一种原代汗腺细胞条件培养基及原代汗腺细胞培养方法与流程

1.本发明涉及汗腺细胞培养技术领域，特别是涉及一种实现人汗腺细胞体外长期培养扩增的原代汗腺细胞条件培养基及原代汗腺细胞培养方法。


背景技术：

2.汗腺是皮肤最为重要的附属器官之一，在物质代谢、水电解质平衡以及维持机体内环境稳态等方面具有举足轻重的作用。然而汗腺的再生能力有限，且创伤后皮肤的瘢痕性修复进一步破坏了汗腺的结构和功能，导致皮肤不能正常排汗，体温调节失衡，给患者带来巨大生理及心理伤害。
3.当前主要应用生长因子、基因治疗等策略来激活机体原位组织细胞的再生潜能，以实现创伤皮肤的功能性修复。但是大面积烧创伤后创面内残存的汗腺细胞数量不足，再生潜能有限。无法启动创伤修复的级联反应，修复损伤汗腺的结构及功能。因此自体或同种异体汗腺移植成为理想的选择，为解决大面积深度烧创伤患者的康复治疗，恢复其排汗功能带来了新的契机。尽管如此，供体组织来源短缺、原代汗腺获取过程繁杂、汗腺细胞体外增殖能力弱、难以长期扩增培养并维持其生物学特性。这些缺点阻碍了相关技术的进一步临床推广。因此，如何能在体外有效扩增并获得高质量、高纯度的汗腺细胞，以满足大规模临床治疗的需求，是汗腺移植临床应用最为关键的科学问题之一，同时也是研发含汗腺组织工程皮肤必须攻克的难点问题之一。


技术实现要素：

4.本发明实施例提供了一种实现人汗腺细胞体外长期培养扩增的原代汗腺细胞条件培养基及原代汗腺细胞培养方法，以解决现有技术中体外分离培养的汗腺细胞增殖能力弱、难以长期扩增培养并维持其生物学特性的问题。
5.为了解决上述问题，本技术是这样实现的：
6.第一方面，本发明实施例提供了一种原代汗腺细胞条件培养基，其中，包括细胞基础培养基、血清、glutamax、缓冲液、细胞培养添加剂、青霉素/链霉素、表皮细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、非必需氨基酸、胰岛素、rock抑制剂及nf-κb激动剂。
7.可选地，所述的原代汗腺细胞条件培养基中，所述nf-κb激动剂为佛波醇12-十四酸酯13-乙酸酯。
8.可选地，所述的原代汗腺细胞条件培养基中，佛波醇12-十四酸酯13-乙酸酯为0.01～0.05μg/ml
9.可选地，所述的原代汗腺细胞条件培养基中，所述细胞基础培养基为dmem/f12培养基。
10.可选地，所述的原代汗腺细胞条件培养基中，所述细胞培养添加剂为b27。
11.可选地，所述的原代汗腺细胞条件培养基中，所述rock抑制剂为y-33075。
12.可选地，所述的原代汗腺细胞条件培养基中，所述表皮细胞生长因子的含量为20
～50ng/ml、所述碱性成纤维细胞生长因子的含量为10～20ng/ml、所述y-33075的含量为0.5～1μm。
13.第二方面，本发明实施例提供了一种实现人汗腺细胞体外长期培养扩增的条件培养基，其中，包括以下步骤：
14.取细胞培养皿，加入如上述的原代汗腺细胞条件培养基；
15.将原代汗腺组织加入所述细胞培养皿中，待汗腺组织贴壁后，补加所述原代汗腺细胞条件培养基，且每隔2～3天换液一次；
16.在汗腺细胞融合度达到70％-80％时，进行消化传代，获得扩增后的汗腺细胞。
17.可选地，所述的方法中，在加入原代汗腺细胞条件培养基的步骤之前，所述方法还包括：
18.向所述细胞培养皿中加入胶原蛋白，然后置于co2培养箱中进行包被处理后吸掉胶原蛋白，并用磷酸缓冲盐溶液清洗。
19.可选地，所述的方法中，所述消化传代的过程包括：
20.弃掉培养基，用磷酸缓冲盐溶液清洗后加入细胞消化液，置于co2培养箱中进行消化，待汗腺细胞漂浮时加入上述培养基终止消化；
21.将终止消化后的培养液混匀，然后按1:2进行传代，加入包被处理后的细胞培养皿中，再置于co2培养箱中培养，待汗腺细胞贴壁后利用所述原代汗腺细胞条件培养基进行换液，且每隔2～3天换液一次。
22.本发明实施例包括以下优点：
23.本发明实施例中，在原代汗腺细胞条件培养基中添加有表皮生长因子、成纤维细胞因子及rock抑制剂，通过表皮细胞生长因子和碱性成纤维细胞生长因子、rock抑制剂以及nf-κb激动剂的组合对原代汗腺细胞进行处理，以实现人原代汗腺细胞在体外长期扩增培养，并在传代中维持其自身的生物学特性，为快速大量制造高质量的、可移植用人汗腺细胞，满足大规模临床治疗的需求提供了前提条件。
附图说明
24.图1为体外扩增第3天后的第一代汗腺细胞形态图，bar＝200um；
25.图2为体外扩增第5天后的第一代汗腺细胞形态图，bar＝200um；
26.图3为体外扩增第15天后的第二代汗腺细胞形态图，bar＝200um；
27.图4为体外扩增第15天后的第二代汗腺细胞形态图，bar＝50um；
28.图5为体外扩增第30天后的第三代汗腺细胞形态图，bar＝200um；
29.图6为体外扩增第30天后的第三代汗腺细胞形态图，bar＝50um；
30.图7为体外扩增第33天后的第四代汗腺细胞形态图，bar＝200um；
31.图8为体外扩增第40天后的第四代汗腺细胞形态图，bar＝200um；
32.图9为不同培养基体外培养10天的原代汗腺细胞β-半乳糖苷酶染色效果比对图；
33.图10为本发明实施例培养基体外培养不同时间的原代汗腺细胞β-半乳糖苷酶染色效果对比图；
34.图11为原代汗腺细胞的ck5 pcr结果图；
35.图12为原代汗腺细胞的ck18 pcr结果图。
具体实施方式
36.为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
37.本发明实施例所提供的原代汗腺细胞条件培养基，包括细胞基础培养基、血清、谷氨酰胺添加剂(glutamax)、缓冲液、细胞培养添加剂、青霉素/链霉素双抗、表皮细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、非必需氨基酸、胰岛素rock抑制剂及nf-κb激动剂。
38.其中，表皮细胞生长因子(egf)和碱性成纤维细胞生长因子(fgf)均可以激活细胞外信号调节蛋白激酶(erk)信号通路，egf在汗腺的形态发生和内稳态中发挥积极的作用；而fgf调控着上皮组织器官生长发育的各个阶段，作为特定旁分泌介质结合于上皮细胞表面受体，从而刺激上皮细胞的增殖；而rock抑制剂能激活生长促进基因igf2和aldh1a1的持续表达，抑制凋亡，从而促进上皮干细胞的增殖和存活。
39.因此，本发明实施例所提供的细胞培养基中，将表皮生长因子、成纤维细胞因子、rock抑制剂和nf-κb激动剂进行组合，能够在维持原代汗腺细胞自身稳态的情况下，延缓原代汗腺细胞的衰老进程，使提取出来的原代汗腺迅速爬出汗腺细胞并快速扩增，并且能够维持原代汗腺培养过程中的生物学特性，克服了传统组织块培养法获取的汗腺细胞数量少、培养时间长等问题。
40.可选地，上述血清浓度的体积百分数为5～10％，glutamax浓度为1～2mm，缓冲液浓度为5～10mm，细胞培养添加剂浓度为0.5～1％，青霉素/链霉素双抗浓度体积百分数为1～2％，非必需氨基酸的体积百分数为1～2％，胰岛素浓度为5～10μg/ml。
41.可选地，本发明实施例所提供的原代汗腺细胞条件培养基中，上述rock抑制剂具体可以为y-33075。
42.可选地，在上述原代汗腺细胞条件培养基中，表皮细胞生长因子的含量为20～50ng/ml、碱性成纤维细胞生长因子的含量为10～20ng/ml、y-33075的含量为0.5～1μm。其中，各成分的浓度过低并没有效果，而浓度过高会抑制细胞生长。
43.可选地，在一种实施方式中，本发明实施例所提供的原代汗腺细胞条件培养基，还包括nf-κb激动剂。nf-κβ通路作为eda/edar信号的下游，能激活shh、细胞周期蛋白d1、fox基因家族等在汗腺发育的各个阶段起作用的基因组分。因此nf-κb激动剂能替代汗腺发育调控因子eda的作用，在汗腺细胞体外扩增培养体系中维持其生物学特性。
44.可选地，在一种具体实施方式中，上述nf-κb激动剂为佛波醇12-十四酸酯13-乙酸酯(pma)，能够有效维持汗腺细胞的特性。
45.可选地，在一种具体实施方式中，pma的含量为0.01～0.05μg/ml。
46.可选地，在上述原代汗腺细胞条件培养基中，细胞基础培养基为dmem/f12培养基。
47.可选地，所述的原代汗腺细胞条件培养基中，所述细胞培养添加剂为b27添加剂，可以提供营养，维持细胞生长。
48.本发明实施例还提供了一种原代汗腺细胞培养方法，包括以下步骤：
49.s1、取细胞培养皿，加入如上述的原代汗腺细胞条件培养基；
50.s2、将原代汗腺组织加入所述细胞培养皿中，待汗腺组织贴壁后，补加所述原代汗腺细胞条件培养基，且每隔2～3天换液一次；
51.s3、在汗腺细胞融合度达到70％-80％时，进行消化传代，获得扩增后的汗腺细胞。
52.本发明实施例所提供的方法，因在原代汗腺细胞条件培养基中添加有表皮细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、rock抑制剂以及nf-κb激动剂，利用该原代汗腺细胞培养基培养原代汗腺细胞，可以通过表皮细胞生长因子和碱性成纤维细胞生长因子、rock抑制剂以及nf-κb激动剂的组合对原代汗腺细胞进行处理，实现人原代汗腺细胞在体外长期扩增培养，并在传代中维持其自身的生物学特性，为快速大量制造高质量的、可移植用人汗腺细胞，满足大规模临床治疗的需求提供了前提条件。
53.可选地，上述步骤s1中，在加入原代汗腺细胞培养基的步骤之前，向所述细胞培养皿中加入胶原蛋白，然后置于co2培养箱中进行包被处理后吸掉胶原蛋白，并用磷酸缓冲盐溶液清洗。
54.其中，利用胶原蛋白包被细胞培养皿，可以使汗腺组织快速贴壁并爬出汗腺细胞，加快培养过程。上述胶原蛋白具体可以为iv胶原蛋白，上述co2培养箱的温度为37℃、co2体积分数为5％，包被处理时长为10～15分钟。
55.可选地，上述步骤s2中，可以利用1ml枪头吸取原代汗腺组织直接打到加有上述培养基的细胞培养皿中；然后经8个小时即可完成汗腺组织的贴壁生长。
56.可选地，在一种实施方式中，上述步骤s3具体包括步骤s301～s302：
57.步骤s301、弃掉培养基，用磷酸缓冲盐溶液清洗后加入细胞消化液，置于co2培养箱中进行消化，待汗腺细胞漂浮时加入上述培养基终止消化；
58.步骤s302、将终止消化后的培养液混匀，然后按1:2进行传代，加入包被细胞培养皿中，再置于co2培养箱中培养，待汗腺细胞贴壁后利用所述原代汗腺细胞培养基进行换液，且每隔2～3天换液一次。
59.上述步骤s301中，先弃掉汗腺细胞条件培养基，然后用磷酸缓冲盐溶液清洗一遍，再加入0.5～1ml的accutase等细胞消化液溶液，再置于温度为37℃、体积分数为5％的co2培养箱中进行消化，并每隔5分钟观察一次，待细胞大量漂浮时加入2ml上述培养基终止消化；
60.上述步骤s302中，通过轻轻吹打的方式将将终止消化后的培养液混匀，然后按1:2进行传代，加入包被细胞培养皿中，再置于温度为37℃、体积分数为5％的co2培养箱中进行培养，等待大约8小时后汗腺细胞贴壁，即可以用上述培养基进行换液，之后每隔2～3天换液一次，实现消化传代。
61.在上述实施方式中，因为一次消化并不能把所有的汗腺细胞消化下来，可以将消化后的细胞培养皿用磷酸缓冲盐溶液清洗一遍后，再加入上述原代汗腺细胞条件培养基继续培养。
62.下面通过实施例对本发明进行详细说明。
63.实施例1
64.原代汗腺细胞培养基的配置：
65.在细胞基础培养基dmem/f12中添加终浓度为10％的血清、1mm的glutamax、5mm的hepes、01％的b27、1％的青霉素/链霉素、50ng/ml的egf、20ng/ml的fgf、1％的neaa、10μg/ml的胰岛素、1μm的y-33075、0.05μg/ml的pma，制得原代汗腺细胞条件培养基。
66.实施例2
67.原代汗腺细胞的长期扩增：
68.(1)取出6cm细胞培养皿，加入2ml iv胶原蛋白，放入置于37℃、体积分数5％的co2培养箱中包被15分钟，取出细胞培养皿，吸掉iv胶原蛋白，用pbs清洗一遍，然后加入实施例1中所配置的培养基，保证培养基没过皿底即可。
69.(2)将用1ml枪头吸取出来的原代汗腺组织直接打到加有上述培养基的细胞培养皿中，待汗腺组织贴壁后(约8个小时)，补加上述培养基，之后每隔2天换液一次，当观察到汗腺细胞融合度达到80％时，即可进行消化传代。
70.(3)弃掉汗腺培养基，用pbs清洗一遍，加入1ml accutase溶液，置于37℃、体积分数5％的co2培养箱中进行消化，每隔5分钟观察一次，待细胞大量漂浮时加入2ml实施例1中所配置的培养基终止消化，轻轻吹打并混匀后，直接按1:2进行传代，加入包被后的6cm细胞培养皿中，置于37℃、体积分数5％的co2培养箱中培养，待汗腺细胞贴壁后，及时用上述培养基进行换液，之后每隔2天换液一次。
71.其中，体外扩增第3天后的第一代汗腺细胞的形态如图1所示，可见原代汗腺细胞形态完整，说明其生长速度较快；
72.体外扩增第5天后的第一代汗腺细胞的形态如图2所示，说明原代汗腺细胞增长迅速；
73.体外扩增第15天后的第二代汗腺细胞的形态如图3及图4所示，可见汗腺细胞的形态依然完整，并没有发生凋亡的现象；
74.体外扩增第30天后的第三代汗腺细胞的形态如图5及图6所示，可见汗腺细胞的形态依然完整，细胞活力高；
75.体外扩增第33天后的第四代汗腺细胞的形态如图7所示，可见汗腺细胞依然没有丧失原代汗腺细胞的形态；
76.体外扩增第40天后的第四代汗腺细胞的形态如图8所示，可见细胞折射率依然很强，没有发生凋亡现象。
77.对比例1
78.培养基的配置：
79.在基础培养基dmem/f12中添加终浓度为10％的血清、1％的青霉素/链霉素，制得细胞培养基。
80.对比例2
81.原代汗腺细胞的扩增：
82.(1)取出6cm细胞培养皿，加入2ml iv胶原蛋白，放入置于37℃、体积分数5％的co2培养箱中包被15分钟，取出细胞培养皿，吸掉iv胶原蛋白，用pbs清洗一遍，然后加入对比例1中所配置的培养基，保证培养基没过皿底即可。
83.(2)将用1ml枪头吸取出来的原代汗腺组织直接打到加有上述培养基的细胞培养皿中，待汗腺组织贴壁后，补加上述培养基，之后每隔2天换液一次，当观察到汗腺细胞融合度达到80％时，即可进行消化传代。
84.(3)弃掉汗腺培养基，用pbs清洗一遍，加入1ml accutase溶液，置于37℃、体积分数5％的co2培养箱中进行消化，每隔5分钟观察一次，待细胞大量漂浮时加入2ml对比例1中所配置的培养基终止消化，轻轻吹打并混匀后，直接按1:2进行传代，加入包被后的6cm细胞培养皿中，置于37℃、体积分数5％的co2培养箱中培养，待汗腺细胞贴壁后，及时用上述培
养基进行换液，之后每隔2天换液一次。
85.实验效果：
86.将实施例2中体外培养10天的原代汗腺细胞及对比例2中体外培养10天的原代汗腺细胞分别β-半乳糖苷酶染色效果，其染色效果分别如图9中的e及f所示，说明nf-κb激动剂能够延缓原代汗腺细胞在体外长期扩增培养中的衰老；
87.将实施例2中体外培养10天和40天的原代汗腺细胞进行β-半乳糖苷酶染色，其染色效果分别如图10中d10及d40所示，说明nf-κb激动剂能够延缓原代汗腺细胞在体外长期扩增培养中的衰老；
88.刚分离出来的原代汗腺细胞、实施例2中体外培养10天后的原代汗腺细胞、对比例2中体外培养10天后的原代汗腺细胞的ck5实时定量pcr结果分别如图11中a、b、c所示；
89.刚分离出来的原代汗腺细胞、实施例2中体外培养10天后的原代汗腺细胞、实施例2中体外培养40天后的原代汗腺细胞的ck18实时定量pcr结果分别如图12中d0、d10和d40所示；
90.通过图11及图12说明表皮细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、nf-κb激动剂及rock抑制剂的组合能够维持原代汗腺细胞在体外长期扩增培养中的生物学特性。
91.以上结果说明：利用本发明提供的原代汗腺细胞条件培养基，能够使提取出来的原代汗腺迅速爬出汗腺细胞，并快速扩增，克服了传统组织块培养法获取的汗腺细胞数量少，培养时间长等困难，并且能够长期维持原代汗腺培养过程中的生物学特性。
92.以上对本发明所提供的一种原代汗腺细胞条件培养基及原代汗腺细胞培养方法，进行了详细介绍，本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本发明的思想，在具体实施方式及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。