一种与门基因电路及获取该与门基因电路的方法与流程

1.本发明涉及基因工程技术领域，具体而言，涉及一种与门基因电路及获取该与门基因电路的方法。


背景技术：

2.随着基因工程技术和细胞生物学方面的不断发展，人类可以完整认识生命过程并加以预测甚至精细控制，并进一步使得合成生物学开始迅速发展。基因电路作为合成生物学研究的领域之一，通过设计和构建生命体中不存在的生物组件和系统，有助于解决癌症、基因缺陷等问题。在基因工程中，往往涉及使用多个启动子，以分别启动不同的功能区。
3.但随着启动子的日益复杂化，多种启动子联用时常常会出现相互干扰导致无法正常工作的情况，而spcas9或sacas9均是基于dna层面进行编辑，它们的基因片段大小均大于3000bp。在临床基因治疗时，因为片段过长，导致治疗载体aav病毒必须分开装配，执行效率较低。因此，亟待提供一种较为高效的基因电路，能够实现测试两种启动子是否互相干扰的功能。


技术实现要素：

4.本发明的目的是提供一种与门基因电路及获取与门基因电路的方法，以至少部分地解决上述的技术问题。
5.根据本发明的一个方面，提供一种与门基因电路，包括依次连接的第一端序列、引导序列和第二端序列；
6.所述第一端序列至少包括依次连接的casrx-c端序列和第一启动子；
7.所述引导序列至少包括依次连接的引导启动子和grna序列，所述引导启动子为h1启动子或u6启动子，所述引导启动子的上游端与所述第一启动子的下游端相连；
8.所述第二端序列至少包括依次连接的第二启动子和casrx-n端序列，所述第二启动子的上游端与所述grna序列的下游端相连；
9.所述casrx-c端序列与所述casrx-n端序列均由casrx的编码基因于拆分位点分拆得到，所述拆分位点位于所述casrx的氨基酸序列的三维预测结构的二级结构铰链区。
10.优选地，所述第一启动子与所述第二启动子均为ef1a-core双向启动子。
11.优选地，所述第一启动子为ef1a-core启动子，所述第二启动子为tac启动子。
12.优选地，在所述casrx-c端序列远离所述第一启动子的上游端，还连接有c端序列荧光蛋白序列；
13.在所述第二启动子和所述casrx-n端序列之间，还连接有n端序列荧光蛋白序列。
14.优选地，在所述casrx-c端序列和所述第一启动子之间，还连接有如seq id no.5所示的c端序列intein序列。
15.优选地，所述第一端序列至少包括依次连接的所述第一启动子、所述c端序列intein序列、所述casrx-c端序列、gggs蛋白序列、所述c端序列荧光蛋白序列、nls蛋白序列
和3'utr段。
16.优选地，在所述casrx-n端序列远离所述n端序列荧光蛋白序列的一端，还连接有n端序列intein序列。
17.优选地，所述第二端序列至少包括依次连接的所述引导启动子、所述grna序列、所述第二启动子、nls蛋白序列、所述n端序列荧光蛋白序列、gggs蛋白序列、所述casrx-n端序列、所述n端序列intein序列和3'utr段。
18.优选地，所述3'utr段内均设置有mirna位点。
19.本发明还提供一种所述与门基因电路的方法,包括下列步骤：
20.步骤1：基于casrx的氨基酸序列，获取所述casrx的三维预测结构；
21.步骤2：在所述三维预测结构的二级结构铰链区，选取拆分位点；
22.步骤3：在所述拆分位点分拆所述casrx的编码基因，得到casrx-c端序列和casrx-n端序列；
23.步骤4：获取第一启动子和第二启动子，在所述casrx-c端序列的上游端连接所述第一启动子，得到第一端序列；
24.在所述casrx-n端序列的下游端连接所述第二启动子，得到第二端序列；
25.获取grna序列和引导启动子，将所述grna序列的上游端和所述引导启动子的下游端相连，得到引导序列，所述引导启动子为h1启动子或u6启动子；
26.步骤5：将所述第一端序列的第一启动子的下游端与所述引导序列的引导启动子的上游端相连，将所述第二端序列的第二启动子的上游端与所述grna序列的下游端相连，即得到与门基因电路。本发明基于casrx的氨基酸序列，通过三维预测结构确定拆分位点，并在分拆得到的casrx-c端序列和casrx-n端序列上分别分别连接有第一启动子和第二启动子，得到第一端序列和第二端序列，并连接有包含grna序列和引导启动子的引导序列，这样通过第一端序列、第二端序列和引导序列，即可得到与门基因电路。casrx蛋白已报告在哺乳动物细胞中具有高效的靶向能力且极低的脱靶效应。这样通过对该与门基因电路进行表达得到的改性casrx，当第一启动子与第二启动子为不同的启动子时，则可以利用类似与门电路的特点，只有在两个启动子能够正常发挥功能前提条件下，重新融合后的casrx才能发挥基因编辑效应，从而可以快速判断两种启动子是否互相干扰。
附图说明
27.通过阅读参照以下附图所作的对非限制性实施例的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
28.图1是根据本发明的获取与门基因电路的方法的示意图；
29.图2是根据本发明的第一端序列的示意图；
30.图3是根据本发明的引导序列的示意图；
31.图4是根据本发明的第二端序列的示意图。
具体实施方式
32.下面结合附图和实施例对本发明作进一步的详细说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施例仅用于解释相关发明，而非对该发明的限定。为了便于描述，附图中仅示出
了与发明相关的部分。
33.需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
34.目前，基于spcas9或sacas9的蛋白分割技术已被用于开发可编程的基因转录表达控制电路构建。但是，spcas9或sacas9均是基于dna层面进行编辑，它们的基因片段大小均大于3000bp，实际临床基因治疗运用时，因为片段过长，导致治疗载体aav病毒必须分开装配，执行效率较低；且它们的向导grna存在pam设定限制，且grna长度被设定为20bp,极易出现脱靶现象，造成较大的临床基因治疗安全风险。而casrx的分割蛋白技术尚未见报道，casrx基因片段长度仅2898bp，靶向mrna且其向导grna无pam区域限制，其pre-sgrna长度可以设定为30bp，脱靶几率极低。因此，基于特定细胞状态casrx分割-重新合并的split-casrx与门基因电路系统将极大促进生物医学研究的进一步发展。
35.本技术实施例中的与门基因电路，是指构建在基因电路上的两个启动子均能正常工作时，才能使表达得到的casrx正常工作，发挥基因编辑功能，如使被感染的细胞携带荧光蛋白等。只有一个启动子能够正常工作是无法使casrx发挥基因编辑功能的。
36.本技术实施例中的casrx，是指根据文献：transcriptome engineering with rna-targeting type vi-d crispr effectors(konermann s,lotfy p,brideau n j,et al.transcriptome engineering with rna-targeting type vi-d crispr effectors[j].cell,2018,173(3):665-676.e14.)中所记载的蛋白序列，是一种较为有效的靶向rna的基因编辑工具，本技术中casrx蛋白的氨基酸序列如seq id no.1所示，具体如下：
[0037]
seq id no.1:miekkksfakgmgvkstlvsgskvymttfaegsdarlekivegdsirsvnegeafsaemadknagykignakfshpkgyavvannplytgpvqqdmlglketlekryfgesadgndniciqvihnildiekilaeyitnaayavnnisgldkdiigfgkfstvytydefkdpehhraafnnndklinaikaqydefdnfldnprlgyfgqaffskegrnyiinygnecydilallsglrhwvvhnneeesrisrtwlynldknldneyistlnylydritneltnsfsknsaanvnyiaetlginpaefaeqyfrfsimkeqknlgfnitklrevmldrkdmseirknhkvfdsirtkvytmmdfviyryyieedakvaaankslpdnekslsekdifvinlrgsfnddqkdalyydeanriwrklenimhnikefrgnktreykkkdaprlprilpagrdvsafsklmyaltmfldgkeindllttlinkfdniqsflkvmpligvnakfveeyaffkdsakiadelrliksfarmgepiadarramyidairilgtnlsydelkaladtfsldengnklkkgkhgmrnfiinnvisnkrfhylirygdpahlheiakneavvkfvlgriadiqkkqgqngknqidryyetcigkdkgksvsekvdaltkiitgmnydqfdkkrsviedtgrenaerekfkkiislyltviyhilknivninaryvigfhcverdaqlykekgydinlkkleekgfssvtklcagidetapdkrkdvekemaerakesidslesanpklyanyikysdekkaeeftrqinrekaktalnaylrntkwnviiredllridnktctlfrnkavhlevaryvhayindiaevnsyfqlyhyimqriimneryekssgkvseyfdavndekkyndrllkllcvpfgyciprfknlsiealfdrneaakfdkekkkvsgns。
[0038]
在本技术实施例中，所使用的术语“连接”是指，执行常规功能的核酸表达调控序列与编码目的基因的核酸序列的功能性连接(functional linkage)。
[0039]
例如，当在拆分得到的casrx-n端序列的一端连接启动子时，casrx-n端序列的表达可处于启动子的影响或调控之下。当启动子的基因序列与casrx-n端序列之间的连接特性不诱导移码突变，且在表达调控序列不抑制核酶的表达时，则可以认为完成了本技术实施例中的“连接”。可使用本领域公知的基因重组技术来实现该“连接”过程，并且可以采用本领域公知的酶来进行位点特异性dna的切割和连接。
[0040]
本技术实施例中的荧光蛋白，可以选自萤光素酶(luciferase)、绿色荧光蛋白(gfp)、修饰型绿色荧光蛋白(modified green fluorescent protein，mgfp)、增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescentprotein，egfp)、红色荧光蛋白(rfp)、修饰型红色荧光蛋白(modified red fluorescent protein，mrfp)、增强型红色荧光蛋白(erfp)、蓝色荧光蛋白(bfp)、增强型蓝色荧光蛋白(ebfp)、黄色荧光蛋白(yfp)、增型黄色荧光蛋白(eyfp)、青色荧光蛋白(cfp)或增强型青色荧光蛋白(ecfp)等，但不限于此。通过将荧光蛋白插入于casrx的序列中，可以通过观察判断是否存在被编辑的基因。对于本领域技术人员来说，可以理解的是，可用这种方法来判断casrx是否正常发挥基因编辑的功能。
[0041]
本发明所用的术语“microrna”(或
″
mirna
″
)具有其在本领域中的普通含义。因此，“microrna”表示来自遗传基因位点的rna分子，其从可以形成局部rna前体mirna结构的转录物加工而来。成熟mirna通常长度为20、21、22、23、24或25个核苷酸，尽管其它数目的核苷酸也可存在，例如18、19、26或27个核苷酸。
[0042]
本技术中，mirna编码序列具有与侧翼基因组序列配对的潜力，使成熟mirna放置在非完全配对的rna双链体之内，所述双链体作为从更长的前体转录物进行mirna加工的中间体。这一加工典型地通过分别称为drosha和dicer的两种特定的内切核酸酶的连续作用而发生。drosha从初级转录物产生典型地折叠成发夹或茎-环结构的mirna前体。采用dicer方法切割这个mirna前体可以得到mirna双链体，其发夹或茎-环结构的一条臂包含成熟mirna，另一条臂包含类似大小的节段。所述的mirna随后被引导到其靶mrna以发挥其功能，而mirna被降解。另外，mirna典型地衍生自与预测的蛋白质编码区不同的基因组节段。
[0043]
本技术中，基于casrx的氨基酸序列获取与该氨基酸序列对应的三维预测结构的具体方法可以是使用如swissmodel等在线模拟网站，也可以是基于相似的结构作为模板，对相似的模板进行修改得到等多种方式，基于casrx的氨基酸序列得到casrx的三维预测结构主要是为了便于执行寻找拆分位点的处理。
[0044]
通过上述三维预测结构即可清楚地获知其二级结构的铰链区位于何处。这里的二级结构，主要是指在蛋白质的多肽链中有规则重复的构象，限于主链原子的局部空间排列，不包括与肽链其他区段的相互关系及侧链构象。二级结构主要有α-螺旋、β-折叠、β-转角。常见的二级结构有α-螺旋和β-折叠。二级结构是通过骨架上的羰基和酰胺基团之间形成的氢键维持的，氢键是稳定二级结构的主要作用力。铰链区主要是指在二级结构上包括h链间二硫键、不形成α-螺旋、易发生伸展及一定程度的转动的区域。
[0045]
申请人发现，在casrx二级结构的铰链区选取拆分位点，所获得的重构的casrx能够保持较好的基因编辑功能稳定性，例如选取casrx的二级结构铰链区第439位赖氨酸与第440位苏氨酸之间作为拆分位点，根据本领域技术人员的常识，基于氨基酸序列所确定的拆分位点是能够在基因序列上准确定位的，这样就可以基于该拆分位点对casrx的基因序列进行准确拆分，得到casrx-c端序列和casrx-n端序列。在将自二级铰链区对应的拆分位点拆分得到的casrx-c端序列和casrx-n端序列与其他编码序列连接后，重新连接并表达得到的重构的casrx能够保持较好的基因编辑功能稳定性。
[0046]
本发明实施例中的casrx-c端序列和casrx-n端序列，是指自拆分得到的以羧基结尾的casrx氨基酸序列片段和以氨基结尾的casrx氨基酸序列片段，对应的casrx-c端序列和casrx-n端序列则为对应的基因序列。
[0047]
本发明实施例提供一种与门基因电路，包括依次连接的第一端序列、引导序列和第二端序列，如图1所示，第一端序列至少包括依次连接的casrx-c端序列、第一启动子；引导序列至少包括依次连接的引导启动子和grna序列，引导启动子为h1启动子或u6启动子，引导启动子与第一启动子相连；第二端序列至少包括第二启动子和casrx-n端序列，第二启动子与引导rna序列相连；casrx-c端序列与casrx-n端序列由casrx的编码基因于拆分位点分拆得到，拆分位点位于casrx的氨基酸序列的三维预测结构的二级结构铰链区。
[0048]
上述的h1启动子的序列的一种实现方式的序列如seq id no.2所示，具体如下：
[0049]
seq id no.2:ttatagggagctgaagggaagggggtcacagtaggtggcatcgttcctttctgactgcccgccccccgcatgccgtcccgcgatattgagctccgaacctctcgccctgccgccgccggtgctccgtcgccgccgcgccgccatggaattcgaacgctgacgtcatcaacccgctccaaggaatcgcgggcccagtgtcactaggcgggaacacccagcgcgcgtgcgccctggcaggaagatggctgtgagggacaggggagtggcgccctgcaatatttgcatgtcgctatgtgttctgggaaatcaccataaacgtgaaatgtctttggatttgggaatcttataagttctgtatgagaccactctttcccatagggcggagggaagctcatcagtggggccacgagctgagtgcgtcctgtcactccactcccatgtcccttgggaaggtctgagactagggccagaggcggccctaacagggctctccctgagcttcggggaggtgagttcccagagaacggggctccgcgcgag。
[0050]
上述的u6启动子的序列的一种实现方式的序列如seq id no.3所示，具体如下：
[0051]
seq id no.3:gatccgacgccgccatctctaggcccgcgccggccccctcgcacagacttgtgggagaagctcggctactcccctgccccggttaatttgcatataatatttcctagtaactatagaggcttaatgtgcgataaaagacagataatctgttctttttaatactagctacattttacatgataggcttggatttctataagagatacaaatactaaattattattttaaaaaacagcacaaaaggaaactcaccctaactgtaaagtaattgtgtgttttgagactataaatatcccttggagaaaagccttgttt。
[0052]
本发明基于casrx的氨基酸序列，通过三维预测结构确定拆分位点，并在分拆得到的casrx-c端序列和casrx-n端序列上分别分别连接有第一启动子和第二启动子，得到第一端序列和第二端序列，并连接有包含grna序列和引导启动子的引导序列，这样通过第一端序列、第二端序列和引导序列，即可得到与门基因电路。casrx蛋白已报告在哺乳动物细胞中具有高效的靶向能力且极低的脱靶效应。这样通过对该与门基因电路进行表达得到的改性casrx，当第一启动子与第二启动子为不同的启动子时，则可以利用类似与门电路的特点，只有在两个启动子能够正常发挥功能前提条件下，重新融合后的casrx才能发挥基因编辑效应，从而可以快速判断两种启动子是否互相干扰。
[0053]
优选地，如图1所示，第一启动子与第二启动子均为ef1a-core启动子，其一种实现方式的序列如seq id no.4所示，具体如下：
[0054]
seq id no.4:cactgaggtggagaagagcat。
[0055]
申请人经过实验探究发现，使用ef1a-core启动子，可以在保证启动效率的情况下有效缩短启动子的长度。将第一启动子和第二启动子设置为已探明功效的ef1a-core启动子，可以在需要根据具体需求改变拆分位点时方便地判断新的拆分位点是否符合需求，并能够降低整个与门基因电路的长度。本技术中的ef1a-core启动子，是指将ef1a启动子去掉上游和下游的序列，只保留其核心的部分编码序列，这样可以在不过度影响启动效率的同时降低序列长度。
[0056]
在另一种实现方式中，第一启动子与第二启动子不相同。这样通过对该与门基因
电路进行表达得到的改性casrx，当第一启动子与第二启动子为不同的启动子时，则可以利用类似与门电路的特点，只有在两个启动子能够正常发挥功能前提条件下，重新融合后的casrx才能发挥基因编辑效应，从而可以快速判断两种启动子是否互相干扰。例如将第一启动子设置为上述的ef1a-core启动子，第二启动子设置为tac启动子，若表达得到的改性casrx无法发挥基因编辑效应，则说明ef1a-core启动子与tac启动子无法正常协同工作。
[0057]
如图1所示，在casrx-c端序列远离第一启动子的一端，还连接有c端序列荧光蛋白序列；在第二启动子和casrx-n端序列之间连接有n端序列荧光蛋白序列。这样可以快速地观察到基因编辑是否成功。
[0058]
作为一种优选的实现方式，在第一启动子和casrx-c端序列之间，还连接有c端序列intein序列。其具体可以是，第一端序列的序列至少包括依次连接的第一启动子、c端序列intein序列、casrx-c端序列、gggs蛋白序列、c端序列荧光蛋白序列、nls蛋白序列、3'utr段。
[0059]
c端intein序列的一种实现方式的序列如seq id no.5所示，具体如下：
[0060]
seq id no.5：atgatcaagatcgccacacggaagtacctgggcaagcagaacgtgtacgacatcggcgtgggcgagcctcacaatttcgccctgaagaacggctttatcgccagcaac。
[0061]
作为一种优选的实现方式，在casrx-n端序列远离n端序列荧光蛋白序列的一端，还连接有n端序列intein序列。其具体可以是，第二端序列的序列至少包括依次连接的：引导启动子、grna序列、第二启动子、nls蛋白序列、n端序列荧光蛋白序列、gggs蛋白序列、casrx-n端序列、n端序列intein序列、3'utr段。
[0062]
n端intein序列的一种实现方式的序列如seq id no.6所示，具体如下：
[0063]
seq id no.6：tgcctgagctacgagacagagatcctgaccgtggaatacggcctgctgcctatcggcaagatcgtggaaaagcggatcgagtgcaccgtgtacagcgtggacaacaacggcaacatctacacccagcctgtggctcagtggcacgacagaggcgagcaagaggtgttcgagtactgcctggaagatggcagcctgatcagagccaccaaggaccacaagttcatgacagtggacggccagatgctgcccatcgacgagattttcgagcgcgagctggacctgatgagagtggacaacctgcctaactga。
[0064]
上述的gggs蛋白序列可以是3倍gggs蛋白序列，也可以是单倍gggs蛋白序列等，本技术对gggs蛋白序列的具体设置方式不作过多限制，能够满足正常表达的功能即可。
[0065]
优选地，3'utr段内设置有mirna位点。因此，只有在2个启动子能够正常发挥功能前提条件下，本技术所提供的改性casrx能够根据发挥下游的基因编辑效应，方便研究人员分析待研究启动子的功能，当该待研究启动子具备某种特定细胞功能时，使得grna及重新融合后的casrx产生后续生物效应以报告这种启动子具备该种功能。
[0066]
根据本发明的另一反面，本技术实施例提供一种获取与门基因电路的方法,包括下列步骤:
[0067]
步骤1：基于casrx的氨基酸序列，获取casrx的三维预测结构；
[0068]
步骤2：在三维预测结构的二级结构铰链区，选取拆分位点；
[0069]
步骤3：在拆分位点分拆casrx的编码基因，得到casrx-c端序列和casrx-n端序列；
[0070]
步骤4：获取第一启动子和第二启动子，在casrx-c端序列的一端连接c端序列荧光蛋白序列，并将casrx-c端序列的另一端与第一启动子相连，得到第一端序列；
[0071]
在casrx-n端序列通过n端序列荧光蛋白序列并连接第二启动子，得到第二端序
列；
[0072]
获取grna序列和引导启动子，连接grna序列和引导启动子，得到引导序列，引导启动子为h1启动子或u6启动子；
[0073]
步骤5：将第一端序列的第一启动子与引导序列的引导启动子相连，将第二端序列的第二启动子与grna序列相连，得到与门基因电路。
[0074]
在步骤1中，基于casrx的氨基酸序列获取与该氨基酸序列对应的三维预测结构的具体方法可以是使用如swissmodel等在线模拟网站，也可以是基于相似的结构作为模板，对相似的模板进行修改得到等多种方式，基于casrx的氨基酸序列得到casrx的三维预测结构主要是为了便于执行寻找拆分位点的处理。
[0075]
在步骤2中，申请人发现，在casrx二级结构的铰链区选取拆分位点，所获得的重构的casrx能够保持较好的基因编辑功能稳定性，例如选取casrx的二级结构铰链区第439位赖氨酸与第440位苏氨酸之间作为拆分位点，根据本领域技术人员的常识，基于氨基酸序列所确定的拆分位点是能够在基因序列上准确定位的，这样就可以基于该拆分位点对casrx的基因序列进行准确拆分，得到casrx-c端序列和casrx-n端序列。在将自二级铰链区对应的拆分位点拆分得到的casrx-c端序列和casrx-n端序列与其他编码序列连接后，重新连接并表达得到的重构的casrx能够保持较好的基因编辑功能稳定性。
[0076]
在步骤3中，可以是先制备casrx的基因序列并在分拆位点进行分拆，并进行后续步骤的进一步基因合成，也可以是casrx-c端序列和casrx-n端序列相互独立合成。步骤3中的在拆分位点分拆casrx的编码基因主要是所得到的第一端序列和第二端序列中的casrx-c端序列和casrx-n端序列之间的断点为步骤2中所得到的分拆位点。
[0077]
步骤4及步骤5中的连接过程在上文中已经进行了叙述，其具体连接操作为本领域技术人员的常用技术手段，此处不过多赘述。
[0078]
实施例
[0079]
材料
[0080]
细胞：
[0081]
hek293t细胞系，由中科院上海细胞生物研究所究所提供。
[0082]
药品及试剂：
[0083]
洛斯维-1640(rpmi－1640)培养基及胎牛血清(fbs)，购自美国gibco公司。
[0084]
doxycycline(盐酸强力霉素),规格：10mm/ml，批号：id0390-10mm*1ml(inwater)，供应商：索莱宝。
[0085]
质粒合成自通用生物(安徽)，分类器质粒骨架均使用swb-blasticidin慢病毒骨架,合成启动子载体骨架使用swp-puromycin。
[0086]
lipofectamine 3000,规格：1ml，批号：l3000015，供应商：thermalfisher。
[0087]
慢病毒包装试剂盒，规格：100ml，批号：gm-040801-100，供应商：吉满生物。
[0088]
opti-mem培养基,规格：100ml，批号：31985-062，供应商：北京中生瑞泰科技有限公司。
[0089]
仪器：
[0090]
cx41倒置相差显微镜和bx51荧光显微镜，均购自日本olympus公司；dtx880酶联免疫检测仪，购自美国beckman公司；751gd紫外分光光度计，购自杭州汇尔仪器有限公司；
cytoflex流式细胞仪，购自贝克曼库尔特国际贸易(上海)有限公司。
[0091]
实验例1：
[0092]
基因合成图3中的基因结构，并通过gibson assembly法将该基因片段整合到dna 3.1的质粒骨架上，并通过invitrogen lipofecta mine 3000将整合好的质粒转染进hek293t细胞中,3天后，在莱卡荧光共聚焦显微镜下观察是否有mvenus荧光表达(mvenus荧光共聚焦参数，exλ:515,emλ:527)。
[0093]
gibson assembly操作步骤：gibson assembly反应体系10μl:其中pcdna 3.1载体骨架3μl，casrx蛋白分割蛋白克隆片段1μl，混合酶6μl，50℃反应20min。
[0094]
invitrogen lipofectamine 3000转染操作步骤：
[0095]
1、细胞汇合度至70％时转染；
[0096]
2、使用opti-mem培养基稀释lipofectamine 3000,充分混匀；
[0097]
3、使用opti-mem培养基稀释质粒dna,制备质粒dna预混液，然后添加p3000试剂，充分混合；
[0098]
4、在每管已稀释的lipofectamine 3000试剂中加入稀释的dna(1:1体积比例)。
[0099]
5、室温孵育15分钟；
[0100]
6、加入质粒dna-lipofectamine 3000复合物至细胞中；
[0101]
7、37度孵育细胞2-4天。观察mvenus荧光表达。1、细胞汇合度至70％时转染；
[0102]
2、使用opti-mem
tm
培养基稀释lipofectamine 3000,充分混匀；
[0103]
3、使用opti-mem
tm
培养基稀释质粒dna,制备质粒dna预混液，然后添加p3000
tm
试剂，充分混合；
[0104]
4、在每管已稀释的lipofectamine 3000试剂中加入稀释的dna(1:1体积比例)。
[0105]
5、室温孵育15分钟；
[0106]
6、加入质粒dna-lipofectamine 3000复合物至细胞中；
[0107]
7、37度孵育细胞2-4天。观察mvenus荧光表达。
[0108]
通过bd流式分选仪,提取mvenus阳性表达的hek293t细胞的mrna，使用takara primescript
tm
反转录试剂盒，将提取的mrna反转录成cdna,再通过tb green premix ex taq ii(tli rnaseh plus)试剂盒，在abi定量pcr仪上对c-myc及sox3基因的表达丰度进行计算分析。其结果如下表1所示：
[0109]
表1
[0110][0111]
[0112]
该结果说明，casrx分拆并重新合并后仍然具有显著的rna干扰效应。
[0113]
实施例2：
[0114]
使用合成启动子：第一启动子、第二启动子及mirna 1、mirna 2的casrx分拆合并基因电路对a549细胞中myc、sox3的基因表达产生了显著敲低作用:
[0115]
1、细胞汇合度至70％时转染；
[0116]
2、使用opti-mem
tm
培养基稀释lipofectamine 3000,充分混匀；
[0117]
3、使用opti-mem
tm
培养基稀释质粒dna,制备质粒dna预混液，然后添加p3000
tm
试剂，充分混合；
[0118]
4、在每管已稀释的lipofectamine 3000
tm
试剂中加入稀释的dna(1:1体积比例)。
[0119]
5、室温孵育15分钟；
[0120]
6、加入质粒dna-lipofectamine 3000
tm
复合物至细胞中；
[0121]
7、37度孵育细胞2-4天。观察mvenus荧光表达。
[0122]
通过bd流式分选仪,提取mvenus阳性表达的hek293t细胞的mrna，使用takara primescript
tm
反转录试剂盒，将提取的mrna反转录成cdna,再通过tbgreen premix ex taq ii(tli rnaseh plus)试剂盒，在abi定量pcr仪上对c-myc及sox3基因的表达丰度进行计算分析。如表2所示。
[0123]
第一启动子的序列如seq id no.7所示，具体如下：
[0124]
seq id no.7:tttgcataacaaaggagatttgcataacaaaggtcgtttgcataacaaagggactttgcataacaaaggctatttgcataacaaaggacttttgcataacaaaggtgctttgcataacaaagggta。
[0125]
第二启动子的序列如seq id no.8所示，具体如下：
[0126]
seq id no.8:atttgcataacaaaggaagaatttgcataacaaaggatcgatttgcataacaaaggagacatttgcataacaaaggactaatttgcataacaaaggaactatttgcataacaaaggatgc。
[0127]
mirna 1的序列如seq id no.9所示，具体如下：
[0128]
seq id no.9:aggatctacactggctactgag。
[0129]
mirna 2的序列如seq id no.10所示，具体如下：
[0130]
seq id no.10:ccaaacactgctgggtaagacg。
[0131]
表2
[0132][0133]
该结果说明，casrx分拆并重新合并后仍然具有显著的rna干扰效应且与特定启动子、mirna构成的与门基因电路有较好的不同细胞区分功能。
[0134]
以上描述仅为本技术的较佳实施例以及对所运用技术原理的说明。本领域技术人员应当理解，本技术中所涉及的发明范围，并不限于上述技术特征的特定组合而成的技术方案，同时也应涵盖在不脱离发明构思的情况下，由上述技术特征或其等同特征进行任意组合而形成的其它技术方案。例如上述特征与本技术中公开的(但不限于)具有类似功能的技术特征进行互相替换而形成的技术方案。