一种基于葡萄糖氧化酶的人工改造酶及其表达应用的制作方法

1.本发明主要涉及理性蛋白质工程进化手段，可对已有的蛋白质结构进行改造，以增强其催化性能。本发明还涉及定点突变后的葡萄糖氧化酶基因在分泌生产葡萄糖氧化酶中的应用，属于蛋白质工程以及葡萄氧化酶生产领域。


背景技术：

2.葡萄糖氧化酶(glucose oxidase，e.c.1.1.3.4，简称god)能够在有氧气的条件下专一性催化β-d-葡萄糖生成葡萄糖酸和过氧化氢，是食品工业中一种重要的工业用酶。广泛用于葡萄酒、啤酒、果汁、奶粉等食品脱氧、面粉改良、防止食品褐变等方面，在食品快速检测及生物传感器上也有广泛应用。同时还用于小麦面粉的改良工艺等方面。
3.由微生物生长繁殖快、来源广，是生产葡萄糖氧化酶的主要来源，主要生产菌株为黑曲霉和青霉。
4.但是由于黑曲霉的发酵主要是用作生产葡萄糖酸或者葡萄糖酸盐的，比如葡萄糖酸钠、葡萄糖酸钙，因此葡萄糖氧化酶主要是作为一种副产物出现，而这导致葡萄糖氧化酶的生产酶活并不高，很多都是只有个位数的酶活。
5.随着分子生物学技术的发展，研究者试图通过微生物表达系统来表达外源基因，以此来达到对某一种蛋白高效表达的目的。目前已经开发出的外源基因表达系统包括大肠杆菌、芽抱杆菌、链霉菌、曲霉、酵母、昆虫、哺乳类细胞等等。通常情况下，使用原核细胞作为外源基因的表达体系操作简便，各种技术已经趋于成熟,但是受原核系统本身的限制，真核来源的蛋白在表达的时候不能正确地折叠或者缺少转录翻译之后的必要修饰，从而导致表达出了蛋白，可是蛋白却没有生物活性，没有进一步的利用价值，而且原核系统中的有毒蛋白质或者有抗原作用的蛋白很可能会混杂在终产物中，使结果受到干扰。
6.但是，原核表达仍然具有重要意义，可以作为真核系统表达之前目的基因和质粒的构建以及扩增。
7.而对于真核哺乳动物细胞作为宿主，可以较为理想地进行蛋白表达后的修饰，但是由于操作复杂，成本较高，而且后期培养细胞会有病毒感染的可能，因此这种方法并没有成为广泛使用的方法。
8.所以目前主流的蛋白表达体系是酵母体系。
9.酵母系统通过几十年的发展目前已经成为一种模式操作平台，各项操作已经趋于完善。在蛋白表达方面,有适于真核生物基因产物正确折叠的细胞内环境，尤其是可以对蛋白的一些关键糖基化位点进行修饰，使一些对糖基化有要求的蛋白能够表达出活性。
10.选定了表达系统之后，想要进一步提高外源葡萄糖氧化酶的性能只有在基因水平对葡萄糖氧化酶基因序列进行改造。
11.早在1998年，就有学者对葡萄糖氧化酶的结构进行了解析。
12.在2020年7月份后饲料生产中全面禁抗的大背景下，葡萄糖氧化酶是代替抗生素的优选之一。但全价饲料生产要经过85℃经3分钟高温制粒，许多饲料企业虽然认同葡萄糖
氧化酶的功效，但认为该酶添加在饲料中经过85℃，3分钟的高温制粒，酶活已所剩无几，所以，提高葡萄糖氧化酶对高温(85℃经3分钟)的耐受性，意义重大。
13.2019年tu等人对改酶的热稳定性展开了研究，经过四轮突变，首次获得在不损害酶活的情况下热稳定性提升的葡萄糖氧化酶，2020年，在2019年的基础上，又经过四轮突变，得到突变体m8，其核苷酸序列如seq id no.1所示，该突变体m8的热稳定性得到了进一步的提升，但是突变体m8的热稳定性仍然无法满足高温制粒等过程中对葡萄糖氧化酶的要求，对于商业应用来说还是不够的。
14.因此，在不损害比酶活力的条件下，进一步提升酶的热稳定性是本领域技术人员致力于研发的方向之一，在经过人工设计改造过的酶基础上做进一步改造也是更有难度和挑战性的。


技术实现要素：

15.本发明的目的，就是为了解决上述问题而提供了一种基于葡萄糖氧化酶的人工改造酶及其表达应用，通过理性设计、定点突变技术改造来自于黑曲霉的葡萄糖氧化酶m8基因，最后得到热稳定性显著提高的突变体。
16.本发明的目的是这样实现的：
17.本发明提供了一种基于葡萄糖氧化酶的人工改造酶，其氨基酸序列如seqid no.2所示。
18.编码上述基于葡萄糖氧化酶的人工改造酶的基因。
19.上述基因的核苷酸序列如seq id no.3所示。
20.包含上述核苷酸序列的重组表达载体。
21.包含上述重组表达载体的宿主细胞。
22.本发明还提供了基于葡萄糖氧化酶的人工改造酶基因在分泌表达葡萄糖氧化酶中的应用。
23.将所述的通过理性设计、定点突变得到的新的人工改造的葡萄糖氧化酶基因在原核细胞中，与用于原核细胞进行基因操作所用的穿梭表达质粒连接构成重组表达质粒；将重组表达质粒转化入真核细胞表达蛋白并整合入真核细胞基因组中得到重组酵母；培养重组酵母，诱导葡萄糖氧化酶的分泌表达。
24.上述应用中，原核细胞为大肠杆菌，真核细胞表达蛋白是毕赤酵母pichiapastoris gs115表达蛋白。
25.本发明在已经获得的经过改造的高热稳定性酶(突变体m8)的基础上，在不损害比酶活的条件下进一步提升该酶的热稳定性，用苯丙氨酸取代葡萄糖氧化酶m8氨基酸序列402位的缬氨酸以及在n端增加his6标签。
26.本发明通过分析目标化合物生物合成的高通量组学数据，优化蛋白设计的数学模型和算法工具，构建深度学习等智能算法，建立系统生物学分析及新元件功能预测模型。解析蛋白高精度结构，探究底物识别、催化活性、结构稳定性等分子机理，实现理性设计突变点。针对设计好的突变，采用定点突变试剂盒构建含有目的蛋白的质粒，再转电转入酵母菌中诱导表达。将所得目的蛋白进行纯化，验证了在不损害比酶活力的基础上，该基因具有较高的热稳定性。
附图说明
27.图1是实施例1中突变体ppic 9k-v402f质粒的核酸电泳验证图；
28.图2是实施例1中突变体v402f目的蛋白表达纯化后的蛋白电泳验证图；
29.图3是实施例3中abts显色反应的标准曲线；
30.图4是实施例4中v402f和m8的热稳定性测定曲线。
具体实施方式
31.下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。下述实施例中所述试剂原料除非注明来源外，均为市售的常见原料，试剂的配制采用常规方法。实施例中未详述的方法均为本领域常规操作。
32.生物材料：
33.采用全人工合成的方式合成野生型葡萄糖氧化酶基因序列(以文献报道为的m8为准，以下命名为“葡萄糖氧化酶m8基因”)，核苷酸序列如seq idno.1所示，并构建含有该葡萄糖氧化酶m8基因的ppic 9k质粒，即ppic9k-m8质粒。
34.实施例1含突变体v402f基因的质粒构建
35.v402f突变体是用苯丙氨酸取代葡萄糖氧化酶m8氨基酸序列402位的缬氨酸，且在n端增加his6标签。
36.以上突变体的目的基因以葡萄糖氧化酶m8基因序列为模板，采用pcr的方法进行构建，具体引物设计如下表所示：
[0037][0038]
以葡萄糖氧化酶m8基因序列为模板，通过上述方法对葡萄糖氧化酶m8基因序列进行定点突变，得到突变体目的基因v402f，具体步骤如下：
[0039]
1 ppic 9k-m8质粒的扩增
[0040]
1.1转化
[0041]
将合成好的ppic 9k-m8质粒转化到大肠杆菌dmt chemically competent cell中培养。
[0042]
(1)加入1ul 100ng/ul的ppic 9k-m8质粒于50ul感受态细胞中(在感受态细胞刚刚解冻时加入质粒)，轻弹混匀，冰浴20-30分钟。
[0043]
(2)42℃水浴热激45秒，立即置于冰上2分钟。
[0044]
(3)加250ul平衡至室温的lb培养基，200rpm、37℃培养1小时。
[0045]
(4)将amp抗性的平板在37℃培养箱中预热。
[0046]
(5)取200ul菌液均匀地涂在平板上，在37℃培养箱中过夜培养。
[0047]
1.2平板挑单
[0048]
挑出平板上长得圆润大颗的单菌落，加入到含有10ml的lb培养基的50ml离心管中，在37℃培养16h。
[0049]
1.3质粒抽提
[0050]
(1)将长好的2ml菌液加入到离心管中，11000xg离心1min，弃上清，重复5次，每管共收集10ml大肠杆菌。
[0051]
(2)加入400ul fapd1 buffer，用移液枪吹打重悬大肠杆菌。在加fapd1之前，要检查rnase已经被加入到fapd1中了，要求看不到颗粒状菌体、
[0052]
(3)加400ul fapd2 buffer，轻柔的转动离心管8次，剧烈转动会使质粒断裂。为了裂解细胞，需要在室温下静置3分钟
[0053]
(4)加入600ul fapd3 buffer，轻柔的转动离心管8次，立刻中和裂解产物
[0054]
(5)18000xg离心5min分离裂解液，离心同时，将试剂盒里所带的fapd管放到收集管中
[0055]
(6)取上清，加入到fapd管中，11000xg离心30s，丢弃流出的液体，重复直到上清液全部被收集到fapd管中。
[0056]
(7)加800ul w1 buffer到fapd管中，11000xg离心30s，丢弃流出的液体
[0057]
(8)加700ul wash buffer，11000xg离心30s，丢弃流出的液体，重复一次
[0058]
(9)将fapd管放到收集管中18000xg离心3分钟，离心后空气中晾5min，使fapd管干燥
[0059]
(10)将fapd管放到1.5ml ep管中，加50ul elution buffer到fapd管的膜上，注意不要将膜戳破，将fapd管立着放置1min
[0060]
(11)18000xg离心1min淋洗ppic 9k-m8质粒dna，储存dna在-20℃。
[0061]
2目的基因v402f的获取及ppic 9k-v402f质粒的扩增
[0062]
2.1定点突变v402f质粒的构建
[0063]
体系：
[0064][0065]
条件：
[0066][0067]
2.2转化养菌挑单培养
[0068]
重复1.1
[0069]
挑单：挑出平板上长得圆润大颗的单菌落，加入到含有1ml的lb培养基的1.5ml离心管中，在37℃培养10h。
[0070]
2.3验证保种测序
[0071]
验证：核酸胶跑电泳验证电转是否成功，使用pcr扩增技术获得目的基因片段，核酸电泳验证如图1所示。
[0072]
保种：取500ul加入500ul 50％的甘油
[0073]
测序：质粒测序由金斯瑞公司完成
[0074]
由此，得到含突变体v402f基因的ppic 9k-v402f质粒。
[0075]
2.4质粒抽提
[0076]
挑出经过验证的单菌落，加入到含有10ml的lb培养基的50ml离心管中，在37℃培养16h。
[0077]
重复步骤1.3，得到ppic 9k-v402f质粒dna，储存dna在-20℃。
[0078]
实施例2突变体v402f目的蛋白的获取
[0079]
将抽提的ppic 9k-v402f质粒电转入gs115毕赤酵母感受态细胞中，以甲醇诱导表达。
[0080]
对表达了葡萄糖氧化酶的gs115进行离心，取上清液进行硫酸铵沉淀，透析过夜。将所得目的蛋白以hitrap q柱进行纯化，最后得到突变体v402f目的蛋白，蛋白电泳验证如图2所示。
[0081]
由此，本实施例最终表达纯化得到突变体v402f目的蛋白。
[0082]
实施例3 v402f目的蛋白的酶活性测定
[0083]
本实施例将v402f目的蛋白以及葡萄糖氧化酶m8(制备方法同实施例2)分别与葡萄糖反应，产生过氧化氢，过氧化氢再与abts进行显色反应，在波长415nm处可测其吸光值，以此计算葡萄糖氧化酶的活性，具体方法如下：
[0084]
1、abts显色反应标准曲线的绘制
[0085]
测定体系：除保证体系除abts外全部远远过量,将酶换成过氧化氢
[0086]
hrp:辣根过氧化物酶，比酶活力≥250u/mg
[0087]
测定体系：
[0088][0089]
其中，abts梯度稀释至5nmol/ml、10nmol/ml、25nmol/ml、50nmol/ml、80nmol/ml、100nmol/ml。
[0090]
取100ul，故横坐标应为0.5nmol、1nmol、2.5nmol、5nmol、8nmol、10nmol。
[0091]
由此测定相应的吸光值，绘制标准曲线如图3所示，通过拟合得到线性曲线的斜率为0.2276。
[0092]
2、对v402f目的蛋白进行酶活性测定
[0093]
测定体系：
[0094][0095]
采用nano微量分光光度仪测得实施例2制备的v402f目的蛋白的浓度为0.16mg/ml,测得葡萄糖氧化酶m8的浓度为0.642mg/ml
[0096][0097][0098]
将0.16mg/ml v402f和0.642mg/ml m8两种目的蛋白酶液稀释五百倍，将葡萄糖、hrp、abts、加入96孔板，放入酶标仪30℃震荡混匀5min，取40ul稀释后酶液加入反应体系，震荡反应10min，同时测吸光值。
[0099]
葡萄糖氧化酶与葡萄糖反应，产生过氧化氢，过氧化氢再与abts进行显色反应，在波长415nm处可测其吸光值，以此计算葡萄糖氧化酶的活性，公式如下：
[0100]
其中，0.2276为abts显色反应标准曲线的斜率。
[0101][0102]
葡萄糖氧化酶m8作为对照也通过上述方法进行测定酶活，两者测定结果如下：
[0103][0104]
比酶活力＝酶活力/浓度
[0105]
从以上测定结果可以看到突变体v402f的比酶活力略高于m8蛋白的比酶活力。
[0106]
实施例4 v402f目的蛋白的热稳定性测定
[0107]
测定方法：v402f目的蛋白及m8蛋白在80℃下孵育不同时间(分别为0s、30s、60s、90s及120s)并进行酶活力测定(采用实施例3中的测定方法)，得到的结果如图4所示，图中，剩余酶活力％＝当前测定的酶活力/0s时的酶活力*100％，从图中可以看到在90s时，m8蛋白的剩余酶活力％为23.2％，而v402f目的蛋白的剩余酶活力％高达46.7％，由此说明突变体v402f的热稳定性相对于m8有明显的提升。
[0108]
以上实施例仅供说明本发明之用，而非对本发明的限制，有关技术领域的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，还可以作出各种变换或变型，因此所有等同的技术方案也应该属于本发明的范畴，应由各权利要求所限定。