一种鉴定赭鹿花菌的引物组、试剂盒及其应用的制作方法

1.本发明涉及分子鉴定技术领域，特别是涉及一种鉴定赭鹿花菌的引物组、试剂盒及其应用。


背景技术：

2.有毒蘑菇是一类食用后，能让人、动物等有中毒反应甚至导致死亡的大型真菌，其产生的有毒害作用的物质称为菌物毒素。对于不同种类的有毒蘑菇，它们含有多种毒素，可导致不同的中毒症状。一旦误食赭鹿花菌(gyromitra infula)可引起溶血性疾病，早期主要症状是头痛、腹泻和恶心呕吐，两天左右可有寒战，腹部疼痛，肝脾肿大、发热以及血红蛋白尿，严重时可因为急性肾衰竭而丢失生命。因为此类蘑菇中含有马胺酸和甲基联胺，可溶解和破坏红细胞，进而引起急性溶血。赭鹿花菌中毒事件一旦发生，快速检测和鉴定赭鹿花菌对于蘑菇中毒事件的调查、中毒患者的救助就会显得尤为重要和迫切。
3.传统的检测方法，如形态鉴定法、hplc法、pcr法等不适用于经济不发达，有毒蘑菇知识短缺，设备条件有限的偏远地区，因此，迫切需要一种针对赭鹿花菌的操作简单、灵敏度高、适合基层和可现场应用的新型快速检测方法。


技术实现要素：

4.为了解决上述问题，本发明提供了一种鉴定赭鹿花菌的引物组、试剂盒及其应用。本发明提供的引物组可以特异性扩增赭鹿花菌的核酸，利用该引物组可以鉴定赭鹿花菌，且具有操作简单、灵敏度高、适合基层和可现场检测的优势。
5.为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
6.本发明提供了一种鉴定赭鹿花菌(gyromitra infula)的引物组，所述引物组包括：正向外引物f3、反向外引物b3、正向内引物f2、反向内引物b2、正向内引物f1c、反向内引物b1c和环引物lb；
7.所述正向外引物f3的核苷酸序列如seq id no.1所示；
8.所述反向外引物b3的核苷酸序列如seq id no.2所示；
9.所述正向内引物f2的核苷酸序列如seq id no.3所示；
10.所述反向内引物b2的核苷酸序列如seq id no.4所示；
11.所述正向内引物f1c的核苷酸序列如seq id no.5所示；
12.所述反向内引物b1c的核苷酸序列如seq id no.6所示；
13.所述环引物lb的核苷酸序列如seq id no.7所示。
14.本发明还提供了一种鉴定赭鹿花菌的试剂盒，所述试剂盒包括上述的引物组。
15.本发明还提供了上述引物组或上述试剂盒在鉴定待测样品是否含有赭鹿花菌中的应用。
16.本发明还提供了一种鉴定待测样品是否含有赭鹿花菌的方法，所述方法包括以下步骤：
17.以待测样品的基因组dna为模板，利用上述试剂盒进行lamp反应；
18.若得到扩增产物，则待测样品中含有赭鹿花菌；若未得到扩增产物，则待测样品中不含有赭鹿花菌。
19.优选的，所述扩增产物的判断方法包括ph指示法；
20.当ph指示剂为酚红时，则鉴定结果为：若反应结果为黄色，则待测样品含有赭鹿花菌；若反应结果为粉红色或红色，则待测样品不含赭鹿花菌。
21.优选的，所述lamp反应的体系以10μl计，包括5μl 2
×
lamp预混液，3μl引物混合液，2μl dna模板和余量ddh2o。
22.优选的，所述引物混合液中不同引物的浓度为：
23.正向外引物f3和反向外引物b3的浓度分别为0.6μmol/l；
24.正向内引物f2、反向内引物b2、正向内引物f1c和反向内引物b1c的浓度分别为4.8μmol/l；
25.环引物lb的浓度为2μmol/l。
26.优选的，所述lamp反应的温度为65℃；所述lamp反应的时间为60～90min。
27.有益效果：
28.本发明提供了一种鉴定赭鹿花菌的引物组，所述引物组包括：正向外引物f3、反向外引物b3、正向内引物f2、反向内引物b2、正向内引物f1c、反向内引物b1c和环引物lb；所述正向外引物f3的核苷酸序列如seq id no.1所示；所述反向外引物b3的核苷酸序列如seq id no.2所示；所述正向内引物f2的核苷酸序列如seq id no.3所示；所述反向内引物b2的核苷酸序列如seq id no.4所示；所述正向内引物f1c的核苷酸序列如seq id no.5所示；所述反向内引物b1c的核苷酸序列如seq id no.6所示；所述环引物lb的核苷酸序列如seq id no.7所示。本发明提供的引物组可以特异性扩增赭鹿花菌的核酸，且与容易混淆的皱柄白马鞍菌(helvella crispa)、大鹿花菌(gyromitra gigas)、粗柄马鞍菌(helvella macropus)、波地钟菌(verpa bohemica)、疣孢褐盘菌(peziza badia)和羊肚菌(morchella esculenta)，及其他大型真菌如琥珀乳牛肝菌(suillus placidus)、裂丝盖伞(inocybe rimosa)、锥鳞白鹅膏菌(amanita virgineoides)和黏盖乳牛肝菌(suillus bovinus)的核酸均无交叉反应，特异性强，利用该引物组可以鉴定赭鹿花菌。
29.进一步的，本发明提供的鉴定方法，利用上述引物组能够在90分钟内完成对赭鹿花菌的特异性鉴定，检测结果能够通过肉眼直接观察，具有操作简单、灵敏度高(检出限1ng/μl)、适合基层和可现场检测的优势。
附图说明
30.图1为实施例1筛选的引物组对不同蘑菇的检测结果；其中从左至右的样本分别为：1号管：赭鹿花菌；2号管：皱柄白马鞍菌；3号管：大鹿花菌；4号管：琥珀乳牛肝菌；5号管：裂丝盖伞；6号管：锥鳞白鹅膏；7号管：黏盖乳牛肝菌；0号管为ddh2o；
31.图2为实施例1筛选的引物组对不同蘑菇的检测结果；其中从左至右的样本分别为：1号管：赭鹿花菌；8号管：粗柄马鞍菌；9号管：波地钟菌；10号管：疣孢褐盘菌；11号管：羊肚菌；0号管为ddh2o；
32.图3为不同稀释浓度下的灵敏度检测结果；其中从左至右不同管的赭鹿花菌基因
组dna的浓度分别为：1号管10ng/μl；2号管1ng/μl；3号管0.1ng/μl；4号管0.01ng/μl；5号管1pg/μl；6号管0.1pg/μl；7号管0.01pg/μl；8号管1fg/μl；0号管为ddh2o；
33.图4为不同赭鹿花菌和赭鹿花菌混合物的反应结果；其中从左至右分别为1号管：水煮后消化的赭鹿花菌样品；2号管：水煮后消化的50wt.％赭鹿花菌 50wt.％羊肚菌；3号管：水煮后消化的10wt.％赭鹿花菌 90wt.％羊肚菌；4号管：水煮后消化的1wt.％赭鹿花菌 99wt.％羊肚菌；0号管：ddh2o；
34.图5为对比例1中对照lamp引物组对不同蘑菇的检测结果；其中从左至右不同管的样本分别为：1’号管：赭鹿花菌；2’号管：皱柄白马鞍菌；3’号管：大鹿花菌；4’号管：琥珀乳牛肝菌；0号管：ddh2o。
具体实施方式
35.本发明提供了一种鉴定赭鹿花菌的引物组，所述引物组包括：正向外引物f3、反向外引物b3、正向内引物f2、反向内引物b2、正向内引物f1c、反向内引物b1c和环引物lb；
36.所述正向外引物f3的核苷酸序列如seq id no.1所示：accataatgtgcgctgtca；
37.所述反向外引物b3的核苷酸序列如seq id no.2所示：gacgctgacgggactct；
38.所述正向内引物f2的核苷酸序列如seq id no.3所示：cacgagtcatcacgcctg；
39.所述反向内引物b2的核苷酸序列如seq id no.4所示：aactctatcccgcccccg；
40.所述正向内引物f1c的核苷酸序列如seq id no.5所示：cactccgggtggccttttgc；
41.所述反向内引物b1c的核苷酸序列如seq id no.6所示：cccccgaaacaaaactgtcggg；
42.所述环引物lb的核苷酸序列如seq id no.7所示：gggagggctgcagtgtcag。
43.本发明筛选得到的引物组可以特异性扩增赭鹿花菌的核酸，且与其形态类似的蘑菇及常见的有毒和可食蘑菇，如皱柄白马鞍菌、大鹿花菌、琥珀乳牛肝菌、裂丝盖伞、锥鳞白鹅膏菌、黏盖乳牛肝菌、粗柄马鞍菌、波地钟菌、疣孢褐盘菌和羊肚菌的核酸均无交叉反应，特异性强，利用该引物组可以有效鉴定赭鹿花菌。
44.本发明还提供了一种鉴定赭鹿花菌的试剂盒，所述试剂盒包括上述的引物组。本发明提供的试剂盒可以有效鉴定赭鹿花菌，作用原理同上，在此不再赘述。
45.本发明还提供了上述引物组或上述试剂盒在鉴定待测样品是否含有赭鹿花菌中的应用。本发明所述鉴定作用原理同上，在此不再赘述。
46.本发明还提供了一种鉴定待测样品是否含有赭鹿花菌的方法，所述方法包括以下步骤：
47.以待测样品的基因组dna为模板，利用上述试剂盒进行lamp反应；
48.若得到扩增产物，则待测样品中含有赭鹿花菌；若未得到扩增产物，则待测样品中不含有赭鹿花菌。本发明及实施例中所述鉴定待测样品是否含有赭鹿花菌优选是以非诊断为目的，仅是为了获得一个待测样品中是否含有赭鹿花菌的中间值。
49.在本发明中，所述扩增产物的判断方法优选ph指示法；
50.当ph指示剂为酚红时，则鉴定结果为：若反应结果为黄色，则待测样品含有赭鹿花菌；若反应结果为粉红色或红色，则待测样品不含赭鹿花菌。本发明对扩增产物的判断方法没有具体限定，实施例中优选以ph指示法为例进行说明，但是不能仅将其认定为本发明的
全部保护范围。
51.本发明优选采用显色法进行结果的判断，显色法能够通过肉眼直接观察，可用于现场快速检测。
52.在本发明中，所述lamp反应的体系优选以10μl计，包括5μl 2
×
lamp预混液，3μl引物混合液，2μl dna模板和余量ddh2o；所述2
×
lamp预混液优选购自new england biolabs，美国，含有：氯化钾50mmol/l，硫酸铵10mmol/l，七水硫酸镁3mmol/l，tween-200.1％，100μmol/l酚红染料，0.8μl ntps(10mmol/l)，0.1μl bst 2.0warmstarttm dna聚合酶(8u/μl)。
53.在本发明中，所述引物混合液中不同引物的浓度优选为：
54.正向外引物f3和反向外引物b3的浓度分别为0.6μmol/l；
55.正向内引物f2、反向内引物b2、正向内引物f1c和反向内引物b1c的浓度分别为4.8μmol/l；
56.环引物lb的浓度为2μmol/l。
57.在本发明中，所述lamp反应的温度优选为65℃；所述lamp反应的时间优选为60～90min，更优选为90min。
58.本发明提供的方法具有准确、灵敏、快速、低成本和可视化的特点，能够在90分钟内完成对赭鹿花菌的特异性鉴定；其也具有较高的灵敏度，检出限达到1ng/μl；检测结果能够通过肉眼直接观察，可用于现场快速检测。
59.为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的一种鉴定赭鹿花菌的引物组、试剂盒及其应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
60.实施例1
61.lamp引物设计及筛选
62.首先从ncbi genbank数据库共下载10个赭鹿花菌its序列(mz567199.1、mg846961.1、mg846962.1、mg846960.1、mg846959.1、mg846958.1、mg846957.1、mg846956.1、mg846955.1和mg846954.1)，经同源序列比对，选择赭鹿花菌的种内保守区段作为引物设计区域。
63.为保证引物的特异性，再将赭鹿花菌物种与4种赭鹿花菌近源物种的its序列(its序列为mz567191.1的gyromitra esculenta、its序列为mh938663.1的gyromitra gigas、its序列为mt373905.1的gyromitra ambigua和its序列为mz667895.1的gyromitra brunnea)进行多重序列比对，寻找特异性区间作为引物结合位点(以mg846960.1为例，选择的引物设计区域为1～171位点)。
64.选择上述4种赭鹿花菌的近源物种以及皱柄白马鞍菌、琥珀乳牛肝菌、裂丝盖伞、锥鳞白鹅膏菌、黏盖乳牛肝菌、粗柄马鞍菌、羊肚菌、波地钟菌和疣孢褐盘菌作为背景引物组设计特异性引物序列，筛选得到的引物组为：正向外引物f3、反向外引物b3、正向内引物f2、反向内引物b2、正向内引物f1c、反向内引物b1c和环引物lb；
65.所述正向外引物f3的核苷酸序列如seq id no.1所示；
66.所述反向外引物b3的核苷酸序列如seq id no.2所示；
67.所述正向内引物f2的核苷酸序列如seq id no.3所示；
68.所述反向内引物b2的核苷酸序列如seq id no.4所示；
69.所述正向内引物f1c的核苷酸序列如seq id no.5所示；
70.所述反向内引物b1c的核苷酸序列如seq id no.6所示；
71.所述环引物lb的核苷酸序列如seq id no.7所示。
72.实施例2
73.引物组的特异性检测
74.为检测实施例1筛选得到的引物组的特异性，将设置一个阳性对照(赭鹿花菌)，10个阴性对照(与赭鹿花菌形态类似的蘑菇及常见的有毒和可食蘑菇)和一个空白对照(ddh2o)，分组及检测结果见表1。dna的提取采用dna secure新型植物基因组dna提取试剂盒(tiangen，中国)进行。
75.lamp反应总体系10μl，包含：5μl lamp预混液(2
×
)[购自new england biolabs，美国，含有：氯化钾50mmol/l，硫酸铵10mmol/l，七水硫酸镁3mmol/l，tween-200.1％，100μmol/l酚红染料，0.8μl ntps(10mmol/l)，0.1μl bst 2.0warmstarttm dna聚合酶(8u/μl)]，3μl引物混合液[正向外引物f3和反向外引物b3的浓度分别为0.6μmol/l；正向内引物f2、反向内引物b2、正向内引物f1c和反向内引物b1c的浓度分别为4.8μmol/l；环引物lb的浓度为2μmol/l]，2μl dna模板，用ddh2o补足至10μl。lamp反应于pcr热循环仪中在65℃的温度下恒温进行，反应时长90min。
[0076]
反应阶段结束后，将反应管放在白纸上，根据反应管中反应液的颜色判断反应结果。若反应管中的反应液为黄色，则判断为阳性，即待测样品含有赭鹿花菌成分；若反应管中的反应液为粉红色或红色，则判断为阴性，即待测样品中不含有赭鹿花菌成分。检测结果见表1、图1和图2。
[0077]
表1不同分组及lamp检测结果
[0078]
编号物种名采集地lamp结果1赭鹿花菌黑龙江，中国 2皱柄白马鞍菌贵州，中国—3大鹿花菌吉林，中国—4琥珀乳牛肝菌贵州，中国—5裂丝盖伞贵州，中国—6锥鳞白鹅膏云南，中国—7黏盖乳牛肝菌云南，中国—8粗柄马鞍菌新疆，中国—9波地钟菌吉林，中国—10疣孢褐盘菌黑龙江，中国—11羊肚菌吉林，中国—0ddh2o —
[0079]
注：“ ”为阳性，“—”为阴性。
[0080]
由表1、图1和图2可知，本发明筛选得到的引物组可以特异性扩增赭鹿花菌的核酸，且与其形态类似的蘑菇及常见的有毒和可食蘑菇，如皱柄白马鞍菌、大鹿花菌、琥珀乳牛肝菌、裂丝盖伞、锥鳞白鹅膏菌、黏盖乳牛肝菌、粗柄马鞍菌、波地钟菌、疣孢褐盘菌和羊肚菌的核酸均无交叉反应，特异性强，利用该引物组可以有效鉴定赭鹿花菌。
[0081]
实施例3
[0082]
实施例1筛选得到的lamp引物组的灵敏性检测
[0083]
通过分光光度计检测dna纯度与浓度，并将赭鹿花菌基因组dna从10ng/μl至1fg/μl进行10倍系列稀释，进行lamp反应(反应体系和反应程序同实施例2)，观察反应结束后反应液颜色，实验结果见图3和表2。
[0084]
表2赭鹿花菌的lamp引物组灵敏度检测结果
[0085][0086][0087]
注：“ ”为阳性，“—”为阴性。
[0088]
由图3和表2可知，1号和2号管的反应液为黄色，可见本发明提供的引物组的检出限浓度为1ng/μl，远低于许多传统的检测方法，足以满足实际的检测需求，具有较高的灵敏度。
[0089]
实施例4
[0090]
实施例1筛选得到的lamp引物组的适用性检测
[0091]
考虑到在实际应用中，人们在食用蘑菇前通常预先对其进行加工(如煮熟)，且在临床实践中，通常需要对蘑菇中毒患者的呕吐物或粪便进行检测。因此，为了验证筛选得到的引物组在实际检测的可行性，我们将发泡后的蘑菇样品进行煮沸和消化处理后进行了lamp检测，具体方法如下：
[0092]
首先将发泡过后赭鹿花菌和羊肚菌按照质量比1：1、1：9和1：99分别混合，制成赭鹿花菌混合物；然后将赭鹿花菌和赭鹿花菌混合物分别在100℃的水中煮10min；将水煮后的赭鹿花菌和赭鹿花菌混合物于人造胃液中于37℃孵育4h(人工胃液由0.05g氯化钾，0.42g氯化钠和0.32g胃蛋白酶组成，用100ml水定容，然后用1mol/l盐酸将ph调节至3.0)，进行dna提取和lamp反应(具体方法同实施例2)，观察反应结束后反应液颜色，结果见图4和表3。
[0093]
表3赭鹿花菌lamp引物组适用性检测结果
[0094]
编号水煮后消化的样品lamp结果1赭鹿花菌 250％赭鹿花菌 50％羊肚菌 310％赭鹿花菌 90％羊肚菌 41％赭鹿花菌 99％羊肚菌 0ddh2o—
[0095]
注：“ ”为阳性，“—”为阴性。
[0096]
由图4和表3可知，除空白对照外，所有样品均发生阳性反应，说明本发明实施例1筛选的引物组可从经水煮后消化的单一和混合蘑菇样品(赭鹿花菌可检测出的含量低至1wt.％)检测到赭鹿花菌。可见，本发明提供的引物组及其lamp检测方法具有较高的实用性，适合基层和现场检测(本发明所述的检测是以非诊断为目的，仅是为了获得一个待测样品中是否含有赭鹿花菌的中间值)。
[0097]
对比例1
[0098]
一种与实施例1相似的方法，筛选得到的引物组如表4所示。
[0099]
表4用于赭鹿花菌lamp检测的引物对照组
[0100]
引物序列5'-3'seq idg.mol-f3’gtccacctgaaacacaacaseq id no.8g.mol-f2’caccaaactgcagtcagaseq id no.9g.mol-f1c’ccaagagatccgttgttgaaagttseq id no.10g.mol-b3’ttcccgcatcgatgaagaacgseq id no.11g.mol-b2’atgattcactgaattctgcaaseq id no.12g.mol-b1c’tgtgcgttcaaagattcgseq id no.13g.mol-lb’gcgaaatgcgataagtaatgtgaaseq id no.14
[0101]
采用表4中的对照lamp引物组重复实施例2的方法，检测不同种蘑菇(赭鹿花菌、皱柄白马鞍菌、大鹿花菌和琥珀乳牛肝菌)的dna，结果见图5和表5。
[0102]
表5不同蘑菇及lamp检测结果
[0103]
编号物种名采集地lamp结果1’赭鹿花菌黑龙江，中国 2’皱柄白马鞍菌贵州，中国 3’大鹿花菌吉林，中国 4’琥珀乳牛肝菌贵州，中国—0ddh2o —
[0104]
注：“ ”为阳性，“—”为阴性。
[0105]
由图5和表5可知，采用对照lamp引物组特异性较差，可以扩增出赭鹿花菌外的其他非靶标物种(1’、2’、3’号管反应液为黄色，待测样品分别是赭鹿花菌、皱柄白马鞍菌和大鹿花菌)。
[0106]
综上所述，本发明提供的赭鹿花菌lamp引物组和检测方法具有准确、灵敏、快速、低成本和可视化的特点，能够在90分钟内完成对赭鹿花菌的特异性鉴定；其也具有较高的灵敏度，检出限达到1ng/μl；检测结果能够通过肉眼直接观察，可用于现场快速检测。其可应用于蘑菇中毒的预防和快速准确地检测中毒事件中的有毒蘑菇是否含有赭鹿花菌，对中毒后的针对性治疗和诊断具有重要意义。可用于在临床治疗和法医学分析。
[0107]
虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可以做各种改动和修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。