一株发酵毕赤酵母Z9Y-3及其果酒增香酿造工艺的制作方法

一株发酵毕赤酵母z9y-3及其果酒增香酿造工艺
技术领域
1.本发明涉及葡萄酒、果酒酿造技术领域，具体涉及一株发酵毕赤酵母z9y-3及其果酒增香酿造工艺。


背景技术：

2.长期以来我国葡萄酒酿造技术照搬欧美酿造技术标准，加之酿酒葡萄几乎全部引种自欧美国家，导致我国大部分葡萄酒产品同质化严重，典型果香和风味不突出。此外，我国其他水果酿造技术单一，照搬葡萄酒发酵技术，使用商业酿酒酵母进行单一的酒精发酵，产品质量普遍不高，尤其是水果的典型香气较弱，缺乏市场竞争力。
3.香气是果酒产品质量的重要评价方面，也是其风味典型性的主要体现方面。发酵果酒中的香气物质种类繁多，目前仪器检测出的葡萄酒、果酒中的挥发性物质约有1000种。然而，不是所有挥发性成分都能呈现出香气，只有那些含量超过其嗅觉阈值的物质才能被人体嗅觉器官感知，科学家用气味活性值来评价挥发性物质的呈香潜力。气味活性值(odor activity value,oav)，即物质浓度与嗅觉阈值的比值。嗅觉阈值是某物质在溶液中被品评员嗅觉感知的最小浓度。根据oav值及其香气特征，品种香气物质中萜烯类、c
13-去甲类异戊二烯是葡萄酒典型香气特征的重要组成物质，这两类香气成分通常有着较低的嗅觉阈值，因而能够显著影响果酒的香气特征。品种香气物质主要来源于果酒、水果浆果中不具有挥发性的糖苷类香气物质，这些糖苷类物质可以在各种糖苷水解酶的作用下释放出活性香气成分。果酒中糖苷酶通常来自发酵过程中的各种酿酒微生物，如酿酒酵母所产糖苷酶的活性低、对葡萄酒酿造环境的耐受性较低，同时该酵母发酵性能的一致性使葡萄酒的品种特征和区域典型性下降。发酵香气物质中酯类物质是果酒中果香的重要贡献成分，主要的果香酯类物质有乙酸乙酯、乙酸异丁酯、乙酸异戊酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯、苯乙酸乙酯和乙酸苯乙酯。在果酒酒精发酵过程中果香酯类物质的最终浓度取决于酶促合成和酯酶水解反应的平衡，因此酒精发酵过程中由酿酒微生物释放的酯酶、酯合成酶酶活会影响葡萄酒中果香酯类物质含量。
4.目前，研究发现，非酿酒酵母能够分泌活性更高和耐受性更强的糖苷水解酶，并且该类酵母参与的混菌发酵对增加葡萄酒的香气复杂度有很大贡献。此外，有研究者提出利用优选非酿酒酵母与酿酒酵母混菌发酵可以显著促进酒精发酵过程中酯酶、酯合成酶酶活，并提高葡萄酒中果香类香气物质的含量。并且，在酿酒酵母单一发酵不同阶段添加优选酵母风味酶提取液可以增强果酒花香和果香香气特征。


技术实现要素：

5.本发明提供一株发酵毕赤酵母z9y-3及其果酒增香酿造工艺，通过将一株优选发酵毕赤酵母(pichia fermentans)z9y-3及其风味酶提取液分别应用于果酒发酵过程中，促进了品种香气物质的释放，提高了果香香气物质的生成，增强果酒中果香和花香香气特征。
6.为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：一株发酵毕赤酵母z9y-3，其特征在
于：所述的发酵毕赤酵母(pichia fermentans)z9y-3于2019年10月28日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc no：m2019857。
7.一株发酵毕赤酵母z9y-3果酒增香酿造工艺步骤为：
8.1)发酵毕赤酵母z9y-3菌株的复壮、扩大培养及其发酵培养；
9.将优选发酵毕赤酵母z9y-3的干粉/甘油保藏液接种于5ml～10ml yepd培养基中，接种量为106cfu/ml，在28℃恒温培养箱中活化24～48小时，接着将活化培养液以体积比为10％接种量接种于50～100ml yepd培养基中，于摇床中28℃180rpm/min扩大培养24～48小时；接着将扩大培养后的发酵毕赤酵母z9y-3以体积比为10％的接种量接种于发酵培养基中，在28℃、180r/min条件下发酵培养72～96小时；
10.2)发酵毕赤酵母z9y-3风味酶的提取
11.将发酵培养好的毕赤酵母z9y-3菌液置于细胞破碎仪中，利用玻璃珠在65hz条件下对酵母细胞进行破碎30min，接着以转速为8000rpm/min在离心机中离心15min，取上清液，上清液通过peg 2000透析袋进行浓缩，得到发酵毕赤酵母风味酶提取液；
12.3)发酵毕赤酵母z9y-3的风味酶应用于果酒增香酿造；
13.取成熟的水果，低温快速除梗破碎，在破碎的同时添加50mg/l so2，随后添加20mg/l果胶酶，果醪4℃条件下冷浸渍24h，随后接种106cfu/ml商业酿酒酵母，在酒精发酵旺盛期，启动发酵0-48后添加步骤2)中酵母风味酶提取液，发酵温度控制在20～25℃，酒精发酵期间，若果汁含糖量不足，在发酵旺盛期添加蔗糖至目标酒度达11
±
1％vol；通过添加酒石酸增酸或碳酸钙降酸的方法，调整发酵汁含酸量在5-8g/l，每天监测温度和比重，并压皮渣帽浸入果汁，促进浸渍，待比重降至1.015左右进行分离皮渣，继续监控果醪发酵温度和比重，待比重降到降至0.992～0.996，检测还原糖，当含量低于2g/l，说明发酵至干，分离上部清酒入干净罐中，同时加入60mg/l左右的so2，终止发酵，满罐密封贮藏，温度保持在15℃左右，随后进行果酒常规的澄清稳定工艺。
14.一株发酵毕赤酵母z9y-3果酒增香酿造工艺步骤为：
15.1)发酵毕赤酵母z9y-3菌株的复壮、扩大培养；
16.将优选发酵毕赤酵母z9y-3的干粉/甘油保藏液接种于yepd培养基中，接种量为106cfu/ml，在28℃恒温培养箱中活化24～48小时，接着将活化培养液以体积比为10％接种量接种于50～100ml yepd培养基中，于摇床中28℃180rpm/min扩大培养24～48小时；
17.2)发酵毕赤酵母z9y-3在酒精发酵过程中的增香
18.取成熟的水果，低温快速除梗破碎，在破碎的同时添加50mg/l so2，随后添加20mg/l果胶酶，果醪4℃条件下冷浸渍24h，果醪回温后同时接种发酵毕赤酵母z9y-3的扩大培养液(106cfu/ml)和酿酒酵母(106cfu/ml)，发酵温度控制在20～25℃，酒精发酵期间，若果汁含糖量不足，在发酵旺盛期添加白砂糖至目标酒度达11
±
1％vol；通过添加酒石酸增酸或碳酸钙降酸的方法，调整发酵汁含酸量在5-8g/l，每天监测温度和比重，并压皮渣帽浸入果汁，促进果皮的浸渍，待比重降至1.015左右进行分离皮渣，继续监控果醪发酵温度和比重，待比重降至0.992～0.996，检测还原糖，当含量低于2g/l后，分离上部清酒入干净罐中，同时加入60mg/l左右的so2，终止发酵，满罐密封贮藏，温度保持在15℃左右，随后进行果酒常规的澄清稳定工艺。
19.进一步，水果含糖量≥150g/l，以葡萄糖计；含酸量≥4g/l，以酒石酸计。
20.与现有技术相比，本发明具有如下优点和效果：
21.1)本发明发酵毕赤酵母z9y-3可以高产糖苷酶、酯酶、酯合成酶等风味酶，促进果酒中萜烯类物质以及果香酯类物质的生成，增强葡萄酒的果香和花香香气特征，提高葡萄酒的质量；
22.2)本发明针对风味酶的底物特异性，利用不同底物对酶活进行检测，操作方法简单，检测结果准确；
23.3)本发明将发酵毕赤酵母z9y-3及其风味酶提取液分别应用于果酒酒精发酵过程中，不仅促进品种香气物质的释放，也提高了果香酯类物质的生成，有助于果酒香气轮廓的塑造，进一步提高果酒品质。
附图说明
24.图1为本发明的技术流程图；
25.图2为发酵毕赤酵母菌株wl培养基菌落形态(28℃，72h)和细胞显微形态(10
×
100倍)；
26.图3酒精发酵过程中c2-c10酯酶酶活累积量变化；图中
△
sc:酿酒酵母单一发酵；
▲
es1:发酵0小时添加酵母风味酶提取物；
■
es2:发酵48小时添加酵母风味酶提取物；
●
es3:酒精发酵120添加酵母酵母风味酶提取物；
○
sp:酿酒酵母与毕赤酵母混菌发酵；
27.图4酒精发酵过程中c2-c10酯合成酶酶活累积量变化，图中(
△
sc:酿酒酵母单一发酵；
▲
es1:发酵0小时添加酵母风味酶提取物；
■
es2:发酵48小时添加酵母风味酶提取物；
●
es3:
具体实施方式
28.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图和实施例对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
29.本发明发酵毕赤酵母(pichia fermentans)z9y-3于2019年10月28日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc no：m2019857，是从四川白酒酒窖中筛选得到，与其他酿酒酵母相比，发酵毕赤酵母z9y-3能够分泌更高的糖苷酶酶活，尤其是β-d-葡萄糖苷酶酶活，对酿酒环境的耐受性更强，能够促进品种香气物质的释放。同时，将发酵毕赤酵母z9y-3与酿酒酵母以不同接种比例进行混菌发酵，或在酿酒酵母单一发酵不同阶段添加z9y-3风味酶提取液提高了酯酶以及酯合成酶酶活累积量，促进了果香酯类物质的生成，增强果酒果香香气特征。
30.本发明人工筛选的优良发酵毕赤酵母z9y-3菌株如图2(a)所示，在yepd培养基中28℃培养48h，取菌液稀释制成临时装片用于显微镜观察，如图所示，发酵毕赤酵母细胞呈柠檬形或棒状，其大小为(2.7～5.3)
×
(2.8～6.4)μm，在显微镜下观察，发酵毕赤酵母细胞单个或成对出现，大多数为出芽繁殖，未观察到子囊孢子。如图2(b)所示，该菌株在wlan培养基上菌落呈圆形，边缘全缘不整齐，表面不光滑有凸起，切面隆起，有明显产膜现象，易于挑起。同时该菌株具有较高糖苷酶、酯酶、酯合成酶酶活，是量产果香酯类物质的潜力菌株。
31.实施例一：
32.本发明发酵毕赤酵母z9y-3果酒增香酿造工艺步骤为：
33.1)发酵毕赤酵母z9y-3菌株的复壮、扩大培养及其发酵培养；
34.将优选发酵毕赤酵母z9y-3的干粉/甘油保藏液接种于5ml yepd培养基中，接种量为106cfu/ml，在28℃恒温培养箱中活化48小时，接着将活化培养液以10％接种量(v/v)接种于100ml yepd培养基中，于摇床中28℃180rpm/min扩大培养24小时；接着将扩大培养后的发酵毕赤酵母z9y-3以10％(v/v)的接种量接种于发酵培养基中，在28℃、180r/min条件下发酵培养72小时；
35.2)发酵毕赤酵母z9y-3风味酶的提取
36.在5ml离心管中加入2ml发酵毕赤酵母z9y-3发酵培养液和2ml 0.45mm玻璃珠，将其置于细胞破碎仪中，在65hz条件下对酵母细胞进行破碎30min，细胞破碎时每破碎3min，在冰上冰浴30s，整个操作重复10次直至细胞破碎率达到95％以上，接着在4℃下以转速为8000rpm/min在离心机中离心15min后取上清液，上清液通过peg 2000透析袋进行浓缩，体积浓缩20倍得到发酵毕赤酵母风味酶提取液。利用紫外分光光度计和气相色谱质谱联用仪(gc-ms)分别测定糖苷酶、酯酶以及酯合成酶酶活；
37.3)发酵毕赤酵母z9y-3的风味酶应用于果酒增香酿造；
38.取成熟的葡萄，低温快速除梗破碎，在破碎的同时添加50mg/l so2，随后添加20mg/l果胶酶，果醪4℃条件下冷浸渍24h，随后接种106cfu/ml商业酿酒酵母，在酒精发酵旺盛期，启动发酵0-48后添加步骤2)中酵母风味酶提取液(按10mu/ml糖苷酶或酯酶酶活)，发酵温度控制在20～25℃，酒精发酵期间，若果汁含糖量不足，在发酵旺盛期添加蔗糖至目标酒度达11
±
1％vol；通过添加酒石酸增酸或碳酸钙降酸的方法，调整发酵汁含酸量在5-8g/l，每天监测温度和比重，并压皮渣帽浸入果汁，促进浸渍，待比重降至1.015左右进行分离皮渣，继续监控果醪发酵温度和比重，待比重降到降至0.992～0.996，检测还原糖，当含量低于2g/l，说明发酵至干，分离上部清酒入干净罐中，同时加入60mg/l左右的so2，终止发酵，满罐密封贮藏，温度保持在15℃左右，随后进行果酒常规的澄清稳定工艺。
39.实施例二：
40.本发明非酿酒酵母z9y-3果酒增香酿造工艺步骤为：
41.1)发酵毕赤酵母z9y-3菌株的复壮、扩大培养；
42.发酵毕赤酵母z9y-3菌株的复壮、扩大培养及其发酵培养：将优选发酵毕赤酵母z9y-3的干粉/甘油保藏液接种于5ml yepd培养基中，接种量为106cfu/ml，在28℃恒温培养箱中活化48小时，接着将活化培养液以10％接种量(v/v)接种于100ml yepd培养基中，于摇床中28℃180rpm/min扩大培养24小时；
43.2)发酵毕赤酵母z9y-3在酒精发酵过程中的增香
44.取成熟的葡萄，低温快速除梗破碎，在破碎的同时添加50mg/l so2，随后添加20mg/l果胶酶，果醪4℃条件下冷浸渍24h，果醪回温后同时接种106cfu/ml发酵毕赤酵母z9y-3的扩大培养液和106cfu/ml商业酿酒酵母，发酵温度控制在20～25℃，酒精发酵期间，若果汁含糖量不足，在发酵旺盛期添加白砂糖至目标酒度达11
±
1％vol；通过添加酒石酸增酸或碳酸钙降酸的方法，调整发酵汁含酸量在5-8g/l，每天监测温度和比重，并压皮渣帽浸入果汁，促进果皮的浸渍，待比重降至1.015左右进行分离皮渣，继续监控果醪发酵温度和比重，待比重降至0.992～0.996，检测还原糖，当含量低于2g/l后，分离上部清酒入干净
罐中，同时加入60mg/l左右的so2，终止发酵，满罐密封贮藏，温度保持在15℃左右，随后进行果酒常规的澄清稳定工艺。
45.上述两个实施例中水果含糖量≥150g/l，以葡萄糖计；含酸量≥4g/l，以酒石酸计。
46.本实验前期利用紫外分光光度计和gc-ms测定了发酵毕赤酵母和酿酒酵母中不同风味酶酶活，如表1所示：
47.表1发酵毕赤酵母和酿酒酵母中不同风味酶酶活(mu/ml)
[0048][0049][0050]
数据结果显示，发酵毕赤酵母所产的β-d-葡萄糖苷酶( 68％)和α-l-阿拉伯糖苷酶( 128％)会显著高于酿酒酵母，尤其是β-d-葡萄糖苷酶，它被认为是葡萄酒中非挥发性香气物质水解的关键酶。因此，优选发酵毕赤酵母是一株高产糖苷酶的酵母，应用于果酒发酵可以显著促进品种香气物质的释放，提高葡萄酒香气的馥郁度。酵母中酯酶酶活会显著高于酯合成酶酶活，并且发酵毕赤酵母z9y-3中c2酯酶( 32％)、c4酯酶( 5％)、c6酯酶( 4％)酶活会高于酿酒酵母，尤其是c2酯酶酶活；而z9y-3中酯合成酶酶活都高于酿酒酵母，其中c2酯合成酶( 118％)、c8酯合成酶( 92％)和c10酯合成酶( 389％)酶活呈现显著差异。
[0051]
表2发酵毕赤酵母及其风味酶提取物分别与酿酒酵母混菌发酵品种香气含量(mg/l)
[0052]
[0053][0054]
实验前期以爱格丽葡萄汁为原料，将发酵毕赤酵母z9y-3、z9y-3风味酶提取物分别与酿酒酵母进行发酵。利用spme-gc-ms检测葡萄酒中品种香气物质含量(表2)。由表2可知，品种香气物质主要包括c6化合物、萜烯类和c13-去甲类异戊二烯类物质，与酿酒酵母单一发酵相比，发酵毕赤酵母z9y-3、z9y-3风味酶提取物分别和酿酒酵母混合发酵都可以显著促进品种香气化合物中萜烯类和c6化合物的释放。其中萜烯类含量分别提高14％和37％，c6化合物含量分别提高2％和19％，且在酿酒酵母单一发酵过程中添加z9y-3风味酶提取物对两大类化合物的促进作用会大于z9y-3与酿酒酵母混菌发酵效果。但z9y-3及其风味酶提取物对于c13-去甲类异戊二烯前体的水解作用不明显，其游离态香气物质含量会低于酿酒酵母单一发酵。总体来说，发酵毕赤酵母z9y-3、z9y-3风味酶提取物应用于果酒发酵可以促进果酒品种香气的释放，增强果酒花香和果香香气特征。
[0055]
表3发酵毕赤酵母及其风味酶提取物分别与酿酒酵母混菌发酵挥发性发酵香气含量(mg/l)
[0056]
[0057][0058]
接着以模拟葡萄汁作为原料，将发酵毕赤酵母z9y-3及其风味酶提取物分别与酿酒酵母进行发酵，发酵过程中利用紫外分光光度计和气相色谱质谱联用仪(gc-ms)分别监测了酯酶、酯合成酶酶活变化，并根据其酶活累积量绘制了变化曲线(如图3、图4所示)。由图3可知，c2-c10酯酶酶活累积量的范围为90-160u，这要显著高于图4中酯合成酶酶活累积量(6-70u)。与酿酒酵母单一发酵相比，发酵毕赤酵母与酿酒酵母混菌发酵可以显著促进c2，c4，c6酯酶以及c2酯合成酶酶活，提高比例分别为28.18％,7.67％,116.77％,59.94％。并且添加发酵毕赤酵母风味酶提取物后，c2、c4、c6、c8酯酶和c2酯合成酶的累积活性分别提高了5.74％、71.29％、91.19％、35.83％和48.93％。利用spme-gc-ms检测模拟葡萄汁中挥发性发酵香气物质含量(表3)，由数据结果可知，酿酒酵母单一发酵乙酸乙酯和乙酸高级醇酯的生成量分别为24.3mg/l和1.7mg/l，酵毕赤酵母与酿酒酵母混菌发酵二者含量分别为28.9mg/l和3.4mg/l，混菌发酵显著促进了乙酸酯的生成，且乙酸高级醇酯产量翻了一倍。且在不同时间添加酵母风味酶提取物都提高了乙酸酯的含量，在0小时添加酵母风味酶提取物中乙酸高级醇含量最高(3.5mg/l)，说明在酒精发酵过程中添加发酵毕赤酵母风味酶提取物对于提高乙酸酯含量可以与混菌发酵达到同样的效果。
[0059]
对于脂肪酸乙酯来说，短链脂肪酸乙酯在不同处理之间无明显差异，混和发酵对于短链脂肪酸乙酯的生成没有明显的促进作用，而混菌发酵中链脂肪酸乙酯含量为7.3mg/l，酿酒酵母单一发酵其含量为6.8mg/l，混菌发酵也促进了中链脂肪酸乙酯的生成。同时，发酵不同阶段加入发酵毕赤酵母风味酶提取物也有利于乙酸乙酯、乙酸高级醇酯以及中链脂肪酸乙酯的生成。数据结果表明，将优选发酵毕赤酵母及其风味酶应用于酒精发酵过程中，不仅可以显著促进品种香气化合物释放，而且有利于果香酯类物质的生成，提高葡萄酒
果香香气特征和香气质量。
[0060]
进一步通过pearson相关性分析可知(表4)，不同酯酶、酯合成酶酶活与果香酯类物质之间的关系存在差异。c2、c4、c6酯酶与果香酯类物质之间呈现显著正相关关系，而c8、c10酯酶与乙酸酯、短链脂肪酸乙酯为负相关，总酯酶酶活与中链脂肪酸乙酯呈现显著正相关关系，说明酯酶酶活的提高有利于果香酯类物质的生成，尤其是中链脂肪酸乙酯(0.473**)。果香酯类物质与不同碳链长度的酯合成酶酶活之间的相关性没有其与酯酶之间的相关性显著，酯合成酶酶活与所有果香酯类物质之间都是正相关，与短链脂肪酸乙酯和中链脂肪酸乙酯的相关系数分别为0.429*，0.375*，为显著正相关。因此，不论是混菌发酵还是在发酵过程中添加酵母风味酶提取物都可以促进酯酶、酯合成酶酶活，从而促进了乙酸乙酯、乙酸高级醇酯、脂肪酸乙酯等果香酯类物质的生成，增强果酒果香香气特征。
[0061]
表4不同酯酶、酯合成酶酶活与果香酯类物质之间的pearson相关系数
[0062]
影响因子乙酸乙酯乙酸高级醇酯短链脂肪酸乙酯中链脂肪酸乙酯c
2-酯酶0.419
*
0.392
*
0.3550.334c
4-酯酶0.421
*
0.454
*
0.522
**
0.567
**c6-酯酶0.3480.422
*
0.1960.449
*c8-酯酶-0.007-0.144-0.0160.259c
10-酯酶0.081-0.131-0.0080.317总酯酶酶活0.3400.3040.3540.473
**c2-酯合成酶0.365
*
0.2270.0830.209c
4-酯合成酶0.1910.1880.2070.267c
6-酯合成酶0.2920.3300.3000.258c
8-酯合成酶0.3450.3540.455
*
0.403
*c10-酯合成酶0.3300.3510.487
**
0.386
*
总酯合成酶酶活0.3230.3450.429
*
0.375
*
[0063]
本发明中果酒香气贡献物质的检测方法参考kong,li,jin,zhu,and tao(2019)，品种香气物质和发酵挥发性物质的含量利用spme-gc-ms进行检测。发酵毕赤酵母z9y-3作为一株高产糖苷酶酶活的非酿酒酵母，与酿酒酵母混菌发酵可以促进品种香气物质的释放，且在酒精发酵过程中可以提高酯酶、酯合成酶等风味酶酶活，进一步有利于果香酯类物质的生成。在酿酒酵母单一发酵过程中添加其风味酶提取物也可以显著提高乙酸乙酯、乙酸高级醇酯、短链脂肪酸乙酯以及中链脂肪酸乙酯的生成，增强果酒香气特征。因此，将发酵毕赤酵母z9y-3或z9y-3风味酶提取液应用于果酒发酵上的酿造工艺对增强果酒果香、花香香气特征有效。
[0064]
以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，并非用于限定本发明的保护范围。