包含位于纳米原纤纤维素水凝胶中的真核细胞的可移植细胞组合物、其制备方法和纳米原纤纤维素的用途与流程

包含位于纳米原纤纤维素水凝胶中的真核细胞的可移植细胞组合物、其制备方法和纳米原纤纤维素的用途
发明领域
1.本技术涉及包含位于纳米原纤纤维素水凝胶基质中的真核细胞的可移植细胞组合物及其制备方法。本技术还涉及用于治疗方法的可移植细胞组合物，以及纳米原纤纤维素用于制备可移植细胞组合物的用途。
2.背景
3.在医学治疗,例如癌症治疗或需要某些细胞或组织再生的其他治疗中可能需要移植干细胞。然而，为可移植细胞获得合适的环境和组成是具有挑战性的，该合适的环境和组成可以将移植的干细胞保留在适当的位置并定位细胞到细胞的信号传导。在组织中，细胞外基质(ecm)由细胞分泌并将细胞包围在组织中。它是对具有组织特征的细胞的结构支持。它不是对细胞的简单的被动机械支撑，而是复杂的支架，包括各种高度调节的对于决定其所包围的细胞的作用和命运至关重要的生物活性分子。然而，由于所含生物分子和结构的多样性，可能会导致接受者体内出现排异或其他不良反应，这种基质对大多数移植用途没有用。
4.在某些情况下，使用了哺乳动物源性胶原蛋白等基质，因为它们提供了存在于哺乳动物组织中的局部环境线索。然而，它们不稳定，例如容易受到体内酶促降解的影响，因此难以创造持久的生态位。因此，需要找到持久且相容的可移植组合物和方法以向对象提供细胞。


技术实现要素：

5.在本技术中，公开了纳米原纤纤维素水凝胶如何在细胞移植中与干细胞(例如干细胞衍生的球体)一起使用以减少不希望的团聚并使细胞与可能导致细胞凋亡的注射剪切力隔离。纳米原纤纤维素水凝胶衍生的基质材料在体内应用中显示出巨大的潜力。
6.本技术提供了一种制备可移植细胞制备物的方法，该方法包括：
[0007]-在允许细胞形成细胞聚集体的条件下培养真核细胞，优选持续至少三天，
[0008]-在纳米原纤纤维素水凝胶中提供细胞聚集体和/或将细胞聚集体与纳米原纤纤维素水凝胶组合以获得可移植的细胞组合物，其包含位于纳米原纤纤维素水凝胶基质中的真核细胞。
[0009]
本技术提供包含纳米原纤纤维素水凝胶基质的可移植组合物。
[0010]
本技术提供一种可移植的细胞组合物，其包含位于纳米原纤纤维素水凝胶基质中的真核细胞。该细胞组合物可以通过制备可移植细胞制备物的方法获得。
[0011]
本技术提供了用于治疗方法的可移植细胞组合物，所述治疗方法包括向对象施用细胞。
[0012]
本技术提供了纳米原纤纤维素用于制备可移植细胞组合物的用途。
[0013]
主要实施方式在独立权利要求中限定。在从属权利要求中公开了各种实施方式。除非另有明确说明，否则权利要求书和说明书中记载的实施方式和实施例可以相互自由组
合。
[0014]
作为水凝胶存在的纳米原纤纤维素形成用于细胞的亲水性间质基质，该基质是无毒的、生物相容的并且也是可生物降解的。基质可以酶促降解，例如通过添加纤维素酶来降解。另一方面，水凝胶在生理条件下是稳定的，不需要通过使用其他试剂进行交联。可以通过调节纳米原纤纤维素的化学和/或物理性质来控制纳米原纤纤维素水凝胶的性质，例如渗透性。
[0015]
包含纳米原纤纤维素的水凝胶的某些有利特性包括柔韧性、弹性和可重塑性，这使得例如能够将水凝胶注射到体内的各种靶标中。由于水凝胶包含大量水，因此对分子也显示出良好的渗透性。实施方式的水凝胶还提供高的保水能力和分子扩散特性速度。
[0016]
本文所述的纳米原纤纤维素水凝胶可用于医学和科学应用，其中包含纳米原纤纤维素的材料与生物接触。如本文所述的包含纳米原纤纤维素的产品与生物具有高度生物相容性，并提供多种有益效果。不囿于任意具体理论的束缚，认为含有极其亲水的纳米原纤纤维素的水凝胶具有非常高的比表面积，并因此具有高保水能力，当施用于细胞时，在细胞和包含纳米原纤纤维素的水凝胶之间形成有利的潮湿环境。纳米原纤纤维素中的大量游离羟基在纳米原纤纤维素和水分子之间形成氢键，并且能够形成凝胶和产生纳米原纤纤维素的高保水能力。纳米原纤纤维素水凝胶包含大量的水，并且还能够使流体和/或试剂迁移。
[0017]
纳米原纤纤维素可用作细胞基质，因此提供一种保护细胞并帮助它们维持其活力的环境。形成的基质可称为间隙基质，类似于ecm并提供具有不均匀孔径的网状基质。纤维素纳米原纤网络的尺寸非常接近胶原蛋白纳米纤维的天然ecm网络。它为细胞提供结构支持和相互连接的孔的网络，用于有效的细胞迁移和营养物质向细胞的转移。此外，纳米原纤纤维素是非动物基材料，因此无异源物质，所以不存在疾病转移或排异的风险。特别是当涉及人细胞时，除了纤维素和可能的少量添加剂外，该制备物将仅包含人源性成分，因此其不包含来自外来动物或微生物物种的任何物质。
[0018]
纤维素纳米原纤的荧光背景可以忽略不计。使用本发明的材料可以获得用于细胞的透明且多孔的基质，并且与替代方案相比，该材料的处理容易。纤维素纳米原纤水凝胶具有最佳的弹性、刚度、剪切应力、机械附着性和孔隙率，也可用作3d和2d细胞储存或培养的基质。
[0019]
纳米原纤纤维素水凝胶是可注射和可移植的，因此能够将细胞(例如干细胞)递送到所需的对象。纳米原纤纤维素水凝胶是假塑性材料，这使得它们易于注射，因为挤出剪切力足够大，可以在注射过程中降低粘度，注射后，当剪切力去除时，材料会稳定以保持其形状。当注射或植入时，细胞以活性形式留在对象体内。使用纳米原纤纤维素作为间隙基质可防止或减少细胞或细胞球体的不希望的聚集。
[0020]
纤维素具有生物相容性，因为其具有适度的(如果有的话)外来反应，并且对于干细胞应用是安全的，没有已知的毒性。纤维素也是生物耐久的；纤维素吸收缓慢，因为细胞不能合成降解纤维素所需的纤维素酶，因此纳米原纤纤维素水凝胶将保持限于局部。
附图说明
[0021]
图1显示了使用growdextm生成的hesc衍生的onp球体的示例性共焦显微照片。比例尺＝250μm。
[0022]
图2显示了使用growdex-ttm生成的hesc衍生的onp球体的示例性共焦显微照片。比例尺＝250μm。
[0023]
图3显示(a)：可以在3-d培养环境中生成人psc衍生的onp，以形成具有2％growdex-t
tm
的球体(可能会增加体外和体内的存活率)。βiiit(βiii-微管蛋白)和map2是人onp标记物。比例尺＝100μm。(b)：人psc衍生的an祖细胞可以在水凝胶产生的干细胞生态位中进行神经元分化。白色箭头表示神经元连接。比例尺＝20μm。(c)：人psc衍生的an可以通过rfp(在cp：细胞质中表达)和细胞核(n：细胞核)进行识别。pax2：复染。比例尺＝20μm。(d)：用1.5％growdex
tm
移植的人hesc衍生的onp球体也可以用stem101(st101)，内耳(小鼠)中的抗人核抗体进行鉴定。请注意，在使用hpsc衍生的onp进行移植手术后，在内耳的三个腔室之一的中阶(sm)中发现stem101阳性细胞。toto3(toto3碘化物)：复染。
具体实施方式
[0024]
在该说明书中，除非另有特别说明，否则百分数值是基于重量(w/w)。如果给出任何数值范围，则该范围也包括上限值和下限值。开放式术语“包括”还包括封闭式术语“由
……
组成”作为一种选择。
[0025]
本文所述的材料和产品可以是医学和/或科学材料和产品，例如生命科学材料和产品，并且可以用于涉及活细胞和/或生物活性材料或物质的方法和应用中，例如本文所述。所述材料或产品可以是或涉及细胞移植、细胞培养、细胞储存和/或细胞研究材料或产物，并且可以用于其中将细胞进行移植、培养、储存、维持、运输、提供、修饰、测试和/或用于医学或科学目的的方法，或用于其他相关且适用的方法。
[0026]
本技术提供在纳米原纤纤维素水凝胶中包含细胞的组合物。该组合物是可移植的，即其是一种能够安全地将细胞递送或给予对象以提供或形成细胞移植的形式。不希望细胞移植会在对象中引起排异或疾病。本技术还提供包含纳米原纤纤维素水凝胶基质的可移植组合物。这种组合物可以包含或不包含细胞，并且可以作为中间产品或原材料提供，并且可以将其包装在合适的密封包装中以用于储存、运输和/或使用。
[0027]
可移植的组合物优选具有特定的化学含量、干含量和基质材料的类型。可移植组合物或组合物中的纳米原纤纤维素水凝胶优选不包括其他类型的细胞衍生材料，例如细胞培养基或细胞培养基衍生材料，或者其可以仅包括痕量的此类材料。细胞衍生材料可以包括可移植细胞之外来源的细胞、细胞器、激素、抗原、蛋白质、肽、核酸和/或脂质。优选地，组合物或纳米原纤纤维素水凝胶不包含或仅包含痕量的其他类型的细胞衍生材料。“痕量”可指小于0.5％(w/w)、小于0.1％(w/w)、小于0.05％(w/w)或小于0.01％(w/w)，或指使用检测或识别特定生物化合物的常用方法(例如免疫学方法)无法检测到的量。组合物和/或组合物中的纳米原纤纤维素水凝胶优选无动物源、无异源和/或无饲养。无饲养是指其中不存在饲养细胞的细胞培养基和/或条件，例如其中在不存在饲养细胞层的情况下培养细胞。
[0028]
组合物可以是可注射组合物或可植入组合物。组合物可以以合适的形式提供，例如用注射器、微量移液器或其他合适的施用器提供。一个实施方式提供了包装在注射器或微量移液器中的可移植细胞组合物。注射器可以是任何合适的注射器，其还可包括注射针。在一个实施方式中，注射器包括用于将组合物移植到对象体内的注射针。注射器和针头可用于本文讨论的治疗方法中，例如用于细胞移植，以及用于储存、运输和提供可移植细胞组
合物。本技术还提供了包含可移植细胞组合物的注射器，优选包含用于将组合物移植到对象体内的注射针。微量移液器可以是任何适用于细胞移植的微量移液器，例如细胞转移微量移液器。本文公开的施用器可通过使用基于压力或基于体积的仪器例如注射器或泵来操作或可以是能够通过上述仪器操作的。组合物可以以剂量提供，例如包装在诸如注射器或微量移液器或微量移液器尖端的施用器中。剂量可具有500μl或更小的体积，例如10
–
500μl、10
–
200μl或20
–
200μl。
[0029]
组合物也可以包装在管中，该管可以是任何合适的管，例如可密封试管，其可以用于储存、运输和提供可移植细胞组合物。一个实例提供了包含位于纳米原纤纤维素水凝胶中的细胞的植入物，优选包含本文所述的可移植细胞组合物。更特别地，可移植细胞组合物可包含在包含一个或多个增强部分的植入物中。纳米原纤纤维素可以以针对可注射组合物公开的浓度存在于植入物中，例如浓度为1-3％(w/w)，或者植入物可以包含更高浓度的纳米原纤纤维素，例如10％或更少，例如1
–
10％(w/w)、4
–
10％(w/w)、5
–
10％(w/w)或3.5
–
8％(w/w)。这将有助于植入物保持其形式和便于植入。
[0030]
本文所用的移植是指将细胞从供体转移(植入)到受体，目的是恢复体内功能。当在不同物种之间进行移植时，例如动物与人之间，则称为异种移植。供体可以与受体相同或不同。移植可以是自体的或同种异体的。
[0031]
细胞，尤其是真核细胞，可以是干细胞或分化细胞，例如源自或衍生自人体或动物体，例如来自患者的细胞。细胞可以是自体细胞，在这种情况下，细胞是从将在治疗中接受细胞的同一对象获得的。这可以在例如自体干细胞移植中实施，也称为自体干细胞移植，这是将干细胞从对象取出，储存，然后返回给同一对象的干细胞移植。因此，细胞的供体和受体是同一对象或个体，例如人。自体细胞可以在从对象移出之后和返回对象之前已经被处理和/或修饰。在自体干细胞移植的一个例子中，对象的自生细胞在从体内被破坏的处理(例如通过化学疗法和/或放疗的癌症治疗)之前被移除或收获，收获的细胞被储存，例如冷冻并随后解冻，最终回到体内。这种移植主要用于治疗某些白血病、淋巴瘤和多发性骨髓瘤，有时也用于治疗其他癌症，如睾丸癌和神经母细胞瘤，以及某些儿童癌症。
[0032]
或者，细胞可以是同种异体细胞，在这种情况下，细胞是从与将在移植或其他治疗中接受细胞的对象(受体)不同的对象(供体)获得的。
[0033]
干细胞可以是未聚集的单一或分离的干细胞，或干细胞球体，例如干细胞衍生的球体。在一种实施方式中，干细胞是人干细胞。
[0034]
细胞球体是指通过细胞外基质连接在一起的多细胞细胞聚集体，在这种情况下，多细胞细胞聚集体通过纳米原纤纤维素基质连接在一起。由于动态的细胞-细胞和细胞-基质相互作用，球体比作为单独细胞存在的单细胞更复杂，这使它们成为在体外模拟体内组织微环境的重要工具。细胞球体可以通过在基质材料中培养或孵育细胞以形成包含多细胞聚集体或球体的三维细胞培养系统来形成。基质材料可以是合适的凝胶材料，优选水凝胶，例如琼脂糖凝胶或纳米原纤纤维素凝胶。当使用纳米原纤纤维素作为基质材料时，在培养或孵育三天后就可以获得细胞球体。一般来说，细胞球体的直径可能会有所不同，范围从几十微米到超过毫米。然而，本文通过控制和调整培养和基质形成材料和条件来获得适合移植目的的具有受控直径的细胞球体。
[0035]
细胞球体是优选的，因为发现在移植过程中，由原纤纤维素网络稳定的多细胞聚
集体促进了对象中细胞的活性、增殖和分化。纳米原纤纤维素基质为此类细胞聚集体的移植目的创造了最佳条件。在本文公开的方法中形成的细胞聚集体可以是细胞球体的形式，或者细胞聚集体可以形成细胞球体。
[0036]
本技术提供了一种制备可移植细胞制备物的方法，该方法包括：
[0037]-在允许细胞形成细胞聚集体的条件下培养真核细胞，
[0038]-提供纳米原纤纤维素水凝胶中的细胞聚集体以获得可移植的细胞组合物，该组合物包含在纳米原纤纤维素水凝胶中的真核细胞。
[0039]
在一种实施方式中，所述方法包括：
[0040]-在允许细胞形成细胞聚集体的条件下培养真核细胞，
[0041]-将细胞聚集体与纳米原纤纤维素水凝胶组合以获得可移植的细胞组合物，该组合物包含位于纳米原纤纤维素水凝胶中的真核细胞。
[0042]
该方法可以包括在允许细胞聚结的条件下培养细胞。条件包括允许聚结和/或聚集体形成的合适时间。条件可以包括合适的培养基，例如液体培养基和/或凝胶培养基。培养可以在培养皿或培养板，或多孔微孔板中进行。细胞可以在水凝胶中培养，例如纳米原纤纤维素水凝胶，其优选包含液体培养基。使用nfc水凝胶可以促进获得所需尺寸的细胞球体。水凝胶的浓度不应太高，因为凝胶基质材料(例如nfc)的浓度太高可能会阻止球体的形成，尤其是对于干细胞，例如多能干细胞。优选地，水凝胶的浓度不超过3％(w/w)，或不超过2.5％(w/w)。在一些实例中，细胞在约1％(w/w)nfc水凝胶、约1.5％(w/w)nfc水凝胶或约2％(w/w)nfc水凝胶中培养。该方法可以包括在浓度范围为0.8-3％(w/w)、1.3-2.2％(w/w)、0.8-2％、1-2％(w/w)、例如0.8-1.5％(w/w)、或约1％(w/w)、约1.5％(w/w)或约2％(w/w)的纳米原纤纤维素水凝胶中培养真核细胞。细胞可以1x105个细胞/ml
–
1x107个细胞/ml的密度，例如1x106–
5x106个细胞/ml的密度接种到或提供给细胞培养物。
[0043]
细胞聚集体(可以是细胞球体)的平均直径可以在80
–
700μm的范围内，例如在80
–
300μm的范围内，如图1、2和3a所示。似乎用浓度约为2％(w/w)的nfc产生的细胞球体(例如在nfc中培养和/或与nfc结合)比用更低浓度的nfc产生的细胞球体具有更小的平均直径，例如在80-250μm的范围内。直径也可以保持。这可能会增加细胞在体外和体内的存活率，并能够提供有效且可行的可移植细胞制备物。还可以调节已经形成的或正在形成的细胞球体的直径，例如通过加入edta溶液或类似试剂来减小细胞的直径。
[0044]
该方法还可包括提供纳米原纤纤维素水凝胶，其可用于培养和/或用于形成可移植细胞组合物。细胞聚集体可以提供在水凝胶中和/或与水凝胶组合。可以混合水凝胶，优选通过用移液器尖端或类似工具轻轻混合，以获得细胞和水凝胶的均匀分布，并避免破坏细胞或细胞球体以及避免气泡形成。
[0045]
为了获得可移植的细胞或细胞球体，细胞可以在不含化合物的细胞培养基中培养，这些化合物可能会导致受体的排异或其他免疫反应，或可能提供疾病风险，例如其他类型的细胞衍生的物质，和/或细胞培养基无动物源、无异源和/或无饲养。此类培养基优选仅包含所需细胞培养如干细胞培养所需的基本细胞培养化合物。也有可能在细胞培养过程中，在最后一步，即在将细胞提供或转移到最终纳米纤维素基质之前，将培养基改变为这种培养基。
[0046]
作为替代或者附加，可在从细胞培养物获得后洗涤细胞，例如通过使用合适的缓
冲培养基或溶液，和/或任何合适的无动物源、无异种和/或无饲养的培养基或溶液进行洗涤。洗涤介质不包含可能在移植中引起问题的不需要的化合物，例如源自其他类型细胞的化合物，例如其他类型的细胞，例如其他动物细胞或微生物细胞。在一些情况下，此类化合物可存在于用于培养细胞的细胞培养基中。通常，可移植组合物中可以使用仅包含缓冲化合物和任选的盐、表面活性剂、增塑剂、乳化剂等化合物的水性介质。可以提供盐、缓冲剂等试剂以获得适合细胞的生理条件。这种介质的一个例子是缓冲溶液，尤其是缓冲盐溶液，例如等渗缓冲液，例如磷酸盐缓冲盐水。在最简单的情况下，缓冲溶液仅包含一种或多种缓冲剂和任选的一种或多种盐。缓冲溶液还可包含一种或多种渗透/肿胀稳定剂，自由基清除剂/抗氧化剂，离子螯合剂，膜稳定剂和/或能量底物。介质可由本文公开的成分的水溶液组成。通常，缓冲溶液是包含弱酸及其共轭碱(反之亦可)的混合物的水溶液。可以使用缓冲溶液将ph值保持在基本恒定或接近恒定的值。缓冲溶液的ph值可以在6-8的范围内，例如7-8，例如7.0-7.7。特别是干细胞可能需要7.4左右的ph范围，例如7.2
–
7.6。
[0047]
可用于生物学应用的缓冲剂的例子包括taps([三(羟甲基)甲基氨基]丙磺酸)，bicine(2-(双(2-羟乙基)氨基)乙酸)，tris(三(羟甲基)氨基甲烷)或(2-氨基-2-(羟甲基)丙烷-1,3-二醇)，tricine(3-[n-三(羟甲基)甲基氨基]-2-羟基丙磺酸)，tapso(3-[n-三(羟甲基)甲基氨基]-2-羟基丙磺酸)，hepes(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸)，tes(2-[[1,3-二羟基-2-(羟甲基)丙烷-2-基]氨基]乙磺酸)，mops(3-(n-吗啉代)丙磺酸)，pipes(哌嗪-n,n
′‑
双(2-乙磺酸))，卡可基酸盐(cacodylate，二甲基砷酸)和mes(2-(n-吗啉代)乙磺酸)。
[0048]
一般缓冲溶液的一个具体示例是磷酸盐缓冲盐水(pbs)，通常其ph值为约7.4。这是一种水基盐溶液，包含磷酸氢二钠和氯化钠，在某些配方中还包含氯化钾和磷酸二氢钾。溶液的渗透压和离子浓度与人体的渗透压和离子浓度匹配，因此是等渗的。
[0049]
通常，缓冲溶液包含一种或多种缓冲剂。在一个例子中，缓冲溶液包含两性离子缓冲剂，例如4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸(hepes)。缓冲剂的pka值优选在6-8的范围内。缓冲溶液中的缓冲剂含量可以小于100mm，例如10
–
50mm，或20
–
30mm，例如20
–
25mm。在一个例子中，缓冲液是hepes缓冲液(例如10mm hepes，150mm nacl，10mm edta，ph 7.4)。
[0050]
在一个实施方式中，该方法包括在纳米原纤纤维素水凝胶中提供细胞或细胞聚集体和/或将细胞或细胞聚集体与纳米原纤纤维素水凝胶组合之前去除细胞培养基，例如通过过滤、离心和/或洗涤细胞或细胞聚集体(用不含其他类型细胞衍生物质和/或无动物源、无异源和/或无饲养的培养基进行)来进行。更具体地，可以过滤和/或离心细胞或细胞聚集体以去除不需要的培养基和任选的其他材料。过滤可以借助真空进行。
[0051]
形成的细胞聚集体是多细胞聚集体，在本文中称为细胞球体。培养可以进行至少三天，例如3-14天，或3-7天。该方法尤其适用于干细胞。在形成聚集体之后，可以收获细胞并用合适的培养基或缓冲液洗涤和/或使细胞悬浮在合适的培养基或缓冲液中，例如ph值在6-8范围内的缓冲液或培养基，如本文之前所述。此后，细胞聚集体可以转移到nfc水凝胶中。nfc水凝胶将在细胞聚集体之间形成间质基质，该基质加强结构，固定细胞，但使药剂能够流动通过基质，这使得例如细胞信号传导、营养物质流动和其他重要功能成为可能。实施方式中的基质是指围绕细胞形成多孔三维格子的基质，其功能类似于组织的细胞外基质中存在的间质基质。基质可以均匀地分布在组合物中和/或细胞之间。基质可以形成和/或进
一步发展，即nfc可以与细胞反应以形成基质，在细胞已经存在于基质中合适的时间段之后，例如至少6小时，至少12小时，或至少24小时之后。细胞可以在使用前在纳米原纤纤维素水凝胶中储存和/或孵育数天或者甚至数周。
[0052]
在另一个例子中，细胞在纳米原纤纤维素水凝胶中培养，该水凝胶可以含有细胞培养基。可以收获细胞并将其转移到另一纳米原纤纤维素水凝胶中，或者可以将它们在培养它们的同一水凝胶中提供给移植。在这种情况下，可能需要清洗细胞和/或将水凝胶的浓度调整到所需的范围内。在这种情况下，在纳米原纤纤维素水凝胶中提供细胞以获得可移植的细胞组合物，该组合物包含在纳米原纤纤维素水凝胶中的真核细胞，并且不需要从不同来源专门转移细胞。
[0053]
发现纳米原纤纤维素，无论是化学未改性的还是化学改性的，尤其是阴离子改性的，都促进了细胞球体的形成并对其稳定化。细胞球体可用于移植等方法，包括将细胞施用于对象，例如通过注射或植入来实现。特别是与干细胞球体一起使用的nfc水凝胶减少了细胞的进一步聚集，并使细胞在细胞移植过程中免受注射剪切力的影响。移植后，细胞可以在nfc水凝胶中分化为所需的细胞类型。
[0054]
纳米原纤纤维素在水凝胶中的浓度，优选在最终的可移植组合物中的浓度，可以在1-3％的范围内，这适用于可注射组合物。浓度可以在1-2.5％(w/w)或1.3-2.2％(w/w)的范围内，例如1.5-2.0％(w/w)。发现这些浓度有助于将细胞球体保持在所需的和/或获得的大小和形状。发现浓度不应低，因为水凝胶的粘度在浓度低于1％(w/w)或低于1.5％(w/w)时可能太低。另一方面，浓度也不能太高，如超过5％(w/w)，或超过3％(w/w)或超过2.5％(w/w)，因为试剂在水凝胶基质中的流动可能会减少或者甚至可能被阻塞。浓度太高也可能会干扰细胞球体。可移植细胞组合物中的细胞密度可以在1x104个细胞/ml
–
1x108个细胞/ml的范围内，例如在1x105个细胞/ml
–
1x107个细胞/ml的范围内。
[0055]
纳米原纤纤维素应具有足够的原纤化程度，以便获得所需的性质和效果。在一个实施方式中，纳米原纤纤维素具有的原纤平均直径在1-200nm的范围内，和/或当分散在水中时，提供350pa或更高的储能模量，例如在350-5000pa的范围内，或优选350-1000pa，屈服应力为25pa或更高，例如在25-300pa的范围内，优选25-75pa，其由应力控制旋转流变仪在2％应变和25℃下测定，其中剪切应力在0.001
–
100pa的范围内以10弧度/秒(rad/s)的频率逐渐增加。
[0056]
纳米原纤纤维素可以是组合物中唯一的基质材料，例如组合物中唯一的聚合物材料。然而，除了nfc之外，还可以包括其他聚合物材料，例如透明质烷，透明质酸及其衍生物，基于肽的材料，蛋白质，其他多糖，例如海藻酸盐，聚乙二醇。可以获得形成半互穿网络(semi-ipn)的组合物，其中纳米原纤纤维素提供结构稳定性。总组合物中其他聚合物材料的干重含量可以在20-80％(w/w)的范围内，例如40-60％(w/w)或10-30％(w/w)或10
–
20％(w/w)。
[0057]
由于水凝胶的光学特性，可以在nfc水凝胶中目视研究细胞和细胞球体，例如在显微镜下进行。当细胞在水凝胶基质中时也可以进行其他测试，因为基质允许分子物质流动。通过酶促降解水凝胶，例如通过使用一种或多种纤维素酶，可以从nfc水凝胶中释放细胞或细胞球体。
[0058]
术语“细胞培养”或“细胞的培养”是指维持、运输、分离、培养、繁殖、传代和/或分
化细胞或组织。细胞可以为任何排列形式，例如单个细胞、单层、细胞簇或球体，或者作为组织。
[0059]
细胞
[0060]
在本发明方法和产品中，提供了细胞。细胞可以是真核细胞。真核细胞可以是植物细胞，酵母细胞或动物细胞。真核细胞的例子包括可移植细胞，例如干细胞。在本发明方法中，细胞优选为动物细胞或人细胞。如前所述，细胞可以作为聚集体存在。
[0061]
细胞的具体实例包括干细胞，未分化细胞，前体细胞以及完全分化的细胞，以及它们的组合。在一些实例中，细胞包括选自下组的细胞类型：角膜基质细胞，角质形成细胞，成纤维细胞，上皮细胞及其组合。在一些实例中，细胞选自下组：干细胞，祖细胞，前体细胞，结缔组织细胞，上皮细胞，肌肉细胞，神经元细胞，内皮细胞，成纤维细胞，角质形成细胞，平滑肌细胞，基质细胞，间充质细胞，免疫系统细胞，造血细胞，树突状细胞，毛囊细胞及其组合。细胞可以是基因修饰的细胞，例如转基因细胞，顺基因细胞或敲除细胞，或病原细胞。这样的细胞可以用于例如药物研究或治疗。特别地，干细胞可以用于治疗应用中，例如提供给患者。
[0062]
真核细胞可以是哺乳动物细胞。哺乳动物细胞的实例包括人细胞，小鼠细胞，大鼠细胞，兔细胞，猴细胞，猪细胞，牛细胞，鸡细胞等。
[0063]
在一个实施方式中，细胞是干细胞，例如全能、多能、多潜能、寡能或单能干细胞。干细胞是能够通过细胞分裂来更新自身的细胞，并且可以分化为多谱系细胞。这些细胞可分为胚胎干细胞(esc)，诱导多能干细胞(ipsc)和成体干细胞，也称为组织特异性或体干细胞。干细胞可以是人干细胞，其可以是非胚胎来源的，例如成体干细胞。这些是分化后遍布全身的未分化细胞。它们负责例如器官再生，能够分裂为多能或多潜能状态，并分化为分化细胞谱系。干细胞可以是在没有胚胎破坏的情况下产生的人胚胎干细胞系，例如在《细胞&干细胞》(cell stem cell，2008年2月7日；2(2):113
–
7)中描述的。干细胞可获自自体成体干细胞，例如骨髓，脂肪组织或血液。
[0064]
干细胞的例子包括间充质干细胞(msc)，多潜能成体祖细胞诱导多能干细胞(ips)和造血干细胞。
[0065]
在人干细胞的情况下，细胞可以是非胚胎细胞或胚胎细胞，例如hesc(人胚胎干细胞)，其是在不破坏胚胎的情况下得到的。对于人胚胎干细胞，细胞可以来自沉积的细胞系，或者由未受精的卵(即“孤雌生殖”卵)或由孤雌生殖性激活卵制成，因此不会破坏人胚胎。
[0066]
在一个实施方式中，细胞是间充质干细胞(msc)。间充质干细胞(msc)是成体干细胞，可以从人和动物来源(例如哺乳动物)中分离出来。间充质干细胞是能分化为多种细胞类型的多潜能基质细胞，所述多种细胞类型包括成骨细胞、软骨细胞、肌细胞和脂肪细胞。间充质本身是源自中胚层的胚胎结缔组织，其分化为造血组织和结缔组织。然而，间充质干细胞不能分化为造血细胞。间充质干细胞和骨髓基质细胞这两个术语已经互换使用了很多年，但没有一个术语的描述是充分的。基质细胞是结缔组织细胞，其形成组织功能细胞所依靠的支持结构。尽管这是对msc的一种功能的准确描述，但该术语未能传达新近发现的msc在组织修复中的作用。该术语包括源自其他非骨髓组织的多潜能细胞，例如源自胎盘、脐带血、脂肪组织、成人肌肉、角膜基质或乳牙牙髓的多能细胞。这些细胞没有能力重建整个器官。
[0067]
国际细胞治疗协会(international society for cellular therapy)提出了定义msc的最低标准。这些细胞(a)应该表现出塑性粘附，(b)具有特定的细胞表面标记集，即分化簇(cd)73、d90、cd105，并且缺乏cd14、cd34、cd45和人白细胞抗原-dr(hla-dr)的表达，以及(c)具有体外分化为脂肪细胞、软骨细胞和成骨细胞的能力。这些特征对所有msc均有效，尽管从各种组织来源分离的msc中存在很少的差异。msc不仅存在于胎儿组织中，而且也存在于许多成人组织中，几乎没有例外。据报道，骨髓中具有有效的msc群。已从脂肪组织、羊水、羊膜、牙体组织、子宫内膜、肢芽、经血、外周血、胎盘和胎膜、唾液腺、皮肤和包皮、羊膜下脐带内膜、滑液和华通氏胶中分离出了具有msc特征的细胞。
[0068]
人间充质干细胞(hmsc)表现出极高的可塑性，并几乎在所有器官中都有，在骨髓中密度最高。hmsc可作为间充质细胞的可再生来源，并具有多能分化成多种细胞谱系的能力，包括成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、骨骼和心肌细胞、内皮细胞和神经元，在适当的刺激下在体外以及在移植后在体内均可分化。
[0069]
在一个实例中，细胞是多潜能成体祖细胞(mapc)，其衍生自可从骨髓、肌肉和脑中收获的原始细胞群。mapc是比间充质干细胞更原始的细胞群，尽管它们模仿胚胎干细胞的特性，但它们仍保留了成体干细胞在细胞治疗中的潜力。在体外，mapc具有成脂、成骨、神经生成、肝生成、造血、生肌、软骨生成、上皮和内皮细胞谱系的巨大分化潜力。mapc的一个关键特征是它们在体外显示出巨大的增殖潜力而不会丢失其表型。mapc可用于治疗多种疾病，例如缺血性脑卒中、移植物抗宿主病、急性心肌梗死、器官移植、骨修复和骨髓增生异常。mapc还可以增强骨形成，促进新血管形成并具有免疫调节作用。
[0070]
诱导多能干细胞(ips)是一类多能干细胞，可以直接从成体细胞中产生。它们几乎可以无限地繁殖，并且可以在体内产生其他所有细胞类型，包括神经元、心脏、胰腺和肝细胞。诱导多能干细胞可以直接来自成人组织，并且可以以患者匹配的方式制备，因此可以为它们提供移植而没有免疫排异的风险。人诱导多能干细胞是特别令人感兴趣的，并且它们可以由例如人成纤维细胞、角质形成细胞、外周血细胞、肾上皮细胞或其他合适的细胞类型产生。
[0071]
造血干细胞(hsc)，也称为血干细胞，是可以发育成所有类型的血细胞的细胞，所述所有类型的血细胞包括白细胞、红细胞和血小板。在外周血和骨髓中发现造血干细胞。hsc同时引起血细胞的髓系和淋巴系。髓系和淋巴系都参与树突状细胞的形成。髓样细胞包括单核细胞，巨噬细胞，嗜中性粒细胞，嗜碱性粒细胞，嗜酸性粒细胞，红细胞和巨核细胞至血小板。淋巴样细胞包括t细胞、b细胞和自然杀伤细胞。造血干细胞移植可用于治疗癌症和其他免疫系统疾病。
[0072]
通常，细胞可以在水凝胶中培养，也可以将细胞储存在水凝胶中。可以将细胞维持在水凝胶上或水凝胶中并在水凝胶上或水凝胶中增殖，而无需来源于细胞外的基于动物或人的试剂或培养基。细胞可以均匀地分散在水凝胶上或水凝胶中。
[0073]
最初，可以在单独的培养物中对细胞进行预培养，然后将其回收并转移到新培养基中，该新培养基可以与所述单独的培养基相似或不同。获得细胞悬液。该细胞悬液或另一种细胞悬液可以与纳米原纤纤维素(例如包含纳米原纤纤维素的水凝胶)组合和/或混合，以获得或形成细胞系统或细胞组合物。如果在细胞系统中培养细胞，则会形成细胞培养物。细胞系统或培养物可以是2d系统或培养物或者3d系统或培养物。2d系统或培养物是指以膜
的形式和/或作为层的系统或培养物。3d系统或培养物是指纳米原纤纤维素中的系统或培养物，其中允许细胞在所有三个维度上生长和/或相互作用。nfc水凝胶基质模仿天然的细胞外基质结构，并提供营养物质、气体等的有效运输。在一个实例中，细胞系统是3d细胞系统。
[0074]
纳米原纤纤维素
[0075]
用于形成水凝胶的原料是纳米原纤纤维素，也称为纳米纤维素，是指分离的纤维素原纤或衍生自纤维素原料的原纤束。纳米原纤纤维素是基于自然界中储量丰富的天然聚合物。纳米原纤纤维素具有在水中形成粘性水凝胶的能力。纳米原纤纤维素的生产技术可以基于使纤维原料崩解，例如研磨纸浆纤维的水性分散体以获得纳米原纤化的纤维素。在研磨或均化过程后，得到的纳米原纤纤维素材料是稀释的粘弹性水凝胶。
[0076]
由于崩解条件，所获得的材料通常以相对低的浓度均匀地分布在水中的形式存在。原料可以是浓度为0.2-10％(w/w)，例如0.2
–
5％(w/w)的水性凝胶。纳米原纤纤维素可以直接由纤维原料的崩解获得。市售的纳米原纤纤维素水凝胶的一个例子是upm的
[0077]
由于其纳米级结构，纳米原纤纤维素具有独特的性质，该性质使得常规非纳米原纤纤维素无法提供的功能成为可能。可以制备表现出与常规产品或使用常规纤维素材料的产品的性能不同的材料和产品。然而，由于纳米级结构，纳米原纤纤维素也是具有挑战性的材料。例如，纳米原纤纤维素的脱水或处理可能是困难的。
[0078]
纳米原纤纤维素可以由植物来源的纤维素原料制备，或者也可以源自某些细菌发酵过程。纳米原纤纤维素优选由植物材料制备。该原料可以基于含纤维素的任何植物材料。在一个例子中，原纤是从非薄壁(non-parenchymal)植物材料获得的。在这种情况下，原纤可以从次生细胞壁获得。这种纤维素原纤的一种丰富来源是木纤维。纳米原纤纤维素可以通过对来自木材的纤维原料进行均化制得，所述纤维原料可以是化学浆。纤维素纤维崩解以产生平均直径仅为数纳米的原纤，在大多数情况下该平均直径可以为200nm或更小，得到在水中的原纤分散体。来源于次生细胞壁的原纤基本为晶体，其结晶度至少为55％。这种原纤可以具有与源自初生细胞壁的原纤不同的性质，例如源自次生细胞壁的原纤的脱水可能更具挑战性。通常，在来自初生细胞壁的纤维素来源中，例如在甜菜、马铃薯块茎和香蕉叶柄(banana rachis)来源，微原纤比来自木材的原纤更容易从纤维基质中释放出来，并且崩解所需的能量更少。然而，这些材料仍然有些不均匀，并且由大的原纤束组成。
[0079]
非木材材料可以来自农业残留物、草或其他植物物质，例如从棉花、玉米、小麦、燕麦、黑麦、大麦、稻、亚麻、大麻、马尼拉麻、剑麻、黄麻、苎麻、洋麻、西沙尔麻落麻(bagasse)、竹或芦苇得到的秸秆、树叶、树皮、种子、壳、花、蔬菜或果实。纤维素原料还可以源自产生纤维素的微生物。微生物可以是醋酸杆菌属(acetobacter)，农杆菌属(agrobacterium)，根瘤菌属(rhizobium)，假单胞菌属(pseudomonas)或产碱杆菌属(alcaligenes)，优选是醋酸杆菌属，更优选是木醋杆菌(acetobacter xylinumor)或巴氏醋杆菌(acetobacter pasteurianus)。
[0080]
已经发现，从木纤维素获得的纳米原纤纤维素优选用于本文所述的医学或科学产品。木纤维素可大量获得，并且针对木纤维素开发的制备方法使得能够生产适用于该产品的纳米原纤材料。通过使植物纤维，特别是木纤维原纤化而获得的纳米原纤纤维素在结构
上与从微生物获得的纳米原纤纤维素不同，并且具有不同的性质。例如，与细菌纤维素相比，纳米原纤化的木纤维素是均匀且更为多孔和疏松的材料，这在涉及活细胞的应用中是有利的。通常使用细菌纤维素时不会像在植物纤维素中那样进行类似的原纤化，因此材料在这方面也有所不同。细菌纤维素是致密材料，容易形成小球体，因此该材料的结构是不连续的，因此不希望在与活细胞有关的应用中使用这种材料，特别是当需要该材料的均质性时尤为如此。
[0081]
木材可以来自软木树如云杉、松树、冷杉、落叶松、花旗松或铁杉，或来自硬木树如桦树、白杨、杨树、桤木、桉树、橡树、山毛榉或刺槐，或者来自软木和硬木的混合物。在一个实例中，纳米原纤纤维素从木浆获得。纳米原纤纤维素可以从硬木浆获得。在一个实例中，硬木是桦木。纳米原纤纤维素可以从软木浆获得。在一个实例中，所述木浆是化学浆。化学浆对于本文公开的产品可能是期望的。化学浆是纯材料，可用于多种应用。例如，化学浆缺少机械浆中存在的沥青和树脂酸，并且它的无菌程度更高或更容易灭菌。此外，化学浆柔性更高，并例如在医学和科学材料中提供有利的性质。例如，可以制备非常均匀的纳米原纤纤维素材料，而无需过多的处理或不需要特定的设备或费力的处理步骤。
[0082]
包括纤维素原纤和/或原纤束的纳米原纤纤维素的特征在于高的纵横比(长度/直径)。纳米原纤纤维素的平均长度(如原纤或原纤束之类的颗粒的中值长度)可能超过1μm，在大多数情况下为50μm或更小。如果初级原纤没有完全彼此分离，则缠结原纤的平均总长度可以例如在1
–
100μm，1
–
50μm或1
–
20μm的范围内。但是，如果纳米原纤材料高度原纤化，则初级原纤可能完全或几乎完全分离，平均原纤长度会更短，例如在1
–
10μm或1-5μm的范围内。这尤其适用于天然级别的原纤，这些原纤不会例如在化学、酶促或机械作用下被缩短或消化。但是，强衍生化的纳米原纤纤维素的平均原纤长度可以更短，例如在0.3
–
50μm，例如0.3
–
20μm，例如0.5
–
10μm或1
–
10μm的范围内。特别是变短过的原纤，例如酶促消化或化学消化的原纤，或经过机械处理的材料所具有的平均原纤长度可以小于1μm，例如0.1
–
1μm，0.2
–
0.8μm或0.4
–
0.6μm。可以例如使用cryo-tem、sem或afm图像在显微镜下估计原纤的长度和/或直径。
[0083]
对于高度原纤化的材料，纳米原纤纤维素的平均直径(宽度)小于1μm，或小于或等于500nm，例如在1-500nm的范围内，但优选小于或等于200nm，甚至小于或等于100nm或者小于或等于50nm，例如，在1
–
200nm，2
–
200nm，2
–
100nm或2
–
50nm，甚至2
–
20的范围内。本文公开的直径可以指原纤和/或原纤束的直径。最小的原纤处于初级原纤的级别，平均直径通常在2-12nm的范围内。原纤的尺度和尺寸分布取决于精制方法和效率。在高度精制的天然纳米原纤纤维素的情况中，平均原纤直径(包括原纤束的直径)可以在2
–
200nm或5
–
100nm的范围内，例如在10
–
50nm的范围内。纳米原纤纤维素的特征在于具有大的比表面积和强的形成氢键的能力。在水分散体中，纳米原纤纤维素一般呈现为浅色或混浊的凝胶状材料。根据纤维原料，从植物(特别是木材)获得的纳米原纤纤维素也可含有少量的其它植物成分，特别是木成分，如半纤维素或木质素。该量取决于植物来源。
[0084]
通常，根据tappi w13021，纤维素纳米材料可以分为几类，tappi w13021提供了纤维素纳米材料的标准术语。并非所有这些材料都是纳米原纤纤维素。两个主要类别是“纳米物体”和“纳米结构化材料”。纳米结构化材料包括直径为10
–
12μm且长径比(l/d)《2的“纤维素微晶”(有时称为cmc)，以及直径为10
–
100nm且长度为0.5
–
50μm的“纤维素微纤”。纳米物
体包括“纤维素纳米纤维”，其可以分为直径为3-10nm且l/d》5的“纤维素纳米晶体”(cnc)和直径为5
–
30nm且l/d》50的“纤维素纳米原纤”(cnf或nfc)。
[0085]
可以基于三个主要特性对不同级别的纳米原纤纤维素进行分类：(i)尺寸分布，长度和直径；(ii)化学组成；和(iii)流变性质。为了完全描述一个级别，可以平行使用这些性质。不同级别的实例包括天然(未化学改性和/或未酶促改性的)nfc、氧化nfc(高粘度)、氧化nfc(低粘度)、羧甲基化nfc和阳离子化nfc。在这些主要级别中，还存在一些子级别，例如：极好的原纤化对比中等原纤化，高取代度对比低取代度，低粘度对比高粘度等。原纤化技术和化学预改性对原纤尺寸分布有影响。通常，非离子级别具有更宽的平均原纤直径(例如在10-100nm或10-50nm的范围内)，而化学改性级别则要细很多(例如在2-20nm的范围内)。改性级别的分布也更窄。某些改性，特别是tempo氧化，可产生较短的原纤。
[0086]
取决于原料来源，例如硬木浆与软木浆相比，最终纳米原纤纤维素产品中存在不同的多糖组成。通常，从漂白的桦木浆制备非离子级别，会产生高二甲苯含量(25重量％)。从硬木浆或软木浆制备改性级别。在这些改性级别中，半纤维素也与纤维素结构域一起被改性。该改性很可能是不均匀的，即，一些部分相比其他部分改性程度更高。因此，通常无法进行详细的化学分析，因为改性产物是不同多糖结构的复杂混合物。
[0087]
在水性环境中，纤维素纳米原纤的分散体形成粘弹性水凝胶网络。该凝胶由分散和水合的缠结原纤在相对低浓度(例如0.05至0.2％(w/w))下就已经形成。nfc水凝胶的粘弹性可用例如动态振动流变学测量来表征。
[0088]
纳米原纤纤维素水凝胶表现出特有的流变性质。例如，纳米原纤纤维素水凝胶是剪切稀化或假塑性材料，可以认为是触变特性的特例，这意味着其粘度取决于使材料变形的速度或力。当在旋转流变仪中测量粘度时，观察到以下剪切稀化特性：随着剪切速率增加而粘度降低。水凝胶显示出塑性特性，这意味着在材料开始容易流动之前需要一定的剪切应力(力)。该临界剪切应力经常被称作屈服应力。屈服应力可由用应力控制流变仪测定的稳态流动曲线测定。当将粘度相对于施加的剪切应力作图时，可看到在超过临界剪切应力后粘度急剧下降。零剪切粘度和屈服应力是描述材料悬浮能力的最重要流变参数。这两个参数能够非常清楚地区分不同的级别，从而能对级别进行分类。
[0089]
原纤或原纤束的尺寸取决于例如原料，崩解方法和崩解运行的次数。可采用任何合适的设备，如精制机、研磨机、分散器、均质机、磨碎机(colloider)、摩擦研磨机、销棒粉碎机(pin mill)、转子-转子解胶机、超声波破碎器、流化器(如微流化器、大流化器(macrofluidizer)或流化器型均质机)来对纤维素原料进行机械崩解。在存在足够的水以防止纤维间形成键的条件下进行崩解处理。
[0090]
在一个实例中，通过使用具有至少一个转子、桨叶或类似移动机械构件的分散器进行崩解，所述分散器例如是具有至少两个转子的转子-转子分散器。在分散器中，当桨叶以由半径(到转轴的距离)测定的圆周速度和旋转速度以相反方向旋转时，分散体中的纤维材料被转子的桨叶或拱肋从相反方向反复撞击。由于纤维材料在径向上向外转移，其撞在一个接着一个以高圆周速度从相反方向过来的桨叶(即拱肋)的宽表面上；换而言之，其受到来自相反方向的多次连续冲击。同样，在桨叶(即拱肋)的宽表面的边缘处(其边缘与下一个转子桨叶的相对边缘形成桨叶间隙)，出现剪切力，其有助于纤维的崩解并使原纤脱离。撞击频率取决于转子的旋转速度、转子的数量、各转子中桨叶的数量和分散体通过装置的
流速。
[0091]
在转子-转子分散器中，纤维材料被引导通过反向旋转的转子，并且沿着相对于转子转轴的径向方向向外移动，以这种方式反复受到由不同的反向旋转转子引起的剪切和撞击力，并籍此而同时发生原纤化。转子-转子分散器的一个实例是atrex设备。
[0092]
适于崩解的设备的另一实例是销棒粉碎机，例如多重外周销棒粉碎机。该设备的一个示例包括外壳，且在所述外壳内具有装配有碰撞表面的第一转子；与第一转子同心并装配有碰撞表面的第二转子，该第二转子被设置为以与第一转子相反的方向旋转；或与第一转子同心并装配有碰撞表面的定子。该设备包括位于外壳中并向转子或转子和定子的中央开放的进料孔，和位于外壳壁上并向最外部转子或定子的外周开放的出料孔。
[0093]
在一个实例中，崩解通过使用均质机进行。在均质机中，纤维材料在压力的作用下均化。纤维材料分散体向纳米原纤纤维素的均化是由分散体的强制通流引起的，这使得材料崩解为原纤。纤维材料分散体在给定的压力下通过窄通流间隙，其中，分散体线性速度的增加使分散体受到剪切力和撞击力，导致从纤维材料中移去原纤。纤维片段在原纤化步骤中崩解为原纤。
[0094]
在本文中，术语“原纤化”一般指通过向颗粒作功(work)来机械崩解纤维材料，其中纤维素原纤从纤维或纤维片段中脱离。该功可基于各种作用，例如研磨、碾碎或剪切、或它们的组合，或者能够降低颗粒尺寸的其他相应的作用。表述“崩解”或“崩解处理”可与“原纤化”互换使用。
[0095]
经历原纤化的纤维材料分散体是纤维材料和水的混合物，在本文中也被称为“浆(pulp)”。纤维材料分散体一般可指与水混合的整个纤维、从中分离的部分(片段)、原纤束或原纤，并且一般地，水性纤维材料分散体是这类物质的混合物，其中组分之间的比例取决于加工程度或处理阶段，例如取决于同一批次纤维材料在处理过程中的进行处理的次数或“经历”次数。
[0096]
表征纳米原纤纤维素的一种方式是使用含有所述纳米原纤纤维素的水性溶液的粘度。粘度可以是例如布氏粘度或零剪切粘度。如本文所述，比粘度用来将纳米原纤纤维素与非纳米原纤纤维素区分。
[0097]
在一个实例中，用布氏粘度计(布氏粘度)或者其他对应设备来测量纳米原纤纤维素的表观粘度。合适地，使用桨式转子(vane spindle)(73号)。有几种市售的布氏粘度计可用于测量表观粘度，它们都基于相同的原理。合适地，在设备中使用rvdv弹簧(rvdv spring)(布氏rvdv-iii)。用水将纳米原纤纤维素的样品稀释至0.8重量％的浓度，并混合10分钟。稀释的样品物质添加到250ml烧杯中，将温度调节至20℃
±
1℃，如果需要的话进行加热，并混合。使用10rpm的低转速。通常，布氏粘度可以在20℃
±
1℃，0.8％(w/w)的稠度和10rpm的条件下测量。
[0098]
在该方法中例如作为原料提供的纳米原纤纤维素可以通过其在水溶液中提供的粘度来表征。粘度描述了例如纳米原纤纤维素的原纤化程度。在一个实例中，纳米原纤纤维素在分散于水中时提供在20℃
±
1℃，0.8％(w/w)的稠度和10rpm条件下测得的至少2000mpa
·
s，例如至少3000mpa
·
s的布氏粘度。在一个实例中，纳米原纤纤维素在分散于水中时提供在20℃
±
1℃，0.8％(w/w)的稠度和10rpm条件下测得的至少10000mpa
·
s的布氏粘度。在一个实例中，纳米原纤纤维素在分散于水中时提供在20℃
±
1℃，0.8％(w/w)的稠
度和10rpm条件下测得的至少15000mpa
·
s的布氏粘度。所述纳米原纤纤维素在分散于水中时在20℃
±
1℃，0.8％(w/w)的稠度和10rpm条件下测得的布氏粘度范围的实例包括2000
–
20000mpa
·
s，3000
–
20000mpa
·
s，10000
–
20000mpa
·
s，15000
–
20000mpa
·
s，2000
–
25000mpa
·
s，3000
–
25000mpa
·
s，10000
–
25000mpa
·
s，15000
–
25000mpa
·
s，2000
–
30000mpa
·
s，3000
–
30000mpa
·
s，10000
–
30000mpa
·
s和15000
–
30000mpa
·
s。
[0099]
纳米原纤纤维素还可以通过平均直径(或宽度)或平均直径与粘度一起来表征，所述粘度例如是布氏粘度或零剪切粘度。在一个实例中，适用于本文所述产品的纳米原纤纤维素具有在1-200nm或1-100nm范围内的平均原纤直径。在一个实例中，所述纳米原纤纤维素具有在1-50nm范围内，诸如2-20nm或5-30nm的平均原纤直径。在一个实例中，所述纳米原纤纤维素具有在2-15nm范围内的平均原纤直径，例如在tempo氧化的纳米原纤纤维素的情况中。
[0100]
可用多种技术，例如使用显微镜来测定原纤的直径。可通过对场发射扫描电子显微镜(fe-sem)、透射电子显微镜(tem)(例如低温透射电子显微镜(cryo-tem))或原子力显微镜(afm)获得的图像进行图像分析来测定原纤厚度和宽度分布。通常，afm和tem最适合具有窄原纤直径分布的纳米原纤纤维素级别。
[0101]
根据一个实例，在22℃，用装配有窄间隙叶片几何结构(直径28mm，长度42mm)的应力受控的旋转流变仪(ar-g2，英国ta仪器公司(ta instruments,uk))，在直径为30mm的圆筒形样品杯中对纳米原纤纤维素分散体的流变粘度进行测量。在将样品装载到流变仪之后，使它们静止5分钟，之后开始测量。用逐渐增加的剪切应力(其与施加的扭矩成比例)来测量稳态粘度，并测量剪切速率(其与角速度成比例)。在达到恒定剪切速率之后或者在2分钟的最大时间之后，记录某一剪切应力下的报道粘度(＝剪切应力/剪切速率)。当超过1000s-1
的剪切速率时，停止测量。该方法可用于测定零剪切粘度。
[0102]
在另一个实例中，水凝胶样品的流变学测量是用配备有20mm板几何结构的应力控制旋转流变仪(ar-g2，英国ta仪器公司)进行的。将样品以1mm的间隙装载到流变仪之后，不稀释，使它们静置5分钟，然后开始测量。在25℃，10rad/s频率和2％应变下，以0.001
–
100pa范围内逐渐增加的剪切应力来测量应力扫描粘度。可以测定储能模量、损耗模量和屈服应力/断裂强度。
[0103]
已经发现在注射后水凝胶保持其形状需要最低的粘度水平。这可以以350pa或更高的储能模量和25pa或更高的屈服应力/断裂强度为特征。
[0104]
在一个实例中，纳米原纤纤维素(例如在该方法中作为原料提供)当分散在水中时提供在1000
–
100000pa
·
s范围内、例如在5000
–
50000pa
·
s范围内的零剪切粘度(在小剪切应力下恒定粘度的“平台”)，和在1
–
50pa范围内、例如在3
–
15pa范围内的屈服应力(开始剪切稀化时的剪切应力)，这些测量结果是通过旋转流变仪在22℃
±
1℃，0.5重量％(w/w)的稠度条件下在水性介质中测定的。这种纳米原纤纤维素还可以具有200nm或更小的平均原纤直径，例如在1-200nm的范围内。
[0105]
浊度是通常为肉眼不可见的个体颗粒(所有的悬浮或溶解固体)导致的流体的混浊或模糊。有几种测量浊度的实用方式，最直接的是测量光穿过水样柱时的衰减(即，强度的降低)。可以替代使用的杰克逊蜡烛法(单位：杰克逊浊度单位或jtu)本质上是反过来测量完全遮蔽穿过水柱所见的蜡烛火焰所需的水柱长度。
[0106]
可以采用光学浊度测量仪器来定量测定浊度。存在一些市售用于定量测量浊度的浊度计。在本发明中，采用基于比浊法的方法。来自校准比浊计的浊度单位称作比浊法浊度单位(ntu)。用标准校准样品对测量设备(浊度计)进行校准和控制，然后对经稀释的nfc样品的浊度进行测量。
[0107]
在一种浊度测量方法中，将纳米原纤纤维素样品在水中稀释至低于所述纳米原纤纤维素的胶凝点的浓度，测量稀释样品的浊度。测得纳米原纤纤维素样品的浊度的所述浓度为0.1％。采用具有50ml测量容器的hach p2100浊度计(turbidometer)来进行浊度测量。测定纳米原纤纤维素样品的干物质，将0.5g样品(以干物质计算)装载到测量容器中，其用自来水填充至500g，并通过振荡剧烈混合约30秒。立即将水性混合物分入5个测量容器中，将它们插入浊度计中。对每个容器进行3次测量。从所获得的结果计算平均值和标准偏差，最终结果单位为ntu单位。
[0108]
表征纳米原纤纤维素的一种方式是既限定粘度又限定浊度。低浊度表示原纤的小尺寸，例如小直径，因为小原纤对光的散射很差。一般而言，随着原纤化程度增加，粘度增加并且同时浊度降低。然而，这种情况直到达到某个点之前一直在发生。当进一步进行原纤化时，原纤最终开始破裂并且不能再形成牢固的网络。因此，在此点之后，浊度和粘度都开始下降。
[0109]
在一个实例中，阴离子纳米原纤纤维素的浊度低于90ntu，例如3-90ntu，诸如5-60ntu，例如8-40ntu，这些数值是通过比浊法在0.1％(w/w)稠度下在水性介质中测得。在一个实例中，天然纳米原纤的浊度甚至可以高于200ntu，例如10-220ntu，诸如20-200ntu，例如50
–
200ntu，这些数值是通过比浊法在20℃
±
1℃，0.1％(w/w)稠度条件下在水性介质中测得。为了表征纳米原纤纤维素，这些范围可以与纳米原纤纤维素的粘度范围如零剪切粘度，储能模量和/或屈服应力结合。
[0110]
纳米原纤纤维素可以是未改性的纳米原纤纤维素或包含未改性的纳米原纤纤维素。未改性的纳米原纤纤维素的排液明显比例如阴离子级别更快。未改性的纳米原纤纤维素通常具有在20℃
±
1℃，0.8％(w/w)的稠度和10rpm下测得的2000
–
10000mpa
·
s范围内的布氏粘度。纳米原纤纤维素优选具有合适的羧酸含量，例如在0.6-1.4毫摩尔cooh/克的范围内，例如在0.7-1.2毫摩尔cooh/克的范围内，或在0.7-1.0毫摩尔cooh/克的范围内，或在0.8
–
1.2毫摩尔cooh/克的范围内，该羧酸含量通过电导滴定法测定。
[0111]
崩解的纤维类纤维素原料可以是改性的纤维原料。改性的纤维原料是指纤维受处理影响从而使纤维素纳米原纤更易于从纤维上脱离的原料。通常对液体中悬浮物(即浆料)形式存在的纤维类纤维素原料进行改性。
[0112]
对纤维的改性处理可以是化学、酶促或物理改性处理。在化学改性中，纤维素分子的化学结构通过化学反应(纤维素的“衍生化”)改变，优选使得纤维素分子的长度不受影响，但官能团添加至聚合物的β-d-吡喃葡萄糖单元。纤维素的化学改性以某一转化度发生，该转化度取决于反应物的剂量和反应条件，原则上化学改性不完全，这样纤维素将保持为原纤的固体形式并且不溶于水。在物理改性中，阴离子型、阳离子型或非离子型物质或其任意组合物理吸附在纤维素表面上。
[0113]
改性后，纤维中的纤维素尤其可以带离子电荷。纤维素的离子电荷削弱了纤维的内部键，随后将促进其崩解为纳米原纤纤维素。可以通过对纤维素进行化学或物理改性来
获得离子电荷。与起始原料相比，改性后的纤维可以具有更高的阴离子或阳离子电荷。用于形成阴离子电荷的最常用化学改性方法是氧化(其中羟基被氧化为醛基和羧基)，磺化和羧甲基化。可能需要化学改性引入基团，例如羧基，其可以参与纳米原纤纤维素和生物活性分子之间共价键的形成。进而，可以通过使阳离子基团(例如季铵基团)连接至纤维素来进行阳离子化，从而以化学方式产生阳离子电荷。
[0114]
纳米原纤纤维素可包括化学改性的纳米原纤纤维素，例如阴离子改性的纳米原纤纤维素或阳离子改性的纳米原纤纤维素。在一个实例中，纳米原纤纤维素是阴离子改性的纳米原纤纤维素。在一个实例中，阴离子改性的纳米原纤纤维素是氧化的纳米原纤纤维素。在一个实例中，阴离子改性的纳米原纤纤维素是磺化的纳米原纤纤维素。在一个实例中，阴离子改性的纳米原纤纤维素是羧甲基化的纳米原纤纤维素。通过纤维素的阴离子改性获得的材料可以称为阴离子纤维素，其是指与未改性的材料相比，通过改性增加了阴离子基团(例如羧基)的量或比例的材料。作为羧基的替代或者补充，还可以将其他阴离子基团引入纤维素，例如磷酸根基团或硫酸根基团。这些基团的含量可以在与本文关于羧酸公开的范围相同的范围内。
[0115]
纤维素可以被氧化。在纤维素的氧化中，纤维素的伯羟基可以通过杂环硝酰基化合物，例如通过n-氧基介导的催化氧化(例如2,2,6,6-四甲基哌啶-1-氧基自由基，通常称为“tempo”)进行催化氧化。纤维素β-d-吡喃葡萄糖单元的伯羟基(c6-羟基)被选择性地氧化为羧酸基团。还从伯羟基形成一些醛基。关于这一发现，即低的氧化程度不能实现足够有效的原纤化而较高的氧化程度在机械破坏处理之后影响纤维素的降解，纤维素可氧化到一定的水平，即通过电导滴定测定的氧化纤维素中的羧酸含量为0.5
–
2.0毫摩尔cooh/克浆料，或0.6
–
1.4毫摩尔cooh/克浆料，或0.8
–
1.2毫摩尔cooh/克浆料，优选1.0
–
1.2毫摩尔cooh/克浆料。当由此得到的氧化的纤维素的纤维在水中崩解时，它们提供个体化纤维素原纤的稳定透明分散体，该个体化纤维素原纤的宽度可以例如为3-5nm。当氧化的浆料作为起始介质时，可以得到在0.8％(w/w)稠度下测得的布氏粘度至少为10000mpa
·
s、例如在10000
–
30000mpa
·
s范围内的纳米原纤纤维素。
[0116]
在本公开中无论何时提及催化剂“tempo”，很明显所有涉及“tempo”的测量和操作都等同地或者类似地适用于tempo的任意衍生物或者任意能够选择性催化纤维素中c6碳的羟基基团的氧化的杂环硝酰基自由基。
[0117]
本文公开的纳米原纤纤维素的改性也可以应用于本文描述的其他原纤纤维素级别。例如，高度精制的纤维素或微原纤纤维素也可以被类似地化学改性或酶改性。但是，例如，材料的最终原纤化程度存在差异。
[0118]
在一个实例中，这些化学改性的纳米原纤纤维素在分散于水中时提供在20℃
±
1℃，0.8％(w/w)的稠度和10rpm条件下测得的至少10000mpa
·
s的布氏粘度。在一个实例中，这些化学改性的纳米原纤纤维素在分散于水中时提供在20℃
±
1℃，0.8％(w/w)的稠度和10rpm条件下测得的至少15000mpa
·
s的布氏粘度。在一个实例中，这些化学改性的纳米原纤纤维素在分散于水中时提供在20℃
±
1℃，0.8％(w/w)的稠度和10rpm条件下测得的至少18000mpa
·
s的布氏粘度。所用的阴离子纳米原纤纤维素的例子的布氏粘度在13000
–
15000mpa
·
s或18000
–
20000mpa
·
s的范围内，或甚至最高达25000mpa
·
s，这取决于原纤化的程度。
[0119]
在一个实例中，纳米原纤纤维素是tempo氧化的纳米原纤纤维素。该材料在低浓度下提供高粘度，例如在20℃
±
1℃，0.8％(w/w)稠度和10rpm条件下测得的至少20000mpa
·
s、甚至至少25000mpa
·
s的布氏粘度。在一个实例中，tempo氧化的纳米原纤纤维素在20℃
±
1℃，0.8％(w/w)稠度和10rpm条件下测得的布氏粘度在20000
–
30000mpa
·
s的范围内，例如25000
–
30000mpa
·
s。
[0120]
在一个实例中，纳米原纤纤维素包含未化学改性的纳米原纤纤维素。在一个实例中，这种未化学改性的纳米原纤纤维素在分散于水中时提供在20℃
±
1℃，0.8％(w/w)的稠度和10rpm条件下测得的至少2000mpa
·
s，或至少3000mpa
·
s的布氏粘度。
[0121]
用于增强制造工艺或者改进或调节产品性质的助剂可包含在纳米原纤纤维素分散体中。这些助剂可以溶于分散体的液相中，它们可以形成乳液或者它们可以是固体。助剂可以在制造纳米原纤纤维素分散体的过程中已经添加到原料中，或者可以添加到形成的纳米原纤纤维素分散体或凝胶中。助剂也可以添加到最终产品中，例如通过浸渍、喷洒、浸没、浸泡等方法添加到最终产品中。助剂通常不与纳米原纤纤维素共价结合，因此它们可以从纳米纤维素基质中释放出来。当使用nfc作为基质时，可以得到这些试剂的控释和/或缓释。助剂的实例包括治疗剂(药剂)和影响产品性质或活性剂性质的其它试剂，例如缓冲剂、表面活性剂、增塑剂、乳化剂等。在一个实例中，分散体含有一种或多种盐，其可以加入以增强最终产品的性质或促进在制造过程中从产品中除去水。盐的实例包括氯盐，例如氯化钠，氯化钙和氯化钾。盐的含量可以为分散体中干物质的0.01-1.0％(w/w)。也可将最终产品浸入或浸泡在氯化钠溶液中，例如浸入或浸泡在约0.9％的氯化钠水溶液中。最终产品中所需的盐含量可以是湿产品体积的0.5-1％，例如约0.9％。可以提供盐、缓冲剂和类似试剂以获得生理条件。
[0122]
可以包括多价阳离子以获得纳米原纤纤维素的非共价交联。一个实例提供了一种纳米原纤纤维素产品，其包含纳米原纤纤维素，特别是包含阴离子改性的纳米原纤纤维素，以及多价阳离子，例如多价金属阳离子，例如选自钙、钡、镁、锌、铝、金、铂和钛的阳离子，其中所述纳米原纤纤维素被所述多价阳离子交联。特别是钡和钙可能在生物医学应用中有用，并且特别是钡可以用于标记并可以用于检测注入的水凝胶。根据水凝胶的干含量计算，多价阳离子的量可以在0.1
–
3％(w/w)的范围内，例如0.1
–
2％(w/w)。
[0123]
一个例子提供了一种制备这种水凝胶的方法，该方法包括提供浆料，将浆料崩解直至获得纳米原纤纤维素，将纳米原纤纤维素形成为水凝胶。
[0124]
可以将纳米原纤纤维素原纤化到所需的原纤化程度，并调节至所需的水含量，或进行其他改性，以使其形成具有如本文所述的所需性质的凝胶。在一个实例中，水凝胶中的纳米原纤纤维素是阴离子改性的纳米原纤纤维素。
[0125]
用作医用或科学水凝胶的水凝胶需要是均匀的。因此，制备水凝胶的方法可以包括使包含纳米原纤纤维素的水凝胶均化，优选用均质化装置如本文所述的那些进行均化。利用这种优选的非原纤化均化步骤，可以从凝胶中除去不连续区域。获得具有可用于应用的更好性质的均匀凝胶。水凝胶可以进一步灭菌，例如通过使用加热和/或辐射，和/或通过添加灭菌剂，例如抗微生物剂来进行灭菌。
[0126]
本技术提供了纳米原纤纤维素用于制备可移植细胞组合物的用途。纳米原纤纤维素可以是本文公开的任何合适的纳米原纤纤维素，并且制备的可移植细胞组合物可以是本
文公开的任何可移植细胞组合物。
[0127]
组合物的用途
[0128]
本文公开的在纳米原纤纤维素水凝胶中包含真核细胞的组合物可以用于各种方法，包括将组合物递送、移植、注射、植入和/或以其他方式给予至对象，例如人或动物对象，例如人。对象可以是患者，特别是需要涉及组合物中包含的细胞的治疗的患者。该方法包括以合适的形式，例如以可注射形式、可植入形式或可移植形式，提供在纳米原纤纤维素水凝胶中包含真核细胞的组合物。
[0129]
本技术提供用于包括向对象施用细胞的治疗方法的可移植组合物。本技术提供用于细胞移植的可移植组合物。
[0130]
这些用途可以在治疗方法中实施，所述治疗方法例如是基于细胞的治疗，例如干细胞治疗。方法可以是细胞移植方法，如本文所公开的。
[0131]
一个实例提供了一种用于治疗需要干细胞治疗的对象的方法，该方法包括：
[0132]-识别需要干细胞治疗的对象，
[0133]-提供本文公开的包含位于纳米原纤纤维素水凝胶中的真核干细胞的组合物，和
[0134]-向对象施用或递送组合物，例如通过注射或通过植入来进行。
[0135]
一个实例提供了一种用于治疗需要细胞移植的对象的方法，该方法包括：
[0136]-识别需要细胞移植的对象，
[0137]-提供本文公开的包含位于纳米原纤纤维素水凝胶中的真核细胞的组合物，和
[0138]-将组合物移植到对象，例如通过注射或植入进行。
[0139]
可以使用干细胞的治疗方法多种多样，包括例如组织再生，心血管疾病治疗，脑部疾病治疗，例如帕金森病和阿尔茨海默病治疗，细胞缺乏症治疗，例如i型糖尿病，血液疾病治疗，例如提供造血干细胞来治疗白血病，镰状细胞贫血和其他免疫缺陷问题。
[0140]
实施例
[0141]
与干细胞球体一起使用的nfc水凝胶减少了不希望的团聚，并使细胞在细胞移植过程中免受注射剪切力的影响。结果表明，人胚胎干细胞衍生的球体(hecm)在nfc水凝胶中成功分化为神经网络。hecm球体在nfc中成功移植到小鼠内耳中，在细胞递送3周后它们仍然存活。
[0142]
以下实验揭示了用于内耳干细胞替代疗法的支持性生化干细胞生态位的产生。
[0143]
引言
[0144]
听力损失通常是由于毛细胞(hc)的损失和随后的螺旋神经节神经元(sgn)的损失造成的，螺旋神经节神经元是与大脑的必然联系。hc受损后，螺旋神经节神经元(sgn)的退化可能会持续数周至数年。在人和大多数实验动物中，sgn损伤遵循从远端到中央的进展，外周突首先退化。这种模式对人工耳蜗(ci)的听力恢复有负面影响：由于没有外周突，sgn细胞体被认为是无法电激发的，ci电极的电主体是相对较远的中央(蜗轴(modiolar))突。这种“电极-神经元间隙”降低了ci电极的空间选择性，增加了有害的ci通道相互作用，并可能限制信息传递。
[0145]
阶内(intra-scalar)细胞外基质(ecm)的植入可以通过将机械支架与阶鳞状上皮相结合来提供干细胞生态位。ecm可以将移植的干细胞保留在位并定位细胞间信号传导。ecm与干细胞衍生的球体一起使用可以减少不需要的团聚并使细胞免受可能导致细胞凋亡
的注射剪切力的影响。过去，通常使用哺乳动物衍生的胶原蛋白，因为它们提供存在于哺乳动物组织中的局部环境线索。然而，它们容易受到体内酶促降解的影响，因此难以创造持久的生态位。纳米原纤纤维素(nfc)水凝胶具有产生干细胞生态位的潜力。nfc水凝胶在纤维大小和机械性能方面模拟天然软组织ecm。它们是可注射的，因此能够将细胞(包括人胚胎干细胞衍生的球体)递送给所需的对象。nfc水凝胶很容易注射，因为挤出剪切力足够大，可以在注射过程中降低粘度，并且一旦去除剪切力就可以稳定保持其形状。作为植物来源的材料，nfc水凝胶无异源。纤维素具有生物相容性，因为其具有适度的(如果有的话)外来反应，并且对于干细胞应用是安全的，对hesc没有已知的毒性。纤维素也是生物耐久的；纤维素吸收缓慢，因为细胞不能合成降解纤维素所需的纤维素酶。nfc水凝胶可以保持局部状态，并作为体内药物释放的持久载体，例如在小鼠体内。研究了在ecm(即nfc水凝胶)中加入衍生聚集体对耳神经元分化、轴突生长和突触发生的促进。用nfc水凝胶将hesc衍生的球体作为3-d多细胞聚集体植入小鼠内耳。
[0146]
方案
[0147]
从hesc生成人耳神经元祖细胞(onp)和sgn
[0148]
用逐步方法再现人onp和sgn发展的阶段有助于hesc向sgn命运的受控分化。开发了一个方案，用于通过用在鸡、非洲爪蟾(xenopus)和啮齿动物听觉神经系统中表达的可扩散配体的人类似物进行处理来从hesc(h1、h7和h9，wicell，wi，美国)中获得onp和sgn。
[0149]
从hesc生成人onp和sgn
[0150]
人esc衍生的onp是使用matsuoka aj、morrissey zd、zhang c、homma k、belmadani a、miller ca等人在《人胚胎干细胞向基板衍生的螺旋神经节样感觉神经元的定向分化》(directed differentiation of human embryonic stem cells toward placode-derived spiral ganglion-like sensory neurons),stem cells transl med，2017年3月；6(3):923
–
36中描述的方案生产的，并接种到ezsphere
tm
微孔中以产生球体聚集体，其直径由接种密度和培养时间控制。
[0151]
简而言之，方法如下：
[0152]
1.在涂有r-laminin-511(imatrix-511tm,nacalai)的传统单层六孔组织培养板中接种hesc衍生的耳神经祖细胞(onp)两天，并辅以我们之前发布的onp维持培养基。
[0153]
2.以2x106个细胞/ml的接种密度将onp单悬浮并接种到微制造的3-d细胞培养装置(ezspheretm，nacalai)中。
[0154]
3.让细胞在微孔中聚结并形成聚集体。培养3天后，球体就可以转移到growdex。
[0155]
4.转移前，将growdex用pbs(-/-)稀释至工作浓度为1％(v/v)。
[0156]
5.将150μl 1％天然级growdex或1％阴离子级growdex()添加到96孔板中。
[0157]
5a.使用低粘附性p200微量移液器吸头将growdex转移到孔中。
[0158]
5b.growdex被吸收并缓慢分配以避免产生气泡。如果摄取困难，则将growdex在小型离心机中旋转离心。
[0159]
6.使用光学显微镜协助观察球体，使用广口p1000微量移液器吸头从培养物中取出一到两个球体，并分配在growdex顶部并轻轻混合到水凝胶中。
[0160]
7.然后小心地将100μl onp维持培养基放在growdex的顶部上。
[0161]
8.将板在37℃、5％co2下孵育，每三天更换一半培养基，方法是从孔顶部去除培养
基(注意不要干扰凝胶)。随后在凝胶顶部加入适量的培养基和生长因子。
[0162]
耳聋和听力评估
[0163]
年龄为p28-30的dtr小鼠用一次50ng/g肌内注射白喉毒素(目录号：d0564，西格玛
·
奥尔德里奇公司(sigma-aldrich)，圣路易斯，密苏里州)致聋。在注射前即刻和注射后1周获得短纯音听觉脑干反应(abr)以确认效果。在iac双壁隔音室中收集abr，小鼠使用75mg/kg氯胺酮和8mg/kg甲苯噻嗪(i.p.)镇静。使用采用testpoint平台编写的定制软件进行刺激控制和平均。短纯音以250,000采样/秒的速度生成，分辨率为12位，并以51ms的刺激间间隔呈现。正弦曲线采用1ms线性上升斜坡、3ms平坦平台和1ms线性下降斜坡进行窗口化。在通过单位增益alesisra150放大器进行阻抗转换并通过安装在定制窥器中的beyer dt-7700驱动器进行转换后，将窥器放置在外管的入口处。将皮下针电极插入前囟( 输入)、乳突(-输入)和腹部(中性接地)。诱发电位由wpi iso-80差分放大器放大(10,000倍)，并通过frequency devices 901p滤波器组(8极巴特沃斯高通，3db截止频率为300hz；8极贝塞尔低通，3khz的3db频率)过滤。进行时域平均，以便实现至少6db的响应噪声比或收集1024个平均值，波形以250,000采样/秒和12位分辨率存储。伪差去除用于省略心肌源活动(即emg)的污染,这在小鼠中相对较大。图2显示了dtr小鼠和野生型c57/bl6j(杰克逊实验室(jackson laboratory)，美国缅因州巴尔港(bar harbor))上的abr示例图。
[0164]
将hesc衍生的听觉神经元体内移植到内耳
[0165]
在3-d培养装置中培养五天后，将hesc衍生的onp球体转移到96孔板并悬浮在1.5％growdextm或2％growdex-ttm中。使用广口p1000微量移液器吸头转移人esc衍生的onp球体，并轻轻混合到growdextm或growdex-ttm中以防止气泡形成。一旦重新悬浮在nfc水凝胶中后，将水凝胶和球体再次转移到35-mm细胞培养皿中。35-mm培养皿的低壁允许我们的细胞转移微量移液器以适当的低角度接近培养皿。
[0166]
使用无菌技术在致聋一周后对dtr小鼠进行植入。在手术前给予美洛昔康(2mg/kg)以尽量减少有时在同步麻醉中观察到的呼吸窘迫的潜在并发症。后续剂量(1mg/kg)每天给药一次，持续三天和prn。使用3-4％的异氟醚诱导麻醉，诱导后减少到1-2％，使用0.3l/分钟的o2气体和0.25l/分钟的n2o气体进行递送。动物的头部固定在一个定制的头部固定器上，该固定器还通过鼻锥输送麻醉气体。热疗由循环水泵提供，并以0.1ml/10g的量替代无感觉的体液流失。一旦达到麻醉的手术平面，就进行耳后切口，并使用缝合系带在头侧和尾侧反映皮肤和肌肉。离开耳后骨的面神经的可视化提供了标志(紧接在该点的后面)，通过0.5mm金刚石磨头将覆盖圆窗的颞骨变薄，注意避免干扰镫骨动脉。为了进入鼓阶，使用弯曲的33g针切下圆窗膜。调整微量移液器支架及其显微操作器，使微量移液器正确接触圆窗膜的边缘。完成后，整个机械手在其垂直轴上旋转，将移液器吸头移至安装在升降架上的细胞皿；这最大限度地减少了额外调整和保持微量移液器静水压力的不必要的复杂性。因此，将细胞培养皿升至注射微量移液器的水平，并通过基于压力(xenoworks数字注射器，美国加利福尼亚州诺瓦托市萨特公司(sutter inc.))或基于体积转移(数字微量注射泵(digital microsyringe pump),美国佛罗里达州萨拉索塔wpi公司)的仪器用微量移液器保持球体。一旦被捕获，微量移液管被摆回移植位置，球体或细胞器被释放到耳蜗的底转。圆窗缺陷由筋膜覆盖并用vet bond粘合剂固定。肌肉和皮肤分层闭合，在热疗的帮助下使动物恢复。术后，我们给予丁丙诺啡-sr-la进行疼痛的预防性管理。在安静且视觉上与世
隔绝的笼子里恢复通常有助于减少刺激，有助于减轻应激。在出现术后并发症(例如手术伤口感染)的情况下，使用局部抗生素并与兽医人员协商进行疼痛管理。
[0167]
组织固定和免疫组织化学
[0168]
植入后存活期完成后，每只动物在co2室中安乐死，然后立即进行心内灌注。打开胸腔，剪断右心房，用25g针穿刺左心室尖端进行灌注。灌注10ml体积的生理盐水，然后灌注10ml 4％多聚甲醛。将耳蜗从颞骨切开并放入5ml 16％edta中，在4℃下连续旋转5天，每天更换溶液。组织在三天内用增加的蔗糖梯度(10％到30％)进行冷冻保护。将样品包埋在最佳切削温度化合物(f)中并在-80℃下冷冻。然后在leica cm3050s低温恒温器(德国努斯洛奇的徕卡公司(leica inc.,nussloch,germany))上将组织切成10μm的切片，并固定在涂有明胶的载玻片上。在染色之前，将载玻片储存在-80℃。通过在0.001m edta(ph＝9)中在120℃下将载玻片蒸30分钟来进行抗原修复。蒸煮后，样品用pbs洗涤3次，并在10％正常山羊血清和5％牛血清白蛋白的pbst溶液中封闭一小时。将样品与小鼠抗人核抗体(1:100，stem101，日本东京的宝生物工程株式会社(takara bio，tokyo，japan))在4℃下孵育过夜。第二天用pbst中的1％正常山羊血清清洗载玻片，然后用alexa fluor 405偶联的抗小鼠二抗(1:500，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆市的英杰公司(invitrogen))孵育1小时(在室温和避光下)。用pbst中的1％正常山羊血清清洗载玻片，然后用toto-3碘化物核复染剂(1:10,000，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆的赛默费雪公司(thermo fisher))孵育15分钟。最后用pbs洗涤样品，然后用prolong gold抗褪色封固剂(美国马萨诸塞州沃尔瑟姆的赛默费雪公司(thermo fisher))进行处理。使用leica tcs sp5显微镜(德国努斯洛奇的徕卡公司(leica,inc.))进行激光扫描共焦成像。
[0169]
结果
[0170]
提供了从未分化的hpsc到an的逐步神经元分化方案。使用该方案，用2％growdex tm生成的hesc衍生的onp球体如图1所示。此外，图2中显示了用1.5％growdex
tm
生成的hesc衍生的onp球体。免疫细胞化学证明了用2％growdex-ttm培养的人esc衍生的onp球体表达了an蛋白标记物(map2和β-iii微管蛋白)(图3a)。hesc衍生的onp可以进一步分化为更成熟的神经元。图3b显示了在神经元分化培养基中额外培养14天的hesc衍生的onp在彼此之间延伸神经突；表明它们已经建立了一个神经元网络。为了在体内识别hesc衍生的onp球体，使用含有evrogen turborfp orf和turbogfp-2a-blast(通用电气医疗(ge healthcare)，芝加哥，伊利诺伊州，美国)的ploc慢病毒载体生成在核中表达gfp和在细胞质中表达rfp的hesc衍生的onp(图3c)。在dtr小鼠内耳中用1.5％growdex tm移植的人esc衍生的onp球体可以用抗人核抗体stem101(st101)进行鉴定。注意到，在使用四种hesc衍生的onp球体进行移植手术三周后，在内耳的三个腔室之一的中阶(sm)中发现stem101阳性细胞。