一种用于黑色茶花杂种鉴定的SSR标记引物及应用的制作方法

一种用于黑色茶花杂种鉴定的ssr标记引物及应用
技术领域
1.本发明属于茶花杂种鉴定技术领域，具体涉及一种用于茶花杂种鉴定的ssr标记引物及应用。


背景技术：

2.茶花（camellia）是我国十大名花，也是世界名贵花卉之一。尽管目前国际茶花协会登陆的品种有20000多个，但市场上常见的茶花品种花色主要为红色、粉色及白色，少量品种为黄色，而具有极高观赏价值及开发利用前景的黑色茶花品种仅10余个，且大多为国外选育。黑色茶花品种花瓣呈现黑红色，鲜艳活泼，有蜡质感，满足人们对特异新奇花卉品种的追求；同时黑色茶花花青苷含量丰富，而花青素具有抗氧化衰老的作用，因此，黑色茶花具有良好的商品市场优势及开发利用前景。ssr技术广泛用于分子遗传标记种质资源鉴定等方面，目前ssr分子标记技术用于黑色茶花杂种鉴定还未见报道。


技术实现要素：

3.本发明目的在于提供一种用于黑色茶花杂种鉴定的ssr标记引物，该引物重复性好、特异性强。
4.本发明目的按如下技术方案实现：一种用于黑色茶花杂种鉴定的ssr标记引物，所述引物为（如seq id no.1～6所示）：引物编号：ssr31，上游引物：5
′‑ꢀ
caaggcagagtaggctgagg
ꢀ‑3′
，下游引物：5
′‑ꢀ
aaaagggaaggggaaagtca
ꢀ‑3′
，重复单元：(agc)7，片段大小：212～273；引物编号：ssr48，上游引物：5
′‑ꢀ
gttggaggtttttcagccac
ꢀ‑3′
，下游引物：5
′‑ꢀ
attgaaagtcgctgcttcgt
ꢀ‑3′
，重复单元：(ccg)7，片段大小：249～300；引物编号：ssr250，上游引物：5
′‑ꢀ
acctccagcttccatcagaa
ꢀ‑3′
，下游引物：5
′‑ꢀ
atcttgacgggcgtaacatc
ꢀ‑3′
，重复单元：(ccg)5，片段大小：261～315；鉴定黑色茶花杂种的方法，具体步骤如下：步骤1，dna提取： 将黑色茶花杂种及其亲本叶片加液氮研磨后提取dna，分光光度计检测dna浓度和纯度，0.8%琼脂糖凝胶电泳检测dna质量；步骤2，ssr扩增：利用本发明ssr引物，以黑色茶花杂种及其杂交亲本dna为模板进行ssr扩增；步骤3，对扩增产物采用qsep100全自动核酸蛋白分析系统进行电泳分离检测和片段大小测定。步骤4，对电泳结果分析：对ssr检测结果进行峰图分析及等位基因的读取和分析，根据峰值图，检测到黑色茶花杂种具有母本及父本扩增谱带，尤其具有父本特异扩增谱带，据此判断其为真杂种。
5.具体地，步骤1中提取dna是按北京艾德莱生物科技有限公司ctab植物基因组dna快速提取试剂盒的提取方法提取；采用分光光度计（美国thermo 公司）检测dna浓度和纯
度。
6.具体地，步骤2中ssr扩增反应在veriti 96-well thermal cycler（thermo fisher scientific）上进行。 步骤2中25 μl反应体系：含100 ng的模板dna 1.5 μl，2
×
tsingke master mix 12.5 μl，10 mmol
·
l-1引物2 μl，超纯水9 μ。pcr扩增程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35个循环；72 ℃延伸9 min。
7.本发明具有如下有益效果：本发明利用ssr分子标记技术对黑色茶花杂种进行了有效鉴定，明确了黑色茶花杂种与亲本遗传变异的关系，对黑色茶花杂种后代进行快速鉴定和早期选择，可实现筛选并创制黑色茶花新种质。同时，本发明ssr标记重复性好、特异性强；本发明方法具有高效、成本低、鉴定周期短等优点，能够代替传统杂种鉴定的方法，具有广阔应用前景。
附图说明
8.图1黑色茶花杂种黑色茶花
‘
霍伯
’×
杜鹃红山茶及其亲本ssr扩增峰图及电泳图。
9.图2 黑色茶花杂种
‘
黑魔法
’×
杜鹃红山茶及其亲本ssr扩增峰图及电泳图。
10.图3黑色茶花杂种黑色茶花
‘
皇家天鹅绒
’×
杜鹃红山茶及其亲本ssr扩增峰图及电泳图。
11.图4
‘
霍伯’、杜鹃红山茶及其杂种
‘
霍伯
’×
杜鹃红山茶花朵形貌图。
12.图5
‘
黑魔法’、杜鹃红山茶及其杂种
‘
黑魔法
’×
杜鹃红山茶花朵形貌图。
13.图6
‘
皇家天鹅绒’、杜鹃红山茶及其杂种
‘
皇家天鹅绒
’×
杜鹃红山茶花朵形貌图。
具体实施方式
14.下面结合附图及更具体细节对本发明做更详细说明，以便充分理解本发明。但本发明能够以很多不同于此的其他方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵情况下做出类似改进，本发明不受下面公开的具体实施方式的限制。
15.鉴定黑色茶花杂种具体按步骤如下：步骤1. dna提取：叶片加液氮研磨后，按照北京艾德莱生物科技有限公司ctab植物基因组dna快速提取试剂盒的提取方法提取dna。nanodrop 2000超微量分光光度计（美国thermo 公司）检测dna浓度和纯度，0.8%琼脂糖凝胶电泳检测dna质量。
16.步骤2. ssr扩增：利用本发明ssr引物，以黑色茶花杂种杂种及其亲本dna为模板进行ssr扩增。ssr扩增反应在veriti 96-well thermal cycler（thermo fisher scientific）上进行。25 μl反应体系：含100 ng的模板dna 1.5 μl，2
×
tsingke master mix 12.5 μl，10 mmol
·
l-1
引物2 μl，超纯水9 μl。pcr扩增程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35个循环；72 ℃延伸9 min。
17.步骤3.扩增产物检测：扩增产物在qsep100全自动核酸蛋白分析系统（bioptic，inc.）上进行电泳分离检测和片段大小测定。利用qsep100软件对ssr检测结果进行峰图分析及等位基因的读取和分析。
18.步骤4.对电泳结果分析：对ssr检测结果进行峰图分析及等位基因的读取和分析，根据峰值图，检测到黑色茶花杂种具有母本及父本扩增谱带，尤其具有父本特异扩增谱带，据此判断其为真杂种。
19.步骤5.形态性状分析：对黑色茶花杂种及其亲本盛花期的花朵进行观察与统计，性状登记均按照国家标准“植物新品种特异性、一致性、稳定性测试指南山茶属”（gb/t 26911-2011）进行，依据杂交亲本及杂种的形态对杂种的真实性进行鉴定。检测到杂种出现母本不具有的父本特异性状或双亲均不具有的新性状，即判定其为真实杂种。
20.实施例1一、材料采集黑色茶花杂种
‘
霍伯
’×
杜鹃红山茶及其母本
‘
霍伯’、父本杜鹃红山茶的叶片进行dna提取及ssr扩增，对其盛花期的花朵进行观察与统计，性状登记均按照国家标准“植物新品种特异性、一致性、稳定性测试指南 山茶属”（gb/t 26911-2011）进行。
21.二、ssr分析按上述方法进行黑色茶花杂种
‘
霍伯
’×
杜鹃红山茶及其亲本的ssr分析，所用引物如下：引物编号：ssr48，上游引物：5
′‑ꢀ
gttggaggtttttcagccac
ꢀ‑3′
，下游引物：5
′‑ꢀ
attgaaagtcgctgcttcgt
ꢀ‑3′
，重复单元：(ccg)7，片段大小：249～300。
22.引物ssr48扩增黑色茶花杂种
‘
霍伯
’×
杜鹃红山茶及其亲本的结果见图1，母本
‘
霍伯’在268bp检测到特征峰、带，父本杜鹃红山茶在261bp检测到特征峰、带，杂种
‘
霍伯
’×
杜鹃红山茶分别在261bp、268bp处检测到特征峰、带，表明杂种
‘
霍伯
’×
杜鹃红山茶同时具有父母本的特征峰、带，尤其具有父本杜鹃红山茶261bp处特征峰、带（箭头所指），据此判定其为真实杂种。
23.三、形态性状分析黑色茶花杂种
‘
霍伯
’×
杜鹃红山茶及其母本
‘
霍伯’、父本杜鹃红山茶的花朵见图4，其中母本
‘
霍伯’花色为深黑红色，花型为半重瓣型；父本杜鹃红山茶花色为鲜红色，花型为单瓣型；杂种
‘
霍伯
’×
杜鹃红山茶花色为深黑红色，花型为牡丹型；杂种
‘
霍伯
’×
杜鹃红山茶具有双亲均不具备的新性状，据此判定其为真实杂种。
24.以上，综合ssr分子标记分析及形态性状分析结果，判定
‘
霍伯
’×
杜鹃红山茶为
‘
霍伯’和杜鹃红山茶的真实杂种。
25.实施例2一、材料采集黑色茶花杂种
‘
黑魔法
’×
杜鹃红山茶及其母本
‘
黑魔法’、父本杜鹃红山茶的叶片进行dna提取及ssr扩增，对其盛花期的花朵进行观察与统计，性状登记均按照国家标准“植物新品种特异性、一致性、稳定性测试指南 山茶属”（gb/t 26911-2011）进行。
26.二、ssr扩增分析 按上述方法进行黑色茶花杂种
‘
黑魔法
’×
杜鹃红山茶及其亲本的ssr分析，所用引物如下：引物编号：ssr250，上游引物：5
′‑ꢀ
acctccagcttccatcagaa
ꢀ‑3′
，下游引物：5
′‑ꢀ
atcttgacgggcgtaacatc
ꢀ‑3′
，重复单元：(ccg)5，片段大小：261～315。
27.引物ssr250扩增黑色茶花杂种
‘
黑魔法
’×
杜鹃红山茶及其亲本的结果见图2，母本
‘
黑魔法’在266bp检测到特征峰、带，父本杜鹃红山茶在279bp检测到特征峰、带，杂种
‘
黑魔法
’×
杜鹃红山茶分别在266bp、279bp处检测到特征峰、带，表明杂种
‘
黑魔法
’×
杜鹃红
山茶同时具有父母本的特征峰、带，尤其具有父本杜鹃红山茶279bp处特征峰、带（箭头所指），据此判定其为真实杂种。
28.三、形态性状分析黑色茶花杂种
‘
黑魔法
’×
杜鹃红山茶及其母本
‘
黑魔法’、父本杜鹃红山茶的花朵见图5，其中母本
‘
黑魔法’花色为深黑红色，花型为半重瓣型；父本杜鹃红山茶花色为鲜红色，花型为单瓣型；杂种
‘
黑魔法
’×
杜鹃红山茶花色为浅黑红色，花型为牡丹型；杂种
‘
黑魔法
’×
杜鹃红山茶具有双亲均不具备的新性状，据此判定其为真实杂种。
29.以上，综合ssr分子标记分析及形态性状分析结果，判定
‘
黑魔法
’×
杜鹃红山茶为
‘
黑魔法’和杜鹃红山茶的真实杂种。
30.实施例3一、材料采集黑色茶花杂种
‘
皇家天鹅绒
’×
杜鹃红山茶及其母本
‘
皇家天鹅绒’、父本杜鹃红山茶的叶片进行dna提取及ssr扩增，对其盛花期的花朵进行观察与统计，性状登记均按照国家标准“植物新品种特异性、一致性、稳定性测试指南 山茶属”（gb/t 26911-2011）进行。
31.二、ssr扩增分析 按上述方法进行黑色茶花杂种
‘
皇家天鹅绒
’×
杜鹃红山茶及其亲本的ssr分析，所用引物如下：引物编号：ssr31，上游引物：5
′‑ꢀ
caaggcagagtaggctgagg
ꢀ‑3′
，下游引物：5
′‑ꢀ
aaaagggaaggggaaagtca
ꢀ‑3′
，重复单元：(agc)7，片段大小：212～273。
32.引物ssr31扩增黑色茶花杂种
‘
皇家天鹅绒
’×
杜鹃红山茶及其亲本的结果见图3，母本
‘
皇家天鹅绒’在238bp检测到特征峰、带，父本杜鹃红山茶在217、227、238 bp检测到特征峰、带，杂种
‘
皇家天鹅绒
’×
杜鹃红山茶分别在217、227、238 bp处检测到特征峰、带，表明杂种
‘
皇家天鹅绒
’×
杜鹃红山茶同时具有父母本的特征峰、带，尤其具有父本杜鹃红山茶217、227 bp处特征峰、带（箭头所指），据此判定其为真实杂种。
33.三、形态性状分析黑色茶花杂种
‘
皇家天鹅绒
’×
杜鹃红山茶及其母本
‘
皇家天鹅绒’、父本杜鹃红山茶的花朵见图6，其中母本
‘
皇家天鹅绒’花色为深黑红色，花型为半重瓣型；父本杜鹃红山茶花色为鲜红色，花型为单瓣型；杂种
‘
皇家天鹅绒
’×
杜鹃红山茶花色为浅黑红色，花型为单瓣型；杂种
‘
皇家天鹅绒
’×
杜鹃红山茶具有父本特异性状或双亲均不具备的新性状，据此判定其为真实杂种。
34.以上，综合ssr分子标记分析及形态性状分析结果，判定
‘
皇家天鹅绒
’×
杜鹃红山茶为
‘
皇家天鹅绒’和杜鹃红山茶的真实杂种。