwi相互作用rna(pirna)相关蛋白(例如ago3、aubergine、hiwi、hiwi2、hiwi3、piwi、alg1及alg2)转化为数个小rna分子，如下文所详细讨论。188.本文中所使用的术语“植物”包括数个整株植物、一嫁接植物、所述数个植物的祖先和子代以及数个植物部分，包含数个种子、数个幼苗、数个茎、数个根(包含数个块茎)、数个根茎、数个接穗以及数个植物细胞、组织以及器官。所述植物可以是任何形式，包含数个悬浮培养物、数个胚、数个分生组织、数个愈伤组织、数个叶片、数个配子体、数个孢子体、数个花粉以及数个小孢子。在本发明的所述数个方法中可能有用的数个植物包含属于绿色植物总科(superfamilyviridiplantee)的所有植物，特别是选自以下的单子叶(monocotyledonous)和双子叶(dicotyledonous)植物，包含一饲料(fodder)或豆科植物、观赏植物、粮食作物、乔木或灌木(shrub)，选自包括以下列表：相思树属(acaciaspp.)、槭树属(acerspp.)、猕猴桃属(actinidiaspp.)、七叶树属(aesculusspp.)、澳大利亚贝壳杉(agathisaustralis)、苦合欢(albiziaamara)、三色桫椤(alsophilatricolor)、须芒草(andropogonspp.)、落花生属(arachisspp.)、槟榔(arecacatechu)、香桂(asteliafragrans)、鹰嘴紫云英(astragaluscicer)、多小叶红苏木(baikiaeaplurijuga)、桦木属(betulaspp.)、芸苔属(brassicaspp.)、木榄(bruguieragymnorrhiza)、伯克苏木(burkeaafricana)、紫铆花(buteafrondosa)、粉质胚乳白花菜(cadabafarinosa)、朱缨花属(calliandraspp.)、野茶树(camelliasinensis)、美人蕉(cannaindica)、大麻(cannabis)、cannabissativa、汉麻(hemp)、工业汉麻(industrialhemp)、辣椒属(capsicumspp.)、决明属(cassiaspp.)、距豌豆(centroemapubescens)、木瓜属(chacoomelesspp.)、肉桂(cinnamomumcassia)、小果咖啡(coffeaarabica)、可乐豆木(colophospermummopane)、变异小冠花(coronilliavaria)、枸子(cotoneasterserotina)、山楂属(crataegusspp.)、黄瓜属(cucumisspp.)、柏木属(cupressusspp.)、银蕨(cyatheadealbata)、榅桲(cydoniaoblonga)、日本柳杉(cryptomeriajaponica)、香茅属(cymbopogonspp.)、银蕨(cyntheadealbata)、榅桲(cydoniaoblonga)、货贝黄檀(dalbergiamonetaria)、大叶骨碎补(davalliadivaricata)、金钱草属(desmodiumspp.)、新西兰树蕨(dicksoniasquarosa)、拢双黄茅(dibeteropogonamplectens)、迪奥豆属(diocleaspp.)、扁豆属(dolichosspp.)、直矛豆(dorycniumrectum)、金字塔稗(echinochloapyramidalis)、红景天属(ehraffiaspp.)、穇子(eleusinecoracana)、幽眉草属(eragrestisspp.)、刺桐属(erythrinaspp.)、桉属(eucalypfusspp.)、假乌木(eucleaschimperi)、绒毛状金茅(eulaliavi/losa)、荞麦属(pagopyrumspp.)、费约果(feijoasellowlana)、草莓属(fragariaspp.)、千斤拔属(flemingiaspp.)、河岸藤露览树(freycinetiabanksli)、东亚老鹤草(geraniumthunbergii)、银杏(ginagobiloba)、野黄豆(glycinejavanica)、墨西哥丁香属(gliricidiaspp.)、陆地棉(gossypiumhirsutum)、银禅属(grevilleaspp.)、鞘杆古夷布提木(guibourtiacoleosperma)、岩黄蓍属(hedysarumspp.)、牛鞭草(hemaffhiaaltissima)、黄茅(heteropogoncontoffus)、大麦(hordeumvulgare)、红荀茅(hyparrheniarufa)、小连翅(hypericumerectum)、hypeffheliadissolute、异花木蓝(indigoincamata)、鸢尾属(irisspp.)、雨伞草(leptarrhenapyrolifolia)、胡枝子属(lespedizaspp.)、万苣属(lettucaspp.)、银合欢(leucaenaleucocephala)、单罗得草(loudetiasimplex)、lotonusbainesli、百脉根属(lotusspp.)、硬皮豆(macrotylomaaxillare)、苹果属(malusspp.)、木薯(manihotesculenta)、紫苜蓿(medicagosaliva)、水杉(metasequoiaglyptostroboides)、香蕉(musasapientum)、香蕉(banana)、烟草属(nicotianumspp.)、驴食豆属(onobrychisspp.)、鸟足豆属(ornithopusspp.)、稻属(oryzaspp.)、非洲双翼豆(peltophorumafricanum)、狼尾草属(pennisetumspp.)、酪梨(perseagratissima)、碧冬煎属(petuniaspp.)、菜豆属(phaseolusspp.)、加拿利海枣(phoenixcanariensis)、新西兰剑麻(phormiumcookianum)、石楠属(photiniaspp.)、白云杉(piceaglauca)、松属(pinusspp.)、豌豆(pisumsativam)、新西兰罗汉松(podocarpustotara)、斑点普格纳西亚草(pogonarthriafleckii)、礼普格纳西亚草(pogonaffhriasquarrosa)、杨属(populusspp.)、瓜叶牧豆(prosopiscineraria)、花旗松(pseudotsugamenziesii)、星状老虎刺(pterolobiumstellatum)、西洋梨(pyruscommunis)、栎属(quercusspp.)、厚叶石斑木(rhaphiolepsisumbellata)、美味棒花棕(rhopalostylissapida)、纳塔尔漆树(rhusnatalensis)、欧洲醋栗(ribesgrossularia)、荼荐子属(ribesspp.)、刺槐(robiniapseudoacacia)、蔷薇属(rosaspp.)、悬钩子属(rubusspp.)、柳属(salixspp.)、红裂稃草(schyzachyriumsanguineum)、金松(sciadopitysvefficillata)、北美红杉(sequoiasempervirens)、巨杉(sequoiadendrongiganteum)、两色高梁(sorghumbicolor)、菠菜属(spinaciaspp.)、流苏状鼠尾粟(sporobolusfimbriatus)、苦豆草(stiburusalopecuroides)、矮柱花草(stylosanthoshumilis)、葫芦茶属(tadehagispp.)、落羽杉(taxodiumdistichum)、阿拉伯黄背草(themedatriandra)、三叶草属(trifoliumspp.)、小麦属(triticumspp.)、异叶铁杉(tsugaheterophylla)、越桔属(vacciniumspp.)、蚕豆属(viciaspp.)、葡萄(vitisvinifera)、锥穗沃森花(watsoniapyramidata)、马蹄莲(zantedeschiaaethiopica)、玉蜀黍(zeamays)、苋菜(amaranth)、洋蓟(artichoke)、芦笋(asparagus)、球花甘蓝(broccoli)、抱子甘蓝(brusselssprouts)、卷心菜、油菜(canola)、胡萝卜、花椰菜、芹菜、绿叶羽衣甘蓝(collardgreens)、亚麻(flax)、散叶甘蓝(kale)、小扁豆(lentil)、油籽油菜(oilseedrape)、秋葵、洋葱、马铃薯、水稻、大豆、稻草、甜菜、甘蔗、向日葵、西红柿、南瓜茶(squashtea)、树。或者，藻类和其它非绿色植物(non‑viridiplantae)可以用于本发明的一些实施例的方法。189.根据一具体的实施例，所述植物是一作物、一开花植物、一杂草或一桥木。190.根据一具体的实施例，所述植物是一木本(woody)植物物种，例如，猕猴桃(actinidiachinensis)(猕猴桃科(actinidiaceae))、木薯(manihotesculenta)(大戟科(euphorbiaceae))、北美鹅掌楸(firiodendrontulipifera)(木兰科(magnoliaceae))、杨树(populus)(杨柳科(salicaceae))、檀香树(santalumalbum)(檀香科(santalaceae))、榆树(ulmus)(榆科(ulmaceae))以及蔷薇科(rosaceae)(苹果、李、梨)和芸香科(rutaceae)(柑桔、小柠檬)的不同物种、裸子植物(例如，白云杉(piceaglauca)和火炬松(pinustaeda))、林木(例如，桦木科(betulaceae)、壳斗科(fagaceae)、裸子植物以及热带树种)、果树、灌木或草本植物(例如，香蕉、可可、椰子、咖啡、枣子、葡萄以及茶)以及油棕。191.根据一具体的实施例，所述植物是一热带作物，例如，咖啡、澳洲坚果、香蕉、菠萝、芋头、木瓜、芒果、大麦、豆类、木薯、鹰嘴豆、可可(巧克力)、豇豆、玉米(maize)(玉米(corn))、小米、水稻、高粱、甘蔗、甘薯、烟草、芋头、茶、山药。[0192]“谷物(grain)”、“种子”或“豆”是指一开花植物的繁殖单位，能够发育成另一种这样的植物。如本文中所使用，所述数个术语同义地且可互换地使用。[0193]根据一具体的实施例，所述植物是一植物细胞，例如一胚胎细胞悬浮液中的植物细胞。[0194]根据一具体的实施例，所述植物细胞是一原生质体。[0195]所述数个原生质体来源自任何植物组织，例如水果、数个花朵、数个根、数个叶、数个胚、胚细胞悬浮液、愈伤组织或幼苗组织。[0196]根据一具体的实施例，所述植物细胞是一胚发生细胞。[0197]根据一具体的实施例，所述植物细胞是一体细胞胚发生细胞。[0198]如本文所使用，术语“植物基因”是指所述植物中的任何基因，例如内源基因，所述内源基因可被修饰以针对一有害生物基因赋予沉默特异性。[0199]根据一实施例，所述植物基因是一非编码基因(例如非蛋白质编码基因)。[0200]根据一实施例，所述植物基因是一编码基因(例如蛋白质编码基因)。[0201]根据一实施例，所述植物基因(即表现出与所述有害生物基因的所述核酸序列具有同源性的所述预定序列)不编码一沉默分子。[0202]根据一实施例，所述植物基因不编码具有一内在沉默活性的一分子(例如rna分子，例如非编码rna分子，如下文所详细讨论)。[0203]根据一实施例，所述植物基因编码具有一内在沉默活性的一分子(例如rna分子，例如非编码rna分子，如下文所详细讨论)。[0204]如本文所使用，术语“有害生物(pest)”是指直接或间接伤害所述植物的生物。一直接作用包括例如，以植物叶子为食。间接作用包括例如，一疾病因子(例如一病毒、一细菌等)向所述植物的传播。在后一种情况下，所述有害生物是一病原体传播的载体。[0205]根据一些实施例，有害生物是一无脊椎有害生物，包括通过例如但不限于摄取及/或浸泡的数个方法对长dsrna敏感的一无脊椎有害生物。每种可能性代表本发明的一单独实施例。根据一些实施例，对26bp以上(可能地为26至50bp)的长dsrna敏感的一无脊椎有害生物。每种可能性代表本发明的一单独实施例。[0206]根据一实施例，所述有害生物是一无脊椎生物(invertebrateorganism)。[0207]数个示例性有害生物包括但不限于昆虫、线虫、蜗牛、蛞蝓、蜘蛛、毛虫(caterpillars)、蝎子、螨虫(mites)、蜱虫(ticks)、真菌等。[0208]数个有害生物包括但不限于选自鞘翅目(例如甲虫)、双翅目(例如苍蝇、蚊子)、膜翅目(例如锯蝇、黄蜂、蜜蜂及蚂蚁)、鳞翅目(例如蝴蝶及飞蛾)、食毛目(mallophaga)(例如虱子，例如咀嚼虱、咬虱及鸟虱)、半翅目(例如真正的臭虫)、同翅目包括胸口亚目(例如蚜虫、粉虱及介壳虫)、颈喙亚目(auchenorrhyncha)(例如蝉、叶蝉、树蝉、飞虱及沬蝉(spittlebugs))、鞘喙亚目(coleorrhyncha)(例如苔藓虫及甲虫)、直翅目(例如蚱蜢、蝗虫及蟋蟀，包括蚱蜢及蟋蟀)、缨翅目(例如蓟马)、革翅目(dermaptera)(例如耳螟)、等翅目(例如白蚁)、虱目(anoplura)(例如吸虱)、虹吸目(例如跳蚤)、毛翅目(如石蛾)等的昆虫。[0209]本发明的有害生物包括但不限于玉米：欧洲玉米螟(ostrinianubilalis)；球菜夜蛾(agrotisipsilon)；玉米穗虫(helicoverpazea)；秋粘虫(spodopterafrugiperda)；西南玉米螟(diatraeagrandiosella)；小玉米茎蛀虫(elasmopalpuslignosellus)；甘蔗螟虫(diatraeasaccharalis)；西部玉米根虫(diabroticavirgifera)；北方玉米根虫(diabroticalongicornisbarberi)；南方玉米根虫(diabroticaundecimpunctatahowardi)；叩头虫属金针虫(melanotusspp.)；北方蒙面金龟子(白蛴螬)(cyclocephalaborealis)；南方蒙面金龟子(白蛴螬)(cyclocephalaimmaculata)；日本甲虫(popilliajaponica)；玉米跳蚤甲虫(chaetocnemapulicaria)；玉米蝾螈(sphenophorusmaidis)；玉米叶蚜(rhopalosiphummaidis)；玉米根蚜(anuraphismaidiradicis)；蝾螈(blissusleucopterusleucopterus)；红腿蚱蜢(melanoplusfemurrubrum)；迁徙蚱蜢(melanoplussanguinipes)；玉米蛆(hylemyaplatura)；玉米斑潜叶虫(agromyzaparvicornis)；草蓟马(anaphothripsobscrurus)；窃蚁(solenopsismilesta)；二斑叶螨(tetranychusurticae)；高粱：高粱螟(chilopartellus)；秋粘虫(spodopterafrugiperda)；玉米穗虫(helicoverpazea)；小玉米茎蛀虫(elasmopalpuslignosellus)；粒状蠕虫(feltiasubterranea)；白蛴螬(phyllophagacrinita)；线虫(eleodes、conoderus及aeolusspp.)；谷叶甲虫(oulemamelanopus)；玉米跳蚤甲虫(chaetocnemapulicaria)；玉米蝾螈(sphenophorusmaidis)；玉米叶蚜(rhopalosiphummaidis)；黄色甘蔗蚜虫(siphaflava)；蝾螈(blissusleucopterusleucopterus)；高粱蠓(contariniasorghicola)；胭脂红叶螨(tetranychuscinnabarinus)；二斑叶螨(tetranychusurticae)；小麦：粘虫(pseudaletiaunipunctata)；秋粘虫(spodopterafrugiperda)；小玉米茎蛀虫(elasmopalpuslignosellus)；西部地老虎(agrotisorthogonia)；elasmopalpuslignosellus(elasmopalpuslignosellus)；谷叶甲虫(oulemamelanopus)；三叶草象鼻虫(hyperapunctata)；南方玉米根虫(diabroticaundecimpunctatahowardi)；俄罗斯小麦蚜虫；绿蚧(schizaphisgraminum)；英国粮蚜(macrosiphumavenae)；红腿蚱蜢(melanoplusfemurrubrum)；差异蚱蜢(melanoplusdifferentis)；迁徙蚱蜢(melanoplussanguinipes)；黑森瘿蚊(mayetioladestructor)；小麦蠓(sitodiplosismosellana)；小麦茎蛆(meromyzaamericana)；小麦鳞茎苍蝇(hylemyacoarctate)；烟草蓟马(frankliniellafusca)；小麦茎叶蜂(cephuscinctus)；小麦卷曲螨(aceriatulipae)；向日葵：向日葵芽蛾(suleimahelianthana)；向日葵蛾(homoeosomalectellum)；向日葵甲虫(zygogrammaexclamationis)；胡萝卜甲虫(bothyrusgibbosus)；葵花籽蠓(neolasiopteramurtfeldtiana)；棉花：棉虫(heliothisvirescens)；棉铃虫(helicoverpazea)；甜菜夜蛾(spodopteraexigua)；粉红铃虫(pectinophoragossypiella)；棉铃象鼻虫(anthonomusgrandis)；棉蚜(aphisgossypii)；棉跳蚤(pseudatomoscelisseriatus)；带翅粉虱(trialeurodesabutilonea)；褪泽植物臭虫(lyguslineolaris)；红腿蚱蜢(melanoplusfemurrubrum)；差异蚱蜢(melanoplusdifferentis)；洋葱蓟马(thripstabaci,)；烟草蓟马(franklinkiellafusca)；胭脂红叶螨(tetranychuscinnabarinus)；二斑叶螨(tetranychusurticae)；水稻：甘蔗螟(diatraeasaccharalis)；秋粘虫(spodopterafrugiperda)；玉米穗虫(helicoverpazea)；葡萄肖叶甲(colaspisbrunnea)；稻水象鼻虫(lissorhoptrusoryzophilus)；水稻象鼻虫(sitophilusoryzae)；稻叶蝉(nephotettixnigropictus)；蝾螈(blissusleucopterusleucopterus)；绿色臭虫(acrosternumhilare)；大豆：大豆活瓣(pseudoplusiaincludens)；天鹅绒毛虫(anticarsiagemmatalis)；绿色三叶草(plathypenascabs)；欧洲玉米螟(ostrinianubilalis)；黑地老虎(agrotisipsilon)；甜菜夜蛾(spodopteraexigua)；棉虫(heliothisvirescens)；棉铃虫(helicoverpazea)；墨西哥豆甲虫(epilachnavarivestis)；绿桃蚜(myzuspersicae)；马铃薯叶蝉(empoascafabae)；绿色臭虫(acrosternumhilare)；红腿蚱蜢(melanoplusfemurrubrum)；差异蚱蜢(melanoplusdifferentis)；玉米蛆(hylemyaplatura)；大豆蓟马(sericothripsvariabilis)；洋葱蓟马(thripstabaci)；草莓红蜘蛛(tetranychusturkestani)；二斑叶螨(tetranychusurticae)；大麦：欧洲玉米螟(ostrinianubilalis)；黑地老虎(agrotisipsilon)；绿蚧(schizaphisgraminum)；蝾螈(blissusleucopterusleucopterus)；绿色臭虫(acrosternumhilare)；棕色臭虫(euschistusservus)；玉米蛆(deliaplatura)；黑森瘿蚊(mayetioladestructor)；褐麦螨(petrobialatens)；油菜油菜：甘蓝蚜虫(brevicorynebrassicae)；跳蚤甲虫(phyllotretacruciferae)；宽领夜蛾(mamestraconfigurata)；小菜蛾(plutellaxylostella)；根蛆(deliassp.)。[0210]示例性线虫包含但不限于，穴居线虫(burrowingnematode)(穿孔线虫(radopholussimilis))、秀丽隐杆线虫(caenorhabditiselegans)、阿拉伯咖啡穿孔线虫(radopholusarabocoffeae)、咖啡根腐线虫(pratylenchuscoffeae)、根结线虫(root‑knotnematode)(根结线虫属(meloidogynespp.)、孢囊线虫(cystnematode)(异皮线虫属(heteroderaspp.)和球异皮线虫属(globoderaspp.))、根腐线虫(rootlesionnematode)(根腐线虫属(pratylenchusspp.))、甘薯茎线虫(stemnematode)(茎线虫(ditylenchusdipsaci))、松树萎蔫线虫(pinewiltnematode)(松材线虫(bursaphelenchusxylophilus))、肾形线虫(reniformnematode)(肾形线虫(rotylenchulusreniformis))、匕首线虫(xiphinemaindex)、假根瘤线虫(nacobbusaberrans)以及叶芽线虫(aphelenchoidesbesseyi)。[0211]示例性真菌包含但不限于，尖孢镰刀菌(fusariumoxysporum)、油菜茎基溃疡病菌(leptosphaeriamaculans)(和春油菜黑胫病(phomalingam))、油菜菌核病菌(sclerotiniasclerotiorum)、水稻稻瘟病菌(pyriculariagrisea)、藤仓赤霉菌(gibberellafujikuroi)念珠镰孢(fusariummoniliforme)、稻瘟病菌(magnaportheoryzae)、灰葡萄孢霉(botrytiscinereal)、柄锈双单孢菌属(pucciniaspp.)、禾谷镰孢(fusariumgraminearum)、禾本科布氏白粉菌(blumeriagraminis)、禾生球腔菌(mycosphaerellagraminicola)、炭疽菌属(colletotrichumspp.)、玉米黑粉菌(ustilagomaydis)、亚麻栅锈菌(melampsoralini)、豆薯层锈菌(phakopsorapachyrhizi)以及立枯丝核菌(rhizoctoniasolani)。[0212]根据一具体的实施例，所述有害生物是蚂蚁、白蚁、蜜蜂、黄蜂、毛虫、蟋蟀、蝗虫、甲虫、蜗牛、蛞蝓、线虫、臭虫(bug)、苍蝇、果蝇、粉虱、蚊子、蚱蜢、飞虱、螟虫、蚜虫、鳞片、蓟马、蜘蛛、螨虫、木虱、蜱虫、飞蛾、蠕虫及蝎子，及处于不同生命周期阶段的蚂蚁、蜜蜂、黄蜂、毛虫、甲虫、蜗牛、蛞蝓、线虫、臭虫、苍蝇、粉虱、蚊子、蚱蜢、蜈蚣、蚜虫、鳞片、蓟马、蜘蛛、螨虫、木虱及蝎子。[0213]根据一具体的实施例，所述有害生物处于其生命的任何生命周期阶段。[0214]根据一实施例，所述有害生物是一病毒。[0215]短语“沉默一害生物基因(silencingapestgene)”是指与未通过本发明设计的长dsrna分子靶向的一有害生物基因相比，将一多核苷酸或由其编码的多肽的表达水平降低至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或100％。[0216]用于测量一多核苷酸或由其编码的多肽的表达水平的数个测定包括但不限于rt‑pcr、西方墨点法(westernblot)、免疫组织化学(immunohistochemistry)及/或流式细胞术(flowcytometry)、测序(sequencing)或任何其他检测方法(如下文所进一步讨论)。[0217]优选地，所述有害生物基因的沉默引起所述有害生物的抑制、控制及/或死亡，从而限制所述有害生物对所述植物造成的损害。控制一有害生物包括但不限于杀死所述有害生物、抑制所述有害生物的发育、改变所述有害生物的繁殖力或生长，以使所述有害生物对所述植物造成较少损害、减少产生的后代数量、产生不适合的有害生物、产生更容易受到捕食者攻击的有害生物、或阻止所述有害生物吃所述植物。[0218]如本文所使用，术语“有害生物基因(pestgene)”是指对于生长、发育、繁殖或传染性必不可少的所述有害生物中的任何基因。所述基因可在所述有害生物的任何组织中表达，然而，在一具体的实施例中，靶向抑制所述有害生物的所述数个基因在所述有害生物的肠道组织的数个细胞、所述有害生物的中肠的数个细胞、肠腔或中肠内壁的数个细胞、所述有害生物的肠道微生物组的数个细胞及所述有害生物的免疫系统的数个细胞中表达。此类靶基因可参与例如肠道细胞代谢、生长、分化及免疫系统。[0219]通过所述数个本方法所靶向的示例性有害生物基因包括但不限于下表1a至b中所列出的所述数个基因。[0220]根据一具体的实施例，所述线虫基因包括类似放射线虫(radopholussimilis)数个基因钙网蛋白13(calreticulin13。crt)或胶原蛋白5(col‑5)。[0221]根据一具体的实施例，真菌基因包括尖孢镰刀菌(fusariumoxysporum)数个基因fow2、frp1及opr。[0222]根据一实施例，与受所述有害生物伤害且未施用本发明设计的长dsrna分子的一植物相比，沉默一有害生物基因(silencingapestgene)，减少了一植物中的数个疾病症状或减少了对所述植物至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或100％的损害(由所述有害生物引起)。[0223]测量一有害生物的控制的数个测定是本领域众所周知的，参见例如通过引用并入本文的美国专利号5,614,395。此类数个技术包括随时间测量平均病灶直径(averagelesiondiameter)、病原体生物量(pathogenbiomass)及数个腐烂植物组织的总体百分比(overallpercentageofdecayedplanttissues)。举例而言，参见通过引用并入本文的thomma等人(1998)plantbiology95:15107‑15111。另参见baum等人(2007)naturebiotech11:1322‑1326及wo2007/035650，同时提供了数个整株植物饲喂试验及数个玉米根饲喂试验。[0224]根据一实施例，所述方法包括选择一植物基因的一核酸序列，所述植物基因的所述核酸序列与所述有害生物基因的一核酸序列表现出一预定序列同源性。[0225]根据一实施例，所述植物基因的所述核酸序列与所述有害生物基因的所述核酸序列之间的所述序列同源性包括60％至100％、70％至80％、70％至90％、70％至100％、75％至100％、80％至90％、80％至100％、85％至100％、90％至100％或95％至100％同一性。[0226]根据一具体的实施例，所述序列同源性包括所述植物基因的所述核酸序列与所述有害生物基因的所述核酸序列之间的75％至100％同一性。[0227]根据一具体的实施例，所述序列同源性包括所述植物基因的所述核酸序列与所述有害生物基因的所述核酸序列之间的85％至100％同一性。[0228]根据一具体的实施例，所述序列同源性包括所述植物基因的所述核酸序列与所述有害生物基因的所述核酸序列之间的75％至100％同一性。[0229]根据一实施例，所述序列同源性包括所述植物基因的所述核酸序列与所述有害生物基因的所述核酸序列之间的至少50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。[0230]同源性(例如，同源性百分比、序列同一性 序列相似性)可使用计算成一对序列比对(pairwisesequencealignment)的任何同源性比较软件来确定。[0231]如本文所使用，在两个核酸或多肽序列的上下文中的“序列同一性”或“同一性”包括指在比对(aligned)时相同的两个序列中的所述数个残基。当序列同一性百分比用于数个蛋白质时，应认识到，不相同的数个残基位置通常因数个保守氨基酸取代(conservativeaminoacidsubstitutions)而不同，其中数个氨基酸残基被具有数个相似化学性质(例如电荷或疏水性)的数个其他氨基酸残基取代而因此不会改变所述分子的所述数个功能性质。当数个序列在数个保守取代(conservativesubstitutions)方面不同时，可以向上调整所述序列同一性百分比以校正所述取代的所述保守本质。通过此数个保守取代(suchconservativesubstitutions)而有所不同的数个序列被认为具有“序列相似性”或“相似性”。进行这种调整的数个手段是本领域技术人员众所周知的。一般而言，这涉及将一保守取代评分为一部分错配(partialmismatch)而不是一完全错配(fullmismatch)，从而增加所述序列同一性百分比。因此，举例而言，如果一相同氨基酸的评分为1，而一非保守取代的评分为0，则保守取代的评分介于0及1之间。数个保守取代的评分是例如根据henikoffs及henikoffjg的演演算法(aminoacidsubstitutionmatricesfromproteinblocks.proc.natl.acad.sci.，美国，1992年，89(22):10915至9)来计算的。[0232]可以使用任何同源性比较软件，包括例如国家生物技术信息中心(nationalcenterofbiotechnologyinformation，ncbi)的blastn软件，例如通过使用数个默认参数(defaultparameters)，来确定同一性(例如，同源性百分比)。[0233]根据本发明的一些实施例，所述同一性是一全局同一性(globalidentity)，即本发明的所述整个氨基酸或数个核酸序列的同一性，而不是其数个部分的同一性。[0234]根据本发明的一些实施例，术语“同源性(homology)”或“同源的(homologous)”是指两个或多个核酸序列的同一性；或两个或多个氨基酸序列的同一性；或一氨基酸序列与一或多个核酸序列的同一性。[0235]根据本发明的一些实施例，所述同源性是一全局同源性(globalhomology)，即本发明的所述整个氨基酸或核酸序列的同源性，而不是其数个部分的同源性。[0236]两个或多个序列之间的同源性或同一性程度可以使用各种已知的序列比较工具来确定。以下是可与本发明的一些实施例一起使用的此类工具的一非限制性描述。[0237]当从一多核苷酸序列开始并与其他多核苷酸序列进行比较时，emboss‑6.0.1needleman‑wunsch演演算法(可从emboss(dot)sourceforge(dot)net/apps/cvs/emboss/apps/needle(dot)html获得)可以与以下数个默认参数一起使用：(emboss‑6.0.1)间隙开启(gapopen)＝10；间隙扩展(gapextend)＝0.5；数据文件＝ednafull；总结(brief)＝是(yes)。[0238]根据本发明的一些实施例，与emboss‑6.0.1needleman‑wunsch演算法一起使用的所述数个参数是间隙开启(gapopen)＝10；间隙扩展(gapextend)＝0.2；数据文件＝ednafull；总结(brief)＝是(yes)。[0239]根据本发明的一些实施例，用于比较数个多核苷酸与数个多核苷酸的用于使用emboss‑6.0.1needleman‑wunsch演算法来确定同源性的所述阈值为80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。[0240]根据一些实施例，同源性程度的确定还需要采用smith‑waterman演算法(用于蛋白质‑蛋白质比较或核苷酸‑核苷酸比较)。[0241]gencore6.0smith‑waterman演算法的所述默认参数包括：model＝sw.model。[0242]根据本发明的一些实施例，用于使用smith‑waterman演算法确定同源性的所述阈值为80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。[0243]根据本发明的一些实施例，在执行与感兴趣的所述多肽或多核苷酸的所述全局同源性之前(例如整个序列有80％的全局同源性)，对通过与感兴趣的所述多肽或多核苷酸的局部同源性(localhomology)(例如超过60％的所述序列长度的60％同一性)预选的序列进行所述总体同源性。举例而言，数个同源序列是使用blast软件选择的，其中所述blastp及tblastn演算法作为所述第一阶段的数个过滤器，且所述针(needle)(emboss包)或frame 演算法比对用于所述第二阶段。局部同一性(数个blast比对)的定义非常宽松‑在60％的所述数个序列长度跨度上具有60％的同一性，因为它仅用作所述全局比对阶段的一过滤器。在所述特定实施例中(当使用所述局部同一性时)，不使用所述blast包的所述默认过滤(通过设置参数“‑ff”)。[0244]在所述第二阶段中，基于与所述核心基因多肽序列至少80％的全局同一性来定义数个同源物。根据一些实施例，所述同源性是一局部同源性或一局部同一性。[0245]数个局部比对工具包括但不限于美国国家生物技术信息中心(ncbi)的blastp、blastn、blastx或tblastn软件、fasta及smith‑waterman演算法。[0246]根据一具体的实施例，同源性是使用具有以下数个参数的blastn确定的：数个最大靶序列＝1000，期望阈值＝10，字大小(wordsize)＝11，匹配分数＝2，不匹配分数＝‑3，间隙存在成本＝5，间隙扩展成本＝2。[0247]根据一具体的实施例，通过鉴定与所述有害生物转录物具有“数个同源性延伸(homologystretches)”的数个植物转录物来选择表现出与所述有害生物基因的一核酸序列具有一预定序列同源性的一植物基因的一核酸序列。根据一具体的实施方案，所述同源性延伸是在所述整个植物转录物上的20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、35个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个、50个、100个、150个、200个、250个、300个、400个、500个、600个、700个、800个、900个、1000个、1500个、2000个、2500个、3000个、3500个、4000个、4500个、5000个、5500个、6000个、7000个、8000个、9000个、10,000个或更多个核苷酸(例如20个至50个核苷酸、20个至25个核苷酸，例如21个核苷酸)。在所述20个至50个核苷酸(例如21个核苷酸)内，所述植物转录物与所述有害生物转录物的同源性优选为75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％。[0248]根据一具体的实施例，当所述有害生物是一线虫(heteroderaglines)时，所述有害生物基因如保藏号af469060.1(大豆胞囊线虫泛素延伸蛋白(heteroderaglycinesubiquitinextensionprotein))所述，所述植物基因如nm_001203752.2(拟南芥泛素11(arabidopsisthalianaubiquitin11)(ubq11))所述。[0249]根据一具体的实施例，当所述有害生物是一线虫(heteroderaglines)时，所述有害生物基因如保藏号af500024.1(大豆胞囊线虫假定腺蛋白g8h07(heteroderaglycinesputativeglandproteing8h07))所述，植物基因如nm_116351.7(拟南芥糖基转移酶家族1蛋白(arabidopsisthalianaglycosyltransferasefamily1protein)(at4g01210))所述。[0250]根据一具体的实施例，当所述有害生物是一线虫(大豆胞囊线虫(heteroderaglycines))时，所述有害生物基因如保藏号af502391.1(大豆胞囊线虫假定腺蛋白g10a06(heteroderaglycinesputativeglandproteing10a06))所述，植物基因如nm_001037071.1(拟南芥bzip转录因子家族蛋白(arabidopsisthalianabziptranscriptionfactorfamilyprotein，tga1))所述。[0251]根据一实施例，所述方法包括修饰编码一rna分子的一植物内源核酸序列，以针对所述植物基因赋予沉默特异性，使得能够募集rna依赖型rna聚合酶(rdrp)的数个小rna分子与所述植物基因的一转录物形成碱基互补，所述数个小rna分子是从rna加而来的，以产生能够沉默所述有害生物基因的所述长dsrna分子。[0252]根据一实施例，所述rna分子是一非编码rna分子。[0253]如本文所使用，术语“非编码rna分子”是指未转译成一氨基酸序列且不编码一蛋白质的一rna序列。[0254]根据一实施例，编码所述rna分子的所述核酸序列位于一非编码基因(例如非蛋白质编码基因)中。所述基因组的示例性非编码部分包括但不限于数个内含子、数个非编码rna的数个基因、数个dna甲基化区、数个增强子及数个基因座控制区、数个绝缘子、数个s/mar序列、数个非蛋白质编码假基因(non‑protein‑codingpseudogenes)、数个转座子(transposons)、数个非自主转座元件(non‑autonomoustransposableelements)(例如alu、sines及突变的数个非编码转座子及反转录转座子)以及数个染色体着丝粒及端粒区域的数个简单重复。[0255]根据一实施例，编码所述rna分子的所述核酸序列位于普遍表达的一非编码基因中。[0256]根据一实施例，编码所述rna分子的所述核酸序列位于以一组织特异性方式(例如在一叶片、果实或花朵中)表达的一非编码基因中。[0257]根据一实施例，编码所述rna分子的所述核酸序列位于以一诱导方式表达的一非编码基因中。[0258]根据一实施例，编码所述rna分子的所述核酸序列位于受发育性调节的一非编码基因中。[0259]根据一实施例，编码所述rna分子的所述核酸序列位于数个基因之间，即位于基因间区域(intergenicregion)。[0260]根据一实施例，编码所述rna分子的所述核酸序列位于一非编码基因的一内含子内。[0261]根据一实施例，编码所述rna分子的所述核酸序列位于编码基因(例如蛋白质编码基因)中。[0262]根据一实施例，编码所述rna分子的所述核酸序列位于一编码基因(例如蛋白质编码基因)的一外显子内。[0263]根据一实施例，编码所述rna分子的所述核酸序列位于编码一编码基因(例如蛋白质编码基因)的一非转译区(utr)的一外显子内。[0264]根据一实施例，编码所述rna分子的所述核酸序列位于一编码基因(例如蛋白质编码基因)的一转译外显子内。[0265]根据一实施例，编码所述rna分子的所述核酸序列位于一编码基因(例如蛋白质编码基因)的一内含子内。[0266]根据一实施例，编码所述rna分子的所述核酸序列位于普遍表达的一编码基因内。[0267]根据一实施例，编码所述rna分子的所述核酸序列位于以一组织特异性方式(例如在一叶片、果实或花朵中)表达的一编码基因内。[0268]根据一实施例，编码所述rna分子的所述核酸序列位于以一诱导方式表达的一编码基因内。[0269]根据一实施例，编码所述rna分子的所述核酸序列位于发育性调节的一编码基因中。[0270]根据一实施例，所述rna分子(例如非编码rna分子)通常受到所述rna沉默加工机制或活性所影响。然而，本文还考虑了数个核苷酸的一些改变(例如，对于多达24个核苷酸activityrepression)是通过数个表观遗传相关因子(epigenetic‑relatedfactors)所介导的，例如数个甲基转移酶(methyl‑transferases)、甲基化靶dna(methylatetargetdna)及数个组蛋白(histones)。因此，在共转录基因沉默中，一小rna与一靶rna的所述关联(association)(小rna转录相互作用)破坏了所述靶新生转录物的稳定性，并招募了诱导染色质重塑成抑制基因活性及转录的一结构的数个dna及组蛋白修饰酶(dna‑andhistone‑modifyingenzymes)(即数个表观遗传因子)。此外，在共转录基因沉默中，数个染色质相关的长非编码rna支架(chromatin‑associatedlongnon‑codingrnascaffolds)可以独立于数个小rna招募数个染色质修饰复合物(chromatin‑modifyingcomplexes)。这些共转录沉默机制形成数个rna监视系统，所述数个rna监视系统检测及沉默不合适的数个转录事件，并通过数个自我增强表观遗传环(self‑reinforcingepigeneticloops)提供这些事件的一存储(如叙述于下述文献中:d.hoch及d.moazed,rna‑mediatedepigeneticregulationofgeneexpression,natrevgenet.(2015)16(2):71–84]。[0284]根据本发明的一实施例，所述rnai生物发生/加工机制(rnaibiogenesis/processingmachinery)产生所述rna沉默分子。[0285]根据本发明的一实施例，所述rnai生物发生/加工机制(rnaibiogenesis/processingmachinery)产生所述rna沉默分子，但尚未鉴定出具体的靶(specifictarget)。[0286]根据一实施例，所述rna分子(例如非编码rna分子)能够诱导rna干扰(rnai)。[0287]根据一实施例，所述rna分子(例如非编码rna分子或rna沉默分子)是由一前体(precursor)加工而成的。[0288]根据一实施例，所述rna分子(例如非编码rna分子或所述rna沉默分子)是由一单链rna(ssrna)前体加工而成的。[0289]根据一实施例，所述rna分子(例如非编码rna分子或所述rna沉默分子)是由一双链体结构的单链rna前体加工而成的。[0290]根据一实施例，所述rna分子(例如非编码rna分子或所述rna沉默分子)是由一dsrna前体(例如包括完美及不完美碱基配对)加工而成的。[0291]根据一实施例，所述rna分子(例如非编码rna分子或所述rna沉默分子)是由一非结构化rna前体加工而成的。[0292]根据一实施例，所述rna分子(例如非编码rna分子或所述rna沉默分子)是由一蛋白质编码rna前体加工而成的。[0293]根据一实施例，所述rna分子(例如非编码rna分子或所述rna沉默分子)是由一rna前体加工而成的。[0294]根据一实施例，所述rna分子(例如非编码rna分子或所述rna沉默分子)被加工并与rna诱导沉默复合物(rna‑inducedsilencingcomplex，risc)结合。[0295]根据一实施例，所述rna分子(例如非编码rna分子或rna沉默分子)被加工并与rnai加工机制结合，所述rnai加工机制例如为核糖核酸酶，包括但不限于dicer、ago2、所述dicer蛋白家族(例如dcr1及dcr2)、dicer样蛋白家族(dicer‑likeproteinfamily)(例如dcl1、dcl2、dcl3、dcl4)、argonaute蛋白家族(例如ago1、ago2、ago3、ago4)、数个trna切割酶(例如rny1、血管生成素、rna酶p、rna酶p样、slfn3、elac1及elac2)及piwi相互作用rna(pirna)相关蛋白(例如ago3、aubergine、hiwi、hiwi2、hiwi3、piwi、alg1及alg2)(如下文所进一步讨论的)。[0296]根据一实施例，dsrna可源自两种不同的数个互补rna，或源自本身折迭形成dsrna的单一rna。[0297]以下是数个rna沉默分子(例如非编码rna分子)的一详细叙述，所述数个rna沉默分子与rna诱导沉默复合物(risc)结合，并包括可根据本发明的数个具体实施例使用的一内在rnai活性(例如是数个rna沉默分子)。[0298]基于完全和不完全的配对rna(即双链rna；dsrna)、sirna以及shrna‑在数个细胞中数个长dsrna的存在刺激一核糖核酸酶iii酶(ribonucleaseiiienzyme)(称为dicer)的活性。dicer(也称为核糖核酸内切酶dicer或具有rnase基序的解螺旋酶(helicase))是一种在数个植物中通常被称为dicer样(dcl)蛋白的酶。不同植物具有不同数量的dcl基因，因此，例如，拟南芥(arabidopsis)基因组通常具有四个dcl基因，水稻具有八个dcl基因，且玉蜀黍基因组具有五个dcl基因。dicer参与将所述dsrna加工成数个短片段的dsrna(称为短干扰rna(sirna))的过程。源自dicer活性的sirna的长度通常为约21至约23个核苷酸，且包括具有两个3’核苷酸突出端的约19个碱基对双链体。[0299]根据一个实施例，使用长于21bp的数个dsrna前体。各种研究表明，长的dsrna可用于沉默基因表达而不会诱导应激反应或引起显着的脱靶作用‑例如参见(strat等人，nucleicacidsresearch，2006年，第34卷，第13号：3803至3810；bhargavaa等人，brainres.protoc.，2004年，13：115至125；diallom.等人，oligonucleotides，2003年，13：381至392；paddisonp.j.等人，proc.natlacad.sci.usa，2002年；99：1443至1448；trann.等人，febslett.，2004年，573：127至134)。[0300]术语“sirna”是指诱导所述rna干扰(rnai)途径的小的抑制性rna双链体(通常在18至30个碱基对之间)。通常，sirna被化学合成为21个聚体(mer)，具有一中心19bp双链体区域且在末端具有对称的2‑碱基3’‑突出端，尽管最近已经描述了化学合成的25至30个碱基长的rna双链体与在相同位置处具有21个聚体相比，效力可提高100倍。表明使用较长的rna触发rnai所获得的观察到的提高效力是由为dicer提供一基质(27个聚体)而不是一产物(21个聚体)引起的，这提高了所述sirna双链体进入risc的速度或效率。[0301]已经发现，所述3’‑突出端的位置(而不是组成)影响一sirna的效力，且在反义链上具有一3’‑突出端的不对称双链体通常比在有义链上具有所述3’‑突出端的不对称双链体更有效力(rose等人，2005年)。[0302]一双链干扰rna(例如，sirna)的数个链可以连接以形成一发夹(hairpin)或茎环(stem‑loop)结构(例如，一shrna)。因此，如上所述，本发明的一些实施例的所述rna沉默分子也可以是一短发夹rna(shrna)。[0303]如本文中所使用，术语短发夹rna(“shrna”)是指具有一茎环结构的一rna分子，包括互补序列的一第一及第二区域，互补程度和所述数个区域的方向足以使得在所述数个区域之间发生碱基配对，所述第一和第二区域通过一环区域连接，所述环是由于所述环区域内的数个核苷酸(或数个核苷酸类似物)之间缺乏碱基配对而导致的。所述环中的数个核苷酸数目是介于且包含3至23、或5至15、或7至13、或4至9、或9至11之间的数字，在所述环中的一些所述数个核苷酸可以参与所述环中的其他核苷酸的碱基配对交互作用。可以用于形成所述环的数个寡核苷酸序列的实例包含5’‑caagaga‑3及5’‑uuacaa‑3’(国际专利申请号wo2013126963和wo2014107763)。本领域技术人员将意识到，由此产生的单链寡核苷酸形成一茎环或发夹结构，包括能够与所述rnai机制相互作用的一双链区。[0304]本发明的一些实施例的所述rna沉默分子不必限于仅含有rna的那些分子，而是进一步包括数个化学修饰的核苷酸和非核苷酸。[0305]本发明考虑了各种类型的sirna，包含反式作用sirna(tasirna)、重复相关sirna(repeat‑associatedsirna，ra‑sirna)以及自然反义转录衍生sirna(natural‑antisensetranscript‑derived，nat‑sirna)。[0306]根据一具体的实施例，所述rna分子(例如非编码rna分子)是一定相小干扰rna(phasedsmallinterferingrna，phasirna)。数个“phasirna”源自由rdr6转化为dsrna并由dcl4加工的一mrna，例如拟南芥(arabidopsis)数个反式作用sirna(数个tasirna)(vazquez等人，2004年)。在一特殊情况下，数个phasirna也可能是数个草生殖组织中dcl5(以前称为dcl3b)的24个核苷酸产物(song等人，2012年)。一些phasirna的所述反式作用名称(trans‑actingname)(tasirnas)来自如以同源性依赖方式的数个mirnas般发挥功能的它们的能力，导致从非其源mrna的数个基因中的数个mrna的ago1依赖型沉默(参见下文)。[0307]根据一具体的实施例，所述rna分子(例如非编码rna分子)是一tasirna。“tasirna”是一类由数个非编码tas转录物以分阶段模式由mirna触发生成的数个二级sirna(peragine等人，2004；vazquez等人，2004年；allen等人，2005；yoshikawa等人，2005年)。术语“定相(phased)”仅表示数个所述数个小rna是从一特异性核苷酸开始以一头对尾排列(head‑to‑tailarrangement)精确生成的；这种配置是由mirna触发的起始，然后是dcl4催化的切割引起的。参与tasirna生物发生的所述数个主要蛋白质包括但不限于rdr6、基因沉默的抑制子3(suppressorofgenesilencing3，sgs3)、dcl4、ago1、ago7及double‑strandedrnabindingfactor4(peragine等人，2004年；vazquez等人，2004年；xie等人，2005年；adenot等人，2006年；montgomery等人，2008a；fukudome等人，2011年)。最重要的是，产生数个21个核苷酸的tasirna有两种机制，称为所述“one‑hit”或“two‑hit”途径。在所述单击机制(one‑hitmechanism)中，一单一mirna指导所述mrna靶标的裂解，触发所述片段39中的数个phasirna的产生，以到达(或下游)靶位点(allen等人，2005年)。所述单击mirna触发器(one‑hitmirnatrigger)的长度通常为22个核苷酸(chen等人，2010年；cuperus等人，2010年)。在所述双击模型中，使用一对21个核苷酸的mirna靶位点，其中仅在39个靶位点发生切割，触发数个phasirna片段(或靶位点上游)的产生(axtell等人，2006年)。[0308]根据一个实施例，沉默rna包含“pirna”，其是一类piwi相互作用rna，长度约为26及31个核苷酸。数个pirna通常通过与数个piwi蛋白质相互作用形成数个rna‑蛋白质复合物，即数个反义pirna通常加载至数个piwi蛋白质(例如piwi、ago3以及茄子(aubergine，aub))中。[0309]mirna‑accordingtoanotherembodimentthernasilencingmoleculemaybeamirna.[0310]mirna‑根据另一实施例，rna沉默分子可以是一mirna。[0311]术语“微小rna(microrna)”、“mirna”以及“mir”是同义词，是指长度约为19至24个核苷酸的数个非编码单链rna分子的一集合，其调节基因表达。数个mirna广泛存在于各种生物体(例如，昆虫、哺乳动物、植物、线虫)，且已显示其在发育、体内平衡以及疾病病原学中起作用。[0312]最初，所述pre‑mirna是以一长的非完全双链茎环rna的形式存在，进一步通过dicer将其加工成一sirna样双链体，包括成熟的引导链(mirna)和一大小相似的片段(称为乘客(passenger)链(mirna*))。所述mirna和mirna*可以源自所述pri‑mirna和pre‑mirna的相对臂。数个mirna*序列可以在克隆的mirna的文库中找到，但出现率通常低于mirna，因为在大多数情况下于所述细胞中是没有功能的及未降解的。[0313]尽管最初以一双链类型与mirna*存在，但所述mirna最终变成以一单链rna的形式并入一核糖核蛋白复合物中，称为rna诱导沉默复合物(rna‑inducedsilencingcomplex，risc)。各种蛋白质可以形成所述risc，其可以引起对mirna/mirna*双链体的特异性、所述靶基因的结合位点、mirna的活性(抑制或激活)以及所述mirna/mirna*双链体的哪一条链加载至所述risc的可变性。[0314]当将所述mirna：mirna*双链体的所述mirna链加载至所述risc中时，移除并降解所述mirna*。加载至所述risc中的所述mirna：mirna*双链体的所述链是5’末端不紧密配对的链。在所述mirna：mirna*的两端具有大致相等的5’配对的情况下，mirna和mirna*两者都可能具有基因沉默活性。[0315]所述risc根据所述mirna和所述mrna之间的高度互补性，特别是通过所述mirna的核苷酸2至8位(称为“种子序列”)来鉴定数个靶核酸。[0316]许多研究已经着眼于mirna与其mrna靶之间的所述碱基配对需求，用于实现有效的转译抑制(通过bartel(2004年，cell，116至281)综述)。数个计算研究分析了mirna在整个基因组上的结合，已表明在所述mirna的5’端处的碱基2至8位(也称为“种子序列”)在靶结合中的一特定作用，但发现通常为“a”的第一核苷酸的作用也被识别(lewis等人，2005年，cell，120至15)。同样地，krek等人使用核苷酸1至7位或2至8位来鉴定和验证数个靶(2005年，natgenet.，37至495)。在所述mrna中的所述数个靶位点可以在5’utr、3’utr或编码区域中。有趣的是，数个mirna可以通过识别相同或数个位点来调节相同的mrna靶。在大多数遗传识别的靶中存在数个mirna结合位点，可能表明数个risc的协同作用提供了最有效的转译抑制。[0317]mirna可能通过两种机制之一引导所述risc下调节基因表达：mrna剪切(cleavage)或转译抑制。如果所述mrna与所述mirna具有一定程度的互补性，则所述mirna可以指定所述mrna的剪切。当一mirna引导剪切时，切割通常在与所述mirna的残基10和11位配对的所述数个核苷酸之间。或者，如果所述mirna与所述mirna不具有必要的互补程度，则所述mirna可以抑制转译。由于动物在所述mirna和结合位点之间的互补性程度较低，因此转译抑制在动物中可能更为普遍。[0318]应注意的是，任何一对mirna和mirna*的所述5’和3’末端中可能存在可变性。此可变性可能是由于drosha和dicer的酶加工中相对于剪切位点的可变性所致。在mirna和mirna*的所述5’和3’末端处的可变性也可能是由于所述pri‑mirna和pre‑mirna的所述数个茎结构中的不匹配所致。所述数个茎链的不匹配可能引起大量不同的发夹结构。所述数个茎结构中的可变性也可能引起通过drosha和dicer剪切数个产物中的可变性。[0319]根据一实施例，mirna可以独立于dicer进行加工，例如，通过argonaute2进行加工。[0320]应理解的是，所述pre‑mirna序列可以包括45至90、60至80或60至70个核苷酸，而所述pri‑mirna序列可以包括45至30,000、50至25,000、100至20,000、1,000至1,500或80至100个核苷酸。[0321]反义‑反义是一单链rna，旨在通过与其mrna特异性杂交来防止或抑制一基因的表达。一靶rna的下调节可以使用一反义多核苷酸来实现，所述反义多核苷酸能够与用于编码所述靶rna的一mrna转录物特异性杂交。[0322]转座元件rna[0323]数个转座遗传元件(transposablegeneticelements，tes)包括大量dna序列，所有序列都能够通过一剪切及黏贴机制(cut‑and‑pastemechanism)(数个转座子)直接地或通过一rna中间体(反转录转座子)间接地移动至数个基因组中的数个新位点。根据数个te是否具有编码转座(transposition)所需蛋白质的数个orf，所述数个te分为数个自主及非自主类别。rna介导的基因沉默是基因组控制数个te活性及源自基因组遗传及表观遗传不稳定性的数个有害影响的机制之一。[0324]如上所述，所述rna分子(例如非编码rna分子)可能不包括一典型(内在)rnai活性(例如不是一典型rna沉默分子(canonicalrnasilencingmolecule)，或尚未鉴定出的其靶)。此类非编码rna分子包括：[0325]根据一个实施例，所述rna分子(例如非编码rna分子)是一转移rna(trna)。术语“trna”是指作为数个核酸的核苷酸序列与数个蛋白质的氨基酸序列之间的物理连接的一rna分子，以前称为可溶性rna或srna。trna的长度通常约为76至90个核苷酸。[0326]根据一个实施例，所述rna分子(例如非编码rna分子)是一核糖体rna(rrna)。术语“rrna”是指所述核糖体的rna组成部分，即小核糖体亚基(subunit)或大核糖体亚基。[0327]根据一个实施例，所述rna分子(例如非编码rna分子)是一小核rna(snrna或u‑rna)。术语“srna”或“u‑rna”是指在数个真核细胞中的细胞核的数个拼接斑点(splicingspeckle)和数个卡哈尔体(cajalbody)内发现的数个小rna分子。snrna的长度通常约为150个核苷酸。[0328]根据一个实施例，所述rna分子(例如非编码rna分子)是一小核仁rna(smallnucleolarrna，snorna)。术语“snorna”是指主要引导其他rna(例如，rrna、trna以及snrna)的化学修饰的数个小rna分子类别。snorna通常分为两类：c/d盒snorna的长度通常约为70至120个核苷酸，并与甲基化有关；且h/aca盒snorna的长度通常约为100至200核苷酸，并与假尿苷化(pseudouridylation)有关。[0329]与snorna相似的是scarna(即数个小卡哈尔体rna基因(smallcajalbodyrnagene))，其在rna成熟中的作用与snorna相似，但它们的靶是剪接体(spliceosomal)snrna，且它们对数个剪接体snrna前体(在所述细胞核的所述数个卡哈尔体中)进行位点特异性修饰。[0330]根据一个实施例，所述rna分子(例如非编码rna分子)是一细胞外rna(extracellularrna，exrna)。术语“exrna”是指存在于转录它们的数个细胞外部的rna种类(例如，外泌体rna(exosomalrna))。[0331]根据一实施例，rna分子(例如非编码rna分子)是一重复衍生rna(repeat‑derivedrna)。术语“重复衍生rna(repeat‑derivedrna)”是指由衍生自数个反向基因组重复(例如但不限于通过dna重组、基因组位点复制、数个转座事件(transpositionevents)等产生的dna)的dna编码的一rna。[0332]根据一个实施例，所述rna分子(例如非编码rna分子)是一长的非编码rna(longnon‑codingrna，lncrna)。术语“lncrna”或“长ncrna”是指通常长于200个核苷酸的非蛋白质编码转录物。[0333]根据一具体的实施例，与risc结合的数个rna分子(例如非编码rna分子)的非限制性实例包含但不限于微小rna(microrna，mirna)、piwi相互作用rna(pirna)、短干扰rna(sirna)、短发夹rna(shrna)、定相小干扰rna(phasirna)、反式作用sirna(tasirna)、小核rna(smallnuclearrna，snrna或urna)、转座元件rna(如自主及非自主转座rna)、转移rna(trna)、小核仁rna(snorna)、小卡哈尔体rna(scarna)、核糖体rna(rrna)、细胞外rna(exrna)、重复衍生rna(repeat‑derivedrna)以及长的非编码rna(lncrna)。[0334]根据一具体的实施例，与risc结合的数个rnai分子的非限制性实例包含但不限于小干扰rna(sirna)、短发夹rna(shrna)、微小rna(mirna)、piwi相互作用rna(pirna)以及反式作用sirna(tasirna)。[0335]根据一实施例，从本发明的一些实施例的所述rna分子(例如非编码rna分子)加工的数个小rna分子能够募集rna依赖型rna聚合酶(rna‑dependentrnapolymerase，rdrp)。[0336]术语“加工的(processed)”是指rna分子被剪切成能够与rna诱导沉默复合物(rna‑inducedsilencingcomplex，risc)结合的小rna形式的生源论(biogenesis)。举例而言，pre‑mirna被加工成一成熟mirna，例如通过dicer。[0337]如本文所使用，术语“小rna形式”或“数个小rna”或“数个小rna分子”是指能够与一靶rna杂交的所述成熟小rna，例如所述植物基因(或其片段)的转录物。[0338]根据一实施例，所述数个小rna的长度不超过250个核苷酸，例如包括20至250、20至200、20至150、20至100、20至50、20至40、20至30、20至25、20至26、30至100、30至80、30至60、30至50、30至40、50至150、50至100、50至80、50至70、100至250、100至200、100至150、150至250、150至200个核苷酸。[0339]根据一具体的实施例，所述小rna分子包括20至50个核苷酸。[0340]根据一具体的实施例，所述小rna分子包括20至30个核苷酸。[0341]根据一具体的实施例，所述小rna分子包括21至29个核苷酸。[0342]根据一具体的实施例，所述小rna分子包括21至24个核苷酸。[0343]根据一具体的实施例，所述小rna分子包括21个核苷酸。[0344]根据一具体的实施例，所述小rna分子包括22个核苷酸。[0345]根据一具体的实施例，所述小rna分子包括23个核苷酸。[0346]根据一具体的实施例，所述小rna分子包括24个核苷酸。[0347]根据一具体的实施例，所述小rna分子是由20至50个核苷酸组成。[0348]根据一具体的实施例，所述小rna分子是由20至30个核苷酸组成。[0349]根据一具体的实施例，所述小rna分子是由21至29个核苷酸组成。[0350]根据一具体的实施例，所述小rna分子是由21至24个核苷酸组成。[0351]根据一具体的实施例，所述小rna分子是由21个核苷酸组成。[0352]根据一具体的实施例，所述小rna分子是由22个核苷酸组成。[0353]根据一具体的实施例，所述小rna分子是由23个核苷酸组成。[0354]根据一具体的实施例，所述小rna分子是由24个核苷酸组成。[0355]根据一实施例，所述小rna分子包括一沉默活性(即为数个沉默分子)。[0356]如上所述，本发明的一些实施例的数个沉默分子(例如数个rna沉默分子)能够募集rna依赖型rna聚合酶(rna‑dependentrnapolymerase，rdrp)。[0357]术语“rna依赖型rna聚合酶(rna‑dependentrnapolymerase)”或“rdrp”是指从一rna模板催化rna复制的所述酶。[0358]根据一实施例，所述小rna分子包括针对所述rdrp的一扩增器或引物活性。[0359]根据一具体的实施例，能够募集所述rdrp的所述沉默分子选自由微小rna(mirna)、小干扰rna(sirna)、短发夹rna(shrna)、piwi相互作用rna(pirna)、反式作用sirna(tasirna))、定相小干扰rna(phasirna)、转移rna(trna)、小核rna(snrna)、核醣体rna(rrna)、小核仁rna(snorna)、细胞外rna(exrna)、重复衍生rna、自主及非自主转座rna所组成的群组。[0360]根据本发明的一些实施例，能够募集所述rdrp的所述沉默分子包括21至24个核苷酸。[0361]根据本发明的一些实施例，能够募集所述rdrp的所述沉默分子包括21个核苷酸。[0362]根据本发明的一些实施例，能够募集所述rdrp的所述沉默分子包括22个核苷酸。[0363]根据本发明的一些实施例，能够募集所述rdrp的所述沉默分子包括23个核苷酸。[0364]根据本发明的一些实施例，能够募集所述rdrp的所述沉默分子包括24个核苷酸。[0365]根据本发明的一些实施例，能够募集所述rdrp的所述沉默分子是由21个核苷酸组成。[0366]根据本发明的一些实施例，能够募集所述rdrp的所述沉默分子是由22个核苷酸组成。[0367]根据本发明的一些实施例，能够募集所述rdrp的所述沉默分子是由23个核苷酸组成。[0368]根据本发明的一些实施例，能够募集所述rdrp的所述沉默分子是由24个核苷酸组成。[0369]根据一具体的实施例，能够募集所述rdrp的所述沉默分子是mirna。[0370]根据一具体的实施例，所述mirna包括一21至25个核苷酸的成熟小rna[0371]根据一具体的实施例，所述mirna包括一21个核苷酸的成熟小rna。[0372]根据一具体的实施例，所述mirna包括一22个核苷酸的成熟小rna。[0373]根据一具体的实施例，所述mirna包括一23个核苷酸的成熟小rna。[0374]根据一具体的实施例，所述mirna包括一24个核苷酸的成熟小rna。[0375]根据一具体的实施例，所述mirna包括一25个核苷酸的成熟小rna。[0376]根据一具体的实施例，所述mirna是一21至25个核苷酸的成熟小rna。[0377]根据一具体的实施例，所述mirna是一21个核苷酸的成熟小rna。[0378]根据一具体的实施例，所述mirna包括一22个核苷酸的成熟小rna。[0379]根据一具体的实施例，所述mirna是一23个核苷酸的成熟小rna。[0380]根据一具体的实施例，所述mirna是一24个核苷酸的成熟小rna。[0381]根据一具体的实施例，所述mirna是一25个核苷酸的成熟小rna。[0382]示例性mirna包括但不限于mir‑156a、mir‑156c、mir‑162a、mir‑162b、mir‑167d、mir‑169b、mir‑173、mir‑393a、mir‑393b、mir‑402、mir‑403、mir‑447a、mir‑447b、mir‑447c、mir‑472、mir‑771、mir‑777、mir‑828、mir‑830、mir‑831、mir‑831、mir‑833a、mir‑833a、mir‑840、mir‑845b、mir‑848、mir‑850、mir‑853、mir‑855、mir‑856、mir‑864、mir‑2933a、mir‑2933b、mir‑2936、mir‑4221、mir‑5024、mir‑5629、mir‑5648、mir‑5996、mir‑8166、mir‑8167a、mir‑8167b、mir‑8167c、mir‑8167d、mir‑8167e、mir‑8167f、mir‑81777‑8182。[0383]如上所述，本发明一些实施例的所述方法包括修饰编码一rna分子的一植物内源核酸序列，以针对所述植物赋予基因沉默特异性。[0384]根据一实施例，当所述rna分子不具有一内在沉默活性时，所述方法进一步包括将针对所述植物基因赋予所述rna分子的一沉默特异性的一dna编辑剂引入所述植物细胞中。[0385]根据一实施例，当所述rna分子具有针对一天然植物基因的一内在沉默活性时，所述方法进一步包括将一dna编辑剂引入所述植物细胞中，所述dna编辑剂将所述rna分子的一沉默特异性重定向至针对所述植物基因，所述植物基因及所述天然植物基因是不同的。[0386]修饰数个核酸序列的数个方法在下文中详细讨论。[0387]根据一些实施例，例如在本文所述的第二模型中，一植物基因的一核酸序列被修饰，从而编码一长dsrna分子，所述长dsrna分子针对一有害生物基因赋予一沉默特异性。根据一些实施例，所述核酸序列编码针对一天然植物基因具有一内在沉默活性的一rna分子，使得所述修饰产生具有除了或代替所述内在沉默活性的一新沉默活性(例如针对一有害生物基因)的一沉默rna。每种可能性代表本发明的一单独实施例。[0388]因此，根据本发明的另一方面，提供了一种产生能够沉默一有害生物基因的一植物细胞中的一长dsrna分子的方法，所述方法包括：[0389](a)在一植物基因组中选择一核酸序列，所述核酸序列编码一沉默分子，所述沉默分子以一植物基因作为一目标，所述沉默分子能够募集rna依赖型rna聚合酶(rdrp)；[0390](b)修饰所述植物基因的一核酸序列，从而针对所述有害生物基因赋予一沉默特异性，使得包括所述沉默特异性的所述植物基因的一转录物与能够募集所述rdrp的所述沉默分子形成碱基互补，以产生能够沉默所述有害生物基因的所述长dsrna分子，[0391]从而产生能够沉默所述有害生物基因的所述植物细胞中的所述长dsrna分子。[0392]根据一实施例，所述植物基因不编码具有一内在沉默活性的一分子。[0393]根据一实施例，当所述植物基因不编码具有一内在沉默活性的一分子时，所述方法进一步包括将一dna编辑剂引入至所述植物细胞，所述dna编辑剂针对一有害生物基因赋予所述植物基因的一沉默特异性。[0394]根据一实施例，所述植物基因编码针对一天然植物基因具有一内在沉默活性的一分子。[0395]根据一实施例，具有一内在沉默活性的所述植物基因选自一微小rna(mirna)、一小干扰rna(sirna)、一短发夹rna(shrna)、一piwi相互作用rna(pirna)、一反式作用sirna(tasirna)、一定相小干扰rna(phasirna)、一转运rna(trna)、一小核rna(snrna)、一核醣体rna(rrna)、一小核仁rna(snorna)、一细胞外rna(exrna)、一重复衍生rna及一自主及非自主的转座rna。[0396]根据一些实施例，编码具有所述内在沉默活性的一rna的所述植物基因编码了定相二级产生sirna分子。[0397]如本文所使用，短语“定相二级sirna产生分子(phasedsecondarysirna‑producingmolecule)”是指能够与一初级沉默分子(例如一mirna)形成碱基互补的一rna转录物，所述初级沉默分子募集rna依赖型rna聚合酶(rdrp)，从而被转录至一长dsrna分子，然后再加工成数个二级沉默rna分子(即数个定相rna)。根据一些实施例，所述定相二级sirna产生分子是选自由一tasirna及一phasirna所组成的群组。[0398]根据一些实施例，所述定相二级sirna产生分子能够被加工成多个二级沉默rna分子，即至少两个二级沉默rna分子。根据一些实施例，编码所述定相二级sirna产生分子的所述基因的修饰步骤，包括仅修饰通过加工所述定相二级sirna产生分子而形成的所述数个二级沉默rna分子的一部分。根据一具体的实施例，编码所述定相二级sirna产生分子的所述基因的修饰步骤，包括仅修饰通过加工所述定相二级sirna产生分子形成的一个二级沉默rna分子。根据一些实施例，编码所述定相二级sirna产生分子的所述基因的修饰步骤，包括修饰通过加工所述所述定相二级sirna产生分子而形成的至少一个二级沉默rna分子。根据数个其他实施例，编码所述定相二级sirna产生分子的所述基因的修饰步骤，包括修饰通过加工所述定相二级sirna产生分子而形成的所有二级沉默rna分子。不希望受理论或机制的束缚，修饰了编码所述定相二级sirna产生分子的所述基因，使得所述数个二级沉默rna分子中的仅一个的所述沉默特异性针对一新靶(例如一有害生物rna)，足以诱导所述新靶的至少部分沉默。[0399]根据一些实施例，待修饰的所述二级沉默rna分子序列的长度是所述靶向有害生物内二级沉默分子的长度(例如，如果一tasirn在一有害生物内加工从而形成数个24nt二级srna，则针对一植物细胞中编码所述定相二级sirna产生分子的所述基因序列进行修饰，使得至少一个24nt序列靶向选择的所述有害生物rna)。根据一些实施例，修饰所述植物基因(例如编码一定相二级产生sirna分子的一植物基因)的一核酸序列以针对一有害生物基因赋予一沉默特异性的步骤包括修饰21至30nt的一序列，任选地为24nt，可能地为所述植物基因中的30nt，因此所述编码序列与通过所述有害生物基因编码的一rna基本上互补。每种可能性代表本发明的一单独实施例。不希望受理论或机制的束缚，修饰了编码所述定相二级sirna产生分子的所述基因，使得所述编码序列的30nt与所述有害生物基因互补，确保了(可能不同于在所述植物基因内加工的)所述长dsrna的加工，导致在所述有害生物中具有一功能性沉默活性的数个二级rna分子。根据一具体的实施例，具有所述内在沉默活性的所述植物基因是一反式作用sirna(tas)产生分子。[0400]根据一具体的实施例，所述植物基因包含针对所述沉默分子的一结合位点。[0401]根据一具体的实施例，所述植物基因包含针对mirna分子的一结合位点。[0402]根据一具体的实施例，mirna包括但不限于mir‑156a、mir‑156c、mir‑162a、mir‑162b、mir‑167d、mir‑169b、mir‑173、mir‑393a、mir‑393b、mir‑402、mir‑403、mir‑447a、mir‑447b、mir‑447c、mir‑472、mir‑771、mir‑777、mir‑828、mir‑830、mir‑831、mir‑831、mir‑833a、mir‑833a、mir‑840、mir‑845b、mir‑848、mir‑850、mir‑853、mir‑855、mir‑856、mir‑864、mir‑2933a、mir‑2933b、mir‑2936、mir‑4221、mir‑5024、mir‑5629、mir‑5648、mir‑5996、mir‑8166、mir‑8167a、mir‑8167b、mir‑8167c、mir‑8167d、mir‑87f6emir‑8177及mir‑8182。[0403]根据一实施例，当所述植物基因编码具有一内在沉默活性的一分子时，所述方法进一步包括将一dna编辑剂引入至所述植物细胞，所述dna编辑剂将所述植物基因的一沉默特异性重定向至所述有害生物基因，所述有害生物基因及所述天然植物基因是不同的。[0404]如本文所使用，术语“重定向一沉默特异性(redirectsasilencingspecificity)”是指将所述rna分子或所述植物基因的所述转录物的所述原始特异性重新编程为所述rna分子或所述植物基因转录物的一非天然靶。因此，所述rna分子或所述植物基因转录物的所述原始特异性被废除(即功能丧失)，而新的所述特异性是针对与所述天然靶不同的一靶(即分别为一植物或一有害生物的rna)，即获得功能增益。应理解的是，只有在所述rna分子或所述植物基因的转录物不具有内在沉默活性的情况下才会发生功能增益。[0405]如本文所使用，术语“天然植物rna”是指由一rna分子(例如非编码rna分子，例如沉默分子)天然结合的一rna序列。因此，本领域技术人员将所述天然植物rna(即一天然植物基因的转录物)视为所述rna分子(例如非编码rna，例如沉默分子)的一天然基质(即靶)。[0406]如本文所使用，术语“植物rna”或“植物靶rna”是指不被一rna分子(例如非编码rna，例如沉默分子)天然结合的一rna序列(编码的或非编码的)。因此，所述植物rna(即一植物基因的转录物)不是所述rna分子(例如非编码rna，例如沉默分子)的一天然基质(即靶标)。[0407]如本文所使用，术语“有害生物rna”或“有害生物靶rna”是指一rna序列，所述rna序列通过经设计的所述植物rna及/或产生的所述数个dsrna分子及数个二级小rna(通过加工dsrna产生)来沉默。因此，所述有害生物rna(即一有害生物基因的转录物)不是所述植物rna或所述dsrna或所述数个二级小分子的一天然基质(即靶)。[0408]如本文所使用，短语“沉默一基因(silencingagene)”是指来自所述靶基因的mrna及/或数个蛋白质产物的水平的不存在或可观察到的降低(例如由于共同转录及/或转录后基因沉默)。因此，与不被本发明设计的rna分子所靶向的一基因相比，一靶基因的沉默可以是5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％。[0409]沉默的所述数个结果可以通过检查从吸收了所述植物中设计的所述rna的一植物细胞或整株植物或其他生物体(例如有害生物)的所述数个外在特性来确认，或通过数个生化技术(如本文进一步讨论的)来确认。[0410]应理解的是，本发明的一些实施例的经设计的所述rna分子可以具有一些脱靶特异性效应(off‑targetspecificityeffect)，只要它不影响一农业上有价值的性状(例如所述植物的生物量、产量、生长等).[0411]一rna分子(例如沉默分子)与一靶rna的所述特异性结合可以通过计算演算法(例如blast)来确定，并通过包括例如北方印迹、原位杂交、quantigeneplexassay等来验证。[0412]根据一实施例，如果所述rna分子是一sirna或被加工成一sirna，则与其靶序列的所述互补性是在90％至100％(例如100％)的范围内。[0413]根据一实施例，如果所述rna分子是一mirna或pirna或被加工成一mirna或pirna，则与其靶序列的所述互补性是在33％至100％的范围内。[0414]根据一实施例，如果所述rna分子是一mirna，则与其靶序列的所述种子序列互补性(即来自5’端的第2至8个核苷酸)是在85‑100％(例如100％)的范围内。[0415]根据一实施例，与所述靶序列的所述互补性是加工的所述小rna形式的至少约33％(例如21至28nt的33％)。因此，例如，如果所述rna分子是一mirna，则33％的所述成熟mirna序列(例如21nt)包括种子互补(例如21nt中的7nt)。[0416]根据一实施例，与所述靶序列的所述互补性是加工的所述小rna形式的至少约45％(例如21至28nt的45％)。因此，例如，如果所述rna分子是一mirna，则45％的所述成熟mirna序列(例如21nt)包括种子互补(例如21nt中的9至10nt)。[0417]根据一实施例，所述rna分子或植物rna(即在修饰之前)通常被选择为具有分别针对所述植物rna或有害生物rna的所述序列的约10％、20％、30％、33％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或高达99％的互补性。[0418]根据一具体的实施例，所述rna分子或植物rna(即在修饰之前)通常被选择为分别针对所述植物rna或有害生物rna的所述序列具有不超过99％的互补性。[0419]根据一具体的实施例，所述rna分子或植物rna(即在修饰之前)通常被选择为分别针对所述植物rna或有害生物rna的所述序列具有不超过98％的互补性。[0420]根据一具体的实施例，所述rna分子或植物rna(即在修饰之前)通常被选择为分别针对所述植物rna或有害生物rna的所述序列具有不超过97％的互补性。[0421]根据一具体的实施例，所述rna分子或植物rna(即在修饰之前)通常被选择为分别针对所述植物rna或有害生物rna的所述序列具有不超过96％的互补性。[0422]根据一具体的实施例，所述rna分子或植物rna(即在修饰之前)通常被选择为分别针对所述植物rna或有害生物rna的所述序列具有不超过95％的互补性。[0423]根据一具体的实施例，所述rna分子或植物rna(即在修饰之前)通常被选择为分别针对所述植物rna或有害生物rna的所述序列具有不超过94％的互补性。[0424]根据一具体的实施例，所述rna分子或植物rna(即在修饰之前)通常被选择为分别针对所述植物rna或有害生物rna的所述序列具有不超过93％的互补性。[0425]根据一具体的实施例，所述rna分子或植物rna(即在修饰之前)通常被选择为分别针对所述植物rna或有害生物rna的所述序列具有不超过92％的互补性。[0426]根据一具体的实施例，所述rna分子或植物rna(即在修饰之前)通常被选择为分别针对所述植物rna或有害生物rna的所述序列具有不超过91％的互补性。[0427]根据一具体的实施例，所述rna分子或植物rna(即在修饰之前)通常被选择为分别针对所述植物rna或有害生物rna的所述序列具有不超过90％的互补性。[0428]根据一具体的实施例，所述rna分子或植物rna(即在修饰之前)通常被选择为分别针对所述植物rna或有害生物rna的所述序列具有不超过85％的互补性。[0429]根据一具体的实施例，所述rna分子或植物rna(即在修饰之前)通常被选择为分别针对所述植物rna或有害生物rna的所述序列具有不超过50％的互补性。[0430]根据一具体的实施例，所述rna分子或植物rna(即在修饰之前)通常被选择为分别针对所述植物rna或有害生物rna的所述序列具有不超过33％的互补性。[0431]根据一实施例，所述rna分子(例如rna沉默分子)或植物rna被设计成包括分别针对所述植物rna或有害生物rna的所述序列的至少约33％、40％、45％、50％、55％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或甚至100％的互补性。[0432]根据一具体的实施例，所述rna分子(例如rna沉默分子)或植物rna被设计成包括分别针对所述植物rna或有害生物rna的一最少33％的互补性(例如85％至100％种子匹配)。[0433]根据一具体的实施例，所述rna分子(例如rna沉默分子)或植物rna被设计成包括分别针对所述植物rna或有害生物rna的一最少40％的互补性。[0434]根据一具体的实施例，所述rna分子(例如rna沉默分子)或植物rna被设计成包括分别针对所述植物rna或有害生物rna的一最少45％的互补性。[0435]根据一具体的实施例，所述rna分子(例如rna沉默分子)或植物rna被设计成包括分别针对所述植物rna或有害生物rna的一最少50％的互补性。[0436]根据一具体的实施例，所述rna分子(例如rna沉默分子)或植物rna被设计成包括分别针对所述植物rna或有害生物rna的一最少55％的互补性。[0437]根据一具体的实施例，所述rna分子(例如rna沉默分子)或植物rna被设计成包括分别针对所述植物rna或有害生物rna的一最少60％的互补性。[0438]根据一具体的实施例，所述rna分子(例如rna沉默分子)或植物rna被设计成包括分别针对所述植物rna或有害生物rna的一最少70％的互补性。[0439]根据一具体的实施例，所述rna分子(例如rna沉默分子)或植物rna被设计成包括分别针对所述植物rna或有害生物rna的一最少80％的互补性。[0440]根据一具体的实施例，所述rna分子(例如rna沉默分子)或植物rna被设计成包括分别针对所述植物rna或有害生物rna的一最少85％的互补性。[0441]根据一具体的实施例，所述rna分子(例如rna沉默分子)或植物rna被设计成包括分别针对所述植物rna或有害生物rna的一最少90％的互补性。[0442]根据一具体的实施例，所述rna分子(例如rna沉默分子)或植物rna被设计成包括分别针对所述植物rna或有害生物rna的一最少91％的互补性。[0443]根据一具体的实施例，所述rna分子(例如rna沉默分子)或植物rna被设计成包括分别针对所述植物rna或有害生物rna的一最少92％的互补性。[0444]根据一具体的实施例，所述rna分子(例如rna沉默分子)或植物rna被设计成包括分别针对所述植物rna或有害生物rna的一最少93％的互补性。[0445]根据一具体的实施例，所述rna分子(例如rna沉默分子)或植物rna被设计成包括分别针对所述植物rna或有害生物rna的一最少94％的互补性。[0446]根据一具体的实施例，所述rna分子(例如rna沉默分子)或植物rna被设计成包括分别针对所述植物rna或有害生物rna的一最少95％的互补性。[0447]根据一具体的实施例，所述rna分子(例如rna沉默分子)或植物rna被设计成包括分别针对所述植物rna或有害生物rna的一最少96％的互补性。[0448]根据一具体的实施例，所述rna分子(例如rna沉默分子)或植物rna被设计成包括分别针对所述植物rna或有害生物rna的一最少97％的互补性。[0449]根据一具体的实施例，所述rna分子(例如rna沉默分子)或植物rna被设计成包括分别针对所述植物rna或有害生物rna的一最少98％的互补性。[0450]根据一具体的实施例，所述rna分子(例如rna沉默分子)或植物rna被设计成包括分别针对所述植物rna或有害生物rna的一最少99％的互补性。[0451]根据一具体的实施例，所述rna分子(例如rna沉默分子)或植物rna被设计成包括分别针对所述植物rna或有害生物rna的100％互补性。[0452]根据一具体的实施例，所述rna分子或植物rna(例如由rdrp合成的产物)的所述反义链被设计成包括针对所述有害生物rna的所述序列的至少约33％、40％、45％、50％、55％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、甚至100％的互补性。[0453]根据一具体的实施例，所述rna分子或植物rna(例如由rdrp合成的产物)的所述反义链被设计成包括针对所述有害生物rna的所述序列的一最少33％的互补性(例如85至100％种子匹配)。[0454]根据一具体的实施例，所述rna分子或植物rna(例如由rdrp合成的产物)的所述反义链被设计成包括针对所述有害生物rna的所述序列的一最少40％的互补性。[0455]根据一具体的实施例，所述rna分子或植物rna(例如由rdrp合成的产物)的所述反义链被设计成包括针对所述有害生物rna的所述序列的一最少45％的互补性。[0456]根据一具体的实施例，所述rna分子或植物rna(例如由rdrp合成的产物)的所述反义链被设计成包括针对所述有害生物rna的所述序列的一最少50％的互补性。[0457]根据一具体的实施例，所述rna分子或植物rna(例如由rdrp合成的产物)的所述反义链被设计成包括针对所述有害生物rna的所述序列的一最少55％的互补性。[0458]根据一具体的实施例，所述rna分子或植物rna(例如由rdrp合成的产物)的所述反义链被设计成包括针对所述有害生物rna的所述序列的一最少60％的互补性。[0459]根据一具体的实施例，所述rna分子或植物rna(例如由rdrp合成的产物)的所述反义链被设计成包括针对所述有害生物rna的所述序列的一最少70％的互补性。[0460]根据一具体的实施例，所述rna分子或植物rna(例如由rdrp合成的产物)的所述反义链被设计成包括针对所述有害生物rna的所述序列的一最少80％的互补性。[0461]根据一具体的实施例，所述rna分子或植物rna(例如由rdrp合成的产物)的所述反义链被设计成包括针对所述有害生物rna的所述序列的一最少85％的互补性。[0462]根据一具体的实施例，所述rna分子或植物rna(例如由rdrp合成的产物)的所述反义链被设计成包括针对所述有害生物rna的所述序列的一最少90％的互补性。[0463]根据一具体的实施例，所述rna分子或植物rna(例如由rdrp合成的产物)的所述反义链被设计成包括针对所述有害生物rna的所述序列的一最少91％的互补性。[0464]根据一具体的实施例，所述rna分子或植物rna(例如由rdrp合成的产物)的所述反义链被设计成包括针对所述有害生物rna的所述序列的一最少92％的互补性。[0465]根据一具体的实施例，所述rna分子或植物rna(例如由rdrp合成的产物)的所述反义链被设计成包括针对所述有害生物rna的所述序列的一最少93％的互补性。[0466]根据一具体的实施例，所述rna分子或植物rna(例如由rdrp合成的产物)的所述反义链被设计成包括针对所述有害生物rna的所述序列的一最少94％的互补性。[0467]根据一具体的实施例，所述rna分子或植物rna(例如由rdrp合成的产物)的所述反义链被设计成包括针对所述有害生物rna的所述序列的一最少95％的互补性。[0468]根据一具体的实施例，所述rna分子或植物rna(例如由rdrp合成的产物)的所述反义链被设计成包括针对所述有害生物rna的所述序列的一最少96％的互补性。[0469]根据一具体的实施例，所述rna分子或植物rna(例如由rdrp合成的产物)的所述反义链被设计成包括针对所述有害生物rna的所述序列的一最少97％的互补性。[0470]根据一具体的实施例，所述rna分子或植物rna(例如由rdrp合成的产物)的所述反义链被设计成包括针对所述有害生物rna的所述序列的一最少98％的互补性。[0471]根据一具体的实施例，所述rna分子或植物rna(例如由rdrp合成的产物)的所述反义链被设计成包括针对所述有害生物rna的所述序列的一最少99％的互补性。[0472]根据一具体的实施例，所述rna分子或植物rna(例如由rdrp合成的产物)的所述反义链被设计成包括针对所述有害生物rna的所述序列的100％互补性。[0473]为了诱导一rna分子或一植物rna的沉默活性及/或特异性或将一rna分子或一植物rna(例如rna沉默分子)的一沉默活性及/或特异性重定向至针对一植物rna或有害生物rna，使用一dna编辑剂来修饰编码一rna分子或所述植物rna(例如rna沉默分子)的所述基因。[0474]以下是用于将数个核酸改变引入至用于一基因的数个方法和数个dna编辑剂的各种非限制性实例的描述，以及根据本公开的数个具体实施例可以使用的用于实施所述数个方法和数个dna编辑剂的数个试剂。[0475]使用工程核酸内切酶进行基因组编辑‑这种方法是指一种反向遗传学方法，通常使用人工工程核酸酶在所述基因组中(数个)所需的位置切割并产生数个特定双链断裂(double‑strandedbreak，dsb)，然后通过数个细胞内源性过程对其进行修复，例如，同源重组(homologousrecombination，hr)或非同源末端连接(non‑homologousend‑joining，nhej)。nhej以一双链断裂(dsb)(有或没有最小的末端修饰)直接连接所述数个dna末端，而hr利用一同源供体序列作为一模板(即s期形成的姐妹染色单体)用于在所述断裂位点再生/复制缺失的dna序列。为了将数个特定核苷酸修饰引入至所述基因组dna，在hr期间必须存在含有所需序列的一供体dna修复模板(外源性提供的单链或双链dna)。[0476]基因组编辑不能使用传统的限制性核酸内切酶来进行，因为大多数限制性酶识别所述dna上的几个碱基对作为其靶，且这些序列通常会在所述基因组的许多位置中发现，从而导致多次切割，而这些切割并不限于一所需的位置。为了克服这一挑战并产生数个位点特定的(site‑specific)单链或双链断裂(dsb)，迄今为止已经发现了几种不同类别的核酸酶，并对其进行了生物工程。这些包括大范围核酸酶(meganuclease)、锌指核酸酶(zincfingernuclease，zfn)、转录激活因子样效应子核酸酶(transcription‑activatorlikeeffectornuclease，talen)以及crispr/cas9系统。[0477]大范围核酸酶(meganucleases)‑大范围核酸酶(也称为归巢核酸内切酶(homingendonucleases))通常分为至少五个家族：laglidadg家族、giy‑yig家族、his‑cys盒家族以及hnh家族以及pd‑(d/e)xk，所述至少五个家族涉及数个edxhd酶，且被一些人认为是一个单独的家族。。这些家族的特征在于数个结构模序(motif)，它们影响催化活性和识别序列。例如，所述laglidadg家族的数个成员的特征在于具有保存的laglidadg模序的一个或两个拷贝。这四个大范围核酸酶家族在数个保存的结构元素以及dna识别序列特异性和催化活性方面彼此很大程度地区分。大范围核酸酶通常在微生物物种中发现，并具有独特的特性，即具有数个非常长的识别序列(>14bp)，因此使其用于在一所需的位置处进行切割自然地具有非常高的特异性。[0478]这可以用来在基因组编辑中制造数个位点特异性双链断裂(dsb)。本领域技术人员可以使用这些天然存在的大范围核酸酶，但这种天然存在的大范围核酸酶的数量是有限的。为了克服这一挑战，诱变(mutagenesis)和高通量筛选方法已用于产生识别数个独特序列的数个大范围核酸酶变体。例如，已经融合了各种大范围核酸酶以产生识别一新序列的数个杂化(hybrid)酶。[0479]或者，可以改变所述大范围核酸酶的数个dna相互作用氨基酸以设计序列特异性大范围核酸酶(例如，参见美国专利号8,021,867)。可以使用例如在certo，mt等人(naturemethods，2012年，9：073至975)、美国专利号8,304,222、8,021,867、8,119,381、8,124,369、8,129,134、8,133,697、8,143,015、8,143,016、8,148,098或8,163,514中所述的方法设计大范围核酸酶，每个内容通过引用整体并入本文中。或者，可以使用商业上可获得的技术(例如，precisionbiosciences的定向核酸酶编辑器tm(directednucleaseeditortm)基因组编辑技术)来获得具有位点特异性切割特征的大范围核酸酶。[0480]zfns和talens‑两种不同的工程核酸酶，锌指核酸酶(zfn)和转录激活因子样效应子核酸酶(talen)均被证明能有效地产生数个靶向双链断裂(dsb)(christian等人，2010年；kim等人，1996年；li等人，2011年；mahfouz等人，2011年；miller等人，2010年)。[0481]基本上，zfn和talen限制性核酸内切酶技术利用一种非特异性dna切割酶，所述酶与一特定的dna结合域(分别是一系列的数个锌指域或数个tale重复序列)相连。通常，选择其dna识别位点和剪切位点彼此分开的一限制性酶。分开所述剪切部分然后连接至一dna结合域，从而产生对一所需的序列具有非常高特异性的一核酸内切酶。具有这种性质的一示例性限制酶是fokl。另外，fokl的优点是需要二聚化(dimerization)才能具有核酸酶活性，这意味着随着每个核酸酶伙伴识别一独特的dna序列，所述特异性会显着地增加。为了增强此效果，已经工程化了数个fok1核酸酶，其仅可以作为数个异二聚体(heterodimer)起作用且具有增加的催化活性。所述异二聚体起作用于核酸酶避免了不需要的同二聚体(homodimer)活性的可能性，因此增加了所述双链断裂(dsb)的特异性。[0482]因此，例如为了靶向一特定位点，数个zfn和数个talen被构建为数个核酸酶对，所述对中的每个分子设计为结合在所述靶位点处的数个相邻序列。在数个细胞中瞬时表达后，所述数个核酸酶与它们的数个靶位点结合，且所述数个foki域异二聚体化(heterodimerize)以产生一双链断裂(dsb)。通过所述非同源末端连接(nhej)途径修复这些双链断裂(dsb)通常会导致数个小缺失或数个小序列插入(插入缺失(indel))。由于通过nhej进行的每次修复都是独特的，因此使用一单个核酸酶对可以在所述靶位点处产生具有一系列的数个不同插入或缺失的一等位基因系列(allelicseries)。[0483]一般来说，在基因编辑中，nhej相对准确(在人类细胞中约85％的dsb从检测开始约30分钟内通过nhej修复)。错误的nhej是依赖的，因为当所述修复是准确的，所述核酸酶将继续切割，直到所述修复产物突变，且识别/切割位点/pam基序消失/突变、或瞬时引入的核酸酶不再存在。[0484]缺失的长度范围通常从几个碱基对到几百个碱基对，但是通过同时使用两对核酸酶在细胞培养中已成功地产生了较大的缺失(carlson等人，2012年；lee等人，2010年)。此外，当将与所述靶向的区域具有同源性的一dna片段与所述核酸酶对结合引入时，可以通过同源重组(hr)修复所述双链断裂(dsb)以产生多个特异性修饰(li等人，2011年；miller等人，2010年；urnov等人，2005年)。[0485]尽管多个zfn和多个talen的多个核酸酶部分具有相似的性质，但这些工程核酸酶之间的差异在于其dna识别肽。zfn依赖于cys2‑his2锌指(zincfinger)，而talen依赖于tale。这两者的这些dna识别肽域(domain)都具有一个特点，即它们天然存在于其蛋白质的组合中。多个cys2‑his2锌指通常存在于间隔为3bp的多个重复序列中，并存在于多种核酸相互作用蛋白的多个不同组合中。另一方面，多个tale存在于所述多个氨基酸和所述多个识别的核苷酸对之间具有一对一识别率的多个重复序列中。由于锌指和tale均以重复的模式发生，因此不同的组合可以尝试来创建各种各样的序列特异性。制备位点特异性锌指核酸内切酶的多个方法包含，例如，模块组装(其中与一三联体序列相关的多个锌指连成一行以覆盖所需的序列)、open(多个肽域的低严格性选择，相对于多个三联体(tripletnucleotide)核苷酸，然后进行多个肽组合的高严格性选择，相对于在多个细菌系统中的最终靶)、以及多个锌指文库的细菌单杂交筛选(one‑hybridscreening)等。zfn也可以从例如sangamobiosciencestm(richmond，加利福尼亚州)商业设计和获得。[0486]设计和获得数个talen的方法描述于例如reyon等人(naturebiotechnology，2012年5月；30(5)：460至5)、miller等人(natbiotechnol.，2011年，29：143至148)、cermak等人(nucleicacidsresearch，2011年，39(12)：e82)、以及zhang等人(naturebiotechnology，2011年，29(2)：149至53)。一种最近开发的基于网络的程序(称为梅奥手(mojohand))，通过梅奥医院(mayoclinic)引入，用于为基因组编辑应用程序设计多个tal和talen构建体(可以通过www(dot)talendesign(dot)org进入)。talen也可以从例如sangamobiosciencestm(richmond，加利福尼亚州)商业设计和获得。[0487]t‑gee系统(靶基因的基因组编辑引擎(targetgene’sgenomeeditingengine))‑提供了一种可编程的核蛋白分子复合物，其含有一多肽部分和一赋予特异性的核酸(specificityconferringnucleicacid，scna)，所述核酸在一靶细胞中进行体内组装，并能够与预定的所述靶核酸序列相互作用。所述可编程的核蛋白分子复合物能够特异性地修饰及/或编辑在所述靶核酸序列内的一靶位点及/或修饰所述靶核酸序列的功能。核蛋白组合物包括(a)用于编码一嵌合多肽的多核苷酸分子并包括(i)能够修饰所述靶位点的一功能域，和(ii)能够与赋予特异性的核酸相互作用的一连接域；以及(b)赋予特异性的核酸(scna)，其包括(i)与所述靶核酸在所述靶位点两侧的区域互补的一核苷酸序列，和(ii)能够特异性地附着于所述多肽的所述连接域的一识别区。所述组合物通过赋予特异性的核酸与一靶核酸的碱基配对，具有高度的特异性和分子复合物与所述靶核酸的结合能力，能够准确地、可靠地以及成本有效地修饰一预定的核酸序列靶。所述组合物的遗传毒性小、组装模块化、利用无需定制的单个平台、可在专用核心设施外独立使用、以及开发周期短且成本低。[0488]crispr‑cas系统及其所有变体(在本文中也称为“crispr”)‑许多细菌和古细菌(archea)含有基于内源性rna的适应性免疫系统，可降解入侵多个噬菌体和多个质粒的多个核酸。这些系统由多个成簇规律间隔短回文重复序列(clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeat，crispr)核苷酸序列组成，所述序列产生多个rna成分和crispr相关的(cas)多个基因(编码多个蛋白成分)。所述多个crisprrna(crrna)含有与多个特定病毒和质粒的dna很短的同源性，并引导cas核酸酶降解与相应的病原体互补的多个核酸。化脓性链球菌(streptococcuspyogenes)的ii型crispr/cas系统的研究指出，3个成分形成一rna/蛋白质复合物，且在一起足以满足序列特异性的核酸酶活性：所述cas9核酸酶，一种与所述靶序列含有20个碱基对同源性的crrna，且是一种反式激活的(trans‑activating)crrna(tracrrna)(jinek等人，science，2012年，337：816至821)。[0489]进一步证明，由在crrna和tracrrna之间的一融合组成的一合成嵌合引导rna(grna)可以在体外定向cas9以剪切与所述crrna互补的多个dna靶。还证明了cas9与多个合成grna的共同瞬时表达可以用于在多种不同物种中产生靶向的多个双链断裂(dsb)(cho等人，2013年；cong等人，2013年；dicarlo等人，2013年；hwang等人，2013a，b；jinek等人，2013年；mali等人，2013年)。[0490]用于基因组编辑的所述crispr/cas系统含有两个不同的组成部分：一sgrna和一内切核酸酶，例如，cas9。[0491]所述grna(在本文中也称为短引导rna(sgrna))通常是一20个核苷酸的序列，用于编码所述靶同源序列(crrna)和所述内源性细菌rna的一组合，所述组合在一单个嵌合转录物中将所述crrna连接至所述cas9核酸酶(tracrrna)。通过在所述sgrna序列和所述补体基因组dna之间的所述碱基配对，将所述sgrna/cas9复合物募集至所述靶序列。为了成功结合cas9，所述基因组靶序列还必须在所述靶序列之后紧接地含有所述正确的原间隔相邻基序(protospaceradjacentmotif，pam)序列。所述sgrna/cas9复合物的所述结合将所述cas9定位在所述基因组靶序列上，因此所述cas9可以切割所述dna的两条链，从而导致一双链断裂(dsb)。与数个zfn和数个talen一样，通过crispr/cas产生的所述数个双链断裂(dsb)可以进行同源重组或nhej，且在dna修复期间容易发生特异性序列修饰。[0492]所述cas9核酸酶具有两个功能域：ruvc和hnh，各自切割一不同的dna链。当这两个的这些域都具有活性时，所述cas9会在所述基因组dna中引起多个双链断裂(dsb)。[0493]crispr/cas的一显着优点是，此系统的高效率与容易产生多个合成grna的能力相结合。这产生了一种可以容易地被修饰以靶向在不同基因组位点的多个修饰及/或靶向在相同位点的多个不同修饰的系统。另外，已经建立了能够同时靶向多个基因的方案。携带所述突变的大多数细胞在所述多个靶向的基因中出现多个双等位基因突变(biallelicmutation)。[0494]然而，在所述sgrna序列与所述基因组dna靶序列之间的所述数个碱基配对相互作用中明显的灵活性允许不完全匹配至会被cas9切割的所述靶序列。[0495]含有一单个无活性催化域(ruvc‑或hnh‑)的所述cas9酶的多个修饰形式称为“切口酶(nickase)”。仅具有一个活性核酸酶域，所述cas9切口酶仅切割所述靶dna的一条链，从而产生一单链断裂或“切口(nick)”。一单链断裂或切口大多是通过单链断裂修复机制修复的，所述机制涉及蛋白质，例如但不仅限于parp(传感器)和xrcc1/ligiii复合物(接合(ligation))。如果一单链断裂(ssb)是通过多个拓扑异构酶(topoisomerase)i毒物或通过多个药物捕获rarp1在天然存在的ssb上产生的，则这些可能会持续存在，且当所述细胞进biol.，(2018年)13(2)：406至416；larussamf及qils.，molcellbiol。(2015年)35(22)：3800至9]。[0500]crispr的数个其他版本可以根据本发明的一些实施例来使用，所述crispr的数个其他版本包括基因组编辑，所述基因组编辑使用来自数个crispr系统的数个组件与数个其他酶一起在细胞dna或rna中直接地安装数个点突变。[0501]因此，根据一实施例，所述编辑剂是dna或rna编辑剂。[0502]根据一实施例，所述dna或rna编辑剂引发碱基编辑。[0503]本文所用的术语“碱基编辑(baseediting)”是指将数个点突变安装至细胞dna或rna中，而不会造成双链或单链dna断裂。[0504]在碱基编辑中，数个dna碱基编辑器通常包括一催化失效的cas核酸酶(catalyticallyimpairedcasnuclease)及对单链dna(ssdna)起作用的一碱基修饰酶之间的融合。在与其靶dna位点结合后，所述grna及靶dna链之间的碱基配对将导致“r环(rloop)”中的一小段单链dna发生置换。所述ssdna气泡内的dna碱基通过所述碱基编辑酶(例如脱氨酶)来修饰。为了提高数个真核细胞的效率，所述催化失效的核酸酶(catalyticallyimpairedcasnuclease)还在所述未编辑的dna链中产生一切口，诱导数个细胞使用所述编辑的链作为一模板来修复所述未编辑的链。[0505]已经描述了两类dna碱基编辑器：数个胞嘧啶碱基编辑器(cytosinebaseeditors，cbe)将一c‑g碱基对转换为一t‑a碱基对，以及数个腺嘌呤碱基编辑器(adeninebaseeditors，abe)将a‑t碱基对转换为g‑c碱基对。总体而言，数个cbe及数个abe可以介导所有四种可能的数个过渡突变(transitionmutations)(c至t、a至g、t至c、及g至a)。同样在rna中，靶向腺苷(targetedadenosine)转化为肌苷(inosine)，是同时使用反义及cas13引导rna靶向的数个方法。[0506]根据一实施例，所述dna或rna编辑剂包括一催化失活的核酸内切酶(catalyticallyinactiveendonuclease)(例如crispr‑dcas)。[0507]根据一实施例，所述催化失活的核酸内切酶是一不具有活性的cas9(例如dcas9)。[0508]根据一实施例，所述催化失活的核酸内切酶是一不具有活性的cas13(例如dcas13)。[0509]根据一实施例，所述dna或rna编辑剂包括能够进行表观遗传编辑(即提供数个化学变化至所述dna、rna或组蛋白)的一酶。[0510]数个示例性酶包括但不限于数个dna甲基转移酶、数个甲基化酶、数个乙酰转移酶。更具体地，数个示例性酶包括例如dna(cytosine‑5)‑甲基转移酶3a(dna(dnmt3a)、组蛋白乙酰转移酶p300(histoneacetyltransferasep300)、10‑11易位甲基胞嘧啶双加氧酶1(ten‑eleventranslocationmethylcytosinedioxygenase1，tet1)、赖氨酸(k)特异性脱甲基酶1a(lysine(k)‑specificdemethylase1a，lsd1)以及钙及整合素结合蛋白1(calciumandintegrinbindingprotein1，cib1)。[0511]除了所述催化失效的核酸酶(catalyticallydisablednuclease)之外，本发明的所述数个dna或rna编辑剂还可包括一核碱基脱氨酶及/或一dna糖基化酶抑制剂。[0512]根据一具体的实施例，所述dna或rna编辑剂包括be1(apobec1‑xten‑dcas9)、be2(apobec1‑xten‑dcas9‑ugi)或be3(apobec‑xten‑dcas9(a840h)‑ugi)，且包括与sgrna一起。apobec1是一脱氨酶全长或催化活性片段，xten是一蛋白质接头(proteinlinker)，ugi是尿嘧啶dna糖基化酶抑制剂，以防止随后的u:g错误匹配被修复回一c:g碱基对，dcas9(a840h)是一切口酶，其中所述dcas9被还原以恢复hnh结构域的所述催化活性，所述hnh结构域仅切割所述未编辑的链、模拟新合成的dna并产生所需的u:a产物。[0513]根据本发明的一些实施例，可用于碱基编辑的其他酶下述文献中详细说明，所述文献为rees及liu，naturereviewsgenetics(2018年)19:770至788，所述文献通过引用整体并入本文。[0514]有许多公开可用的工具可帮助选择及/或设计多个靶序列，以及生物信息学确定的不同物种中不同基因的多个独特sgrna列表，例如但不限于，fengzhang实验室的靶查找器(targetfinder)、michaelboutros实验室的靶查找器(e‑crisp)、rgen工具：cas‑offinder、casfinder：用于在基因组中识别特定cas9靶的灵活算法以及crispr最佳靶查找器(crisproptimaltargetfinder)。[0515]为了使用所述crispr系统，sgrna和一cas核酸内切酶(例如，cas9)都应在一靶细胞中表达或存在(例如，作为一核糖核蛋白复合物)。所述插入载体可以在一单个质粒上含有两个盒，或者所述多个盒由两个单独的质粒表达。多个crispr质粒是可商购的，例如，来自addgene的px330质粒(75sidneyst，suite550a·cambridge，ma02139)。svitashev等人(2015年，plantphysiology，169(2)：931至945)、kumar和jain(2015年，jexpbot，66：47至57)以及在美国专利申请公开第20150082478号中至少公开了使用成簇规律间隔短回文重复序列(crispr)相关的(cas)引导rna技术和一cas核酸内切酶修饰植物基因组，其内容通过引用整体并入本文中。可用于通过grna进行dna编辑的cas核酸内切酶包含但不限于，cas9、cpfl(zetsche等人，2015年，cell，163(3)：759至71)、c2c1、c2c2以及c2c3(shmakov等人，molcell.，2015年11月5日；60(3)：385至97)。[0516]“基因打靶的策略(hitandrun)”或“由内而外(in‑out)”涉及一两步骤的重组程序。在第一步骤中，使用含有一双正/负选择标记盒的一插入型载体来引入所需的序列改变。所述插入载体含有与所述靶向的基因座同源的一单个连续区域，且被修饰以携带感兴趣的突变。此靶向构建体在同源性区域内的一个位点处用一限制酶线性化，引入至所述多个细胞中，并进行阳性选择以分离同源重组介导的事件。携带所述同源序列的所述dna可以以一质粒、单链或双链寡核苷酸的形式提供。这些同源重组体含有一局部复制，所述局部复制由包含所述选择盒在内的中间载体序列隔开。在第二步骤中，对多个靶向的克隆进行负选择，以通过所述重复序列之间的染色体内重组鉴定丢失所述选择盒的多个细胞。所述局部重组事件去除所述重复，并取决于所述重组位点，等位基因保留所述引入的突变或恢复为野生型。最终结果是引入了所需的修饰，而没有保留任何外源性序列。[0517]“双重替换(double‑replacement)”或“标记和交换(tagandexchange)”策略：涉及一两步骤选择程序，类似于所述基因打靶的策略(hitandrun)方法，但需要使用两种不同的靶构建。在第一步骤中，将具有3’和5’同源臂的一标准靶向载体用在将要引入所述突变的位置附近插入一双正/负选择盒。将所述系统组件引入至所述细胞并施行阳性选择后，即可识别hr介导的事件。接下来，将含有与所需的突变具有一同源性区域的一第二靶向载体引入至多个靶向克隆，并施行阴性选择以去除所述选择盒并引入所述突变。最终的等位基因含有所需的突变，同时消除了不需要的外源性序列。phosphotransferase，hpt)。可以根据本教示使用的其他多个标记基因包含但不限于，庆大霉素乙酰转移酶(gentamycinacetyltransferase，accc3)抗性和博来霉素(bleomycin)和腐草霉素(phleomycin)抗性基因。[0534]应理解的是，所述酶nptii通过磷酸化使许多氨基糖苷类抗生素(aminoglycosideantibiotics)失活，例如，卡那霉素(kanamycin)、新霉素(neomycin)、遗传霉素(geneticin)(或g418)和巴龙霉素(paromomycin)。其中，卡那霉素、新霉素以及巴龙霉素用于多种植物物种。[0535]根据另一个实施例，所述报道子是一毒性选择标记。可以用作一报道子的一示例性毒性选择标记是但不限于，使用醇脱氢酶(alcoholdehydrogenase，adh1)基因进行的烯丙醇选择。adh1包括一组脱氢酶，其催化多个醇与多个醛或多个酮之间的相互转化以及nad 或nadp 的同时还原、分解多个组织内的多个酒精性有毒物质。带有降低的adh1表达的多个植物表现出对烯丙醇的耐受性增加。因此，具有降低的adh1的多个植物对烯丙醇的毒性作用具有抗性。[0536]无论使用何种dna编辑剂，都采用本发明的所述方法，使得用于编码所述rna分子或所述植物基因(例如，rna沉默分子)的所述基因通过一缺失、一插入或一点突变中的至少一个来修饰。[0537]根据一实施例，所述修饰是在所述非编码rna分子(例如rna沉默分子)的一结构化区域中。[0538]根据一实施例，所述修饰是在非编码rna分子(例如rna沉默分子)的一茎区域中。[0539]根据一实施例，所述修饰是在非编码rna分子(例如rna沉默分子)的一环区域中。[0540]根据一实施例，所述修饰是在非编码rna分子(例如rna沉默分子)的一茎区域及一环区域中。[0541]根据一实施例，所述修饰是在非编码rna分子(例如rna沉默分子)的一非结构化区域中。[0542]根据一实施例，所述修饰是在非编码rna分子(例如rna沉默分子)的一茎区域及一环区域以及一非结构化区域中。[0543]根据一具体的实施例，所述修饰包括约10至250个核苷酸、约10至200个核苷酸、约10至150个核苷酸、约10至100个核苷酸、约10至50个核苷酸、约1至50个核苷酸、约1至10个核苷酸、约50至150个核苷酸、约50至100个核苷酸、或约100至200个核苷酸的一修饰(与所述天然植物rna或天然rna分子(例如rna沉默分子)相比)。[0544]根据一个实施例，所述修饰包括最多1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、22个、24个、26个、28个、30个、32个、34个、36个、38个、40个、42个、44个、46个、48个、50个、60个、70个、80个、90个、100个、110个、120个、130个、140个、150个、160个、170个、180个、190个、200个或最多250个核苷酸的一修饰(与天然植物rna或天然rna分子(例如rna沉默分子)相比)。[0545]根据一实施例，所述修饰可以在一连续的核酸序列中(例如至少5个、10个、20个、30个、40个、50个、100个、150个、200个碱基)。[0546]根据一实施例，所述修饰可以是以一非连续的方式，例如遍及于一20个、50个、100个、150个、200个、500个、1000个的核酸序列。[0547]根据一具体的实施例，所述修饰包括一最多200个核苷酸的修饰。[0548]根据一具体的实施例，所述修饰包括一最多150个核苷酸的修饰。[0549]根据一具体的实施例，所述修饰包括一最多100个核苷酸的修饰。[0550]根据一具体的实施例，所述修饰包括一最多50个核苷酸的修饰。[0551]根据一具体的实施例，所述修饰包括一最多25个核苷酸的修饰。[0552]根据一具体的实施例，所述修饰包括一最多20个核苷酸的修饰。[0553]根据一具体的实施例，所述修饰包括一最多15个核苷酸的修饰。[0554]根据一具体的实施例，所述修饰包括一最多10个核苷酸的修饰。[0555]根据一具体的实施例，所述修饰包括一最多5个核苷酸的修饰。[0556]根据一实施例，所述修饰取决于所述rna分子(例如沉默分子)的所述结构。[0557]因此，当所述rna沉默分子含有一非必需结构(即所述rna沉默分子的一二级结构(secondarystructure)在其适当的生物发生及/或功能中不起作用)，或为纯dsrna时(即所述rna沉默分子具有一完全或几乎完全的dsrna)，引入一些修饰(例如，20至30个核苷酸，例如，1至10个核苷酸，例如，5个核苷酸)以重定向所述rna沉默分子的所述沉默特异性。[0558]根据另一个实施例，当所述rna沉默分子具有一必需结构(即所述rna沉默分子的所述适当的生物发生及/或活性取决于其二级结构)时，引入多个较大的修饰(例如，10至200个核苷酸，例如，50至150个核苷酸，例如，30个核苷酸以上且不超过200个核苷酸，30至200个核苷酸，35至200个核苷酸，35至150个核苷酸，35至100个核苷酸)以重定向所述rna沉默分子的所述沉默特异性。[0559]根据一个实施例，所述修饰使得所述rna沉默分子的识别/切割位点/pam模序被修饰以消除原始pam识别位点。[0560]根据一具体的实施例，所述修饰是在一pam基序中的至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多个核酸中。[0561]根据一实施例，所述修饰包括一插入。[0562]根据一具体的实施例，所述插入包括约10至250个核苷酸、约10至200个核苷酸、约10至150个核苷酸、约10至100个核苷酸、约10至50个核苷酸、约1至50个核苷酸、约1至10个核苷酸、约50至150个核苷酸、约50至100个核苷酸或约100至200个核苷酸的一插入(与所述天然植物rna或天然rna分子(例如rna沉默分子)相比)。[0563]根据一实施例，所述插入包括一最多1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、22个、24个、26个、28个、30个、32个、34个、36个、38个、40个、42个、44个、46个、48个、50个、60个、70个、80个、90个、100个、110个、120个、130个、140个、150个、160个、170个、180个、190个、200个或最多250个的核苷酸(与所述天然植物rna或天然rna分子(例如rna沉默分子)相比)。[0564]根据一具体的实施例，所述插入包括一最多200个核苷酸的插入。[0565]根据一具体的实施例，所述插入包括一最多150个核苷酸的插入。[0566]根据一具体的实施例，所述插入包括一最多100个核苷酸的插入。[0567]根据一具体的实施例，所述插入包括一最多50个核苷酸的插入。[0568]根据一具体的实施例，所述插入包括一最多25个核苷酸的插入。[0569]根据一具体的实施例，所述插入包括一最多20个核苷酸的插入。[0570]根据一具体的实施例，所述插入包括一最多15个核苷酸的插入。[0571]根据一具体的实施例，所述插入包括一最多10个核苷酸的插入。[0572]根据一具体的实施例，所述插入包括一最多5个核苷酸的插入。[0573]根据一实施例，所述修饰包括一缺失(deletion)。[0574]根据一具体的实施例，所述缺失包括约10至250个核苷酸、约10至200个核苷酸、约10至150个核苷酸、约10至100个核苷酸、约10至50个核苷酸、约1至50个核苷酸、约1至10个核苷酸的缺失、约50至150个核苷酸、约50至100个核苷酸或约100至200个核苷酸(与所述天然植物rna或天然rna分子(例如rna沉默分子)相比)。[0575]根据一实施例，所述缺失包括一最多1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、22个、24个、26个、28个、30个、32个、34个、36个、38个、40个、42个、44个、46个、48个、50个、60个、70个、80个、90个、100个、110个、120个、130个、140个、150个、160个、170个、180个、190个、200个或最多250个的核苷酸(与所述天然植物rna或天然rna分子(例如rna沉默分子)相比)。[0576]根据一具体的实施例，所述缺失包括一最多200个核苷酸的缺失。[0577]根据一具体的实施例，所述缺失包括一最多150个核苷酸的缺失。[0578]根据一具体的实施例，所述缺失包括一最多100个核苷酸的缺失。[0579]根据一具体的实施例，所述缺失包括一最多50个核苷酸的缺失。[0580]根据一具体的实施例，所述缺失包括一最多25个核苷酸的缺失。[0581]根据一具体的实施例，所述缺失包括一最多20个核苷酸的缺失。[0582]根据一具体的实施例，所述缺失包括一最多15个核苷酸的缺失。[0583]根据一具体的实施例，所述缺失包括一最多10个核苷酸的缺失。[0584]根据一具体的实施例，所述缺失包括一最多5个核苷酸的缺失。[0585]根据一实施例，所述修饰包括一点突变(pointmutation)。[0586]根据一具体的实施例，所述点突变包括约10至250个核苷酸、约10至200个核苷酸、约10至150个核苷酸、约10至100个核苷酸、约10至50个核苷酸、约1至50个核苷酸、约1至10个核苷酸、约50至150个核苷酸、约50至100个核苷酸或约100至200个核苷酸(与所述天然植物rna或天然rna分子(例如rna沉默分子)相比)。[0587]根据一实施例，所述点突变包括一最多1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、22个、24个、26个、28个、30个、32个、34个、36个、38个、40个、42个、44个、46个、48个、50个、60个、70个、80个、90个、100个、110个、120个、130个、140个、150个、160个、170个、180个、190个、200个或至多250个核苷酸的点突变(与天然植物rna或天然rna分子(例如rna沉默分子)相比)。[0588]根据一具体的实施例，所述点突变包括一最多200个核苷酸的点突变。[0589]根据一具体的实施例，所述点突变包括一最多150个核苷酸的点突变。[0590]根据一具体的实施例，所述点突变包括一最多100个核苷酸的点突变。[0591]根据一具体的实施例，所述点突变包括一最多50个核苷酸的点突变。[0592]根据一具体的实施例，所述点突变包括一最多25个核苷酸的点突变。[0593]根据一具体的实施例，所述点突变包括一最多20个核苷酸的点突变。[0594]根据一具体的实施例，所述点突变包括一最多15个核苷酸的点突变。[0595]根据一具体的实施例，所述点突变包括一最多10个核苷酸的点突变。[0596]根据一具体的实施例，所述点突变包括一最多5个核苷酸的点突变。[0597]根据一实施例，所述修饰包括一缺失、一插入及/或一点突变中任何的一组合。[0598]根据一实施例，所述修饰包括核苷酸置换(nucleotidereplacement)(例如核苷酸交换(nucleotideswapping))。[0599]根据一具体的实施例，所述交换(swapping)包括约10至250个核苷酸、约10至200个核苷酸、约10至150个核苷酸、约10至100个核苷酸、约10至50个核苷酸、约1至50个核苷酸、约1至10个核苷酸、约50至150个核苷酸、约50至100个核苷酸或约100至200个核苷酸(与所述天然植物rna或天然rna分子(例如rna沉默分子)相比)。[0600]根据一实施例，所述核苷酸交换(nucleotideswap)包括一最多1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、22个、24个、26个、28个、30个、32个、34个、36个、38个、40个、42个、44个、46个、48个、50个、60个、70个、80个、90个、100个、110个、120个、130个、140个、150个、160个、170个、180个、190个、200个或至多250个核苷酸的核苷酸置换(与所述天然植物rna或天然rna分子(例如rna沉默分子)相比)。[0601]根据一具体的实施例，所述核苷酸交换包括一最多200个核苷酸的核苷酸替换。[0602]根据一具体的实施例，所述核苷酸交换包括一最多150个核苷酸的核苷酸置换。[0603]根据一具体的实施例，所述核苷酸交换包括一最多100个核苷酸的核苷酸置换。[0604]根据一具体的实施例，所述核苷酸交换包括一最多50个核苷酸的核苷酸置换。[0605]根据一具体的实施例，所述核苷酸交换包括一最多25个核苷酸的核苷酸置换。[0606]根据一具体的实施例，所述核苷酸交换包括一最多20个核苷酸的核苷酸置换。[0607]根据一具体的实施例，所述核苷酸交换包括一最多15个核苷酸的核苷酸置换。[0608]根据一具体的实施例，所述核苷酸交换包括一最多10个核苷酸的核苷酸置换。[0609]根据一具体的实施例，所述核苷酸交换包括一最多5个核苷酸的核苷酸置换。[0610]根据一实施例，编码所述植物rna或rna分子(例如rna沉默分子)的所述基因通过与一选择的rna沉默序列(例如sirna)交换的一内源rna沉默分子(例如mirna)的一序列来修饰。[0611]根据一实施例，所述rna分子(例如rna沉默分子，例如数个mirna前体(数个pri/pre‑mirna)或数个sirna前体(dsrna))的引导链被修饰以保持结构的原创性并保持相同的碱基配对特征。[0612]根据一实施例，所述rna分子(例如rna沉默分子，例如数个mirna前体(pri/pre‑mirna)或数个sirna前体(dsrna))的所述过客链(passengerstrand)被修饰以保持结构的原创性并保持相同的碱基配对特征。[0613]如本文所使用，术语“结构的原创性”是指所述二级rna结构(即碱基配对谱)。保持结构的独创性对于所述非编码rna(例如rna沉默分子，如sirna或mirna)的正确及有效的生物发生(biogenesis)/加工(processing)是非常重要的，这些rna是结构依赖性的，而不是纯粹序列依赖性的。[0614]根据一实施例，所述rna(例如rna沉默分子)在所述引导链(沉默链)中被修饰以包括与所述靶rna(如上所述)约50至100％的互补性，而所述过客链(passengerstrand)被修饰以保留所述原始(未修饰)rna(例如非编码rna)结构。[0615]根据一实施例，所述rna序列(例如rna沉默分子)被修饰，使得所述种子序列(例如从5'端开始的2至8个mirna核苷酸)与所述靶序列互补。[0616]根据一具体的实施例，所述rna沉默分子(即rnai分子)被设计成使得rnai分子的一序列被修饰以保持结构的原创性并被数个细胞rnai加工及执行因子(cellularrnaiprocessingandexecutingfactors)所识别。[0617]根据一具体的实施例，所述rna分子例如非编码rna分子(即rrna、trna、lncrna、snorna等)被设计成使rnai分子的一序列被修饰以被数个细胞rnai加工及执行因子(cellularrnaiprocessingandexecutingfactors)所识别。[0618]应理解的是，额外的数个突变可以通过额外的数个编辑事件(即，同时或依次)而引入。[0619]可以使用数个dna递送方法(例如通过数个表达载体)或使用数个无dna方法将本发明的所述dna编辑剂引入数个植物细胞中。[0620]根据一实施例，sgrna(或任何其他使用的dna识别模块，取决于所使用的dna编辑系统)可以作为rna提供给细胞。[0621]因此，应理解的是，所述数个本技术涉及使用数个瞬时dna或无dna方法来引入所述dna编辑剂，例如rna转染(例如mrna sgrna转染)或核糖核蛋白(rnp)转染(例如蛋白质‑rna复合物转染)，例如cas9/sgrna核糖核蛋白(rnp)复合物转染)。[0622]举例而言，cas9可以作为一dna表达质粒、体外转录物(即rna)或作为与核糖核蛋白颗粒(rnp)中rna部分结合的一重组蛋白而引入。举例而言，sgrna可以作为一dna质粒或一体外转录物(即rna)递送。[0623]根据本教示，可以使用本领域已知的用于rna或rnp转染的任何方法，例如但不限于，显微注射(microinjection)(如通过cho等人所述，“在秀丽隐杆线虫中通过直接注射cas9‑sgrna核糖核蛋白进行可遗传的基因敲除(heritablegeneknockoutincaenorhabditiselegansbydirectinjectionofcas9‑sgrnaribonucleoproteins)”，genetics，2013年，195：1177至1180，通过引用并入本文中)、电穿孔(electroporation)(如通过kim等人所述，“通过递送纯化的cas9核糖核蛋白在人类细胞中进行的高效rna引导的基因组编辑(highlyefficientrna‑guidedgenomeeditinginhumancellsviadeliveryofpurifiedcas9ribonucleoproteins)”，genomeres.，2014年，24：1012至1019，通过引用并入本文中)、或脂质介导的转染，例如，使用脂质体(liposome)(如zuris等人所述，“阳离子脂质介导的蛋白质递送使得能够在体外和体内进行基于蛋白质的有效基因组编辑(cationiclipid‑mediateddeliveryofproteinsenablesefficientprotein‑basedgenomeeditinginvitroandinvivo)”，natbiotechnol.，2014年，doi：10.1038/nbt.3081，通过引用并入本文中)。rna转染的其他多个方法在美国专利申请号20160289675中描述，其全部内容通过引用并入本文中。[0624]本发明的多个rna转染方法的一优点是rna转染本质上是瞬时的且无载体(vector‑free)。一rna转基因可以作为一最小表达盒递送至一细胞并在其中表达，而不需要任何其他的序列(例如，多个病毒序列)。[0625]根据一个实施例，本发明的所述dna编辑剂使用多个表达载体引入至所述植物细胞中。[0626]本发明一些实施例的所述“表达载体”(在本文中也称为“一核酸构建体(construct)”、“载体”或“构建体”)包含提供此载体适于在原核生物、真核生物或优选两者中复制的多个附加序列(例如，穿梭载体(shuttlevector))。[0627]在根据本发明一些实施例的所述多个方法中有用的多个构建体可以使用本领域技术人员众所周知的重组dna技术来构建。所述多个核酸序列可以插入至多个载体中，所述多个载体可以是市售的、适于转化为多个植物且适于在多个转化的细胞中瞬时表达所述感兴趣的基因。所述遗传构建体可以是一表达载体，其中所述核酸序列可操作地(operably)连接至一个或多个调节序列，从而允许在所述多个植物细胞中表达。[0628]根据一个实施例，为了表达一功能性dna编辑剂，在所述剪切模块(cleavingmodule)(核酸酶)不是所述dna识别单元的一组成部分的情况下，所述表达载体可以用于编码所述剪切模块以及所述dna识别单元(例如，sgrna在crispr/cas的情况下)。[0629]或者，可以将所述剪切模块(核酸酶)和所述dna识别单元(例如，sgrna)克隆至多个单独的表达载体中。在这种情况下，必须将至少两个不同的表达载体转化至同一植物细胞中。[0630]或者，当不使用一核酸酶时(即不从一外源性的来源向所述细胞施加)，可以使用一单个表达载体克隆并表达所述dna识别单元(例如，sgrna)。[0631]多个典型的表达载体还可以含有一转录和翻译起始序列、转录和翻译终止子以及可选的一聚腺苷酸化信号(polyadenylationsignal)。[0632]根据一个实施例，所述dna编辑剂包括用于编码至少一个dna识别单元(例如，grna)的一核酸剂，所述dna识别单元在运作上(operatively)连接至在多个植物细胞中有活性的一顺式作用(cis‑acting)调节元件(例如，启动子)。[0633]根据一个实施例，所述核酸酶(例如，核酸内切酶)和所述dna识别单元(例如，sgrna)是从相同的表达载体编码的。这样的载体可以包括在多个植物细胞中有活性的一单个顺式作用调节元件(例如，启动子)，用于所述核酸酶和所述dna识别单元二者的表达。或者，所述核酸酶和所述dna识别单元可以各自可操作地连接至在多个植物细胞中有活性的一顺式作用调节元件(例如，启动子)。[0634]根据一个实施例，所述核酸酶(例如，核酸内切酶)和所述dna识别单元(例如，sgrna)是从不同的表达载体编码的，其中每个表达载体可操作地连接至在多个植物细胞中有活性的一顺式作用调节元件(例如，启动子)。[0635]如本文中所使用，短语“植物可表达的”或“在多个植物细胞中有活性的”是指一启动子序列，包含添加至其中或含在其中的任何其他调节元件，其至少能够诱导、赋予、激活或增强在一植物细胞、组织或器官中的表达，优选一单子叶或双子叶植物细胞、组织或器官。[0636]使用的所述植物启动子可以是一组成型启动子、一组织特异性启动子、一诱导型启动子、一嵌合(chimeric)启动子或一发育调控(developmentallyregulated)启动子。[0637]对于本发明一些实施例的所述多个方法有用的多个优选启动子的多个范例在表i、ii、iii以及iv中示出。[0638]表i：用于实施本发明的一些实施例的多个示例性组成型启动子[0639][0640][0641]表ii：用于实施本发明的一些实施例的数个示例性种子优选启动子[0642][0643][0644][0645]表iii：用于实施本发明的数个示例性花特异性启动子[0646][0647]表iv：用于实施本发明的数个替代水稻促进剂[0648][0649][0650][0651][0652]所述诱导型启动子是在一特定植物组织中，通过一发育阶段或通过一特定刺激(例如，多个胁迫条件，包括例如光、温度、化学物质、干旱、高盐、渗透压休克(osmoticshock)、氧化剂条件、或在致病性的情况下)诱导的一启动子，且包含但不限于来自豌豆rbcs基因的光诱导启动子、来自苜蓿(alfalfa)rbcs基因的启动子、在干旱中有活性的多个启动子dre、myc以及myb；在高盐和渗透胁迫(osmoticstress)中有活性的多个启动子int、inps、prxea、hahsp17.7g4以及rd21，以及在病原胁迫下有活性的多个启动子hsr203j和str246c。[0653]根据一个实施例，所述启动子是一病原体诱导型(pathogen‑inducible)启动子。这些启动子在感染一病原体(例如，细菌、真菌、病毒、线虫以及昆虫)后在多个植物中定向bombardment)将dna注入至植物细胞或组织中，klein等人，bio/technology，1988年，6：559至563；mccabe等人，bio/technology，1988年，6：923至926；sanford，physiol.plant，1990年，79：206至209；通过使用微量移液器系统(micropipettesystem)：neuhaus等人，theor.appl.genet.，1987年，75：30至36；neuhaus和spangenberg，physiol.plant.，1990年，79：213至217；美国专利号5,464,765：细胞培养、胚胎或愈伤组织的玻璃纤维或碳化硅晶须转化(glassfibersorsiliconcarbidewhiskertransformationofcellcultures，embryosorcallustissue)、或通过将dna与发芽的花粉直接孵育，dewet等人在胚珠组织的实验操作(experimentalmanipulationofovuletissue)中，chapman，g.p.、mantell，s.h.以及daniels，w.编辑，朗文(longman)，伦敦，1985年，第197至209页；以及ohta，proc.natl.acad.sci.，美国，1986年，83：715至719。[0666]所述农杆菌系统包含使用多个质粒载体，所述质粒载体含有整合至所述植物基因组dna中已定义的多个dna片段。所述植物组织的多个接种方法根据多个植物种类以及农杆菌递送系统而变化。一种广泛使用的方法是叶盘(leafdisc)法，其可以用任何组织外植体进行，这为启动整个植物的分化提供了良好的来源。horsch等人在植物分子生物学手册a5(plantmolecularbiologymanuala5)中，克鲁维尔学术出版社(kluweracademicpublishers)，多德雷赫特，1988年，第1至9页。一种辅助方法是将所述农杆菌递送系统与真空渗透结合使用。所述农杆菌系统在创建转基因双子叶植物中特别有效。[0667]根据一个实施例，一无农杆菌表达方法用于将多个外源基因引入至多个植物细胞中。根据一个实施例，所述无农杆菌的表达方法是瞬时的。根据一具体的实施例，一轰击方法用于将多个外源基因引入至多个植物细胞中。根据另一具体的实施例，一植物根的轰击用于将多个外源基因引入至多个植物细胞中。以下多个实例部分中讨论了可以根据本发明的一些实施例使用的一示例性轰击方法。[0668]此外，根据本发明的一些实施例的教示，可以使用各种克隆试剂盒(cloningkit)或基因合成。[0669]根据一个实施例，所述核酸构建体是一二元载体(binaryvector)。二元载体的多个实例是pbin19、pbi101、pbinar、pgptv、pcambia、pbib‑hyg、pbecks、pgreen或ppzp(hajukiewicz，p.等人，plantmol.biol.，25，989，1994年，以及hellens等人，trendsinplantscience，5，446，2000年)。[0670]在其他dna递送方法(例如，如以下所述的转染、电穿孔、轰击、病毒接种)中使用的其他多个载体的多个实例是：pge‑sgrna(zhang等人，nat.comms.，2016年，7：12697)、pjit163‑ubi‑cas9(wang等人，nat.biotechnol.，2004年，32，947至951)、pich47742：2x3不5s‑5’utr‑hcas9(stop)‑nost(belhan等人，plantmethods，2013年，11；9(1)：39)、pahc25(christensen，a.h.和p.h.quail，1996年，基于泛素启动子的载体在单子叶植物中用于可选择及/或可筛选标记基因的高水平表达(ubiquitinpromoter‑basedvectorsforhigh‑levelexpressionofselectableand/orscreenablemarkergenesinmonocotyledonousplants)，转基因研究(transgenicresearch)，5：213至218)、phbt‑sgfp(s65t)‑nos(sheen等人，蛋白质磷酸酶活性是玉米中光诱导基因表达所需要的，emboj.，12(9)，3497至3505，1993年)。[0671]根据一个实施例，本发明的一些实施例的所述方法还包括将多个供体寡核苷酸引入至所述植物细胞中。[0672]根据一个实施例，当所述修饰是一插入时，所述方法还包括将多个供体寡核苷酸引入至所述植物细胞中。[0673]根据一个实施例，当所述修饰是一缺失时，所述方法还包括将多个供体寡核苷酸引入至所述植物细胞中。[0674]根据一个实施例，当所述修饰是一缺失和插入时(例如，交换)，所述方法还包括将多个供体寡核苷酸引入至所述植物细胞中。[0675]根据一个实施例，当所述修饰是一点突变时，所述方法还包括将多个供体寡核苷酸引入至所述植物细胞中。[0676]如本文中所使用，术语“多个供体寡核苷酸(donoroligonucleotide)”或“多个供体寡核苷酸(donoroligo)”是指多个外源性核苷酸，即从外部引入至所述植物细胞中以在所述基因组中产生一精确的变化。根据一个实施例，所述多个供体寡核苷酸是合成的。[0677]根据一实施例，所述数个供体寡核苷酸是数个rna寡核苷酸。[0678]根据一实施例，所述数个供体寡核苷酸是数个dna寡核苷酸。[0679]根据一实施例，所述数个供体寡核苷酸是数个合成寡核苷酸。[0680]根据一实施例，所述数个供体寡核苷酸包括数个单链供体寡核苷酸(ssodn)。[0681]根据一实施例，所述数个供体寡核苷酸包括数个双链供体寡核苷酸(dsodn)。[0682]根据一实施例，所述数个供体寡核苷酸包括数个双链dna(dsdna)。[0683]根据一实施例，所述数个供体寡核苷酸包括双链dna‑rna双链体(dna‑rnaduplex)。[0684]根据一实施例，所述数个供体寡核苷酸包括双链dna‑rna杂交体。[0685]根据一实施例，所述数个供体寡核苷酸包括单链dna‑rna杂交体。[0686]根据一实施例，所述数个供体寡核苷酸包括单链dna(ssdna)。[0687]根据一实施例，所述数个供体寡核苷酸包括双链rna(dsrna)。[0688]根据一实施例，所述数个供体寡核苷酸包括单链rna(ssrna)。[0689]根据一实施例，所述数个供体寡核苷酸包括用于交换的所述dna或rna序列(如上文所讨论)。[0690]根据一实施例，所述数个供体寡核苷酸具有以一非表达载体形式或寡核苷酸形式。[0691]根据一实施例，所述数个供体寡核苷酸包括一dna供体质粒(例如环状或线性化质粒)。[0692]根据一实施例，所述数个供体寡核苷酸包括约50至5000个、约100至5000个、约250至5000个、约500至5000个、约750至5000个、约1000至5000个、约1500至5000个、约2000至5000个、约2500至5000个、约3000至5000个、约4000至5000个、约50至4000个、约100至4000个、约250至4000个、约500至4000个、约750至4000个、约1000至4000个、约1500至4000个、约2000至4000个、约2500至4000个、约3000至4000个、约50至3000个、约100至3000个、约250至3000个、约500至3000个、约750至3000个、约1000至3000个、约1500至3000个、约2000至3000个、约50至2000个、约100至2000个、约250至2000个、约500至2000个、约750至2000个、约1000至2000个、约1500至2000个、约50至1000个、约100至1000个、约250至1000个、约500至1000个、约750至1000个、约50至750个、约150至750个、约250至750个、约500至750个、约50至500个、约150至500个、约200至500个、约250至500个、约350至500个、约50至250个、约150至250个、或约200至250个核苷酸。[0693]根据一具体的实施例，包括所述ssodn(例如ssdna或ssrna)的所述数个供体寡核苷酸包括约200至500个核苷酸。[0694]根据一具体的实施例，包括所述dsodn(例如dsdna或dsrna)的所述数个供体寡核苷酸包括约250至5000个核苷酸。[0695]根据一个实施例，对于将一内源性rna沉默分子(例如，mirna)与一选择的rna沉默序列(例如，sirna)进行基因交换，所述表达载体、ssodn(例如，ssdna或ssrna)或dsodn(例如，dsdna或dsrna)不需在一植物细胞中表达，且可以作为一非表达模板。根据一具体的实施例，在这种情况下，如果以一dna形式提供，则仅需表达所述dna编辑剂(例如，多个cas9/sgrna模块)。[0696]根据一些实施例，对于在不使用一核酸酶的情况下对一内源性非编码rna分子(例如，rna沉默分子)进行基因编辑，可将所述dna编辑剂(例如，sgrna)在有或没有例如寡核苷酸供体dna或rna(如本文中所述)的情况下引入至所述真核细胞中。[0697]根据一个实施例，使用上述任何方法(例如，使用所述表达载体或rnp转染)将多个供体寡核苷酸引入至所述植物细胞中。[0698]根据一个实施例，将所述sgrna和所述多个dna供体寡核苷酸共同引入至所述植物细胞中(例如，通过轰击)。应理解的是，任何其他因子(例如，核酸酶)可以与之共同引[0699]根据一个实施例，将所述sgrna在所述多个dna供体寡核苷酸之前引入至所述植物细胞中(例如，在几分钟或几小时内)。应理解的是，任何其他因子(例如，核酸酶)可以在所述sgrna或所述多个dna供体寡核苷酸之前、同时或之后引入。[0700]根据一个实施例，将所述sgrna在所述多个dna供体寡核苷酸之后引入至所述植物细胞中(例如，在几分钟或几小时内)。应理解的是，任何其他因子(例如，核酸酶)可以在所述sgrna或所述多个dna供体寡核苷酸之前、同时或之后引入。[0701]根据一个实施例，提供了一种组合物，其包括用于基因组编辑的至少一个sgrna和多个dna供体寡核苷酸。[0702]根据一个实施例，提供了一种组合物，其包括用于基因组编辑的至少一个sgrna、一核酸酶(例如，核酸内切酶)以及多个dna供体寡核苷酸。[0703]有多种方法可以直接将dna转移至多个植物细胞中，且技术人员会知道选择哪种方法。在电穿孔中，所述多个原生质体短暂地暴露于一强电场中。在微量注射中，使用非常小的微量移液器将所述dna在机械上直接地注射至所述多个细胞中。在微粒轰击中，所述dna吸附在多个微粒上，例如，多个硫酸镁晶体或多个金或钨微粒，且所述多个微粒在物理上加速进入多个原生质体、多个细胞或多个植物组织。[0704]因此，在本发明的多个实施例中，可以通过本领域技术人员已知的任何方法将多个核酸的递送引入至一植物细胞中，例如包含但不限于：通过多个原生质体的转化(例如参见，美国专利号5,508,184)；通过干燥(desiccation)/抑制介导的dna摄取(例如参见，potrykus等人，1985年，mol.gen.genet.，199：183至8)；通过电穿孔(例如参见，美国专利号5,384,253)；通过与多个碳化硅纤维搅拌(例如参见，美国专利号5,302,523和5,464,765)；通过农杆菌介导的转化(例如参见，美国专利号5,563,055、5,591,616、5,693,512、5,824,877、5,981,840以及6,384,301)；通过加速多个dna涂覆的颗粒(例如参见，美国专利号5,015,580、5,550,318、5,538,880、6,160,208、6,399,861以及6,403,865)、以及通过多个纳米颗粒、多个纳米载体以及多个细胞穿透肽(wo201126644a2；wo2009046384a1；wo2008148223a1)将dna、rna、多个肽及/或多个蛋白质或多个核酸和多个肽的多个组合递送至多个植物细胞中的方法。[0705]其他转染方法包含使用多个转染试剂(例如，lipofectin、thermofisher)、多个树枝状聚合物(kukowska‑latallo，j.f.等人，1996年，proc.natl.acad.sci.usa(美国国家科学院学报)，93，4897至1902)、多个细胞穿透肽(等人，2005年，将细胞穿透肽内化至烟草原生质体中(internalisationofcell‑penetratingpeptidesintotobaccoprotoplasts)，biochimicaetbiophysicaacta，1669(2)：101至7)或多个多胺(zhang和vinogradov，2010年，用于大脑毛细血管内皮细胞的基因递送和转染的短生物可降解多胺(shortbiodegradablepolyaminesforgenedeliveryandtransfectionofbraincapillaryendothelialcells)，jcontrolrelease，143(3)：359至366)。[0706]根据一具体的实施例，将dna引入至多个植物细胞(例如，多个原生质体)中的所述方法包括聚乙二醇(peg)介导的dna摄取。有关更多详细信息，请参见karesch等人(1991年，plantcellrep.，9：575至578)；mathur等人(1995年，plantcellrep.，14：221至226)；negrutiu等人(1987年，plantcellmol.biol.，8：363至373)。然后将多个植物细胞(例如，多个原生质体)在允许它们生长多个细胞壁、开始分裂以形成一愈伤组织、发育多个幼芽和多个根、以及再生整个植物的条件下培养。[0707]稳定的转化后，进行植物繁殖。最常见的植物繁殖方法是通过种子。然而，通过种子繁殖进行再生的缺点在于，由于杂合性(heterozygosity)而导致所述作物中缺乏均匀性，因为多个种子是通过多个植物根据孟德尔规则所支配的多个遗传变异产生的。基本上，每个种子在基因上都是不同的，且每个都有自己的特定性状。因此，优选的是产生转化植物，使得再生植物具有与亲本转基因(parenttransgenic)植物相同的性状和特征。因此，优选的是通过微繁殖(micropropagation)再生所述转化植物，其提供在遗传上相同的转化植物的一快速、一致的繁殖。[0708]微繁殖是从一选定的亲本植物或品种中切除的一单块组织中生长多个新一代植物的一过程。此过程允许具有所需性状的多个植物大量繁殖。多个新产生的植物在遗传上与原始植物相同，且具有所述原始植物的所有特征。微繁殖(或克隆)可以在一短时间内大量产生高质量的植物材料，并在保留所述原始转基因或转化植物的所述多个特征提供多个选定品种的一快速繁殖。多个克隆植物的优点是植物繁殖的速度以及多个所产生植物的质量和均匀性。[0709]微繁殖是一多阶段的程序，需要在多个阶段之间改变培养基或生长条件。因此，所述微繁殖过程包括四个基本阶段：第一阶段，初始组织培养；第二阶段，组织培养繁殖；第三阶段，分化和植物形成；以及第四阶段，温室培养和硬化。在第一阶段期间(初始组织培养)，建立所述组织培养并证明无污染。在第二阶段期间，繁殖所述初始组织培养，直到产生一足够数量的组织样品以满足生产目标为止。在第三阶段期间，将在第二阶段中生长的所述多个组织样品分开并生长成多个单独的植株。在第四阶段期间，将多个转化植株转移至一温室进行硬化，在所述温室中所述植物对光的耐受性逐渐地增加，使其可以在自然环境中生长。[0710]尽管目前优选是稳定的转化，但是本发明的一些实施例还设想了多个叶细胞、多个分生细胞或所述整个植物的瞬时的转化。[0711]瞬时的转化可以通过上述任何直接dna转移方法或通过使用多个修饰的植物病毒的病毒感染来实现。[0712]已证明对多个植物宿主转化有用的多个病毒包含camv、tmv、trv以及bv。使用多个植物病毒的多个植物转化描述于美国专利号4,855,237(bgv)、ep‑a67,553(tmv)、日本公开申请号63‑14693(tmv)、epa194,809(bv)、epa278,667(bv)；以及gluzman，y.等人(分子生物学通讯：病毒载体(communicationsinmolecularbiology：viralvectors)，纽约冷泉港实验室(coldspringharborlaboratory)，第172至189页，1988年)中。用于在包含植物的许多宿主中表达外源dna的伪病毒颗粒(pseudovirusparticle)描述于wo87/06261中。[0713]通过以上参考文献以及通过dawson，w.o.等人(virology，1989年，172：285至292；takamatsu等人(emboj.，1987年，6：307至311)；french等人(science，1986年，231：1294至1297)；以及takamatsu等人(febsletters，1990年，269：73至76)证明了在多个植物中引入和表达多个非病毒外源性核酸序列的多个植物rna病毒的构建。[0714]当所述病毒是一dna病毒时，可以对所述病毒本身进行适当的修饰。或者，可以首先将所述病毒克隆至一细菌质粒中，以易于用所述外源dna构建所需的病毒载体。然后可以从所述质粒中切除所述病毒。如果所述病毒是一dna病毒，则一细菌的复制起点可以附着至所述病毒dna上，然后通过所述细菌复制。此dna的转录和翻译将产生外壳蛋白(coatprotein)，其将包埋(encapsidate)所述病毒dna。如果所述病毒是一rna病毒，则通常将所述病毒克隆为一cdna并插入至一质粒中。然后将所述质粒用于制造所有的构建。然后通过转录所述质粒的所述病毒序列产生所述rna病毒，并转译所述多个病毒基因以产生包埋所述病毒rna的所述(多个)外壳蛋白。[0715]通过以上参考文献以及美国专利号5,316,931中证明了用于在多个植物中引入和表达多个非病毒外源性核酸序列(例如，本发明的一些实施例的所述构建体中包括的序列)的多个植物rna病毒的构建。[0716]在一个实施例中，提供了一种植物病毒核酸，其中已经从一病毒核酸删除了所述天然外壳蛋白编码序列，已经插入了一非天然植物病毒外壳蛋白编码序列和一非天然启动子(优选为所述非天然病毒外壳蛋白编码序列的亚基因组启动子)，其能够在所述植物宿主中表达、包装所述重组植物病毒核酸以及确保所述宿主通过所述重组植物病毒核酸的一系统感染。或者，所述外壳蛋白基因可以通过在其内插入所述非天然核酸序列而失活，从而产生一蛋白质。所述重组植物病毒核酸可以含有一个或多个其他非天然亚基因组启动子。每个非天然亚基因组启动子能够在所述植物宿主中转录或表达多个相邻的基因或核酸序列，且不能彼此重组，也不能与多个天然亚基因组启动子重组。如果包含超过一个核酸序列，则可以在所述天然植物病毒亚基因组启动子或所述天然植物病毒亚基因组和一非天然植物病毒亚基因组启动子附近插入多个非天然(外源)核酸序列。所述多个非天然核酸序列在所述亚基因组启动子的控制下在所述宿主植物中转录或表达以产生多个所需的产物。[0717]在一第二实施例中，如在所述第一实施例中提供了一种重组植物病毒核酸，不同之处在于将所述天然外壳蛋白编码序列置于所述多个非天然外壳蛋白亚基因组启动子之一的附近而不是一非天然外壳蛋白编码序列。[0718]在一第三实施例中，提供了一种重组植物病毒核酸，其中所述天然外壳蛋白基因与其亚基因组启动子相邻，且一个或多个非天然亚基因组启动子已经插入所述病毒核酸中。所述多个插入的非天然亚基因组启动子能够在一植物宿主中转录或表达多个相邻基因，且不能彼此重组，也不能与多个天然亚基因组启动子重组。可以将多个非天然核酸序列插入所述多个非天然亚基因组植物病毒启动子附近，使得在所述多个亚基因组启动子的控制下在所述宿主植物中转录或表达所述多个序列以产生多个所需的产物。[0719]在一第四实施例中，如在所述第三实施例中提供了一种重组植物病毒核酸，不同之处在于将所述天然外壳蛋白编码序列通过一非天然外壳蛋白编码序列替换。[0720]所述多个病毒载体通过所述重组植物病毒核酸编码并通过所述多个外壳蛋白包埋以产生一重组植物病毒。所述重组植物病毒核酸或重组植物病毒用于感染多个合适的宿主植物。所述重组植物病毒核酸能够在所述宿主中复制、在所述宿主中系统传播以及在所述宿主中转录或表达(多个)外源基因(分离的核酸)，以产生所需的蛋白质。[0721]除上述之外，本发明的一些实施例的所述核酸分子还可以被引入至一叶绿体基因组，从而使叶绿体能够表达。[0722]将多个外源性核酸序列引入至所述叶绿素的所述基因组的技术是已知的。此技术包括以下多个步骤。首先，对多个植物细胞进行化学处理，以使每个细胞的叶绿素数量减少至约一个。然后，通过粒子轰击将所述外源性核酸引入至所述多个细胞中，目的是将至少一个外源性核酸分子引入至所述多个叶绿素中。选择所述外源性核酸，使其通过同源重组整合至所述叶绿素的基因组中，所述同源重组容易受所述叶绿素固有的多个酶影响。为此，所述外源性核酸除了包含一感兴趣的基因之外，还包含至少一个源自所述叶绿素的基因组的核酸片段(stretch)。另外，所述外源性核酸包含一可选择的标记，其通过多个顺序选择步骤来确定在此类选择之后所述多个叶绿素基因组的全部或实质上全部的拷贝将包含所述外源性核酸。与此技术有关的更多细节可在美国专利号4,945,050以及5,693,507找到，其通过引用并入本文中。因此，一多肽可以通过所述叶绿素的所述蛋白质表达系统产生并整合至所述叶绿素的内膜中。[0723]无论采用何种转化/感染方法，本教示进一步选择包括一基因组编辑事件的多个转化细胞。[0724]根据一具体的实施例，进行选择使得仅选择在所述特定基因座中包括一成功准确修饰(例如，交换、插入、缺失、点突变)的多个细胞。因此，不选择包括在一非预期基因座中包含一修饰(例如，一插入、缺失、点突变)的任何事件的多个细胞。[0725]根据一个实施例，可以通过检测一分子事件、通过检测一荧光报道子、或通过在选择物(例如，抗生素)存在的情况下生长，在表型水平上进行多个修饰细胞的选择。[0726]根据一个实施例，通过分析新产生的dsrna分子的所述生物发生(biogenesis)和发生(occurrence)来进行多个修饰细胞的选择。[0727]根据一个实施例，通过分析二级小rna分子(通过dsrna的进一步加工而产生)的所述生物发生和发生来进行多个修饰细胞的选择。[0728]根据一个实施例，通过分析新编辑的rna分子(例如新mirna版本的存在、新编辑的数个sirna、pirna、tasirna等的存在)的所述生物发生和发生来进行多个修饰细胞的选择。[0729]根据一个实施例，通过分析新编辑的植物rna转录物(即，修饰的植物基因)的所述生物发生和发生来进行多个修饰细胞的选择。[0730]根据一个实施例，通过分析分别针对一植物rna或一有害生物rna的所述修饰的rna分子(例如，rna沉默分子)或所述修饰的植物rna的所述沉默活性及/或特异性(通过验证在所述植物或生物体中用于编码所述靶rna的至少一个表型)来进行多个修饰细胞的选择，所述表型例如为植物叶片着色，例如，叶片和其他器官中叶绿素的部分或全部丧失(漂白)、存在/不存在坏死模式(nacroticpaterrn)、花色、果实性状(例如，保质期、硬度以及风味)、生长速率、植株尺寸(例如，矮化)、作物产量、生物胁迫耐受性(例如，抗病性、线虫死亡率、甲虫的产卵率或其他与细菌、病毒、真菌、寄生虫、昆虫、杂草以及栽培或本地植物相关的抗性表型)。[0731]根据一实施例，所述rna分子、所述植物rna、所述dsrna或由其加工的所述二级小rna的所述沉默特异性是由基因型上确定的(determinedgenotypically)，例如，通过一基因表达或缺乏表达。[0732]根据一实施例，所述rna分子、所述植物rna、所述dsrna或由其加工的所述二级小rna的所述沉默特异性是由表型上确定的(determinedphenotypically)。[0733]根据一实施例，所述植物的一表型是在一基因型之前确定的。[0734]根据一实施例，所述植物的一基因型是在一表型之前确定的。[0735]根据一实施例，通过分析所述rna分子(例如rna沉默分子)、所述植物rna、所述dsrna或由其加工的所述二级小rna针对一植物rna或一有害生物rna的所述沉默活性及/或特异性(通过测量所述植物rna或有害生物rna的一rna水平)来进行多个修饰细胞的选择。这可以使用本领域已知的任何方法来进行，例如通过北方墨点法、核酸酶保护分析、原位杂交或定量rt‑pcr。[0736]根据一个实施例，通过分析包括所述dna编辑事件的多个植物细胞或多个克隆来进行多个修饰细胞的选择，所述dna编辑事件在本文中也称为“突变”或“编辑”，取决于寻求的编辑类型，例如，插入、缺失、插入‑缺失(插入缺失(indel))、倒位(inversion)、取代及其组合。[0737]用于检测序列改变的方法在本领域中是众所周知的，包含但不限于，dna和rna测序(例如，次世代测序(nextgenerationsequencing))、电泳、一基于酶的错配检测测定法(enzyme‑basedmismatchdetectionassay)以及一杂交测定法，例如，pcr、rt‑pcr、rnase保护、原位杂交、引物延伸(primerextension)、南方墨点法、北方墨点法以及斑点印迹(dotblot)分析。也可以使用用于检测单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphisms，snp)的各种方法，例如，基于pcr的t7核酸内切酶、异源双链(hetroduplex)和sanger测序、或pcr后进行限制酶切(restrictiondigest)以检测(多个)独特限制位点的出现或消失。[0738]验证一dna编辑事件(例如，插入缺失(indel))的存在的另一种方法包括一错配剪切测定法，其利用识别和剪切错配dna的一结构选择酶(例如，内切核酸酶)。[0739]根据一个实施例，通过流式细胞术(facs)选择多个转化的细胞，所述流式细胞术选择表现出荧光(通过所述荧光报道子发射)的多个转化的细胞。在facs分选后，收集阳性选择的多个转化植物细胞群，其显示所述荧光标记，且可以使用一等分试样(aliquot)来测试如上所述的dna编辑事件。[0740]在使用抗生素选择标记的情况下，转化后，在选择(例如，抗生素)存在下培养多个植物细胞克隆，直到它们发展成多个集落(colony)，即多个克隆和多个微愈伤组织(micro‑calli)。如上所述，然后对所述愈伤组织的一部分细胞针对所述dna编辑事件进行分析(验证)。[0741]因此，根据本发明的一个实施例，所述方法进一步包括在所述多个转化的细胞中验证所述rna分子(例如rna沉默分子)、所述植物rna、所述dsrna或由其加工的所述二级小rna针对所述植物rna或有害生物rna的互补性。[0742]如上所述，所述rna分子(例如rna沉默分子)、所述植物rna、dsrna(例如其有义链或反义链)或由其加工的所述二级小rna，进行修饰后，针对所述植物或有害生物rna的所述序列具有至少约30％、33％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或甚至100％的互补性。[0743]设计的rna分子与一靶rna或有害生物的所述特异性结合可以通过本领域中已知的任何方法来确定，例如，通过计算算法(例如，blast)，并通过例如包含北方墨点法、原位杂交、quantigeneplex测定法等多个方法来验证。[0744]应理解的是，对于所述dna编辑事件，多个阳性克隆可以是纯合的(homozygous)或杂合的(heterozygous)。在一杂合细胞的情况下，所述细胞(例如，当二倍体时)可以包括一修饰基因的一拷贝和一非修饰基因的一拷贝。技术人员将根据预期用途选择所述克隆用于进一步的培养/再生。[0745]根据一个实施例，当需要一种瞬时方法时，针对缺少一dna编辑剂的情况(即丢失用于编码所述dna编辑剂的多个dna序列)，进一步分析和选择表现出存在所需的dna编辑事件的多个克隆。例如，这可以通过分析所述dna编辑剂的表达损失(例如，在所述mrna、蛋白质上)来进行，例如通过gfp或q‑pcr、hplc的荧光检测。[0746]根据一个实施例，当需要一种瞬时方法时，可以分析所述多个细胞是否缺少如本文中所述的核酸构建体或其部分，例如，用于编码所述dna编辑剂的核酸序列。这可以通过荧光显微镜、q‑pcr、facs或任何其他方法(例如，南方墨点法、pcr、测序、hplc)来确认。[0747]根据一个实施例，如下所述，对所述植物进行杂交，以获得缺乏所述dna编辑剂(例如，核酸内切酶)的一植物。[0748]多个阳性克隆可以被保存(例如，冷冻保存)。[0749]或者，多个植物细胞(例如，多个原生质体)可以首先通过生长成一组发育为一愈伤组织的多个植物细胞，然后通过使用多个植物组织培养方法从所述愈伤组织再生多个芽(愈伤组织再生(callogenesis))而再生为多个完整植物。多个原生质体向愈伤组织的生长和多个芽的再生需要所述组织培养基中多个植物生长调节剂的适当平衡，所述培养基必须针对每个植物物种进行定制。[0750]使用称为原生质体融合(fusion)的技术，多个原生质体也可以用于植物育种。通过使用一电场或一聚乙二醇溶液诱导来自不同物种的多个原生质体融合。此技术可以用于在组织培养中产生体细胞杂种。[0751]原生质体再生的方法是本领域众所周知的。几个因素会影响原生质体分离、培养以及再生，即所述基因型、所述供体组织及其前处理、用于原生质体分离的酶处理、原生质体培养方法、培养物、培养基以及物理环境。关于一全面的评论请参见maheshwari等人(1986年，原生质体和转化植物细胞的分化(differentiationofprotoplastsandoftransformedplantcells)：3至36，施普林格出版社(springer‑verlag)，柏林)。[0752]如技术人员认为合适的，可以对多个再生的植物进行进一步的育种(breeding)和选择。[0753]因此，本发明的多个实施例进一步涉及多个植物、多个植物细胞以及多个植物的加工产物，其包括能够沉默根据本教示产生的一有害生物基因的所述dsrna分子。[0754]根据本发明的一方面，提供了一种产生耐有害生物或抗植物的方法(amethodofgeneratingapesttolerantorresistantplant)，所述方法包括根据本发明的一些实施例的所述方法产生能够使一植物细胞中的一有害生物基因沉默的一长dsrna分子。[0755]根据本发明的一个方面，提供了一种产生一耐有害生物或抗有害生物植物的方法，所述方法包括：[0756](a)育种本发明的一些实施例的所述植物；及[0757](b)选择数个后代植物，所述数个后代植物表达能够抑制所述有害生物基因的所述长dsrna分子，并且不包括所述dna编辑剂，[0758]从而产生所述耐有害生物或抗有害生物植物。[0759]根据本发明的一方面，提供了一种产生本发明的一些实施例的所述植物或植物细胞的方法，包括在允许繁殖的条件下培养所述植物或植物细胞。[0760]根据一实施例，育种包括杂交(crossing)或自交(selfing)。[0761]本文中所使用的术语“杂交”是指多个雄性植物(或多个配子(gamete))对多个雌性植物(或多个配子)的受精(fertilization)。术语“配子”是指通过来自一配子体(gametophyte)的有丝分裂(mitosis)在多个植物中产生并参与有性生殖的单倍体(haploid)生殖细胞(卵或精子)，在此期间，异性的两个配子融合以形成一二倍体合子(diploidzygote)。所述术语通常包含指一花粉(pollen)(包含所述精子细胞)和一胚珠(ovule)(包含所述卵子)。因此，“杂交”通常是指一个个体的多个胚珠与来自另一个个体的花粉的受精，而“自交”是指一个体的多个胚珠与来自相同个体的花粉的受精。杂交被广泛用于植物育种中，且导致所述两个植物之间的基因组信息混合在一起，所述两个植物杂交来自母亲的一条染色体和来自父亲的一条染色体。这将导致在遗传上多个遗传性状的一新组合。[0762]如上所述，可以杂交所述植株以获得不含多个不需要因子的一植株，例如，dna编辑剂(例如，核酸内切酶)。[0763]根据本发明的一些实施例，所述植物是非转基因的。[0764]根据本发明的一些实施例，所述植物是一转基因植物。[0765]根据一实施例，所述植物是非遗传性修饰的(非转基因)。[0766]根据一实施例，所述植物是遗传性修饰的(geneticallymodified，gmo)。[0767]根据本发明的一方面，提供了本发明一些实施例的所述植物的一细胞。[0768]根据本发明的一方面，提供了本发明一些实施例的所述植物的一种子。[0769]根据一实施例，与不是通过数个本方法产生的数个植物相比(即与数个野生型植物相比)，通过数个本方法产生的所述数个植物提高至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％的针对有害生物的抗性或耐受性。[0770]据本发明，可以使用本领域中已知的任何用于评估一植物对一病原体的耐受性或抗性的方法。多个示例性方法包含但不限于，如ramírezv1、garcía‑andradej、verap.所述，降低拟南芥(arabidopsis)中的myb46表达导致增强对灰葡萄孢霉(botrytiscinereal)的抗性(plantsignalbehav.，2011年6月；6(6)：911至3，epub：2011年6月1日)；或如gallego‑giraldol.等人所述，苜蓿中hct的下调节促进了植物中防御反应的激活(newphytologist，2011年，190：627至639，doi：10.1111/j.1469‑8137.2010.03621.x)，两者均以引用方式并入本文中。[0771]根据进一步的实施例，提供了一种产生一植物细胞中的一长dsrna分子的方法，其中所述长dsrna能够沉默一感兴趣的靶基因，所述方法包括：(a)选择一植物基因与一第一核酸序列，所述植物基因与所述核酸序列显示出与所述感兴趣的靶基因的一核酸序列具有一预定的序列同源性；(b)修饰了编码一rna分子的一第二植物内源核酸序列，以针对所述第一植物基因赋予一沉默特异性，使得能够募集rna依赖型rna聚合酶(rdrp)的数个小rna分子与所述第一植物基因的一转录物形成碱基互补，所述数个小rna分子是从所述rna分子加工而来，以产生能够沉默所述感兴趣的靶基因的所述长dsrna分子。[0772]根据一些实施例，在使用上述方法之前，所述第一核酸序列不编码一沉默rna。根据一些实施例，在使用上述方法之前，所述长dsrna不是由所述第一核酸序列天然产生的。不希望受理论或机制的束缚，虽然上述方法中的所述第一核酸序列不一定天然产生长dsrna(或任何沉默rna)，但所述第二植物内源核酸序列的修饰产生一rna分子(例如mirna)。所述rna分子作为扩增器并与rdrp结合以从所述第一核酸序列的一rna转录物生成长dsrna。因此，实际上，根据一些实施例，上述方法能够从以前不产生长dsrna的一基因中来产生出一长dsrna。[0773]根据一些实施例，所述感兴趣的靶基因是所述植物细胞的一内源基因(endogenousgene)。根据数个其他实施例，所述感兴趣的靶基因是对于所述植物细胞的一外源基因(exogenousgenet)(例如一有害生物的一基因，例如无脊椎有害生物)。[0774]根据一些实施例，由所述第二植物内源核酸序列编码的所述rna分子是一mirna。[0775]根据一些实施例，与所述感兴趣的靶基因的一核酸序列的所述预定序列同源性包括至少两个片段的同源性，每个片段至少为28nt，每个片段与所述感兴趣的靶基因的所述序列具有至少90％的同源性。[0776]根据一些实施例，修饰一核酸序列包括使用一dna编辑剂，例如但不限于一crispr‑核酸内切酶(例如cas9)。根据一些实施例，所述dna编辑剂包括一cripsr‑内切核酸酶及一向导rna(guiderna)，其旨在切割一感兴趣的核酸序列(例如所述第二植物内源核酸的所述序列)。根据一些实施例，修饰一感兴趣的核酸序列包括使用一dna编辑剂(可能具有针对切割所述感兴趣的核酸的一向导rna)，并进一步将一额外核酸序列引入至所述植物细胞，所述额外核酸序列与待修饰的所述核酸序列相似，但待修饰的所述核酸序列包括所需的数个核苷酸改变。不希望受理论或机制的束缚，所述dna编辑剂切割所述感兴趣的核酸序列，并且通过同源依赖性重组(hdr)将所述部分额外核酸序列(包括所需的数个核苷酸改变)引入至所述感兴趣的核酸序列中。[0777]如本文中所使用的术语“约”是指±10％。[0778]术语“包括(comprises)”、“包括(comprising)”、“包含(includes)”、“包含(including)”、“具有(having)”及其词形变化意指“包含但不限于(includingbutnotlimitedto)”。[0779]术语“由……组成(consistingof)”是指“包含并限于”。[0780]术语“基本由……组成(consistingessentiallyof)”意味着组成、方法或结构可包含其它成分、步骤及/或部分，但只要其它成分、步骤及/或部分不实质性地改变所要求保护的组成、方法或结构的基本和新的特征。[0781]如本文中所使用的单数形式“一个/种(a)”、“一个/种(an)”以及“所述/该(the)”包含复数指代物，除非文中另有明确规定。例如，术语“一种化合物”或“至少一种化合物”可包括多种化合物，包括其混合物。[0782]在整个本技术中，本发明的不同的实施例可以范围形式呈现。应理解的是，范围形式的描述仅出于方便和简洁，不应解释为本发明范围的不可变更的限制。因此，范围的描述应视为具体公开了所有可能的子范围以及该范围的各个数值。例如，范围诸如1至6的描述应视为具体公开了诸如1至3、1至4、1至5、2至4、2至6、3至6等子范围，以及该范围的各个数，例如1、2、3、4、5和6。其不论范围宽度均适用。[0783]每当本文中规定一数值范围时，意指包含所述指定范围内的任何所述的数值(分数或整数)。所述短语第一标示数字和第二标示数字“之间的范围”和“从”第一标示数字“到”第二标示数字“的范围”在本文中互换使用，意指包含第一标示数字和第二标示数字和其间的所有分数和整数。[0784]如本文中所使用的术语“方法”是指用于完成给定任务的方式、手段、技术以及程序，包含但不限于化学、药理学、生物、生物化学以及医学领域从业人员已知或容易由他们从已知的方式、手段、技术和程序开发的方式、手段、技术以及程序。[0785]如本文中所使用的术语“治疗”包含消除、实质上抑制、减慢或逆转病情的进展、实质上改善病情的临床和美学症状或实质上预防病情的临床或美学症状的出现。[0786]应理解的是，为了清楚起见，在各个实施例的背景下描述的本发明的某些特征，也可在单一实施例中组合提供。相反，出于简洁起见，在单一实施例的背景下描述的本发明的不同特征，也可单独提供或以任何合适的亚组合提供或适用于本发明的任何其它描述的实施例。在不同实施例的情况下描述的某些特征不视为所述实施例的必需特征，除非该实施例在无所述要素时是无效的。[0787]在下面的数个范例中，提供对上文描述和随附权利要求书部分要求保护的本发明的不同实施例和方面的实验支持。[0788]应理解的是，本技术中公开的任何序列识别号(seqidno)可以是指一dna序列或一rna序列，这根据提及该seqidno的上下文，即使该seqidno仅以一dna序列格式或一rna序列格式表达。例如，seqidno：1以一dna序列格式表达(例如，用t表示胸腺嘧啶)，但它可以是指对应于一核酸序列的一dna序列，或是指一rna分子核酸序列的所述rna序列。同样地，尽管某些序列以一rna序列格式表达(例如，用u表示尿嘧啶)，但根据所述分子的实际类型，它可以是指包括一dsrna的一rna分子的序列，也可以是指对应于所示rna序列的一dna分子的序列。在任何情况下，可以设想具有与任何取代基一起公开的序列的dna和rna分子。[0789]范例[0790]现在参照以下实例，连同上文的描述，其以非限制性方式说明本发明。[0791]一般而言，本文中使用的命名和本发明中利用的实验室程序包含分子、生物化学、微生物和重组dna技术。文献中全面阐释了这样的技术。参见例如“molecularcloning：alaboratorymanual”，sambrook等人，1989年；“currentprotocolsinmolecularbiology”，第i至iii卷，ausubel，r.m.编辑，1994年；ausubel等人，“currentprotocolsinmolecularbiology”，johnwiley和sons，baltimore，马里兰，1989年；perbal，“apracticalguidetomolecularcloning”，johnwiley和sons，纽约，1988年；watson等人，“recombinantdna”，scientificamericanbooks，纽约；birren等人(编辑)“genomeanalysis：alaboratorymanualseries”，第1至4卷，冷泉港实验室出版社(coldspringharborlaboratorypress)，纽约，1998年，；如美国专利号4,666,828、4,683,202、4,801,531、5,192,659以及5,272,057；“cellbiology：alaboratoryhandbook”，第i至iii卷，cellis，j.e.编辑，1994年；“cultureofanimalcells‑amanualofbasictechnique”freshney，wiley‑liss，纽约，1994年，第三版；“currentprotocolsinimmunology”，第i至iii卷，coliganj.e.编辑，1994年；stites等人(编辑)，“basicandclinicalimmunology”(第8版)，appleton和lange，norwalk，ct，1994年；mishell和shiigi(编辑)，“selectedmethodsincellularimmunology”，w.h.freemanandco.，纽约，1980年中所示的方法；可得的免疫测定法大量描述于专利和科学文献中，参见例如美国专利号3,791,932、3,839,153、3,850,752、3,850,578、3,853,987、3,867,517、3,879,262、3,901,654、3,935,074、3,984,533、3,996,345、4,034,074、4,098,876、4,879,219、5,011,771以及和5,281,521，“oligonucleotidesynthesis”，gait，m.j.编辑，1984年；“nucleicacidhybridization”，hames，b.d.和higginss.j.编辑，1985年；“transcriptionandtranslation”，hames，b.d.和higginss.j.编辑，1984年；“animalcellculture”，freshney，r.i.编辑，1986年；“immobilizedcellsandenzymes”，irl出版社(irlpress)，1986年；“apracticalguidetomolecularcloning”，perbal，b.，1984年以及“methodsinenzymology”，第1至317卷，学术出版社(academicpress)；“pcrprotocols：aguidetomethodsandapplications”，学术出版社(academicpress)，加州圣地牙哥，1990年；marshak等人，“strategiesforproteinpurificationandcharacterization‑alaboratorycoursemanual”，cshl出版社(cshlpress)，1996年；其全部通过引用并入，如同在本文中完全阐述一样。在整个文件中提供其它一般参考文献。其中的程序被视为是本领域中众所周知的，并且为了方便读者而提供。其中所含的全部信息通过引用并入本文中。[0792]一般材料及实验步骤[0793]计算管道以生成geigs模板[0794]所述计算geigs管道应用了生物元数据(biologicalmetadate)，并能够自动产生多个geigsdna模板，所述模板用于最低程度编辑多个非编码rna基因(例如，多个mirna基因)，从而获得一新的功能，即将其沉默能力重定向至感兴趣的靶序列。[0795]如图6中所示，所述管道从填入和提交输入开始：(a)通过geigs沉默靶序列；(b)基因编辑所述宿主生物并表达所述geigs；(c)可以选择是否普遍表达所述geigs。如果需要特定geigs表达，则可以从几个选项中选择(特定于一特定组织、发育阶段、胁迫、热/冷休克等的表达)。[0796]当所有必需的输入提交后，所述计算过程将从在多个mirna数据集(例如，小rna测序、微阵列等)之间搜索并仅筛选符合输入标准的多个相关mirna开始。接下来，将选定的多个成熟mirna序列与所述靶序列进行比对，并筛选具有最高互补水平的mirna。然后修饰这些天然的靶互补成熟mirna序列，使其与所述靶的序列完全匹配。然后，所述修饰的多个成熟mirna序列通过预测sirna效能的一算法运行，并筛选出沉默得分最高的前20个。然后将这些最终修饰的mirna基因用于产生200至500ntssdna或250至5000ntdsdna序列，如下所示。[0797]基于在所述修饰的mirna两侧的所述基因组dna序列来设计200至500ntssdna寡核苷酸和250至5000ntdsdna片段。所述pre‑mirna序列位于所述寡核苷酸的中心。所述修饰的mirna的引导链(沉默)序列与所述靶100％互补。然而，所述修饰的乘客mirna链的所述序列进一步修饰以保留所述原始(未修饰的)mirna结构，保持相同的碱基配对外形。[0798]接下来，将多个差异性sgrna设计为特异性靶向所述原始未修饰的mirna基因，而不是所述修饰的交换形式。最后，在所述修饰的mirna基因和所述原始的mirna基因之间进行比较限制性酶切位点分析，并总结了多个差异性限制性位点。[0799]因此，所述管道输出包含：[0800](a)具有最低程度修饰的mirna的200至500ntssdna寡核苷酸或250至5000ntdsdna片段序列。[0801](b)特异性靶向所述原始mirna基因而非所述修饰的mirna基因的2至3个差异性sgrna。[0802](c)在所述修饰的mirna基因和原始的mirna基因之间的多个差异性限制性酶切位点的列表。[0803]通过geigs的dsrna设计[0804]模型1(所述数个数字对应于图1中的所述数个数字)：[0805]1、所述有害生物基因“x”为所述靶基因(沉默时，所述有害生物为被控制的)[0806]2、通过与有害生物基因“x”(植物基因“x”)的同源性搜索，以鉴定出一宿主相关基因‑x。根据一些实施例，如果所述植物基因x包括至少28nt的至少两个延伸(stretches)，每个延伸与有害生物基因x的所述序列具有至少90％的同源性，则根据模型1来鉴定出所述植物基因x。[0807]3、在数个植物细胞内进行geigs，以将一小rna分子(例如22ntmirna)的所述沉默特异性重定向至宿主相关基因‑x，从而使所述小rna分子作为rdrp介导转录的一扩增器，用于植物基因“x”的所述转录物。[0808]4、经使用geigs(本文也称为“小geigsrna”)重定向其沉默特异性的所述扩增小rna形成与rdrp(扩增酶)相关的一risc复合物。[0809]5、所述rdrp合成对于植物基因“x”的所述转录物的一互补反义rna链，形成一长dsrna。[0810]6、然后，所述长dsrna至少部分被所述数个植物细胞内的(数个)dicer或数个其他核酸酶加工成数个二级srna。在这些二级srna中，所述数个二级srna中的一些的沉默特异性是针对有害生物基因x。[0811]7、所述dsrna也至少部分地被数个有害生物吸收，可能在所述有害生物中被加工成数个srna，如上所述。[0812]8、除了例如产生的数个长dsrna外，可能来自所述数个植物细胞的数个二级srna也被数个有害生物吸收，并也沉默了所述靶基因“x”。[0813]模型2(所述数个数字对应于图2中的所述数个数字)：[0814]1、所述有害生物基因“x”为所述靶基因(沉默时，所述有害生物为被控制的)[0815]2、在数个植物细胞中进行geigs，以将一天然存在的rnai前体的所述沉默特异性重定向至针对所述有害生物基因“x”(例如tas基因；其被扩增成长dsrna并加工成其野生型的数个tasirna)，所述天然存在的rnai前体已知以其野生型形式(即其产生长dsrna)来扩增。所述转录物在图2中标记为“扩增的geigs前体(amplifiedgeigsprecursor)”。根据一些实施例，可与模型2一起使用的一rnai前体是形成长dsrna并加工成数个二级小rna的一rnai前体，例如但不限于加工成一反式作用sirna(tasirna)或一定相小干扰rna(phasirna)的一前体。通过使用一核酸内切酶(例如cas9)以诱导所述基因中的一双链断裂并提供通过使用同源依赖性重组(hdr)进行特异性重定向所需的更改将所述数个核苷酸引入至所述基因的一dna“geigs寡核苷酸”，基因组编辑诱导基因沉默(geigs)是对编码所述rnai前体的所述基因进行的。因此，根据所使用的所述“geigs寡核苷酸”，所述rnai前体的一部分(例如ttas)的所述特异性将改变成靶向有害生物基因x。重定向的所述rnai前体将被所述细胞dicer加工成所述数个二级小rna(例如数个tasirna)，所述数个二级小rna也将匹配所述有害生物基因x。在图2所示的所述范例中，所述数个tasirna中只有一个会被改变，导致一tas被加工成所述数个野生型及改变的tasirna。[0816]3、一野生型扩增小rna形成与rdrp(所述扩增酶)相关的一risc复合物。[0817]4、所述rdrp合成对于所述扩增的geigs前体的所述转录物的一互补反义rna链，形成长dsrna。[0818]5、所述扩增的geigsdsrna在植物细胞中被(数个)dicer或数个其他核酸酶至少部分加工成数个二级srna。在这些二级srna中，与geigs发生位置相对应的所述二级小rna的所述沉默特异性是针对有害生物基因x。[0819]6、未加工的所述数个geig长dsrna中的至少一部分被数个有害生物吸收，可能在所述有害生物中被加工成数个小rna，如上所述。[0820]7、可能在所述数个植物细胞内已经产生的数个二级srna(例如数个tas前体中的数个tasirna)也被所述有害生物吸收，并使所述靶基因“x”沉默。[0821]下面的表1a及表1b提供了可以被数个本方法(特别是模型1)靶向的数个示例性有害生物基因。下面的表2提供了可以被数个本方法(特别是模型2)靶向的数个示例性有害生物基因。表2还提供了建议由geigs(表示为“主干”)靶向的数个rnai前体，例如数个tasrna前体。表2提供了建议的数个小干扰rna(表示为“所需的sirna”)，可以使用geigs将其引入建议的所述骨架，从而使所述骨架能够在所述数个有害生物中被加工成这些sirna，从而影响所述数个靶基因的沉默。[0822]表1a：数个潜在有害生物靶基因的列表及其登录号(包括数个植物同源基因，根据模型1)[0823][0824][0825][0826]表1b：数个潜在有害生物靶基因的列表及其数个登录号[0827][0828][0829][0830]表2：数个潜在有害生物靶基因及其使用geigs进行基于tasirna的沉默的数个范例(每个模型2)[0831][0832][0833][0834][0835][0836][0837][0838]拟南芥及番茄的轰击及植物再生[0839]拟南芥根制备[0840]将经过氯气灭菌的多个拟南芥(cv.col‑0)种子播种在ms减蔗糖(minussucrose)平板上，在4℃的黑暗中催近发育(vernalised)3天，然后在25℃的恒定光照下垂直发芽(germinationvertically)。2周后，将根切成1cm的根段，并置于愈伤组织诱导培养基(callusinductionmedia，cim：1/2ms(含b5维生素)、2％葡萄糖、ph5.7、0.8％琼脂、2mg/liaa、0.5mg/l2，4‑d、0.05mg/l激动素(kinetin))平板上。在25℃的黑暗中培养6天后，将所述多个根段转移至多个滤纸圆盘上，并置于多个cimm平板上(1/2ms(不含维生素)、2％葡萄糖、0.4m甘露醇、ph5.7以及0.8％琼脂)4至6小时，以备于轰击。[0841]番茄外植体制备：[0842]数个番茄种子用商业漂白剂进行表面消毒20分钟，然后在无菌条件下使用无菌水洗涤3次。所述数个种子在发芽培养基(ms 维生素，0.6％琼脂糖，ph＝5.8)上培养并置于25℃下，16/8小时光照/黑暗循环。[0843]将8天大的数个番茄植株的数个子叶切成约1平方公分并置于轰击前培养物(ms 维生素、3％蔗糖、0.6％琼脂糖、ph＝5.8、1mg/lbap、0.2mg/liaa)上在25℃的黑暗中放置2天。然后，将数个外植体转移到一靶板的中心(含有ms 维生素、3％甘露醇、0.6％琼脂糖，ph＝5.8)4小时。[0844]轰击[0845]通过pds‑1000/he粒子递送(bio‑rad；pds‑1000/he系统#1652257)将多个质粒构建体引入至所述根组织，此程序需要进行以下概述的几个制备步骤。[0846]黄金储备制备[0847]将40mg0.6μm金(bio‑rad；cat：1652262)与1ml100％乙醇混合，进行脉冲(pulse)离心成团粒，并去除所述乙醇。将此洗涤程序重复另外两次。[0848]洗涤后，将所述团粒重悬于1ml无菌蒸馏水中，并分配至1.5ml试管(50μl等分试样工作体积)中。[0849]磁珠制备[0850]简而言之，进行以下操作：[0851]一般而言，一单个试管有足够的金轰击2盘的拟南芥根(每盘2发)，因此，每个试管分配在4个(1,100psi)基因枪破裂盘(biolisticrupturedisk)(bio‑rad；cat：1652329)之间。[0852]轰击需要同一样品的多个平板，为了保持样品的一致性并尽量减少整体准备工作，将试管合并，并相应地调整dna和cacl2/亚精胺(spermidine)混合物的体积。[0853]以下方案总结制备一个试管的金的过程，应根据所使用的试管的金的数量进行调整。[0854]所有后续过程均在4℃的一艾本德热混合器(eppendorfthermomixer)中进行。[0855]制备多个质粒dna样品，每个试管包括以1000ng/μl的浓度添加11μgdna。[0856](1)将493μlddh2o添加至1等份(7μl)亚精胺(sigma‑aldrich；s0266)中，最终浓度为0.1m亚精胺。将1250μl2.5mcacl2添加至所述亚精胺混合物中，涡旋振荡(vortexed)并置于冰上。[0857](2)将一试管预先准备好的金置于所述热混合器中，并以1400rpm的速度旋转。[0858](3)将11μldna添加至所述试管中、涡旋振荡并放回旋转的热混合器中。[0859](4)为了结合dna/金粒子，将70μl亚精胺cacl2混合物添加至每个试管中(在所述热混合器中)。[0860](5)将所述多个试管剧烈地涡旋振荡15至30秒，并置于冰上约70至80秒。[0861](6)将所述混合物以7000rpm离心1分钟，去除上清液并置于冰上。[0862](7)向每个试管中添加500μl100％乙醇，并通过移液(pipetting)和涡旋振荡重悬所述团粒。[0863](8)将所述多个试管以7000rpm离心1分钟。[0864](9)去除所述上清液，将所述团粒重悬于50μl100％乙醇中，并保存在冰上。[0865]宏载体(macrocarrier)制备[0866]以下操作是在一层流柜(laminarflowcabinet)中进行：[0867](1)灭菌和干燥多个宏载体(bio‑rad；1652335)、多个停止屏(stoppingscreen)(bio‑rad；1652336)以及多个宏载体磁盘架。[0868](2)将多个宏载体平放至所述多个宏载体磁盘架中。[0869](3)涡旋振荡多个涂覆dna的金混合物并分散(5μl)至每个基因枪破裂盘的中心上。[0870]允许乙醇蒸发。[0871]pds‑1000(氦粒子递送系统)[0872]简而言之，进行以下操作：[0873]将氦气瓶的调节阀调整至至少1300psi的输入(incoming)压力。通过按下vac/vent/hold开关并按住点火(fire)开关3秒产生真空。这确保将氦气排放至管路系统中。[0874]将多个1100psi破裂盘置入异丙醇中并混合以去除静电。[0875](1)将1个破裂盘置入所述磁盘固定盖(diskretainingcap)中。[0876](2)构建微载体发射组件(microcarrierlaunchassembly)(带有一停止屏和一含金微载体)。[0877](3)将拟南芥根愈伤组织有盖培养皿(petridish)置于所述发射组件下方6cm处。[0878](4)将真空压力设置为27英寸汞柱(水银)，并打开氦气阀(约1100psi)。[0879](5)释放真空；移除微载体发射组件和所述破裂盘固定盖。[0880](6)在同一组织上轰击(即每个平板轰击2次)。[0881](7)随后将多个轰击过的根置于25℃的黑暗中的多个cim平板上，再放置24小时。[0882]联合轰击(co‑bombardment)[0883]当轰击多个geigs质粒的多个组合时，将5μg(1000ng/μl)所述sgrna质粒与8.5μg(1000ng/μl)交换质粒混合，并将11μl此混合物添加至样品中。如果同时轰击更多的geigs质粒，则多个sgrna质粒与所使用的多个交换质粒的浓度比例为1∶1.7，并将11μg(1000ng/μl)此混合物添加至所述样品中。如果用与geigs交换不相关的多个质粒联合轰击，则以等比例混合，并将11μg(1000ng/μl)所述混合物添加至每个样品中。[0884]数个col‑0原生质体的转染[0885]数个拟南芥(col‑0)原生质体用编码crispr/cas9的数个载体及一供体模板转染，以实现hdr介导的数个交换(hdr‑mediatedswaps)。所述实验被设计为交换tas1b(attas1b_at1g50055)或tas3a(attas3a_at3g17185)基因中的数个序列，产生靶向上述线虫靶基因中数个30bp序列的数个srna。不希望受理论或机制的束缚，产生靶向所述线虫中数个30bp序列的一长dsrna的基本原理是确保当所述dsrna在线虫中加工成数个二级沉默rna时，即使在数个线虫中所形成的数个二级沉默rna的长度与在所述植物中所形成的数个二级沉默rna的长度不同的情况下产生数个功能性沉默rna。[0886]在所述tas1b基因座中设计了两个交换，在所述tas3a基因座中设计了两个交换。所述互换是相互独立的。所述donor模板(1kb)在数个质粒中合成(由美国twist合成)。[0887]使用一血细胞计数器及trypanblue(约：30μl原生质体、65μlmmg、5μl台盼蓝)测定所述原生质体浓度。所述数个原生质体是导向一2x106个细胞/ml的最终密度的数个稀释或浓缩的原生质体。[0888]对于peg转染，sgrnavector(crispr/cas，sgrna，mcherry):donorvector的摩尔比为1:20，相当于每次转染3.9μgsgrnavector及大约21.61μgdonorvector。向1ml的数个原生质体中缓慢加入1ml的peg溶液。制备新鲜的peg溶液(每5毫升2克peg4000(sigma)、0.2m甘露醇、0.5毫升1mcacl2)。数个试管在室温下避光孵育20分钟，然后加入4ml的w5，并通过倒置来混合数个试管。然后将原生质体离心沉淀重新悬浮在5mlpca(原生质体再生培养基)中以允许细胞分裂，有利于hdr。[0889]细胞分析[0890]质粒递送后24至72小时，收集数个细胞并重悬于d‑pbs培养基中。所述溶液中的一半用于分析荧光素酶活性(analysisofluciferaseactivity)，且一半用于分析小rna测序。根据制造商的说明，使用luciferaseassaysystem(promega,usa)进行双荧光素酶分析(analysisofdualluciferaseassay)。根据制造商的说明，使用总rna纯化试剂盒(norgenebiotekcorp.，加拿大)来提取总rna(totalrna)。进行所述小rna测序以鉴定这些样品中所需的成熟小rna。[0891]拟南芥植物再生[0892]对于芽再生，进行来自valvekens等人的改良方案(valvekens，d.等人，procnatlacadsci，美国，1988年，85(15)：5536至5540)。将轰击过的多个根置于多个幼苗诱导培养基(shootinductionmedia，sim)平板上，其包含1/2ms(含b5维生素)、2％葡萄糖、ph5.7、0.8％琼脂、5mg/l2ip、0.15mg/liaa。将多个平板留在25℃的光照下16小时‑23℃的黑暗中8小时的循环。10天后，将多个平板转移至多个ms平板(含3％蔗糖、0.8％琼脂)上1周，然后转移至多个新鲜的相似平板中。一旦多个植物再生，将它们从所述多个根上切除，并置于多个ms平板(含3％蔗糖、0.8％琼脂)上，直到进行分析。[0893]番茄轰击后培养与植株再生[0894]将轰击的数个外植体在25℃的黑暗中置于ms培养基(ms 维生素、3％蔗糖、0.4％琼脂凝胶、ph＝5.8、1mg/lbap、0.2mg/liaa)上两天。数个外植体被转移至16/8数个光/暗循环，并每2周进行亚培养。将数个再生芽转移至根诱导培养基(ms 维生素、3％蔗糖、2.25％gelrite、ph＝5.8、2mg/liba)。[0895]用水清洗数个生根植物，以取出所有的所述琼脂残留物，并放入及覆盖于土壤中。经过一周的驯化后，逐渐取下盖子，使数个植物变硬。[0896]基因分型(genotyping)[0897]根据制造商的建议，使用菲尔植物直接pcr试剂盒(phireplantdirectpcrkit)(thermoscientific)处理数个组织样品并扩增数个扩增子(amplicon)。用于这些扩增的数个寡核苷酸旨在扩增从所述geigs系统的所述修饰序列中的一区域至用作hdr模板的所述区域之外的所述基因组区域，以区分dna掺入。通过所述扩增子的数个不同酶切模式(由特异性选择的数个限制性内切酶给出)来确认修饰基因座中的数个不同修饰，。[0898]基因组pcr反应[0899]根据制造商的说明，使用rna/dna纯化试剂盒(norgen)处理数个细胞样品(a、b、c、d、e，如下面实施例3中所讨论的)的基因组dna。数个样品通过qubit进行定量，dna储存在‑20℃。[0900]所述交换区侧翼的一非特异性引物用于所述数个tas1b(attas1b_at1g50055)及tas3a(attas3a_at3g17185)序列。作为一阴性对照，使用野生型(wt)dna作为模板进行相同的数个交换特异性反应。作为一阳性pcr对照，对所有样品进行了针对wtdna的一特异性pcr。high‑fidelity2xmastermix用于数个pcr扩增。[0901]在0.8％琼脂糖凝胶上运行5μl的每个pcr反应。数个条带大小通过与分子量标记(mw)比较来估计：1kbplusdnaladder(neb)。[0902]为了确认数个交换，进行了一嵌套pcr反应(nestedpcr)。所述第一基因组pcr包括位于所述hdr区域侧翼的数个非特异性正向及反向引物。数个pcr产物用mili‑q超纯水稀释1/100，然后进行上述数个特异性交换pcr。所述嵌套方法(nestedapproach)中用于第一pcr的数个非特异性引物在所述嵌套引物的所述数个退火位点两侧具有数个退火位点。[0903]使用的数个引物：[0904]tas1b的非特异性引物：[0905]‑tas1b_wt_嵌合式_非_特异性_dna_r:5′‑accaatttgacccaaaaaggc‑3′(seqidno:63)[0906]tas1b的交换特异性引物：[0907]‑tas1b_剪接30_嵌合式_dna_f:5′‑gcagcagatcaatgaaattcaacg‑3′(seqidno:64)[0908]‑tas1b_y2530_嵌合式_dna_f:5′‑agccgcctctgtggattcttg‑3′(seqidno:65)[0909]tas3a的非特异性引物：[0910]‑tas3a_wt_嵌合式_非_特异性_dna_r:5′‑aaactcctcgccctcttggtg‑3′(seqidno:66)[0911]tas3a的交换特异性引物：[0912]‑tas3a_ribo3a30_嵌合式_dna_f:5′‑tcttcagcaccttcaccttacg‑3′(seqidno:67)[0913]‑tas3a_spliceo30_嵌合式_dna_f:5′‑tcctttttgaccaacatttgtttgt‑3′(seqidno:68)[0914]阳性对照反应[0915]wttas1b特异性：[0916]‑tas1b_wt_嵌合式_非_特异性_dna_r:5′‑accaatttgacccaaaaaggc‑3′(seqidno:69)[0917]‑tas1b_wt_嵌合式_dna_f:5′‑tggacttagaatatgctatgttggac‑3′(seqidno:70)[0918]wttas3a特异性：[0919]‑tas3a_wt_嵌合式_非_特异性_dna_r5′‑aaactcctcgcctcttggtg‑3′(seqidno:71)[0920]‑tas3a_wt_嵌合式_dna_f5′‑tctatctctacctctaattcgttcgag‑3′(seqidno:72)[0921]dna和rna分离[0922]将多个样品收集至液氮中，并保存在‑80℃中直至进行加工。使用塑料组织研磨器研杵(tissuegrinderpestle)(axygen，美国)在置于干冰中的多个试管中进行组织研磨。根据制造商的指示，使用rna/dna纯化试剂盒(cat.48700；norgenbiotekcorp.，加拿大)从磨碎的组织中分离dna和总rna。在所述rna部分为低260/230比例(＜1.6)的情况下，分离的rna用1μl糖原(glycogen)(cat.10814010；invitrogen，美国)10％v/v乙酸钠、3mph5.5(cat.am9740，invitrogen，美国)以及3倍体积的乙醇在‑20℃下沉淀过夜。将所述溶液在4℃下以最大速度离心30分钟。随后用70％乙醇洗涤2次，风干15分钟，并重悬于无核酸酶的水(cat.10977035；invitrogen，美国)中。[0923]rna提取[0924]根据制造商的说明，使用一rna/dna纯化试剂盒(norgen)处理数个细胞样品(a、b、c、d、e，如下面的实施例3中所述)以进行rna纯化。通过qubit来量化数个样品。rna储存于‑80℃。[0925]rna样品的dna酶处理[0926]使用rt‑pcr反应及随后的pcr来特异性寻找包括所述交换(<200bp)的数个小dsrna片段，以证明能够靶向数个线虫靶基因的dsrna的所述生物发生。为此，根据制造商的说明使用turbodna‑freekit(invitrogen)。进一步进行dnase处理并标准化样品浓度。[0927]反转录(reversetranscription，rt)和定量实时pcr(quantitativereal‑timepcr，qrt‑pcr)[0928]根据制造商的手册(ampd1；sigma‑aldrich，美国)，用dnasei处理1微克分离的总rna。所述样品按照高容量cdna反转录试剂盒(high‑capacitycdnareversetranscriptionkit)(cat.4368814；appliedbiosystems，美国)的指导手册进行反转录。[0929]对于基因表达，根据制造商的方案，在cfx96touchtm实时pcr检测系统(biorad，美国)和greenjumpstarttmtaqreadymixtm(s4438，sigma‑aldrich，美国)上进行定量实时pcr(qrt‑pcr)分析，并用bio‑radcfx管理程序(managerprogram)(3.1版)进行分析。[0930]数个rna样品的rt‑pcr，用于数个col‑0细胞中的数个tas1b及tas3a交换的表达分析[0931]对于rt‑pcr，通过qscriptflexcdna合成试剂盒(quantabiosciences)使用tas1b及tas3a的数个非特异性引物生成cdna。对所述有义链进行一次cdna反应，对tas1b及tas3a的所述反义链进行另一次反应。数个待处理的样品含有165ng/μlrna。[0932]对于所有rt‑pcr反应(相同处理，但使用h2o代替反转录酶)，使用没有反转录酶(‑rt对照)的阴性对照。这是为了确保下游pcr反应中的扩增不会因为dna残留而发生。对每个pcr反应进行一水阴性对照。每种处理的 rt/‑rt用rna制备一主混合物。制作了额外的预混液—(i)使用反转录酶及缓冲液( rt)及(ii)水及缓冲液(‑rt)用于所有样品。最终引物浓度：1μm。[0933]引物：[0934]tas1b[0935]‑tas1b有义：[0936]tas1b_rt_a_r:5′‑taacataaaaatattacaaatatcattccg‑3′(seqidno:93)[0937]‑tas1b反义：[0938]tas1b_rt_b_f:5′‑tcagagtagttatgattgataggatgg‑3′(seqidno:94)[0939]这些引物是用于处理a、b及e。[0940]tas3a[0941]‑tas3a有义：[0942]tas3a_rt_a_r:5′‑gctcaggagggatagacaagg‑3′(seqidno:95)[0943]‑tas3a反义：[0944]tas3a_rt_b_f:5′‑ctcgttttacagattctattctatctc‑3′(seqidno:96)[0945]这些引物是用于处理c、d及e。[0946]对cdna进行pcr以检测重定向至数个线虫靶标的tas1b及tas3a的表达[0947]为了检测从已重定向至数个靶线虫基因的tas1b或tas3a基因转录的dsrna，使用所述cdna作为一模板进行数个pcr反应，其中使用一个针对tas3a或tas1b的非特异性引物及另一个交换特异性(即仅结合在geigs介导的重定向后交换了数个核苷酸的相关tas序列)的引物。非特异性引物退火位点(unspecificprimerannealingsite)位于用于制备cdna的所述序列的稍下游。特异性引物退火位点(specificprimerannealingsite)位于距所述非特异性引物退火位点小于200bp的下游。分析dsrna两条链的表达的方法是相同的：有义(sense)及反义(antisene)。还对‑rtcdna反应进行了数个反应，以确保dnase处理后样品中的残留dna不会发生扩增。作为一阴性对照，每个反应也在wtdna上进行，以证明所述扩增是swap特异性的(swapspecific)。每个pcr反应都包括一个h2o阴性对照。5ul的每个cdnapcr反应用作模板。[0948]引物：[0949]tas3asense有义链特异性反应：[0950]‑核醣体蛋白3a特异性：[0951]tas3a_rna_非_特异性_a_f:5′‑tgaccttgtaagaccccatctc‑3′(seqidno:97)[0952]tas3a_rna_ribo3a30_特异性_a_r:5′‑aggagaaaattcgtaaggtgaagg‑3′(seqidno:98)[0953]‑wt特异性：[0954]tas3a_rna_非_特异性_a_f:5′‑tgaccttgtaagaccccatctc‑3′(seqidno:99)[0955]tas3a_rna_wt_特异性_a_r:5′‑ggtaggagaaaatgactcgaacg‑3′(seqidno:100)[0956]tas3a反义链特异性反应：[0957]‑核醣体蛋白3a特异性：[0958]tas3a_rna_非_特异性_b_r:5′‑caaccatacatcaataacaaacaaaag‑3′(seqidno:101)[0959]tas3a_rna_ribo3a30_特异性_b_f:5′‑atatagaatagatatcggcttcttcag‑3′(seqidno:102)[0960]‑wt特异性：[0961]tas3a_rna_非_特异性_b_r:5′‑caaccatacatcaataacaaacaaaag‑3′(seqidno:103)[0962]tas3a_rna_spliceo30_特异性_b_f:5′‑tcctttttgaccaacatttgtttgt‑3′(seqidno:104)[0963]tas1b有义链特异性反应：[0964]‑y25，copi复合物特异性的β亚基：[0965]tas1b_rna_非_特异性_a_f:5′‑gagtcattcatcggtatctaacc‑3′(seqidno:105)[0966]tas1b_rna_y2530_特异性_a_r:5′‑agccgcctctgtggattcttg‑3′(seqidno:106)[0967]‑wt特异性：[0968]tas1b_rna_非_特异性_a_f:5′‑gagtcattcatcggtatctaacc‑3′(seqidno:107)[0969]tas1b_rna_wt_特异性_a_r:5′‑tggacttagaatatgctatgttggac‑3′(seqidno:108)[0970]tas1b反义链特异性反应：[0971]‑y25，copi复合物特异性的β亚基：[0972]tas1b_rna_非_特异性_b_r:5′‑gcatatcctaaaatatgtttcgttaac‑3′(seqidno:109)[0973]tas1b_rna_y2530_特异性_b_f:5′‑tcgccaagaatccacagagc‑3′(seqidno:110)[0974]‑wt特异性：[0975]tas1b_rna_非_特异性_b_r:5′‑gcatatcctaaaatatgtttcgttaac‑3′(seqidno:111)[0976]tas1b_rna_wt_特异性_b_f:5′‑taagtccaacatagcatattctaagtc‑3′(seqidno:112)[0977]本氏烟草长dsrna对tumv沉默活性的研究[0978]植物材料[0979]nicotianabethamiana在长日条件下(16小时光照，8小时黑暗)在21℃下在土壤上生长4周直至处理。[0980]tumv‑gfp载体克隆[0981]tumv‑gfpcdna盒是从a.等人(a.，sánchez,f.，fereres,a.及ponz,f.，2008年)中所述的载体中扩增出来的。一生物安全病毒载体(biosafeviralvector)的数个外源蛋白的高表达是来自芜菁花叶病毒(turnipmosaicvirus)。西班牙农业研究杂志(spanishjournalofagriculturalresearch)，6(s1)，第48页)。使用引物组5'‑atgtttgaacgatcgggcccaagggacacgaagtgatccg‑3'(seqidno:113)及5'‑ctccaccatgttcccgggggcacagagtgttcaacccc‑3'(seqidno:114)进行扩增。根据制造商的方案，通过融合反应将所述扩增子克隆至含有nptii抗性基因的一二元载体(binaryvector)中，位于t‑dna区域。为了农杆菌浸润(agrobacteriuminfiltration)的目的，随后将所述载体转化至农杆菌菌株(agrobacteriumstrain)gv3101中。[0982]农杆菌诱导(agroinduction)及叶浸润(leafinfiltration)[0983]1、农杆菌的液体培养是在lb中生长。[0984]2、将数个细胞离心并用mma培养基(10mmmes、10mmmgcl2及200μm乙酰丁香酮，ph＝5.6)洗涤一次。[0985]3、将数个细胞离心并取出所述子细胞(sub)。将颗粒重悬在mma培养基中至od600＝0.5。[0986]4、培养物在黑暗中轻轻摇晃6小时。[0987]5、根据需要，以组合数个培养物(含有数个不同载体的细菌之间的比例为1:1，每种农杆菌含有表达一单一基因的一载体)。最终总农杆菌密度‑od600＝0.5。将tumv‑gfp载体添加至od600＝0.0001的一最终密度。[0988]、用一无针注射器将所述数个诱导培养物渗入4周龄的一本氏烟草植物的数个叶子。[0989]用于geigs‑dsrna沉默的数个基因序列[0990]‑attas1b(at1g50055)–seqidno:115[0991]‑geigs‑tumv–seqidno:116[0992]‑geigs‑tumv‑成熟sirna–seqidno:117[0993]‑geigs‑虚拟–seqidno:118[0994]‑geigs‑虚拟‑成熟sirna–seqidno:119[0995]‑mir173_at3g23125–seqidno:120[0996]‑mir173‑成熟mirna–seqidno:121[0997]拟南芥对tumv感染及疾病的保护研究[0998]植物材料[0999]从含有所需geigs序列的数个植物中收集的数个拟南芥种子进行氯气消毒，并以1粒种子/孔播种在数个ms‑s琼脂平板中。将两周大的数个幼苗转移至土壤中。数个植物在24℃下于数个16小时光照/8小时黑暗循环下生长。未修饰(数个植物)的野生型平行地生长及处理(grownandtreatedinparallel)，作为对照。[1000]植物接种与分析[1001]用于数个tumv载体的所述接种及分析植物的数个程序在本领域中已经很好地被建立且先前已经描述于[sardaru,p.etal.,molecularplantpathology(2018),19:1984‑1994]。4周龄的所述拟南芥幼苗，如前所述[sánchez,f.等人，1998年，virusresearch,55(2):207至219]来接种tumv，或如前所述[a.等人，2008年，西班牙农业研究杂志(spanishjournalofagriculturalresearch)，6(s1)，第48页]接踵tumv‑gfp，以表达数个病毒载体。在tumv的情况下，症状评分发生在接种后10至28天。在tumv‑gfp的情况下，gfp信号的分析发生在接种后7至14天。[1002]此外，接种后14天，收获生长在所述接种部位上方的数个新叶，并根据制造商的说明，使用总rna纯化试剂盒(norgenebiotekcorp.，加拿大)来提取总rna。进行小rna分析及rna测序(rna‑seq)，以分析这些样品的基因表达及小rna表达。[1003]番茄感染粉虱的研究[1004]植物材料[1005]数个番茄植物是生长来自收集自含有所需geigs序列的数个植物的数个种子中，每盆中的一株植物是在22℃下于数个16小时光照/8小时黑暗循环。未修饰(数个植物)的野生型平行地生长及处理(grownandtreatedinparallel)，作为对照。[1006]粉虱接种[1007]五只雌性粉虱被引入至一4周龄的番茄植株中。所述数个粉虱被放置在一个夹着一片叶子的笼子里。5天后，对死亡及存活的数个粉虱以及数个卵进行计数。[1008]此外，接种后5天，收获所述受感染的叶子，并提取总rna。死亡及存活的粉虱是分开收集的，并从中提取总rna。进行小rna分析及rna测序(rna‑seq)，以分析这些样品的基因表达及小rna表达。[1009]靶向一线虫基因的dsrna研究[1010]线虫[1011]数个植物寄生包囊线虫(plant‑parasiticcystnematodes)globoderarostochiensis(病理型ro1，从jameshuttoninstitute收藏中获得)在剑桥大学根据defra许可125034/359149/3保存。数个线虫保持在马铃薯栽培品种désirée(solanumtuberosumcultivardésirée)上。将50个囊肿与沙子：壤土的一50:50混合在一个7英寸直径的盆中。每盆种植一个块茎，并在20℃下定期浇水3个月。使植物干燥1个月，然后使用浮选法(flotation)及随后的嵌套筛分(nestedsieving)来从土壤中收集孢囊。通过与番茄根扩散液一起孵化，以从所述包囊中孵化出数个幼体，每2至3天更换一次，持续长达14天。孵化的数个幼体在4℃下存储在含有0.01％tween‑20的水中长达1周，然后用于数个后续分析。[1012]所使用的数个序列[1013]‑attas3a_at3g17185–seqidno:122[1014]‑geigs‑核醣体蛋白3a‑转录物‑seqidno:123[1015]‑geigs‑核醣体蛋白3a‑转录物‑seqidno:124‑表示与通过geigs设计所产生的所述靶基因同源的区域，以在数个线虫中产生sirna(即所述预期的加工sirna)[1016]‑geigs‑剪接体sr蛋白转录物‑seqidno:125[1017]‑geigs‑剪接体sr蛋白转录物‑seqidno:126‑表示与通过geigs设计所产生的所述靶基因同源的区域，以在数个线虫中产生sirna(即预期的加工sirna)[1018]‑mir390_at2g38325–seqidno:127[1019]用于喂养的rna制备[1020]使用tri‑reagent(sigma‑aldrich，美国)提取渗透的数个本氏烟草叶片(n.benthamianaleaves)的总rna，使用两次氯仿洗涤，并在异丙醇中过夜沉淀。回收的rna使用标准醋酸钠沉淀进一步清洗。[1021]根据制造商的说明，使用ultra0.5mlcentrifugalfilters3kdcutoff(merck，美国)清洗所有回收的rna，并用ddw清洗3次。使用nanodrop对rna进行定量。[1022]线虫喂养协议[1023]rna在1xm9及50mm章鱼胺(octopamine)中稀释至1.76μg/μl。每次重复将3500个j2在1.5mleppendorf中沉淀至大约5μl的体积。将25μlrna溶液加入线虫中，并在20℃下在一加热块中孵育，并以300rpm的速度旋转(最终rna浓度为1.47μg/μl)。72小时后，通过旋转线虫(10kg1分钟)进行洗涤，去除上清液。使用500μl无rnas酶的水重复洗涤3次。颗粒在液氮中快速冷冻并保持在‑80℃直至处理。[1024]线虫rna提取及纯化[1025]根据制造商的建议，使用direct‑zolrnaminiprep：zymoresearchcat.编号r2052来进行rna分离。[1026]使用一微管杵，将所述数个冷冻(液氮或干冰)组织样品(≤25毫克)在eppendorf中粉碎至粉末，然后将600μltri试剂添加到样品中并继续研磨直至完全均质。然后在室温下进行以下步骤并以10,000‑16,000xg离心30秒，除非另有说明：[1027]1、将等体积的乙醇(95‑100％)添加到在tri试剂或类似试剂中裂解的一样品中，并充分混合。[1028]2、将所述混合物转移到一收集管中的一zymo‑spintmiicrcolumn2中并离心。将所述管柱转移到一新的收集管中并丢弃流过的所述液体。[1029]3、dnasei处理在管柱内进行[1030](3a)将400μlrnawashbuffer添加到管柱中并离心。[1031](3b)在不含rnase的管中，加入5μldnasei(6u/μl)及75μldna消化缓冲液并混合。将所述混合物直接添加到所述管柱矩阵(columnmatrix)中。[1032](3c)在室温(20‑30℃)下孵育15分钟。[1033]4、将400μldirect‑zoltmrnaprewash添加到所述管柱中并离心。丢弃流出的所述液体并重复所述步骤。[1034]5、将700μlrnawashbuffer添加到所述管柱中，离心2分钟以确保完全去除洗涤缓冲液。将所述管柱小心地转移到不含rnase的管中。[1035]6、为了洗脱rna，将30μl不具有dna酶/rna酶的水直接加入所述管柱矩阵中并离心。[1036]7、使用nanodrop分光光度计/荧光计或qubit荧光计对rna进行定量，rna可能是立即使用的，或是冷冻保存在≤‑70℃下。[1037]qrtcdna文库制备[1038](quantabioscience：qscriptflexcdna合成试剂盒)[1039]1、将所有成分(不含酶)解冻、充分混合、离心(使用前)，并置于冰上(使用前)。[1040]2、将以下物质加入置于冰上的一0.2ml薄壁pcr管或96孔pcr反应板中：[1041]3、成分[1042][1043][1044](注意：对于一混合引物策略，使用2μloligodt。对于多个第一链反应，使用所述反应混合物和rt制备一主混合物，并以5μl分配到每个管中)。[1045]4、通过温和涡旋(gentlevortexing)来混合数个成分，然后离心10秒以收集数个内容物。[1046]5、在65℃下孵育5分钟，然后在冰中快速冷却。[1047]6、将下列物质添加至所述主rna模板混合物：[1048]成分体积qscriptflex反应混合(5x)4μlqscript反转录酶1μl总体积20.0μl[1049](注意：对于多个第一链反应，使用所述反应混合物和rt制备一主混合物，并以5μl分配到每个管中)。[1050]7、通过温和涡旋(gentlevortexing)来混合数个成分，然后以下述步骤培育：在42℃下60分钟、在85℃下5分钟、在4℃下保持。[1051]8、cdna合成完成后，再加入一额外的30μldh2o或te缓冲液[10mmtris(ph8.0)，0.1mmedta]，使用2μl至3μl进行数个20μlqrtpcr反应。cdna可以储存在‑20℃。[1052]sybrgreenjumpstarttaqready反应方案[1053]1、使用前将所有成分(酶除外)解冻、充分混合、离心。使用前置于冰上。[1054]2、将以下物质加入置于冰上的一0.2ml薄壁pcr管或96孔pcr反应板中：[1055]成分体积2xsybr主混合10μl特异性正向引物(10um)1μl特异性反向引物(10um)1μlcdna模板2μl至3μl无核酸酶dh2o可变的总体积20μl[1056]3、以下述步骤培育数个样品：在94℃下2分钟、在94℃下15秒、在55℃至60℃下60秒，35个至40个周期读取sybr信号。熔化曲线(meltingcurve)：95℃‑>65℃，在20℃下每个周期从连续收集信号；65℃‑>95℃每0.2秒。对于所述感兴趣的基因和所述内源性校准物，以技术性三次重复进行反应。[1057]引物序列[1058]‑剪接体sr蛋白：[1059]qrtspsr_fwdgctcaactgacaaagaatctctcac–seqidno:128[1060]qrtspsr_revttgaaaattgggtcaaagaaatgcg–seqidno:129[1061]‑核醣体蛋白3a：[1062]qrtrib3a_fwdgaacggtcgctacgattacga–seqidno:130[1063]qrtrib3a_revcaaacgctctgttgaacaggc–seqidno:131[1064]‑用于标准化的内源基因：[1065]nemaactin_09251_fttccagcagatgtggatcag–seqidno:132[1066]nemaactin_09251_rcggccttattcttcaagcac–seqidno:133[1067]数个生物信息学分析材料‑[1068]fastq格式的小rna原始数据使用具有数个参数“‑m18‑u4‑annnntggaattctcgggtgccaagg”(seqisno:138)的cutadapt2.8来处理，以修剪所述测序适配器，移除所述数个随机适配器，并仅保持长于18nt的数个读取。fastq格式的rna‑seq原始数据使用具有参数“‑m18‑aagatcggaagagcacacgtctgaactccagtca‑aagatcggaagagcgtcgtgtagggaaagagtgt”(seqisno:139)的cutadapt2.8来处理，以去除数个测序适配器，并保持长于18nt的数个读取。[1069]通过使用具有数个参数“‑‑genomesaindexnbases3”的star版本2.7.1a的所述数个靶序列所组成的一伪基因组来创建一比对索引，以容纳所述小伪基因组。[1070]将数个小rna适配器修剪读取(small‑rnaadapter‑trimmedreads)与使用具有数个参数“‑‑outsamtypebamunsorted‑‑outfiltermismatchnmax0‑‑alignintronmax1‑‑alignendstypeendtoend‑‑scoredelopen‑10000‑‑scoreinsopen‑10000”的star2.7.1a的伪基因组来进行比对。数个rna‑seq适配器修剪读取使用具有数个参数“‑‑outsamtypebamunsorted‑‑alignendstypeendtoend‑‑alignintronmax500”的相同资源进行比对。[1071]使用自定义python脚本将比对的数个小rna读取过滤到长度在20个至24个核苷酸之间，并将数个rna‑seq读取过滤到长度大于50个核苷酸。[1072]使用具有数个参数“genomecov‑bg‑scale{factor}”的bedtools2.29.2来计算针对所述数个靶序列的读取覆盖率，其中计算所述因子以将读取计数标准化为每百万读取(rpm)。[1073]使用适用于r版本1.25.0的所述sushi包来产生数个覆盖图。[1074]范例1a[1075]基因组编辑诱导基因沉默(geigs)[1076]为了设计多个geigs寡核苷酸，需要对多个模板非编码rna分子(多个前体)进行加工，并引起衍生出多个小沉默rna分子(多个成熟体(mature))。多个前体的两个来源及其相应的成熟序列用于产生多个geigs寡核苷酸。对于多个mirna，多个序列是从所述mirbase数据库中获得(kozomara，a.和griffiths‑jones，s.，nucleicacidsres，2014年，42：d68，)。多个tasirna前体和多个成熟体是从所述tasirnadb数据库中获得(zhang，c.等人，bioinformatics，2014年，30：1045，)。[1077]在多种宿主生物中选择多个沉默靶(数据未显示)。使用所述sirnarules软件(holen，t.，rna，2006年，12：1620，)设计针对这些靶的多个sirna。这些sirna分子中的每一个用于替换在每个前体中存在的所述多个成熟序列，从而产生多个“缺乏经验的(naive)”geigs寡核苷酸。使用所述viennarnapackagev2.6(lorenz，r.等人，viennarnapackage2.0，algorithmsformolecularbiology，2011年，6：26)将这些缺乏经验的序列的结构调整至尽可能接近所述野生型前体的结构。调整所述结构后，计算在所述野生型的寡核苷酸和所述修饰的寡核苷酸之间的多个序列的数量和二级结构的变化。这些计算对于鉴定多个潜在功能性的geigs寡核苷酸至关重要，所述多个寡核苷酸相对于所述野生型需要最低程度的序列变化。[1078]使用所述casot软件(xiao，a.等人，bioinformatics，2014年，30：1180，)产生针对所述多个野生型前体的多个crispr/cas9小引导rna(sgrna)。选择多个sgrna，其中用于产生所述geigs寡核苷酸的所述修饰会影响所述sgrna的所述pam区域，使其对所述修饰的寡核苷酸无效。[1079]范例1b[1080]内源性植物基因的基因沉默‑pds[1081]为了建立一高通量筛选以使用基因组编辑诱导的基因沉默(geigs)定量评估内源性基因沉默，本发明人考虑了几种潜在的视觉标记。本发明人选择集中于涉及色素积累的多个基因，例如，用于编码八氢番茄红素去饱和酶(phytoenedesaturase，pds)的基因。pds沉默会导致光致漂白(图8b)，这使得可以使用其在基因编辑后作为概念验证(proof‑of‑concept，poc)用作可靠的幼苗筛选。图8a至8c示出了对本生烟(n.benthamiana)和拟南芥(arabidopsis)植物进行pds沉默的一代表性实验。多个植物示出在具有少量类胡萝卜素的多个植物中观察到的特征性光致漂白表型。[1082]在所述poc实验中，选择多个sirna的步骤如下：[1083]为了使用geigs应用启动在拟南芥或本生烟中针对所述pds基因的所述rnai机制，需要鉴定靶向pds的有效的21至24bpsirna。为了找到多个活性的sirna序列，使用了两种方法：(1)筛选文献：由于pds沉默在许多植物中是一众所周知的测定方法，因此本发明人正在不同植物中鉴定多个特征化良好的短sirna序列，这些序列可能与拟南芥或本生烟中的所述基因100％匹配。(2)有许多公开的算法正在用来预测哪种sirna将对一特定基因启动基因沉默。由于这些算法的所述多个预测不是100％，因此本发明人仅使用了至少两种不同算法的结果的序列。[1084]为了使用沉默所述pds基因的多个sirna序列，本发明人正在使用所述crispr/cas9系统将它们与一已知的内源性非编码rna基因序列交换(例如，改变一mirna序列、改变一长dsrna序列、产生反义rna、改变trna等)。有许多特征化的非编码rna的数据库，例如，mirna；本发明人正在选择几种已知的拟南芥或本生烟的多个内源性非编码rna，例如，具有不同表达模式的多个mirna(例如，低构成性表达(constitutiveexpression)、高表达、应激诱导等)。例如，为了将所述内源性mirna序列与靶向所述pds基因的sirna交换，本发明人正在使用所述hr方法(同源重组(homologousrecombination))。使用hr，可以考虑两种选择：使用大约250至500nt的一供体ssdna寡核苷酸序列，其例如包含在中间的所述修饰的mirna序列，或使用携带1kb至4kb插入物的多个质粒，其与在所述植物基因组中附近的所述mirna几乎100％相同，除了2x21bp的所述mirna和所述*mirna改变为所述pds的所述sirna(在所述sirna上下游500至2000bp，如图7中所示)以外。所述转染包含以下多个构建体：用于追踪和富集多个阳性转化细胞的crispr：cas9/gfp传感器，引导所述cas9以产生一双链断裂(dsb)(通过取决于所述插入载体/寡核苷酸的hr来修复)的多个grna。所述插入载体/寡核苷酸含有围绕所述靶向的基因座的两个连续的同源性区域，所述多个区域被替换(即，mirna)并被修饰以携带所述感兴趣的突变(即，sirna)。如果使用质粒，则靶向的构建体包括或不包括多个限制性酶识别位点(restrictionenzymes‑recognitionsite)，并且用作一同源重组的模板，以所述选择的sirna替换所述mirna结束。转染至多个原生质体后，facs用于富集cas9/sgrna转染的事件，多个原生质体再生为多个植物，并对多个漂白的幼苗进行筛选和评分(见图5)。作为对照组，多个原生质体用携带一随机非pds靶向序列的一寡核苷酸转染。所述多个阳性编辑的植物预期产生靶向pds的多个sirna序列，因此，与没有grna的所述对照组相比，pds基因被沉默，幼苗被视为白色。需要注意的是，所述交换后，所述编辑的mirna仍将作为mirna被加工，因为保留了所述原始的碱基配对外形。然而，所述新编辑的经加工mirna与所述靶具有很高的互补性(例如，100％)，因此，实际上所述新编辑的小rna将作为sirna。[1085]范例1c[1086]拟南芥植物对tumv病毒感染的抗性[1087]所述拟南芥基因组的数个改变被设计成在功能性失调的数个非编码rna中引入沉默特异性，以靶向所述萝卜花叶病毒(turnipmosaicvirus，tumv)。这些序列(连同所述基因组位点的所述内容中的数个延伸同源臂)被引入至puc57载体，命名为donor。数个引导rna被引入至crispr/cas9载体系统，以便在所需基因座中产生一dna剪切(dnacleavage)。所述crispr/cas9载体系统通过基因轰击协议(genebombardmentprotocol)与所述donor载体共同引入至植物，以通过同源dna修复(hdr)引入所需的数个修饰。[1088]通过基因分型来确定它们的基因组中具有所需的数个改变的数个拟南芥幼苗，并接种带有tumv或tumv‑gfp的农杆菌，并对病毒反应进行评分。[1089]范例2[1090]番茄植株对粉虱感染(whiteflyinfestation)的抗性[1091]根据所述geigs2.0流程(在上面的“一般材料及实验程序”部分所讨论的)，所述番茄基因组的所述改变旨在产生数个非编码rna，以靶向粉虱中的所述必需基因。这些序列(连同所述基因组位点的所述内容中的数个延伸同源臂)被引入至puc57载体，命名为donor。数个引导rna被引入至crispr/cas9载体系统，以便在所需基因座中产生一dna剪切。这些是通过基因轰击协议与所述数个donor载体而共同引入至植物，以通过同源dna修复(hdr)引入所需的数个修饰。通过基因分型(genotyping)来确定具有所需基因组改变的数个番茄植株被引入至数个粉虱中并进行反应评分。[1092]范例3[1093]使用geigs对拟南芥原生质体中的反式激活沉默rna[1094]为了证明当使用geigs重定向tasirna的所述沉默特异性时的数个植物细胞中的同源依赖性重组(hdr)事件，使用表达所述crispr/cas9内切核酸酶、用于导致一dna断裂的一sgrna及一“供体”序列(也称为geigs供体)的数个载体在数个拟南芥原生质体中进行一转染测定，以通过geigs(在本文中也称为“交换”)引入所需的数个核苷酸改变。所述供体序列包括对应于具有所需的所述数个核苷酸改变的所述靶序列的一序列，两侧是数个同源臂(所述数个改变序列上游及下游约500个碱基对)，以促进所述hdr。[1095]geigs方法基本上是根据上文及wo2019/058255(通过引用并入本文)中描述的原理，并在下文中举例说明。简而言之，当包括所述geigs供体的一载体与一内切核酸酶(例如一cas9及靶向所述待编辑基因的一sgrna)一起引入至一细胞时，所述geigs‑oligo序列被引入至所述细胞的所述基因组(由hdr介导)，这样编辑的所述基因现在包括所需的数个改变(例如，编码可以转录为一长dsrna的一tas基因，其沉默活性已被重定向至一选择的目标)。[1096]两种基因被用作这种操作的数个骨架，都编码数个反式作用sirna(tas)产生分子—tas1b及tas3a(参见下文)。选择使用geigs引入的所述数个改变，使得它们产生长dsrna及小二级tasirna，所述长dsrna及小二级tasirna将会靶向及沉默所述线虫globoderarostochiensis中的数个必需基因。这些靶基因是根据之前的出版物选择的，这些出版物讨论了使用一rnai技术靶向所述数个基因时对一线虫的负面影响(参见下面的表3)。由于这些基因是在不同的线虫品系中鉴定的，它们的同源物是通过一blast搜索在globoderarostochiensis公开可用数据库(www(dot)parasite(dot)wormbase(dot)org/globodera_rostochiensis_prjeb13504/info/index/中鉴定的，使用选择的所述数个基因作为数个查询。[1097]表3‑线虫中的数个靶基因[1098][1099][1100]在所述数个基因序列中选择的数个sirna靶位点在所述下列序列中描述：[1101]gros_g05960:tggagcagcagatcaatgaaattcaacgac(seqidno:59)[1102]gros_g04462：attcgtaaggtgaaggtgctgaagaagccg(seqidno:60)[1103]gros_g04863：aaaaacaaacaaatgttggtcaaaaaggat(seqidno:61)[1104]gros_g00263：ccgctctgtggattcttggcgaatattgcg(seqidno:62)[1105]col‑0原生质体的转染[1106]如上所述，拟南芥(col‑0)原生质体用编码crispr/cas9及sgrna的一载体及包括一供体模板的一载体来转染，以实现hdr介导的数个交换(hdr‑mediatedswaps)。所述实验被设计成使得所述tas1b(attas1b_at1g50055)或tas3a(attas3a_at3g17185)数个基因中的数个序列被交换，产生长dsrna及数个小二级rna，它们靶向上述数个线虫靶基因中的数个30bp序列。在所述tas1b基因座中设计了两个交换，在所述tas3a基因座中设计了两个交换。数个交换是彼此独立的。[1107]在不同实验条件下使用的各种载体组合列于下表4中。使用了数个tas骨架及数个供体寡核苷酸的数个不同组合。在没有dna的情况下进行数个阴性对照转染(处理e)。[1108]表4–数个实验条件[1109][1110][1111]数个col‑0细胞中的tas1b及tas3a交换的基因组证据[1112]预计只有一小部分的数个转染细胞能够使用一hdr供体模板成功地修复dna双链断裂，从而产生一交换。如本领域众所周知的，这是由于数个hdr事件的所述低频率。因此，即使是所述转染样品也预期包括一大量未发生交换的数个细胞。[1113]为了证明所有加工过的所述数个样品都适用于pcr扩增，在从所有的处理(a至e)中获得的基因组dna上使用数个wt特异性引物来进行数个pcr反应。所述正向引物被设计成与预期发生数个交换的所述区域退火，而所述反向引物被设计成在所述重组位点的下游进一步退火(图9a，数个引物以数个箭头表示，预期的所述pct产物以一虚线绘示)。一引物组是针对wttas1b所设计的，另一组是针对wttas3a所设计的。针对wttas1b、y25及数个剪接因子交换处理(wt＝处理e)，获得了预期的所述数个pcr产物(594bp长)。以一类似的方式，针对wttas3a、核醣体蛋白3a及剪接体sr蛋白交换处理，获得了预期的所述数个pcr产物(574bp长)。正如所预期的(水，无模板)，数个阴性对照没有获得扩增(图9b至c)。[1114]然后使用在所述重组位点下游进一步退火的相同非特异性反向引物(wttas1b的一非特异性引物及wttas3a的一不同引物)及一交换特异性正向引物(图9a)进行数个特异性pcr反应。作为所述pcr反应特异性的一对照，wtdna用于每个引物对的一阴性对照(图9e至f)。对于tas1b的y25(587bp长)及剪接因子(584bp长)交换处理，获得了预期的所述数个特异性pcr产物。以一类似的方式，针对核醣体蛋白3a(568bp长)及剪接体sr蛋白(574bp长)交换处理，获得了预期的所述数个特异性pcr产物(图9d至e)。当wtdna用作所有pcr反应的一模板时，没有获得扩增，进一步证明了数个交换特异性引物的所述特异性。此外，正如所预期(水，无模板)，数个阴性对照没有获得扩增。[1115]使用所述非特异性反向引物对数个粗pcr产物进行进一步sanger测序(eurofins)。使用snapgene软件分析数个测序结果。预计会在所述数个特定引物结合位点之前检测由所述数个hdr交换而引入(而不是由所使用的所述数个引物而引入)的一些突变。数个测序反应证实了此数个突变的所述身份及位置。所述数个wt特异性产物也被发送至同时用于tas1b及tas3a的测序，遵循一类似的方法，也可以确认数个wt序列的身份(图9f)。数个结果证实了数个sgrna向导是有活性的，并且所有处理都发生了数个hdr交换，包括tas1b及tas3a基因座以及使用不同的供体寡核苷酸。[1116]当遵循一嵌套式pcr方法时获得了数个类似结果，其中在使用与所述主要方法相同的数个引物组执行一嵌套式特异性pcr反应之前进行一非特异性pcr反应。[1117]基因组pcr[1118]使用一rna/dna纯化试剂盒(如上所述)加工数个细胞样品(a、b、c、d、e)的基因组dna。[1119]如上所述，将所述交换区侧翼的一非特异性引物用于所述数个tas1b(attas1b_at1g50055)及tas3a(attas3a_at3g17185)序列。作为一阴性对照，使用作为模板的野生型(wt)dna进行相同的数个交换特异性反应。预期没有扩增。作为一阳性pcr对照，对所有样品进行了针对wtdna的一特异性pcr。[1120]还采用了一类似的替代方法来确认数个交换。进行了一嵌套式pcr反应(nestedpcrreaction)，而不是一单一pcr反应。所述第一基因组pcr包括位于所述hdr区域侧翼的数个非特异性正向及反向引物。用于所述嵌套式方法中的所述第一pcr的数个非特异性引物在所述数个嵌套式引物的所述退火位点侧翼具有数个退火位点。[1121]数个基因及数个序列[1122]下面的表5列出了(对于tas骨架及线虫靶基因的每个组合)所述geigs供体内的所述geigs‑oligo的所述区域，包括预期的所述数个交换，并将产生将靶向所述线虫中的所述基因的所述sirna。下面列出了所述数个野生型tas骨架、使用的所述数个sgrna及所述数个geigs供体设计的所述数个序列。[1123]所述数个geigs设计中的数个同源区域(即数个区域，所述数个区域旨在交换所述野生型区域以将所述tas长dsrna的沉默激活及特异性重定向至针对所述靶基因沉默)以下划线表示。在下面的所述数个序列中，插入所述供体载体中并包括具有数个同源臂的所述数个交换核苷酸的所述供体序列被称为例如geigs‑剪接因子‑供体。所述交换事件后所述数个tas基因的所述数个长dsrna转录物(将靶向所述线虫中的所述数个基因)被称为例如geigs‑剪接因子‑转录物。[1124]表5–交换的寡核苷酸[1125][1126][1127]每个表5的数个附加序列：[1128]‑attas1b_at1g50055–seqidno:73[1129]‑sgrna_attas1b(包括pam)–seqidno:74[1130]‑geigs‑剪接因子‑转录物‑seqidno:75[1131]‑geigs‑剪接因子‑转录物的geigs设计中的同源区域‑seqidno:76[1132]‑geigs‑剪接因子‑供体‑seqidno:77[1133]‑geigs‑剪接因子‑供体的geigs设计中的同源区域seqidno:78[1134]‑geigs‑y25‑转录物‑seqidno:79[1135]‑geigs‑y25‑转录物的geigs设计中的同源区域‑seqidno:80[1136]‑y25‑供体‑seqidno:81[1137]‑y25‑供体的geigs设计中的同源区区‑seqidno:82[1138]‑attas3a_at3g17185‑seqidno:83[1139]‑sgrna_attas3a(包括pam)‑seqidno:84[1140]‑geigs‑核醣体蛋白3a‑转录物‑seqidno:85[1141]‑geigs‑核醣体蛋白3a‑转录物的geigs设计中的同源区域‑seqidno:86[1142]‑geigs‑核醣体蛋白3a‑供体‑seqidno:87[1143]‑geigs‑核醣体蛋白3a‑供体的geigs设计中的同源区域‑seqidno：88[1144]‑geigs‑剪接体sr蛋白‑转录物‑seqidno:89[1145]‑geigs‑剪接体sr蛋白‑转录物的geigs设计中的同源区域‑seqidno：90[1146]‑geigs‑剪接体sr蛋白‑供体‑seqidno:91[1147]‑geigs‑剪接体sr蛋白‑供体的geigs设计中的同源区域‑seqidno:92[1148]范例4[1149]表达由geigs修饰的一tas基因的数个细胞中的长双链rna[1150]为了证明修饰编码一长dsrna的一植物基因的一核酸序列而导致所述细胞中的一修饰的dsrna，使用源自范例3中分析的所述数个原生质体的rna。使用数个特异性引物将rna反转录至靶测试基因座(在未设计为交换的一区域上)。然后，使用对所述交换区域特异的数个引物(以特异性扩增一交换的序列或一wt序列)，以研究长dsrna的存在作为预测的所述rna转录物的一有义及反义。[1151]从所有处理中提取rna并使用dna酶的处理以去除dna痕迹。然后使用非特异性引物对数个rna样品进行rt‑pcr以生成cdna。进行了两个不同的独立rt‑pcr( rt)反应以分别从tasdna的所述有义及反义链中产生cdna。tas1b及tas3a均遵循所述方法。使用所有相同的数个试剂进行数个反转录对照(‑rt)，但添加水而不是添加反转录酶。如果所述反应混合物中没有反转录酶，则不会产生cdna，因此，在后续数个pcr反应中获得的任何pcr产物都必须从dna酶处理的数个样品后保持完整的残留dna中扩增出来。[1152]使用一非特异性正向引物及一交换特异性反向引物(用于有义cdna)(图10a)或一非特异性反向引物及一交换特异性正向引物(用于反义cdna)(图10b)进行数个特异性pcr反应。数个pcr反应被设计成使得所有pcr产物的长度都低于200个核苷酸(图10a至b)。[1153]数个tas1b(图10c至图10d，数个右图)及tas3a序列(图10e至图10f，数个右图)的wt特异性pcr反应示出，来自经过处理的数个样品的所述rna适用于pcr扩增。在过处理的数个样品中，对于有义(tas1b为105bp，tas3a为133bp)及反义链(tas1b为147bp，tas3a为101bp)的wt基因座(tas1b及tas3a基因)获得了预期的所述数个pcr产物，显示出它们的共存以及所述数个样品中存在dsrna。数个干净‑rt反应(clean‑rtreactions)表示出成功地通过dna酶处理来从rna样品中去除了dna的所述痕迹。[1154]对经过处理的rna进行数个交换特异性rt‑pcr反应，并获得了对y25有义(98bp)及反义处理(149bp)的数个特异性差异扩增pcr产物(图10c至d，数个左图)。以相同的方式，获得了针对核醣体蛋白3a有义(130bp)及反义处理(118bp)的数个特异性差异扩增pcr产物(图10e至图10f，数个左图)。在使用水及无rt模板的数个阴性对照中未获得扩增。作为每个特异性pcr反应的一阴性对照，相同的所述数个主混液(mastermixes)来用于使用来自未处理的数个细胞中的rna作为一模板的pcr(处理e)。缺少所述预期大小的数个强条带表示出所述数个交换特异性引物的所述特异性，证明了来自所述交换基因座的rna表达。[1155]在所述有义方法的情况下使用所述非特异性正向引物(图10g)及在所述反义方法的情况下使用所述非特异性反向引物(图10h)来针对数个粗pcr产物进行sanger测序。预计会在所述特异性引物结合所述数个位点之前检测到通过hdr交换而引入(而不是通过所使用的引物而引入)的一些突变。数个测序反应证实了tas1by25交换及tas3a核醣体蛋白3a交换的此类突变的所述身份及位置(图10g至h)。数个wt特异性产品也遵循一类似的方法被送去同时针对tas1b及tas3a来测序，且wt序列的身份也可以被确认(图10i)。[1156]因此，在使用范例3的数个处理a及c来处理的所述数个细胞中成功地证明了含有交换的dsrna转录物的存在(即含有将其靶向所述y25靶基因的数个交换的tas1b的一dsrna，以及含有将其靶向所述核醣体蛋白3a靶基因的数个交换的tas3a的一dsrna)。[1157]范例5[1158]长dsrna在本氏烟草(nicotianabenthamiana)中靶向特异性改变的沉默活性[1159]以下所述实验证明了在使用dsrna时针对一所选的靶基因的沉默活性，其中靶向特异性(从其加工的数个小rna靶向特异性)已重定向至所选基因(例如使用hdr介导的沉默特异性重定向的geigs方法)。为此，通过渗透本氏烟草叶来使用一瞬时表达系统，其中具有：(1)具有gfp标记的一芜菁花叶病毒(turnipmosaicvirus，tumv)载体，及(2)用于过表达所述“geigs设计”的一载体‑编码基于tas1b作为一转录物的一tas基因，具有靶向tumv所必需的所述数个核苷酸改变，可以通过使用geigs将所述数个核苷酸变化引入至所述拟南芥基因组中的所述tas1b基因骨架来产生(以下也称为“geigs‑tumv”)。通过将已用各种载体转化的菌株gv3101的农杆菌细菌引入至叶片中来进行渗入。[1160]使用所述geigs方法产生“geigs设计”所需的所述数个寡核苷酸，如上文对于拟南芥所叙述，特别是–(1)用于切割tas1b的所述sgrna，(2)靶向tumv的所述sirna序列(通过所述geigs供体使用一hdr介导的交换而引入至tas1b骨架)，(3)包括对tas1b骨架的数个所需改变的所述geigs供体，如下所示：[1161](1)将用于切割tas1b的所述sgrna–seqidno:134。[1162](2)靶向tumv的所述sirna序列(通过所述geigs供体使用一hdr介导的交换将其引入至所述tas1b骨架)–seqidno:135。[1163](3)所述geigs供体，包括对tas1b骨架的数个所需改变‑seqidno:136。[1164](4)在具有(3)的所述供体的geigs之后将在拟南芥中表达的所述geigs寡核苷酸(设计成用于将(1)的所述成熟sirna序列引入至所述tas1b序列)‑seqidno：137。[1165]将一荧光gfp报告基因掺入至所述tumv的一复制组分中，能够监测所述tumv在所述叶片中的所述生长及传播，从而监测在所述病毒上的数个tumv特异性沉默分子的所述沉默功效。[1166]产生tas1b的rdrp依赖型转录的扩增器是mir173。因此，所述tumv‑gfp载体在具有/不具有所述mir173扩增器的情况下共同渗入(co‑infiltrated)，期望在存在扩增器时看到所述tumv靶向dsrna的沉默活性。[1167]作为一阴性对照，将用于过表达不具有特异性已知靶的一“geigs设计”的一载体(也称为“虚拟(dummy)”或“geigs‑虚拟”)渗入数个叶片中(即基于tas1b的dsrna，具有对应于那些在所述“geigs‑tumv”中改变但不对应于本氏烟草中任何已知基因的数个位置的数个核苷酸改变)。表达所述虚拟对照的所述数个载体或所述“geigs‑tumv”dsrna都在具有或不具有所述扩增器的情况下渗入所述数个叶片中。为了在数个处理之间保持数个渗透接种物的水平恒定，在不具有某些组分的数个处理中使用空的农杆菌(参见下表6)。[1168]表六:本氏烟草叶片渗入(同步分析)[1169][1170][1171]如图11a所示，将两种不同的处理同步地(sidebyside)渗入每个叶片中，测量所述叶片的每一侧的所述gfp水平(对应于tumv水平)(所述数个观察结果已通过一qrt‑pcr分析进一步证实))。每个处理至少重复3次，在紫外灯下观察，并牺牲一个数量以进行拍照。[1172]在一叶片(叶片1)中，表达( tumv)的一载体已渗入，与未渗入tumv(‑tumv)的一处理的所述数个gfp水平进行比较。正如所预期的，当不存在病毒时不具有背景荧光。在一第二叶片(叶子2)中，所述tumv‑gfp病毒在使用所述扩增器mir173( mir173)或不使用扩增器mir173(‑mir173)下渗入，说明了mir173本身对于所述病毒的所述复制没有影响(因为它对qrt‑pct相对表达的所述测量没有显著地影响)。在一第三叶片(叶子3)及一第四叶片(叶子4)中，表达所述tumv病毒的所述载体使用表达不靶向已知基因的dsrna(geigs‑虚拟)的一构建体渗入，或者使用改变的所述dsrna使其渗入靶向所述病毒(geigs‑tumv)。这是在不具有所述扩增器(叶子3)或具有所述扩增器(叶子4)的情况下完成的。[1173]如图11a中的相对表达所示，在存在所述扩增器(叶4)的情况下，相较于所述虚拟处理，观察到tumv转录物的一明显显著减少以及一视觉gfp信号减少。当渗入所述geigs‑tumv构建体(不具有扩增器)时，在叶片3中观察到gfp水平略有下降，这是通过qrt‑pcr分析确定的，因为变化太大而不被认为是显著的。[1174]通过使表达所述tumv‑gfp融合的所述载体、所述扩增器及表达一dsrna构建体的一载体(所述“geigs‑tumv”是靶向tumv或所述“geigs‑虚拟”，不靶向一已知基因，参见下表7)渗入，已经使用上述系统进行了整个叶片的渗入(图11b)。作为一对照，使用不具有载体的土壤杆菌所渗入的一叶片。当使用所述geigs‑tumvdsrna而不是使用所述geigs‑虚拟时，观察到数个gfp水平的一明显减少。这强调了所述geigs设计及扩增器基因对tumv复制的影响。[1175]表7:本氏烟草叶片渗入(整个叶片分析)[1176][1177]正如从一扩增器依赖型tasi‑rna途径的所述公认模型所预期的，这些结果证实了所述tas基因及所述扩增器在诱导沉默中的作用。所述数个结果进一步证实了在一植物中表达使用geigs改变的一dsrna的可行性，以沉默一有害生物中一选择的靶的基因表达(例如，通过将所需的数个核苷酸改变引入至编码所述dsrna的一基因中，从而将dsrna重定向至沉默一选择的靶)。[1178]范例6[1179]植物内靶向线虫基因的长dsrna的表达诱导在线虫中的其靶基因的沉默[1180]此实验旨在说明一沉默dsrna分子(例如从一tas基因表达的分子)，所述沉默dsrna分子在一植物中表达并已重新定向以靶向一有害生物基因(例如一线虫基因)，可以诱导所述有害生物(例如线虫)中其靶基因的沉默。[1181]为此，如上所述，通过农杆菌介导至所述数个叶片的方式将它们引入至所述数个叶片中，使用一瞬时表达系统在数个本氏烟草叶片中表达测试的所述dsrna分子。然后使用一叶片提取物喂养所述数个线虫，如下所述，并检查对靶基因表达的影响。[1182]所述分析是通过靶向所述线虫globoderarostochiensis中的所述核醣体蛋白3a及所述数个剪接体sr蛋白基因进行的。特别是，数个本氏烟草叶片被农杆菌渗入，所述农杆菌含有一种载体，所述载体过表达已引入数个核苷酸改变的一tas3a转录物。所述核苷酸改变至少部分地将所述tas3a转录物的所述沉默特异性重定向至这些线虫基因中的一个基因上。通过在所述基因中诱导一dna断裂(例如使用一内切核酸酶，如cas9及一特异性sgrna)并将这些改变通过具有包括所需的数个核苷酸改变的一geigs供体寡核苷酸的同源依赖性重组(hdr)来引入至所述基因，可以使用基因组编辑诱导基因沉默(geigs)将对应的数个改变引入至一植物细胞中的所述tas3a基因中。可用于将针对核醣体蛋白3a的特异性引入至所述tas3a基因中的一geigs寡核苷酸及一sgrna序列的数个序列由上文的范例3中提供。[1183]作为一对照，数个叶片也被tas3a的一野生型转录物渗入。通过所述对照tas3a渗入的数个叶片及被修饰以靶向线虫基因的所述tas3a都进一步通过所述扩增器mir390渗入。[1184]在48及72小时后，收集叶子，在ultra0.5mlcentrifugalfilters3kdcutoff(merck，美国)上提取及清洗总rna。如下所述，线虫globoderarostochiensis以此总rna喂养72小时并收集。提取rna并使用qrt‑pcr进行基因表达分析，使用肌动蛋白作为一内源性标准化基因。核醣体蛋白3a(图12a)及剪接体sr蛋白(图12b)在植物内喂养线虫测试中均已显示其表达水平显著地降低。所述核醣体蛋白3a具有以7×10‑5的一t检验显著所示的表达降低，剪接体sr蛋白具有以1.72×10‑3的一t检验显著所示的表达，代表所述数个靶基因已显著地沉默，并应显示出下一代线虫生长减少。[1185]这些结果表明，对tas3a进行的修饰导致靶向所述数个线虫基因的dsrna的形成，这可以靶向对此类的一dsrna敏感的数个病原体。[1186]用于喂养数个线虫的rna提取物也通过rna‑seq及小rna‑seq(cambridgegenomicservices，cambridge，uk；图13a至图13d)进行了分析。如方法中所述的来进行分析。将数个序列读取与旨在靶向核醣体蛋白3a(图13a及13b)及剪接体sr蛋白(图13c及图13d)的所述geigs设计的所述序列进行比对。同时在两条链(有义及反义)上来进行比对。数个分析证实了所述转录物的两条链皆存在，能够通过分析一长rnaseq读取(图13a及图13c)及短小rnaseq读取(图13b及图13d)来产生一长双链rna。由于rna‑seq分析是使用长度超过50个核苷酸的读取进行的，因此所述分析鉴定了长双链rna。此外，通过20个至24个核苷酸的过滤序列进行所述小rna分析，从而证明所述长dsrna的分阶段加工，证实了所述二级sirna的形成(图13b及图13d)。[1187]尽管已经结合本发明的特定实施例来描述本发明，但是显然地，对于本领域技术人员而言，许多替代、修改及变化将是显而易见的。因此，旨在涵盖落入所附权利要求书的精神及广泛范围内的所有这样的替代、修改及变化。[1188]本说明书中提及的所有出版物、专利及专利申请都通过引用整体并入本文，其程度与好像每个单独的出版物、专利或专利申请被具体地及单独地指示通过引用并入本文的程度相同。此外，在本技术中对任何参考文献的引用或标识均不应解释为承认所述参考文献可作为本发明的现有技术。在使用章节标题的程度上，不应将其解释为必然的限制。[1189]此外，本技术的任何优先权文件的全部内容通过引用并入本文。[1190]参考文献[1191]yadav,b.、veluthambi,k.及subramaniam,k.，2006年。molecularandbiochemicalparasitology。molecularandbiochemicalparasitology，148(2)，第219至222页。[1192]klink,v.、kim,k.、martins,v.、macdonald,m.、beard,h.、alkharouf,n.、lee,s.、park,s.及matthews,b.，2009年。acorrelationbetweenhost‑mediatedexpressionofparasitegenesastandeminvertedrepeatsandabrogationofdevelopmentoffemaleheteroderaglycinescystformationduringinfectionofglycinemax。planta，230(1)，第53至71页。[1193]li,j.、todd,t.、oakley,t.、lee,j.及trick,h.，2010年。host‑derivedsuppressionofnematodereproductiveandfitnessgenesdecreasesfecundityofheteroderaglycinesichinohe。planta，232(3)，第775至785页。[1194]li,j.、todd,t.及trick,h.，2009年。host‑derivedsuppressionofnematodereproductiveandfitnessgenesdecreasesfecundityofheteroderaglycinesichinohe。plantcellreports，29(2)，第113至123页。当前第1页12当前第1页12
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