一株耐UV辐射芽孢杆菌及其应用的制作方法

一株耐uv辐射芽孢杆菌及其应用
技术领域
1.本公开涉及微生物技术领域，具体地，涉及一株耐uv辐射芽孢杆菌及其应用的技术领域。


背景技术：

2.适宜的环境条件是植物良好生长的前提，植物受到非生物胁迫(辐射、氧化、高盐、高渗透压及高温等)时，其生长会受到抑制。uv辐射会造成植株矮化、叶片增厚、光合速率降低、顶端优势解除、植物器官生长不均匀，直接造成作物产量和品质的下降。
3.筛选具有抗紫外辐射性能的菌株，鉴定其相关功能基因，进而转化入植物中，有助于培育具有抗逆性能的植物，以适应外界不断变化的气候环境，具有重要的现实意义。
4.塔克拉玛干沙漠自然气候条件恶劣，昼夜温差大、极端干旱多风、高紫外辐照，是典型的极端环境，生存着一些极端微生物种群，且尚处于未开垦阶段，是发现新的具有特殊功能微生物资源的宝藏。分离自沙漠样本的微生物新种属不断被报道，如jiangella gansuensis，lechevalieria xinjiangensis，planobacterium taklimakanense，desertibacter roseus，yuhushiella deserti，siccirubricoccus deserti，deinococcus malanensis，radiobacillus deserti，这其中的的大部分菌都表现出较好的抗逆性尤其是耐盐、耐辐射特性，为分子生物学、遗传学、生物信息学、生物工程学技术的发展，提供了新的遗传信息、特殊的代谢途径。
5.目前，对耐辐射细菌及其功能基因转化研究多集中在耐辐射异常球菌deinococcus radiodurans。


技术实现要素：

6.本发明的目的是从塔克拉玛干沙漠土壤样品中分离培养出一种新的菌种，分离出具有耐uv辐射能力的新种微生物，辐射芽孢杆菌(radiobacillus sp.)80，可以用于高uv辐射防护用品开发。对研究其uv抗性机理、促进新的dna技术在环境保护、生物修复、人类健康等的发展有着重要意义。
7.本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
8.本发明的技术方案：
9.本发明提供了一种辐射芽孢杆菌，该辐射芽孢杆菌的保藏编号为gdmcc no:61438，且该辐射芽孢杆菌为耐uv辐射的辐射芽孢杆菌(radiobacillus sp.)80。
10.本发明还提供了如上所述的辐射芽孢杆菌作为耐uv辐射功能菌株的应用。
11.本发明的辐射芽孢杆菌80为radiobacillus属的革兰氏阳性菌。通过对其uv抗性机理的研究，可以进一步加深人们uv抗性产生机理的认识，构建新的转基因生物，使其获得其它优良性状。
12.本发明所提供的辐射芽孢杆菌(radiobacillus sp.)80，从塔克拉玛干沙漠土壤样品中分离、筛选获得，菌种编号为80，经微生物分类学检测鉴定，确定为辐射芽孢杆菌
(radiobacillus sp.)潜在新菌种。目前，该菌株已于申请日前保藏于布达佩斯条约微生物国际保藏单位：广东省微生物菌种保藏中心(gdmcc)。地址：地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏日期为2021年1月15日，保藏号为gdmcc no:61438。
13.本发明具体提供的辐射芽孢杆菌(radiobacillus sp.)潜在新菌种80，为革兰氏染色阳性，细胞为长杆状，大小为0.25-0.28μm宽，1.4-4.9μm长，末端产生膨胀的孢子囊，内生芽孢，芽孢大小为0.6-0.7
×
1.0-1.4μm，生长在培养基上培养后，菌落乳白色凸起的圆形，不透明，表面湿润光滑，边缘整齐。
14.以辐射芽孢杆菌(radiobacillus sp.)潜在新菌种80的基因组总dna为模板扩增其16s rdna序列，进行测序，获取长度为1436bp的16s rdna序列(见序列表)，其与genbank数据库收录的相关菌株进行同源性比对分析，该菌与同属的仅有的另一株菌的相似度为98.68％。与同属的radiobacillus deserti tkl69
t
相似度98.92％；与aquibacillus属的相似度为96.83％-95.88％，与aquibacillus halophilus b6b
t
的相似度为96.83％；与salinibacillus属的相似度为96.61％-95.21％，与salinibacillusxinjiangensis j4
t
的相似度为96.61％；与ornithinibacillus属的相似度为96.61％-95.05％，与ornithinibacillus salinisoli lcb256t的相似度为96.61％；与sediminibacillus属的相似度为96.23％-95.77％，所得序列经常见的ncbi网站进行比对分析，并构建系统发育树，初步确定其为潜在新种，暂定菌株名称为辐射芽孢杆菌(radiobacillus sp.)潜在新菌种80。
15.本发明所述的辐射芽孢杆菌(radiobacillus sp.)潜在新菌种80采用包含蛋白胨5.0g，酵母粉1.0g，柠檬酸铁0.1g，氯化钠19.45g，氯化镁5.98g，硫酸钠3.24g，氯化钙1.8g，氯化钾0.55g，碳酸钠0.16g，溴化钾0.08g，氯化锶0.034g，硼酸0.022g，硅酸钠0.004g，氟化钠0.0024g，硝酸钠0.0016g，磷酸氢二钠0.008g，蒸馏水1000ml，ph值7.6
±
0.2，120℃，灭菌15min制备而成的液体培养基或在液体培养基基础上添加1.5％的琼脂制备而成的固体培养基进行培养。
16.本发明所述的辐射芽孢杆菌(radiobacillus sp.)潜在新菌种80可以在温度为15～45℃的范围内生长。
17.本发明所述的辐射芽孢杆菌(radiobacillus sp.)潜在新菌种80可以在nacl浓度为0％-14％的范围内生长。
18.本发明所述的辐射芽孢杆菌(radiobacillus sp.)潜在新菌种80可以ph值为6.0-9.0的范围生长。
19.本发明所述的辐射芽孢杆菌(radiobacillus sp.)80可以耐受84000μw
·
s/cm2剂量的辐射。
20.进一步的，本发明还提供所述的辐射芽孢杆菌(radiobacillus sp.)潜在新菌种80在用于uv辐射防护用品的开发中的用途。
21.进一步的，本发明还提供所述的辐射芽孢杆菌(radiobacillus sp.)潜在新菌种80在用于抗uv转基因生物制备中的用途。
22.进一步的，本发明还提供所述的辐射芽孢杆菌(radiobacillus sp.)潜在新菌种80在用于抗uv转基因生物制备中的用途，其特征在于，所属用途为基因供体。
23.本发明具有以下有益的技术效果：
24.(1)本发明所述的辐射芽孢杆菌(radiobacillus sp.)潜在新菌种80具有良好的uv抗性，在经过10min紫外照射后，存活率达到21.95％，与阳性对照deinococcus radiodurans dsm20539
t
存活率相当(22.83％)，同样条件下阴性对照菌escherichia coli bl21仅有0.76％存活率。经20min紫外照射后，菌株80仍有3.3％存活，d.radiodurans dsm20539t为4.92％，大肠杆菌全部死亡。表明本发明的耐uv辐射芽孢杆菌80具有较好的uv抗性。
25.(2)本发明的辐射芽孢杆菌(radiobacillus sp.)潜在新菌种80，可以直接作为抗uv转基因生物的基因供体，将其优良的抗性基因转入其它生物体中，使其可以获得优良的抗逆性状；同时，它也可能作为新的基因工程菌株，通过接受外来其它优良基因从而获得更多的优良性状；此外，通过传统的诱变育种手段进行性状的改良，还可以获得更多优良性状的菌株。本发明的辐射芽孢杆菌80可以用于高uv辐射防护用品开发。对研究其uv抗性机理、促进新的dna技术在环境保护、生物修复、人类健康等的发展有着重要意义。
附图说明
26.图1所示为耐uv辐射芽孢杆菌80与其它辐射芽孢杆菌属及其相近属成员之间的进化分析(基于16s rdna序列分析)图；
27.图2所示为耐uv辐射芽孢杆菌80与对照菌株deinococcus radiodurans dsm20539
t
、escherichia coli dl21的抗uv能力对比图；
28.图3所示为耐uv辐射芽孢杆菌80的菌落形态图；
29.图4所示为耐uv辐射芽孢杆菌80的透射电镜图。
具体实施方式
30.为了更好地解释本发明，以下结合具体实施例进一步阐明本发明的主要内容，但本发明的内容不仅仅局限于以下实施例。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
31.本发明中采用的试剂为：蛋白胨、酵母粉、柠檬酸铁、氯化钠、氯化镁、硫酸钠、氯化钙、氯化钾、碳酸钠、溴化钾、氯化锶、硼酸、硅酸钠、氟化钠、硝酸钠、磷酸氢二钠、蒸馏水。酪蛋白水解物、酵母提取物、胰蛋白胨、葡萄糖、可溶性淀粉、磷酸氢二钾、无水硫酸镁、丙酮酸钠、氯化钠、琼脂，为市场常见试剂，2
×
pcr green mix购买于北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司。
32.本发明中采用的仪器为：高温灭菌锅、电子天平、无菌操作台、biolog菌种鉴定仪gniii测试板、pcr仪、微量移液器、枪头、离心管、电泳仪、凝胶成像仪、ph计、分光光度计、电子显微镜、培养皿、玻璃棒、酒精灯、接种环、离心机、微波炉。
33.上述所述试剂、材料均可通过公共渠道购买，工艺中所采用的设备和仪器均为本领域常见的设备。
34.本发明中选用的所有材料、试剂和仪器都为本领域熟知的，但不限制本发明的实施，其他本领域熟知的一些试剂和设备都可适用于本发明以下实施方式的实施。
35.以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明
的范围。
36.实施例一：辐射芽孢杆菌(radiobacillus sp.)80的分离
37.于新疆塔克拉玛干沙漠采集土样。取土样5.0g左右，加入45ml无菌水中，于30℃、200rpm下富集培养30min，取富集培养物1.0ml，按照10倍依次梯度稀释，分别取100μl涂布于含1％nacl的r2a琼脂培养基平板上，倒置于30℃培养箱中培养15天，即可获得本发明所述的耐uv辐射芽孢杆菌。
38.r2a琼脂培养基：酪蛋白水解物0.5g/l；酵母提取物0.5g/l；胰蛋白胨0.5g/l；葡萄糖0.5g/l；可溶性淀粉0.5g/l；磷酸氢二钾0.3g/l；无水硫酸镁0.024g/l；丙酮酸钠0.3g/l；氯化钠10g/l；琼脂15g/l；ph＝7.2
±
0.2。121℃灭菌15min。培养温度为30℃。
39.实施例二：辐射芽孢杆菌(radiobacillus sp.)80的鉴定
40.所述的耐uv辐射芽孢杆菌(radiobacillus sp.)80的培养条件为：
41.采用2216e琼脂培养基，具体配方为：蛋白胨5.0g，酵母粉1.0g，柠檬酸铁0.1g，氯化钠19.45g，氯化镁5.98g，硫酸钠3.24g，氯化钙1.8g，氯化钾0.55g，碳酸钠0.16g，溴化钾0.08g，氯化锶0.034g，硼酸0.022g，硅酸钠0.004g，氟化钠0.0024g，硝酸钠0.0016g，磷酸氢二钠0.008g，蒸馏水1000ml。ph值7.6
±
0.2；培养温度：37℃。
42.本发明的耐uv辐射芽孢杆菌(radiobacillus sp.)80具有下述性质：
43.1.形态特征
44.在透射电镜下可见，细胞为长杆状，大小为0.25-0.28μm宽，
45.1.4-4.9μm长。末端产生膨胀的孢子囊，内生芽孢，芽孢大小为0.6-0.7
×
1.0-1.4μm。如附图4所示。
46.2.在各种培养基上的特征：
47.在2216e琼脂培养基上，乳白色凸起的圆形，不透明，表面湿润光滑，边缘整齐，如附图3所示。
48.3.生理生化特征
49.该菌株为好氧生长，革兰氏阳性，接触酶、氧化酶、硝酸盐还原酶、β-半乳糖苷酶阳性，水解吐温20，液化明胶，不产生h2s，利用d-甘露糖、纤维二糖、松二糖、d-半乳糖、l-组氨酸作为单一碳源。细胞主要的肽聚糖为dpg、apl、pl、l，主要的脂肪酸为anteiso-c
15:0
、iso-c
15:0
、anteiso-c
17:0
，主要的呼吸醌为mk-7。
50.4.碳源利用
51.碳源利用情况测定结果如表1所示，能够利用甘油、l-阿拉伯糖、核糖、d-木糖、半乳糖、葡萄糖、果糖、甘露糖、山梨糖、鼠李糖、甘露醇、α-甲基-d-葡萄糖甙、n-乙酰-葡糖胺、苦杏仁苷、熊果苷、七叶灵、柳醇、纤维二糖、麦芽糖、乳糖、蜜二糖、蔗糖、海藻糖、菊糖、松三糖、棉籽糖、淀粉、肝糖、龙胆二糖、d-松二糖、d-塔格糖、葡萄糖酸盐为碳源，但不能以赤藓醇、d-阿拉伯糖、l-木糖、阿东醇、β-甲-d-木糖甙、卫茅醇、肌醇、山梨醇、α-甲基-d-甘露糖甙、木糖醇、d-来苏糖、d-岩糖、l-岩糖、d-阿拉伯糖醇、l-阿拉伯糖醇、2-酮基-葡萄糖酸盐为碳源。
52.5、其它性质
53.最适生长温度为35℃。最适宜盐度2％-4％，最适宜ph6.0-8.5。表1：耐uv辐射芽孢杆菌80与radiobacillus desertitkl69
t
的微生物学特性比较
54.[0055][0056]
实施例三：16s rdna序列鉴定
[0057]
1.基因组提取方法
[0058]
本发明所述的耐uv辐射芽孢杆菌(radiobacillus sp.)80使用tiangen公司的细菌基因组dna提取试剂盒(dp302)进行提取，详见其说明书。
[0059]
2.pcr扩增方法
[0060]
本发明所述的耐uv辐射芽孢杆菌(radiobacillus sp.)80的16s rdna的pcr扩增所用的通用引物序由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。扩增所用的2
×
pcr green mix购买于北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司。
[0061]
正向引物27f：5
’‑
agagtttgatcatggctcag-3’，
[0062]
反向引物1492r：5
’‑
tacggttaccttgttacgactt-3’。
[0063]
pcr扩增体系为：50μl，2
×
pcr green mix12.5μl，上下游引物各1μl，dna模板1μl，ddh2o 9.5ul。
[0064]
pcr反应程序：95℃，5min；30个循环(95℃，30s；51℃，30s；72℃1.5min)；72℃，5min。
[0065]
将扩增得到的16s rdna序列，委托生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。测序结果包括：16s rdna序列如seq id no:1所示。本发明发现的耐uv辐射芽孢杆菌(radiobacillus sp 80)的16s rdna与同属的仅有的另一株菌的相似度为98.68％。与同属的radiobacillus deserti tkl69
t
相似度98.92％；与aquibacillus属的相似度为96.83％-95.88％，与aquibacillus halophilus b6b
t
的相似度为96.83％；与salinibacillus属的相似度为96.61％-95.21％，与salinibacillusxinjiangensis j4
t
的相似度为96.61％；与ornithinibacillus属的相似度为96.61％-95.05％，与ornithinibacillus salinisoli lcb256t的相似度为96.61％；与sediminibacillus属的相似度为96.23％-95.77％；与salirhabdus属的相似度为96.14％-95.77％。
[0066]
通过16s rdna序列相似性，可以明确80为辐射芽孢杆菌属菌株，进一步通过全基因组测序及序列的平均核酸一致性(average nucleotide identity，ani)和dddh分析，80与辐射芽孢杆菌属另一株标准均tkl69t的ani值为78.39％(《95％)，dddh值为22％(《
70％)，同时二者的生理生化性质实验结果有明显差异，表明80为辐射芽孢杆菌属的一个新种。
[0067]
本发明人从塔克拉玛干沙漠土壤样品中分离培养出一种新的菌种，经鉴定确认该菌属于辐射芽孢杆菌属，被命名为耐uv辐射芽孢杆菌(radiobacillus sp.)80，该菌种已在国家知识产权局指定的保藏单位广东省微生物菌种保藏中心保藏，保藏日期为2021年1月15日，保藏登记号为gdmcc no:61438。
[0068]
实施例四：耐uv辐射芽孢杆菌80的耐紫外辐照试验
[0069]
1、试验方法
[0070]
(1)挑取本发明所述的耐uv辐射芽孢杆菌甘油保藏管菌液于2216e培养基平板划线活化，30℃倒置培养；
[0071]
(2)挑取平板上的菌落，接种到2216e液体培养基中，30℃，200rpm，振荡培养3d；
[0072]
(3)测定od
600
，按照目的od
600
＝0.1～0.2，添加到新鲜2216e液体培养基中，30℃，200rpm，培养至od
600
为0.6～0.8；
[0073]
(4)用无菌水调整菌悬液od
600
为0.5。注意，调节od
600
时，以对应的未接菌培养基为空白对照。
[0074]
(5)取1ml od
600
为0.5的菌液，置于35mm培养皿(培养皿提前在紫外灯下打开盖子，并且后续辐照过程盖子保持打开)，在紫外灯下辐照10min，20min。
[0075]
(6)辐照后的菌液迅速稀释各个样品至10-5
、10-6
，取100μl涂布至2216e平板。37℃培养5d，计数。
[0076]
同时分别以deinococcus radiodurans dsm20539
t
和escherichia colibl21菌株为阳性对照和阴性对照，分别在tgy、lb培养基中进行培养和辐照，实验用253.7nm，20w的紫外灯，辐照强度为70μw/cm2，照射10min和20min的剂量分别是42000μw
·
s/cm2和84000μw
·
s/cm2。试验菌和对照菌各进行了3次重复实验。
[0077]
2、结果
[0078]
实验结果表明，在经过10min紫外照射后，存活率达到21.95％，与阳性对照deinococcus radiodurans dsm20539
t
存活率相当(22.83％)，同样条件下阴性对照菌escherichia coli bl21仅有0.76％存活率。经20min紫外照射后，菌株80仍有3.3％存活，d.radiodurans dsm20539t为4.92％，大肠杆菌全部死亡。表明本发明的耐uv辐射芽孢杆菌80具有较好的uv抗性。本发明的耐uv辐射芽孢杆菌80可以用于uv辐射防护用品的开发如防护涂层及相关的化妆品的开发。现有的防晒产品主要防晒成分为氧化锌和氧化钛，为化学成分，可以用本发明中耐uv辐射芽孢杆菌80开发含生物成分的防晒产品。
[0079]
实施例五：耐uv辐射芽孢杆菌80菌株基因组dna的提取
[0080]
本发明还提供了该耐uv辐射芽孢杆菌(radiobacillus sp.)80的基因组提取、16s rdna的扩增方法，具体按照下述操作进行：
[0081]
1.基因组提取方法
[0082]
本发明所述的耐uv辐射芽孢杆菌80使用tiangen公司的细菌基因组dna提取试剂盒(dp302)进行提取，详见其说明书。
[0083]
2.pcr扩增方法
[0084]
本发明所述的耐uv辐射芽孢杆菌80的16s rdna的pcr扩增所用的通用引物序由生
工生物工程(上海)股份有限公司合成。扩增所用的2
×
pcr green mix购买于北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司。
[0085]
正向引物27f：5
’‑
agagtttgatcatggctcag-3’，
[0086]
反向引物1492r：5
’‑
tacggttaccttgttacgactt-3’。
[0087]
pcr扩增体系为：50μl，2
×
pcr green mix12.5μl，上下游引物各1μl，dna模板1μl，ddh2o 9.5ul。
[0088]
pcr反应程序：95℃，5min；30个循环(95℃，30s；51℃，30s；72℃1.5min)；72℃，5min。
[0089]
即扩增获得将扩增得到辐射芽孢杆菌(radiobacillus sp)80的16s rdna序列，大小为1436bp，16s rdna序列测序结果如seq id no:1所示。
[0090]
以上结合附图详细描述了本公开的优选实施方式，但是，本公开并不限于上述实施方式中的具体细节，在本公开的技术构思范围内，可以对本公开的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本公开的保护范围。
[0091]
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本公开对各种可能的组合方式不再另行说明。
[0092]
此外，本公开的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本公开的思想，其同样应当视为本公开所公开的内容。