一种莱氏野村菌NrSfadult202104菌株及其制备方法和应用与流程

一种莱氏野村菌nrsfadult202104菌株及其制备方法和应用
技术领域
1.本发明涉及微生物技术领域，具体地说，涉及一种莱氏野村菌nrsfadult202104菌株及其制备方法和应用。


背景技术：

2.草地贪夜蛾[spodoptera frugiperda(j.e.smith)]又名秋黏虫，为鳞翅目夜蛾科灰翅夜蛾属害虫，原产于美洲热带和亚热带地区，食性杂，尤其喜欢取食危害玉米，因而是对玉米的危害尤为严重。自2019年1月首次在我国云南省普洱市江城县玉米田发现以来，其已蔓延至我国的22个省市，严重危害玉米等作物，已成为严重影响我国玉米产业发展的重要因素。在我国2020年颁布的《农作物病虫害防治条例中》中，已将该虫列为我国十大害虫之首。
[0003]
莱氏野村菌(nomuraea rileyi)又名莱氏绿僵菌，隶属子囊菌门麦角菌科真菌，是一种对鳞翅目幼虫具有良好生防潜力的虫生真菌，在适宜环境条件下能在害虫种群中发生流行从而引起害虫的病害流行，从而有效地防治害虫。据报道，该菌对斜纹夜蛾和棉铃虫等鳞翅目害虫幼虫具有很强的侵染力。然而，目前尚未见到有能对草地贪夜蛾具有强致病性、可用于草地贪夜蛾生物防治的莱氏野村菌。
[0004]
现有技术中，目前对于草地贪夜蛾的防治主要依赖于使用化学农药防治，然而化学农药的大量使用已使该虫对许多农药产生了较强的抗药性，因而为防治该害虫工作带来了新的挑战。此外，采用化学农药防治还会带来农药残留、人畜安全隐患和生态环境影响的风险。因此，探求绿色、安全、高效、持续的防治草地贪夜蛾的措施已势在必行。


技术实现要素：

[0005]
针对现有技术的上述缺陷，本发明提供一种莱氏野村菌nrsfadult202104菌株及其制备方法和应用。
[0006]
为了解决现有技术的问题，本发明提供了如下技术方案：本发明的一种莱氏野村菌nrsfadult202104菌株，其特征在于：该菌株为莱氏野村菌，保藏名称为莱氏野村菌nomuraea rileyi；保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号；保藏日期：2021年6月21日；保藏编号：cgmcc no.22480。
[0007]
进一步地，所述的莱氏野村菌nrsfadult202104菌株的its基因序列为seq id no.1的核苷酸序列。
[0008]
进一步地，该菌株sday培养基上于25℃下培养至第15d时，菌落直径12.26～12.34mm，菌落正面白色绒毛状，中间略凸起，背面颜色从边缘到中心由浅至深，从黄褐色到中心1/2处变为黑褐色；该菌菌丝丝光滑，有分隔，菌丝直径2～3μm；分生孢子梗直立呈葡萄穗状；生孢子长椭圆形，表面光滑一端尖，一端略钝，大小为4.63μm
×
2.12μm。
[0009]
本发明所述的莱氏野村菌nrsfadult202104菌株制草地贪夜蛾成虫莱氏野村菌制备的莱氏野村菌nrsfadult202104菌株菌剂。
[0010]
进一步地，其活性成分为如下(a)(b)(c)中的至少一种：
[0011]
(a)所述的莱氏野村菌nrsfadult202104菌株的培养物的发酵液初提物；
[0012]
(b)所得莱氏野村菌nrsfadult202104菌株细胞的超声裂解上清；
[0013]
(c)所得莱氏野村菌nrsfadult202104菌株细胞的超声裂解沉淀。
[0014]
本发明所述的莱氏野村菌nrsfadult202104菌剂的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
[0015]
(1)从采集到的罹病草地贪夜蛾成虫体分离获得野生莱氏野村菌菌株，在萨氏培养基上培养，将分生孢子转接到新配制的sday培养基上进行纯化；
[0016]
(2)然后进行单孢分离获得纯化的莱氏野村菌nrsfadult202104；
[0017]
(3)将草地贪夜蛾成虫置于浓度为1.0
×
108个孢子/ml的莱氏野村菌nrsfadult202104孢子悬浮液进行喷雾接种，每头成虫喷施2-3ml孢悬液，制得莱氏野村菌nrsfadult202104菌剂。
[0018]
本发明所述的莱氏野村菌nrsfadult202104菌剂在草地贪夜蛾spodoptera frugiperda(j.e.smith)防治方面的应用。
[0019]
有益效果：本发明提供的莱氏野村菌nrsfadult202104是一种能用于防治农业害虫草地贪夜蛾的生防真菌，具有对草地贪夜蛾成虫致病性强、对环境安全、不易使害虫产生抗药性的特点，可以用于生物防治草地贪夜蛾。
[0020]
与现有技术相比，本发明具有如下优点：(1)分离获得的莱氏野村菌nrsfadult202104菌株是对草地贪夜蛾具有强致病性的真菌菌株。
[0021]
(2)莱氏野村菌nrsfadult202104菌株培养简单，生长快速，产孢量大，孢子萌发率高，易于在室内大量培养繁殖。
[0022]
(3)本发明提供的莱氏野村菌nrsfadult202104是一种能用于绿色防治草地贪夜蛾成虫的生防真菌，具有对草地贪夜蛾成虫致病性强、环境无污染、害虫不易产生抗药性的特点，可以广泛用于生物防治草地贪夜蛾。
附图说明
[0023]
图1为本发明的草地贪夜蛾成虫莱氏野村菌nrsfadult202104图；a～c：草地贪夜蛾成虫感染症状；d～h草地贪夜蛾幼虫感染症状。
[0024]
图2为本发明的莱氏绿僵菌nrsfadult202104菌落形态图。
[0025]
图3为本发明的莱氏绿僵菌nrsfadult202104分生孢子的形态图。
具体实施方式
[0026]
以下将配合实施例来详细说明本发明的实施方式，藉此对本发明如何应用技术手段来解决技术问题并达成技术功效的实现过程能充分理解并据以实施。
[0027]
昆虫病原真菌是一类能通过昆虫体表感染昆虫并在其体表和体内繁殖，导致昆虫发病死亡的真菌。因其对环境友好，对害虫具有持续的控制能力，不易产生抗药性，被认为是最有可能替代化学农药的下一代新型生物农药。
[0028]
实施例1
[0029]
本发明的本发明的一种莱氏野村菌nrsfadult202104菌株，该菌株为莱氏野村菌，
保藏名称为莱氏野村菌nomuraea rileyi；保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号；保藏日期：2021年6月21日；保藏编号：cgmcc no.22480。
[0030]
所述的莱氏野村菌nrsfadult202104菌株的its基因序列为seq id no.1所示的核苷酸序列(如下)。
[0031]
》nrsfadult202104
[0032]
ggggtttgggtactccaaccccatgtgacttatacccttttcctgttgcctcggcgggtcatttgccccggaccgggctcgtccagagcccgcccggaaacaggcgcccgccgcgggaccgaaactctgtatctcttagcctttggcacgtctgagtggaatcatacaaaaatgaatcaaaactttcaacaacggatctcttggttctggcatcgatgaagaacgcagcgaaatgcgataagtaatgtgaattgcagaattcagtgaatcatcgaatctttgaacgcacattgcgcccgccagtattctggcgggcatgcctgttcgagcgtcatttcaaccctcaagcccccgcggtttggtgttgggggccggcaattgtcagctgggccgctcatgcggttccctgcggcgccgcccccgaaatgaattggcggccccgtcgcgaactcctctgcgtattagcacaacctcgcaacaggagctcggcgcggccactgccgtaaaacgcacaaacttctccaagagttgacctctaatcatgtatgaatacccgctgaacttaagcatatctataagcggaggcaccacatca
[0033]
本发明所述的莱氏野村菌nrsfadult202104菌株制备的莱氏野村菌nrsfadult202104菌株菌剂。
[0034]
其活性成分为如下(a)(b)(c)中的至少一种：
[0035]
(a)所述的莱氏野村菌nrsfadult202104菌株的培养物的发酵液初提物；
[0036]
(b)所得莱氏野村菌nrsfadult202104菌株细胞的超声裂解上清；
[0037]
(c)所得莱氏野村菌nrsfadult202104菌株细胞的超声裂解沉淀。
[0038]
本发明所述的莱氏野村菌nrsfadult202104菌剂的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
[0039]
从采集到的罹病草地贪夜蛾成虫体分离获得野生莱氏野村菌菌株，在萨氏培养基上培养，将分生孢子转接到新配制的sday培养基上进行纯化，然后进行单孢分离获得纯化的莱氏野村菌nrsfadult202104。将草地贪夜蛾成虫置于浓度为1.0
×
108个孢子/ml的莱氏野村菌nrsfadult202104孢子悬浮液进行喷雾接种，每头成虫喷施2-3ml孢悬液，制得莱氏野村菌nrsfadult202104菌剂。
[0040]
本发明所述的莱氏野村菌nrsfadult202104菌剂在草地贪夜蛾spodoptera frugiperda(j.e.smith)防治方面的应用。
[0041]
试验例1
[0042]
莱氏野村菌nrsfadult202104的分离及鉴定
[0043]
本发明发明人于2021年4月10在云南省大理市弥渡县红岩村罹病草地贪夜蛾成虫上采集到莱氏野村菌nrsfadult202104菌株。本发明发明人所在的课题组在调查采集到了田间自然罹病的草地贪夜蛾成虫虫体后，经过分离、纯化、毒力测定和筛选，发现该菌对草地贪夜蛾成虫具有强致病性，该莱氏野村菌nrsfadult202104菌株对草地贪夜蛾成虫的侵染致病力高于课题组发现的莱氏绿僵菌mrjcbt190808菌株。
[0044]
下面给出的是本发明提供的莱氏绿僵菌nrsfadult202104及其在草地贪夜蛾防治方面的应用的试验例。
[0045]
1.1材料
[0046]
1.1.1供试菌株
[0047]
菌株于2020年12月11日采自云南省大理市弥渡县红岩村罹病草地贪夜蛾成虫。
[0048]
1.1.2菌株的分离培养
[0049]
将采集到的罹病草地贪夜蛾虫体置于5ml无菌ep管中带回实验室，采用划线法，在sday培养基(葡萄糖40g，蛋白胨10g，酵母浸膏粉10g，琼脂20g，1000ml，ph自然)上，于(25
±
1)℃，相对湿度(75％
±
1％)、l//d＝14h//10h的的光照培养箱中培养。培养7d后，将分生孢子转接到新的培养基上进行纯化。纯化的菌株采用sday斜面培养基保存于4℃冰箱。
[0050]
1.1.3菌落形态观察
[0051]
将分离并纯化的真菌分别接于sday培养基(葡萄糖40g，蛋白胨10g，酵母浸膏粉10g，琼脂20g，1000ml，ph自然)上，置于(25
±
1)℃，l//d＝16h//8h光照培养箱中培养，于3、7和14d时，分别测定菌落直径并观察菌落形态特征。
[0052]
1.2结果
[0053]
获得纯培养莱氏绿僵菌nrsfadult202104菌株后，对其形态特征进行鉴定。结果如下，该菌sday培养基上于25℃下培养至第15d时，菌落直径12.26～12.34mm，菌落正面白色绒毛状，中间略凸起，背面颜色从边缘到中心由浅至深，从黄褐色到中心1/2处变为黑褐色(图2)。该菌菌丝丝光滑，有分隔，菌丝直径2～3μm；分生孢子梗直立呈葡萄穗状(图3)；生孢子长椭圆形，表面光滑,一端尖，一端略钝，大小为4.63μm
×
2.12μm。
[0054]
试验例2
[0055]
莱氏野村菌nrsfadult202104对草地贪夜蛾的致病性测定
[0056]
1材料
[0057]
1.1.1供试昆虫
[0058]
草地贪夜蛾均采集于云南省大理市弥渡县红岩村玉米田，并于室内连续饲养3代，试验在温度25
±
1℃、相对湿度(rh)60
±
5％、光周期l∶d＝16∶8条件下的智能人工培养箱(rg-300)中进行。草地贪夜蛾幼虫用新鲜的玉米叶进行饲养，幼虫蜕皮5次后发育成为蛹，蛹在温度25
±
1℃、相对湿度(rh)60
±
5％、光周期l∶d＝16∶8条件下的智能人工培养箱(rg-300)中饲养5天后，即羽化出成虫。供生物测定用。
[0059]
1.1孢子悬浮液制备
[0060]
将分离获得的菌株接种于sday培养基，待其产生大量的分生孢子后(约20d)，用无菌解剖刀刮取培养基表面的分生孢子置于0.02％无菌吐温-80中，配制成1.0
×
104–
1.0
×
108个/ml孢子悬浮液。
[0061]
1.1.2浸渍法
[0062]
挑选同日羽化的大小一致、健康的草地贪夜蛾雌性与雄性成虫，采用喷雾法进行接种，挑选羽化2日龄草贪夜蛾雌、雄成虫用于试验。成虫采用喷雾法进行接种，每只成虫喷施2-3ml孢悬液。接种后将雌、雄成虫分别放置到自制的保鲜膜养虫笼中(20cm
×
20cm
×
20cm)，每天定时添加蜂蜜水。每组试验分别设置3个重复，成虫每个处理重复10头。接种后每天定时观察成虫和幼虫死亡情况以及感染情况，当发现有死亡虫体时，及时将死亡虫体置于底部垫有灭菌滤纸的直径9cm的灭菌培养皿中，盖上皿盖，置于(25
±
1)℃、相对湿度(80％
±
1％)、l//d＝16h//8h的光照培养箱中培养，每天定时观察虫体表面菌丝或分生孢子生长情况，并镜检分生孢子及菌丝形态，根据虫体是否长出目的菌确定各虫的死亡原因。
[0063]
1.1.3数据分析
[0064]
采用excel 2010进行数据整理，累积死亡率采用dps数据处理系统14.0软件进行计算。
[0065]
2.结果
[0066]
2.1草地贪夜蛾成虫的累积死亡率
[0067]
由表1可知，在1.0
×
108个/ml孢子浓度下，莱氏绿僵菌nrsfadult202104侵染草地贪夜蛾雌雄成虫第8天的累积死亡率，分别为61.10％和55.30％。在1.0
×
108个/ml孢子浓度下，接种后第3、5、7、9天时，草地贪夜蛾雄虫虫的死亡率分别为13.33％、29.60％、86.68％和96.67％，雌虫的死亡率分别为6.67％、25.90％、76.67％和93.33％。到第10天时，草地贪夜蛾雌雄成虫的死亡率即可达100.00％。由此可以看出，莱氏绿僵菌nrsfadult202104对草地贪夜蛾具有较好的致病性。而本课题组于2019年6月在云南省曲靖市沾益县发现的莱氏绿僵菌mrjcbt190808菌株对草地贪夜蛾3龄幼虫具有强致病性。由此，该莱氏绿僵菌nrsfadult202104菌株是当前发现的对草地贪夜蛾的致病力最高的莱氏绿僵菌菌株。莱氏绿僵菌nrsfadult202104对草地贪夜蛾雌雄成虫的累积死亡率(％)草地贪夜蛾雌雄成虫的累积死亡率(％)如表1所示：
[0068]
表1
[0069][0070]
2.2莱氏绿僵菌nrsfadult202104对草地贪夜蛾的致死剂量效应
[0071]
对3龄幼虫的致病性测定结果表明，该菌株对草地贪夜蛾的致病力满足时间-剂量死亡率模型，lt
50
随孢子悬浮液浓度的增加而缩短，当浓度为1.0
×
107个孢子/ml时，幼虫累积校正死亡率为51.7％，lt
50
为8.839天；浓度为1.0
×
108个孢子/ml时，幼虫累积校正死亡率为76.7％，lt
50
下降至5.482天(表2)。其余三个浓度的死亡率均低于50％，lt
50
无法计算。
[0072]
3龄幼虫感染初期，其活动能力、取食以及形态特征都与对照组虫体无异。感菌虫体死亡后，体色会发生变化，由正常体色变成微红，虫体开始变僵硬；将虫体进行保湿培养，第2天幼虫气门以及节间部位开始长出微量菌丝；第4天时虫体腹节部分基本被菌丝覆盖；培养第6天后，除头部外，虫体胸腹部均长满白色菌丝；第8天开始有浅绿色孢子产生；直至第10天，整个虫体胸腹部长满孢子，呈深绿色。不同孢子浓度下莱氏绿僵菌菌株xl-595对草地贪夜蛾3龄幼虫的致病力(10d)如表2所示：
[0073]
表2
[0074][0075]
注：式中y是几率值，x是时间的对数。；
“‑”
表示草地贪夜蛾3龄幼虫的最终死亡率低于50.0％，无法估算lt
50
。
[0076]
根据莱氏野村菌nrsfadult202104菌株孢子悬浮液对草地贪夜蛾雌雄成虫的侵染致病效应，计算获得莱氏野村菌nrsfadult202104菌株对草地贪夜蛾雌成虫和雄性成虫的lc
50
分别为1.36
×
105个/ml和1.78
×
105个/ml。由此表明，莱氏野村菌nrsfadult202104对草地贪夜蛾成虫具有较好的致死效应。
[0077]
综上所述，本发明提供的莱氏野村菌nrsfadult202104是一种能用于绿色防治草地贪夜蛾成虫的生防真菌，具有对草地贪夜蛾成虫致病性强、环境无污染、害虫不易产生抗药性的特点，可以广泛用于生物防治草地贪夜蛾。
[0078]
上述说明示出并描述了本发明的若干优选实施例，但如前所述，应当理解本发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改，并能够在本发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离本发明的精神和范围，则都应在本发明所附权利要求的保护范围内。