一种脐带间充质干细胞营养液制备方法及其应用与流程

1.本发明涉及生物细胞制备技术领域，具体涉及一种脐带间充质干细胞营养液制备方法及其应用。


背景技术：

2.间充质干细胞是指具有三胚层分化潜能的一类干细胞亚群，在特定环境下，理论上可以诱导分化为人体任何一种组织细胞，主要来源于人体中广泛存在的间质组织，特别是骨髓、脂肪、脐带和胎盘等，由于其具有强大的增殖能力，较强的分化能力，低免疫原性和免疫调节功能，其在临床上的应用价值越来越受人们关注。同时干细胞内部含有大量的生物活性物质，干细胞上清液中包含血管内皮细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、il-6 与il-7、巨核细胞集落刺激因、肿瘤坏死因子、干扰素等因子、脱氧核糖核酸及核糖核酸、单核细胞趋化蛋白、细胞间黏附分子、活性多肽、以及免疫蛋白igg、iga、igm、igd、ige等，物质可以促进机体干细胞生长、增殖，起到活化干细胞作用。细胞因子和活性物质应用到皮肤缺损中，不仅具有保湿功效，还能够修复受损皮肤，加快创面愈合、减少瘢痕形成。目前，对于间充质干细胞的利用还比较少，申请人结合长期临床实践研究，意在提升其利用率，在医学以及美容领域进行应用方法的研究。


技术实现要素：

3.本发明的目的是提供一种能够很好的修复皮肤细胞，美容效果好的应用方法。
4.为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：一种脐带间充质干细胞营养液制备方法，包括以下步骤：s1、分离干细胞：从人或哺乳动物脐带组织相应组织中分离出间充质干细胞；s2、干细胞培养：对上述步骤中的间充质干细胞加入10％的胎牛血清的α-mem培养基，5％co2，37℃条件下培养3天，之后更换完全培养液，间隔3天更换一次，传代进而得到所需的干细胞；s3、细胞营养液制取：将间充质干细胞培养2～3代后，加入0.25%胰酶3ml，之后加入含胎牛血清的α-mem培养基10ml终止消化，收集细胞悬液，之后在正常室温下离心5min，制得上清液，即为细胞营养液。
5.优选的，所述s1中的间充质干细胞为离体2～3代以后的脐血间充质干细胞。
6.优选的，所述s1步骤具体方法为：(1) 将获取的脐带组织保存于含双抗的pbs缓冲液中，带回实验室；(2) 将上述脐带用含双抗的pbs冲洗3次以上，去除脐带表面的血液；(3) 去除脐动脉及脐静脉后剪碎成1cm大小的组织块；(4) 将组织块放入无菌的50ml离心管内，加入0.1%i型胶原酶15ml,37
°
c水浴中消化1h，每间隔10min 摇匀1次，之后1500r/min离心5min，弃去上清，加入1mg/ml i型胶原酶，于37℃温箱中消化16h；
(5) 加入含胎牛血清的α-mem培养基4ml终止消化，室温下1500r/min 5min，弃去上清，以2.5g/l胰酶消化沉淀30min，加入含胎牛血清的α-mem培养基终止消化，100目筛网过滤，37℃、体积分数为0.05的co2细胞培养箱中培养，即得间充质干细胞。
7.优选的，所述s2步骤具体方法为：(1) 当细胞达到80%～90%融合即可进行传代扩增培养，吸去培养基，用pbs清洗细胞面两次；(2) 加入0.25%胰酶3ml,消化1～2min后，加入含10%胎牛血清的α-mem培养基10ml终止消化，用移液管反复重打细胞重悬混匀之后，收集细胞悬液；(3) 将细胞悬液在室温于1000r/min离心5min，用最大刹车系统降速，弃去上清，将沉淀的细胞团轻轻吹散，用含10%胎牛血清的α-mem培养基重悬细胞，接种于培养瓶中，在37℃、体积分数为5%的co2细胞培养箱中培养3天，间隔3天更换一次，传代进而得到所需干细胞。
8.优选的，所述s3步骤具体方法为：(1) 将间充质干细胞培养2～3代后，在细胞分裂最旺盛的时候进行操作；(2) 加入0.25%胰酶3ml,消化1～2min后，加入含胎牛血清的α-mem培养基10ml终止消化，用移液管反复重打细胞重悬混匀之后，收集细胞悬液；(3) 将细胞悬液在室温于1000r/min离心5min，用最大刹车系统降速，将上清液收集起来保存。
9.优选的，所述细胞培养液用于制备面膜，其具体方法为件生物纤维布浸入适量细胞培养液即可制得。
10.本发明的有益技术效果是：本发明得到的间充质干细胞营养液中包括高浓度人脐血间充质干细胞，干细胞上清液中包含血管内皮细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、il-6 与il-7、巨核细胞集落刺激因、肿瘤坏死因子、干扰素等因子、脱氧核糖核酸及核糖核酸、单核细胞趋化蛋白、细胞间黏附分子、活性多肽、以及免疫蛋白igg、iga、igm、igd、ige等，可以很好地促进组织缺损的修复。
附图说明
11.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
12.图1是本发明的利用流式细胞术鉴定脐带间充质干细胞表面标志cd105表达阳性图；图2是本发明的利用流式细胞术鉴定脐带间充质干细胞表面标志cd73表达阳性图；图3是本发明的利用流式细胞术鉴定脐带间充质干细胞表面标志 cd90表达阳性图；图4是本发明的利用流式细胞术鉴定脐带间充质干细胞表面标志cd45表达阴性图；
图5是本发明脐带间充质干细胞成骨分化图；图6是本发明脐带间充质干细胞成脂分化图；图7是本发明脐带间充质干细胞成软骨分化图；图8是本发明炎性因子表达水平图；图9是本发明生长因子表达水平图；图10是本发明趋化因子表达水平图；图11是本发明脐带间充质干细胞调节性培养基与生理盐水治疗皮肤组织缺损的比较图；图12是本发明正常组织he染色；图13是本发明脐带间充质干细胞调节性培养基治疗后的皮肤he染色图；图14是本发明生理盐水治疗后的皮肤he染色图；图15是本发明治疗评分统计图。
具体实施方式
13.下面将结合实施例，对本发明技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
14.实施例1：一种脐带间充质干细胞营养液制备方法，包括以下步骤：s1、分离干细胞：从人或哺乳动物脐带组织相应组织中分离出间充质干细胞；s2、干细胞培养：对上述步骤中的间充质干细胞加入10％的胎牛血清的α-mem培养基，5％co2，37℃条件下培养3天，之后更换完全培养液，间隔3天更换一次，传代进而得到所需的干细胞；s3、细胞营养液制取：将间充质干细胞培养2～3代后，加入0.25%胰酶3ml，之后加入含胎牛血清的α-mem培养基10ml终止消化，收集细胞悬液，之后在正常室温下离心5min，制得上清液，即为细胞营养液。
15.其中所述s1步骤具体方法为：(1) 将获取的脐带组织保存于含双抗的pbs缓冲液中，带回实验室；(2) 将上述脐带用含双抗的pbs冲洗3次以上，去除脐带表面的血液；(3) 去除脐动脉及脐静脉后剪碎成1cm大小的组织块；(4) 将组织块放入无菌的50ml离心管内，加入0.1%i型胶原酶15ml,37
°
c水浴中消化1h，每间隔10min 摇匀1次，之后1500r/min离心5min，弃去上清，加入1mg/ml i型胶原酶，于37℃温箱中消化16h；(5) 加入含胎牛血清的α-mem培养基4ml终止消化，室温下1500r/min 5min，弃去上清，以2.5g/l胰酶消化沉淀30min，加入含胎牛血清的α-mem培养基终止消化，100目筛网过滤，37℃、体积分数为0.05的co2细胞培养箱中培养，即得间充质干细胞。
16.其中所述s2步骤具体方法为：(1) 当细胞达到80%～90%融合即可进行传代扩增培养，吸去培养基，用pbs清洗细
胞面两次；(2) 加入0.25%胰酶3ml,消化1～2min后，加入含10%胎牛血清的α-mem培养基10ml终止消化，用移液管反复重打细胞重悬混匀之后，收集细胞悬液；(3) 将细胞悬液在室温于1000r/min离心5min，用最大刹车系统降速，弃去上清，将沉淀的细胞团轻轻吹散，用含10%胎牛血清的α-mem培养基重悬细胞，接种于培养瓶中，在37℃、体积分数为5%的co2细胞培养箱中培养3天，间隔3天更换一次，传代进而得到所需干细胞。
17.其中所述s3步骤具体方法为：(1) 将间充质干细胞培养2～3代后，在细胞生长最旺盛的时候进行操作；(2) 加入0.25%胰酶3ml,消化1~2min后，加入含胎牛血清的α-mem培养基10ml终止消化，用移液管反复重打细胞重悬混匀之后，收集细胞悬液；(3) 将细胞悬液在室温于1000r/min离心5min，用最大刹车系统降速，将上清液收集起来保存。
18.所述细胞培养液用于制备面膜，其具体方法为件生物纤维布浸入适量细胞培养液即可制得。
19.利用流式细胞术鉴定脐带间充质干细胞表面标志的方法，包括以下步骤：（1）消化细胞：用细胞刮刀刮取取生长良好的第5代细胞，制成1
×
107个/ml的单细胞悬液。
20.（2）孵育抗体：取洁净的流式上样管将细胞悬液，分别加入如下流式抗体cd73、cd90、cd105、cd45、和相应的同型对照小鼠抗体各10μl，再分别向各管中加入细胞悬液100μl，轻柔混匀，室温下孵育30 min。
21.（3）清洗：每管加入1ml pbs，充分混匀，离心5min (1800rpm)，弃上清，每管加300 μl 流式上机鞘液，充分混匀。
22.（4）上机：设置好通道参数后进行facs检测，每个样本检测10000个细胞，利用beckman kaluza软件进行分析。
23.结果参见图1—图4脐带间充质干细胞成骨分化及鉴定的方法，包含以下步骤（1）铺板：分别将对数期生长的ucmscs按1
×
105个/孔的密度接种于六孔板，每孔加入含10% fbs的α-mem培养基 2 ml，置于细胞培养箱培养；（2）诱导分化：待细胞贴壁后且细胞增殖融合达80-90%时，将培养基更换为成骨诱导分化培养基，每块6孔板，设置1孔阴性对照（即不加入诱导培养基，将培养基更换为2% fbs α-mem），每株细胞设置3个平行复孔，培养基间隔72 h更换一次，诱导分化21天。
24.（3）细胞固定：从培养箱中取出成骨培养基诱导分化的ucmscs，弃上清液，每孔加入1ml pbs溶液洗涤3次，随即每孔加入1ml 10%甲醛固定30 min；（4）细胞洗涤：弃甲醛溶液，用pbs溶液1ml/孔洗涤3次；（5）染色及观察：每孔中加入1%茜素红染色工作液1ml，室温染色5min，pbs 1 ml/孔洗涤2次，苏木素染液复染1 min，弃苏木素染液，pbs 1ml/孔洗涤2次，倒置显微镜下观察并拍照。结果参见图5。
25.脐带间充质干细胞成脂分化及鉴定的方法，包含以下步骤
（1）铺板：分别将对数期生长的ucmscs按1
×
105个/孔的密度接种于六孔板，每孔加入含10% fbs的α-mem培养基 2 ml，置于细胞培养箱培养；（2）诱导分化：待细胞贴壁后且细胞增殖融合达80-90%时，将培养基更换为成脂肪诱导分化培养基，每块6孔板，设置1孔阴性对照（即不加入诱导培养基，将培养基更换为2% fbs α-mem），每株细胞设置3个平行复孔，培养基间隔72 h更换一次，诱导分化21天。
26.（3）细胞固定：从培养箱中取出成脂诱导的ucmscs，弃上清液，每孔用pbs溶液1 ml轻轻洗涤3次，随即每孔加入1ml 10%甲醛室温固定30 min；（4）细胞洗涤：弃甲醛溶液，再次用pbs溶液1ml/孔洗涤3次；（5）染色及观察：配制油红“o”溶液：称取0.5g油红“o”，溶于100 ml异丙醇，用滤纸过滤后，即为0.5%的油红“o”染液；配制油红“o”工作液：用蒸馏水按照3:2的比例稀释油红“o”染液，稀释后再次用25μm定性滤纸过滤；每孔加入油红“o”工作液1ml，避光孵育30 min，去除油红“o”染液，用苏木素染液复染1min，弃苏木素染液，pbs 1ml/孔洗涤2次，置于倒置显微镜下观察并拍照。结果参见图6。
27.脐带间充质干细胞成软骨分化及鉴定的方法，包含以下步骤（1）成软骨诱导方案：取5.5
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105 个细胞的ucmscs细胞悬液放入15 ml离心管中，离心250g
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5min，获得细胞团；轻柔吸弃上清，实验组每组加入1 ml成软骨诱导分化培养基，注意保证细胞团完整性，阴性对照组加入含2% fbs的α-mem，每3天换液1次，诱导分化3周再鉴定；（2）固定：诱导分化3周后，实验组和对照组细胞团用pbs轻柔洗涤3次，随后用10%甲醛固定24 h；（3）脱水、透明：常温下，将组织样本放入80%、95% 、100% 梯度乙醇溶液进行脱水处理，每个梯度60 min，随后放入二甲苯溶液透明；（4）浸蜡、石蜡包埋、切片、脱蜡、水化步骤同前。
28.（5）脱蜡、水化：将带石蜡切片的载玻片移入二甲苯和无水乙醇1:1混合液中15 min，随后移入100％、95％、80％、70％梯度乙醇溶液中各5 min，最后放入双蒸水溶液中水化2 min；（6）阿利辛蓝染色：用3%乙酸放于石蜡切片上孵育3min，再放入ph=2.5 的1% 阿利辛蓝染液染色50 min，流水冲洗2 min，随后用双蒸水漂洗；（7）细胞核复染：应用0.1% nuclear fast red 染色10min，流动水冲洗1min，双蒸水漂洗2min；（8）封片：分别用95% 、100%乙醇脱水2 min，放入37℃温箱，待玻片干燥后用中性树脂封片；（9）观察：随后应用显微镜观察细胞外基质，胶原和蛋白多糖成分沉积染为蓝色。参见图7。
29.可见，人脐血间充质干细胞为离体2～3代以后的人脐血间充质干细胞，其中90％以上的细胞阳性表达cd105（图1）、cd73（图2）、cd90（图3），阴性表达cd45（图4）；具有定向分化的能力，能够向骨组织（图5）、脂肪组织分化（图6）、软骨组织（图7）。
30.脐带间充质干细胞培养上清中细胞因子的检测，包含以下步骤（1）上清收集：将ucmscs以1
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105个/孔的密度种植，培养24h后，以1000rpm离心3min后取上清，分装后于-80℃保存。
31.（2）细胞因子检测类目：利用试剂盒quantibody human cytokine antibody array 2000检测细胞因子，其中包括炎症因子timp-2、timp-1、tnf ri、il-6、mcp-1、icam-1、il-8、eotaxin、il-11、g-csf、tnf rii、mcsf、il-6sr、rantes、gm-csf、eotaxin-2（如图8）；趋化因子mcp-3、gro、mcp-4、6ckine、cxcl16、ip-10、pf4、axl、mcp-2、ena-78、mip-3a、mif、mip-3b、opn、il-17f、mdc、mspa、gcp-2、sdf-1a、tslp、nap-2（如图9）；生长因子：igfbp-3、igfbp-6、tgfb1、hgf、vegf、igfbp-2、gdf-15、opg、ar、igfbp-4、bdnf、bmp-5、igfbp-1、fgf-7、egfr（如图10）。
32.（3）检测方法：将芯片在室温平衡30min后，将包装袋打开，揭开密封条，然后将芯片放在室温干燥1小时。将每个芯片孔中加入100ul的1
×
样品稀释液，室温摇床上孵育30min；弃稀释液，每个孔中添加100
µ
l样品原液，一个阵列一个样品，4 ℃振荡过夜孵育。洗板机清洗玻片，用1
×
洗液i进行清洗，清洗8次，每次震荡10s。然后换用1
×
洗液ii用同样时间和次数进行清洗。配制生物素标记抗体，快速离心生物素标记抗体的小管，每个小管加入1400
µ
l的1
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样品稀释液，混合均匀。每孔加入70ul生物素标记抗体，室温振荡孵育。再次清洗，步骤同前。再向每孔加入70ul的1500倍稀释的荧光剂-链霉亲和素，避光室温震荡孵育1-2个小时。再次清洗后，采用激光扫描仪genepix 4000b microarray scanner扫描信号，采用绿色通道（激发频率=532nm）收集发光值。
33.脐带间充质干细胞培养上清对裸鼠皮肤缺损修复的观察，包含以下步骤（1）裸鼠腹腔内注射戊巴比妥钠（50mg/kg）进行全身麻醉。
34.（2）待麻醉效果满意后，使用75%乙醇消毒裸鼠背部皮肤3遍，将1个无菌的的聚酯胶圈粘贴于裸鼠背部皮肤，使用眼科剪沿胶圈内侧剪除全层裸鼠皮肤，使裸鼠肌肉层暴露，在裸鼠背部制备出1个直径为1cm的圆形皮肤缺损。
35.（3）术后裸鼠单笼饲养，随机进行分组，分别在创面处覆盖浸入脐带间充质干细胞调节性培养基的生物辅料，另一组在创面处覆盖浸入生理盐水的生物辅料，自第三天起每隔两天更换一次创面敷料。每天观察实验动物一般情况和创面愈合情况，包括创面收缩大小、创面渗出液、材部炎症、肉芽组织增生及上皮愈合情况。在第0d、4d、6d、9d、17d、21d进行图像采集。结果参见图11。
36.脐带间充质干细胞调节性培养基生物辅料及生理盐水辅料对皮肤组织的修复，包含以下步骤（1）观察21天后，分别对各组小鼠进行颈椎脱臼处死，取新愈合皮肤，并置于4%的多聚甲醛中完全浸泡，室温下固定组织约24-48h。
37.（2）组织固定后，流水冲洗后于80%、90%及100%的乙醇内分别浸没10min进行脱水处理；将组织使用石蜡包埋1h；使用切片机切片，切片厚度约为5μm，再次置于于37℃固定30min，60℃处理2h后，将切片置于二甲苯中脱蜡，然后于梯度酒精100%，95%，85%及75%中处理5min后，流水冲洗2min，蒸馏水清洗2min后行苏木精-伊红染色法（hematoxylin-eosin staining，he）；（3）he染色：取出上述切片，苏木素染液染色5分钟，自来水冲洗2min；盐酸乙醇分化液处理约20s，自来水冲洗2min；泡入伊红染液着色90s，自来水冲洗1min；再次行梯度酒精脱水80%乙醇20s，95%乙醇20s，无水乙醇5min；二甲苯中处理10min后，滴上中性树胶，盖玻片封片，显微镜下观察组织片染色情况并拍照。具体参见图12-图14。
38.采用下表1的评分标准，分别对每一个组织样本的3张病理切片进行评分，每张组织切片分别选取不同的3个视野进行评分，计算出每个样本的平均分值，对不同组别的病理评分进行统计，使用graphpad prism 5.0软件包(graphpad software inc., ca, usa)进行统计及作图分析，差异有统计学意义(**p＜0.01)。参见图15。
39.表1 皮肤缺损恢复评分表可见，本发明脐带间充质干细胞条件性培养基能促进皮肤组织缺损修复，促进皮肤再生，减少瘢痕形成（如图11所示）。病理切片通过如下评分表进行评分（表1），由图12至图14可以看出间充质干细胞条件性培养基能加快表皮再生完成，促进腺体结构再生。图15为评分统计图，说明间充质干细胞条件性培养基治疗优于生理盐水治疗，具有统计学意义。
40.以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。