一种抑制肺癌细胞增殖的多肽的制作方法

1.本发明涉及多肽药物技术领域，具体为一种抑制肺癌细胞增殖的多肽。


背景技术：

2.鸡贫血病毒(cav)由于其可引起贫血和免疫抑制，也被称为凋亡素，其由121个氨基酸组成，分子量14kd。凋亡素诱导肿瘤细胞凋亡不依赖于p53，并对bc1-2具有拮抗性。由于p53突变和bc1-2高表达是肿瘤细胞对化疗药物产生耐药性重要原因。凋亡素可靶向性诱导肿瘤细胞凋亡，同时不会对正常细胞产生凋亡作用。凋亡素此种特殊的靶向诱导肿瘤细胞凋亡作用使得其为抗癌药物应用带来了巨大希望。
3.凋亡素在人类肿瘤和转化细胞中特异性诱导细胞凋亡，而在正常、未转化细胞中不会诱导细胞凋亡。凋亡素诱导人类肿瘤细胞凋亡的能力与凋亡素在细胞中定位密切相关。凋亡素包含一个功能性的二分型核定位信号(nuclear localization signal,nls)，nls1位于82-88位氨基酸，nls2位于111-121位氨基酸。凋亡素是通过nls的介导下被转运到细胞核中。已知nls2缺失导致凋亡素扩散定位于整个肿瘤细胞胞质中，而极少部分存在于细胞核中，故nls2缺失会导致凋亡素核定位的减少，nls2参与核靶向。已知当nls1中(kkrsc)突变为丙氨酸，凋亡素仅表现出小部分核定位障碍，并在细胞质中形成聚集体。这一发现圆满的揭示了nls1和nls2确实是相互依赖的，它们的功能一致，而凋亡素在肿瘤细胞的核定位中发挥主导作用的是nls2。
4.lrs富含亮氨酸的序列存在于凋亡蛋白的33和46氨基酸之间，凋亡素与细胞核中尚未确定的蛋白质的关联被认为是阻止核输出机制进入这个lrs；这将导致细胞核滞留和细胞死亡。同时，这个富含亮氨酸的区域减少了正常和转化细胞系中凋亡素的核积累。这表明lrs并不帮助细胞核输出，相反，它增强了细胞核内凋亡素的存在。
5.凋亡素作为鸡贫血蛋白的致病病毒，与人体组织细胞成分不同，具有异物性，易刺激机体产生免疫反应。而当其分子量越大，抗原性则越强，引起人体的免疫反应越强烈。且大分子量的物质可长期停留在机体内，有充足时间与免疫细胞接触，引起强烈免疫反应，而小分子量物质则易被机体排出体外，引起的免疫反应程度较低。由于大分子量物质引起的免疫程度较高，给药剂量相对降低，也存在无法达到有效药物浓度的不良后果。根据本发明发明人的前期研究结果，如能删减或替换凋亡素某些序列，降低其分子量，将提高机体用药的安全性，降低机体对其产生的免疫反应的同时使其浓度达到有效的药物浓度，降低合成生产成本。


技术实现要素：

6.鉴于现有技术中所存在的问题，本发明公开了一种抑制肺癌细胞增殖的多肽，该多肽能够促肺癌细胞凋亡；该凋亡素组合肽在抗肺癌药物中的用途；采用的技术方案是，包括(1)凋亡素111-121位的一个核定位信号，核定位信号确保组合肽进人细胞核，诱导肿瘤细胞凋亡；确定凋亡素111-121位的核定位序号，凋亡素111-121氨基酸(nls2)先前已被证
实为核定位序列，可介导凋亡素进入细胞核，nls2发挥核定位中的主导作用；
7.(2)凋亡素33-36的疏水氨基酸富含区，将该序列置于核定位信号与转导肽之间；凋亡素33-46位的亮氨酸富含区(lrs)能促进核定位信号寡聚体，增强凋亡素于细胞核内的聚集，提高核定位信号于热休克蛋白元件结合的能力，将33-46亮氨酸富含区连接于tat与核定位信号nls2之间，通过抑制肿瘤细胞的核输出能力，促进核定位信号寡聚体的聚合；
8.(3)转导肽，在凋亡素核定位信号和疏水区序列组成的多肽氨基端连接转导肽，保证凋亡素能穿过细胞膜进入细胞质。
9.本发明的有益效果：本发明通过cck8实验证明凋亡素组合肽对h460细胞增殖具有抑制作用；通过克隆实验证明所述凋亡素组合肽对h460细胞的克隆具有抑制作用；随着凋亡素组合肽的浓度升高，细胞克隆能力下降。由核染实验证明，凋亡素组合肽对细胞凋亡具有促进作用，加入凋亡素组合肽的组别出现明显凋亡小体；流式细胞术检测证明凋亡素组合肽对h460细胞凋亡具有促进作用。
附图说明
10.图1为本发明不同浓度凋亡素组合肽诱导h460细胞24小时抑制增殖结果之图一；
11.图2为本发明正常培养、不同浓度凋亡素组合肽诱导h460细胞24小时结果；
12.图3为本发明正常培养、不同浓度凋亡素组合肽诱导h460细胞24小时结果；
13.图4为本发明正常培养、不同浓度凋亡素组合肽诱导h460细胞48小时结果；
14.图5为本发明正常培养、不同浓度凋亡素组合肽诱导h460细胞24小时凋亡实验结果；
15.图6为本发明不同浓度凋亡素组合肽诱导h460细胞24小时抑制增殖结果之图二。
具体实施方式
16.实施例1
17.实施cck8实验检测凋亡素组合肽抑制肺癌细胞增殖，检测结果如图1和图6所示。
18.1、细胞培养：
19.h460细胞是贴壁生长细胞，培养方法同普通贴壁细胞。
20.在10cm培养皿加8ml(含9％fbs、1％双抗)1640培养液，观察细胞贴满底壁且状态良好，加入1ml pbs洗贴壁细一次。
21.按1ml/板加0.25％胰酶消化液覆盖细胞面后弃去多余消化液，细胞消化30-60s时，镜下观察细胞变圆变亮。
22.加入(含9％fbs、1％双抗)的1640培养液终止消化，2ml培养液/板，进行1000r/min离心5分钟。弃掉上清液，加入1ml(含9％fbs、1％双抗)1640培养液，进行吹打。取500μl细胞悬液，加入11.5ml(含9％fbs、1％双抗)1640培养液，吹打均匀。按100μl细胞悬液/孔铺96孔板。
23.放入37℃的co2孵箱培养待其贴壁(次日即可贴壁)后加药。
24.2、加药
25.向96孔板中加入100μl不同浓度组(浓度梯度分别为60μl/ml、80μl/ml、100μl/ml、120μl/ml、140μl/ml、160μl/ml、200μl/ml)的ml-33号肽，以及pbs组，在培养箱孵育24h。
26.除去培养基，加入pbs100μl/孔和cck-8(beijing solarbio)10μl/孔。将96孔板在培养箱内孵育1h。
27.酶标仪(i3x/美国molecular devices)测定在450nm处的吸光度。
28.cck8检测h460细胞增殖活力结果，如图1所示。
29.graphpad prism 8计算出ic50＝104。
30.cck8实验结果显示，ml-33肽对h460细胞有抑制增殖作用。随着横坐标药物浓度对数值升高h460细胞存活率降低、药物对细胞增殖抑制率升高。以pbs为对照组，随着药物浓度升高，细胞存活率降低，在浓度为60μl/ml时细胞存活率为71.11％，在浓度为80μl/ml时细胞存活率为64.91％，在浓度为100μl/ml时细胞存活率为58.87％，在浓度为120μl/ml时细胞存活率为38.84％，在浓度为140μl/ml时细胞存活率为37.15％，在浓度为160μl/ml时细胞存活率为28.26％，在浓度为200μl/ml时细胞存活率为20.82％。
31.实施例2
32.实施平板克隆实验检测凋亡素组合肽抑制肺癌细胞克隆，检测结果如图2所示。
33.常规培养h460细胞，以1000个细胞/孔接种于六孔板。
34.用含有9％fbs的1640培养液培养2周，出现肉眼可见的细胞集团。
35.将培养液吸出，用4％的多聚甲醛固定15分钟。
36.吸出多聚甲醛，加入1ml的吉姆萨染液(phygene life sciences company)进行染色15分钟。
37.吸出吉姆萨染液(phygene life sciences company)，最后结果拍照记录。
38.实施例3
39.实施核染实验检测凋亡素组合肽促进肺癌细胞凋亡。检测结果如图3、图4所示。
40.常规培养h460细胞接种于六孔板。
41.放入37℃的co2孵箱培养待其贴壁(次日即可贴壁)后加药。
42.pbs(对照组)、ml-33(80μg/ml、110μg/ml、140μg/ml、170μg/ml)，cddp(1μg/ml)。
43.放入37℃的co2孵箱培养24h后，吸出六孔板中液体，用pbs清洗3次。
44.加入hoechst 33342(10μg/ml)(dalian meilun biotechnology)1ml染色，室温放置15分钟。
45.吸出hoechst 33342，用pbs清洗3次，最后用荧光倒置显微镜(zeiss axio observer3)拍照记录。
46.随着药物ml-33浓度的增加，细胞克隆的数目与pbs组相比明显减少，代表ml-33可显著抑制肿瘤细胞的克隆能力。
47.实施例4
48.实施流式细胞术检测证明凋亡素组合肽对h460细胞凋亡具有促进作用。检测结果如图5所示。
49.1、细胞培养
50.h460细胞是贴壁生长细胞，培养方法同普通贴壁细胞。
51.在10cm培养皿加8ml(含9％fbs、1％双抗)1640培养液，观察细胞贴满底壁且状态良好，加入1ml pbs洗贴壁细一次。
52.按1ml/板加0.25％胰酶消化液覆盖细胞面后弃去多余消化液，细胞消化30-60s
时，镜下观察细胞变圆变亮。
53.加入(含9％fbs、1％双抗)的1640终止消化，2ml培养液/板，进行1000r/min离心5分钟。弃掉上清液，加入1ml(含9％fbs、1％双抗)1640培养液，进行吹打。取650μl细胞悬液，加入11.35ml(含9％fbs、1％双抗)1640培养液，吹打均匀。按2ml细胞悬液/孔铺六孔板。
54.放入37℃的co2孵箱培养待其贴壁(次日即可贴壁)后加药。
55.2、加药、收集细胞
56.分组加入配置完成的浓度为(70ug/ml、90ug/ml、110ug/ml、130ug/ml、150ug/ml及pbs组)，培养24小时(在37℃,5％co2的条件下)。
57.收集培养液内细胞及贴壁细胞，离心(1000转，5分钟)后用pbs洗涤，再使用1ml binding buffer重悬细胞，离心(300g，10分钟)，使用1mlbinding buffer重悬细胞，取200ul细胞悬液于1.5ml离心管内，每管加入5ul annexin v-fitc(避光，室温培养10分钟)，加入5ul pi(避光，室温培养5分钟)，加入300ul pbs吹打混匀。
58.细胞过滤布后，上流式细胞仪(贝克曼cytoflexlx)检测凋亡。
59.24小时ml-33肽(70ug/ml)诱导的h460细胞凋亡率为57.8％，ml-33肽(90ug/ml)诱导的h460细胞凋亡率为88.6％，ml-33肽(110ug/ml)诱导的h460细胞凋亡率为83.9％，ml-33肽(130ug/ml)诱导的h460细胞凋亡率为94.1％，ml-33肽(150ug/ml)诱导的h460细胞凋亡率为97.9％，pbs组h460细胞凋亡率为1.96％。
60.流式细胞术检测细胞凋亡实验的结果都证实，ml-33肽对h460细胞有诱导凋亡作用。用流式细胞术检测ml-33肽对h460细胞促凋亡的作用，如图5所示。
61.q2:(annexinv fitc) /pi ，此区域的细胞为晚期凋亡细胞。q3：(annexinv-fitc) /pi-，此区域的细胞为早期凋亡细胞。q4：(annexinv-fitc)-/pi-，此区域的细胞为活细胞。细胞凋亡率为q2与q3之和。
62.在实验组(pbs组)中，24小时h460细胞凋亡率为1.96％,24小时h460细胞活细胞为98％，细胞状态良好。24小时ml-33肽(70ug/ml)诱导的h460细胞凋亡率为57.8％，ml-33肽(90ug/ml)诱导的h460细胞凋亡率为88.6％，ml-33肽(110ug/ml)诱导的h460细胞凋亡率为83.9％，ml-33肽(130ug/ml)诱导的h460细胞凋亡率为94.1％，ml-33肽(150ug/ml)诱导的h460细胞凋亡率为97.9％。与实验组相比，随着组合肽浓度升高，q2与q3占比升高，说明ml-33肽对h460细胞有凋亡作用，且呈一定剂量依赖性。
63.本文中未详细说明的部件为现有技术。
64.上述虽然对本发明的具体实施例作了详细说明，但是本发明并不限于上述实施例，在本领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下做出各种变化，而不具备创造性劳动的修改或变形仍在本发明的保护范围以内。