抑制结直肠癌增殖和转移的靶标及其应用的制作方法

1.本发明属于生物技术领域，具体涉及抑制结直肠癌增殖和转移的新肿瘤标志物及新靶标发现与其应用，更具体涉及hrct1、hsa_circ_0087144作为抑制结直肠癌增殖和转移研究的新肿瘤标志物及新靶标与其应用。


背景技术：

2.结直肠癌(colorectal cancer，crc)是一种常见的消化道恶性肿瘤，与人类其他癌症相比，其发病率与死亡率逐年攀升，在全世界男性、女性中分别排名第3位及第2位，死亡病例在全世界男性、女性中分别排名第4位及第3位。相较于结直肠癌的严峻形势，目前结直肠癌的治疗仍然以手术切除为主，辅以放化疗以及中医药治疗，但效果并不理想，病人5年生存率仅为47.2％。近年来，靶向治疗越来越流行，已成为抗肿瘤治疗的主要手段之一，而靶向治疗也有一定的缺陷，基因调控网络复杂多样，靶向药的耐药现象是普遍存在的问题，一旦出现耐药情况，就要换新的靶向药物，虽然目前在包括结直肠癌在内的多种肿瘤中已有较多的作用靶标及其靶向药物，但是还远不能满足现有的临床治疗现状，因此发现新的分子靶标，阐明其发挥作用的分子机制，发展多样化的靶向药物，是目前基础科学与临床实践中的一大挑战。
3.hrct1基因，定位于9号染色体，编码13kd的蛋白。在已经公开的《the secreted protein discovery initiative(spdi),a large-scale effort to identify novel human secreted and transmembrane proteins:a bioinformatics assessment》中，有关于hrct1基因的描述。
4.目前对于hrct1基因在国际上结直肠癌领域并无具体相关研究工作，在其他癌症中也未见其具体功能的报导，基因的功能信息与应用价值尚不清楚。
5.cn113025713a的发明《用于预测肿瘤患者对特定抗肿瘤药物的敏感性的生物标志物的应用》告知了一种用于预测肿瘤患者对特定抗肿瘤药物的敏感性的生物标志物的应用，生物标志物中包括hrct1。该专利中，仅仅告知hrct1为一种用于预测肿瘤患者对特定抗肿瘤药物的敏感性的生物标志物，
6.过去人们对于癌症的治疗靶点主要聚焦于癌症进展过程中的关键蛋白质上。近年来，非编码rna作为肿瘤等疾病治疗的新靶标，新方法，变得越来越流行，越来越具有希望。大量的非编码rna已经被证实参与了肿瘤的发生发展过程，以反义寡核苷酸(asos)为例，多种核苷酸rna药物已进入临床的验证以及应用阶段。环状rna(circrna)是近年来发现的一种新型的长链非编码rna，因其结构稳定，序列保守，表达特异性等特点以及明确的生理学作用而有望成为新的癌症诊断标志物和治疗靶标。随着研究的深入，已有大量研究表明circrna在生物体的各项生命进程中发挥着极为关键的作用。而在结直肠癌进展过程，许多发挥关键作用的circrna其功能与作用机制还未被阐明，这显然不利于我们对结直肠癌疾病进展的理解，并基于此开发新的诊疗策略与手段。因此阐明结直肠癌生长过程中发挥关键作用的circrna的功能及其分子机制，基于此开发多样化的有效的诊断标志物及治疗靶
点，对于我们更加合理和准确的诊断与治疗临床crc病人，具有积极的重要意义。
7.目前关于hsa_circ_0087144在生物体内的功能作用等未见任何相关报道。


技术实现要素：

8.本发明要解决的技术问题是提供一种抑制结直肠癌增殖和转移的靶标与诊断标志物及其应用。
9.为解决上述技术问题，本发明提供hrct1、hsa_circ_0087144作为特异性标志物在制备抑制结直肠癌增殖、转移的药物中的应用。
10.本发明还同时提供了hrct1表达促进剂、hsa_circ_0087144表达促进剂在制备抑制结直肠癌增殖、转移的药物中的应用。
11.作为本发明的应用的改进：抑制结直肠癌细胞体内外的增殖和转移。
12.作为本发明的应用的进一步改进：
13.所述hrct1表达促进剂为hrct1的过表达质粒；
14.所述hsa_circ_0087144表达促进剂为hsa_circ_0087144的过表达质粒。
15.本发明还同时提供了预防或/和治疗结直肠癌的组合物，组合物包含：
16.(1)hrct1的表达促进剂；或hsa_circ_0087144的表达促进剂；
17.(2)药剂学上能够接受的载体。
18.作为本发明的预防或/和治疗结直肠癌的组合物的改进：
19.所述hrct1表达促进剂为hrct1的过表达质粒；
20.所述hsa_circ_0087144表达促进剂为hsa_circ_0087144的过表达质粒。
21.本发明还同时提供了一种检测hrct1表达的试剂：检测hrct1表达的试剂包含基于荧光定量pcr定量检测方法的试剂，荧光定量pcr定量检测方法的试剂包含一对特异性引物，
22.引物序列为:f(上游引物):5
’‑
catctctggggtgaacgagg-3’23.r(下游引物):5
’‑
ccactccccaaacccttcag-3’。
24.本发明还同时提供了一种检测hsa_circ_0087144表达的试剂：检测hsa_circ_0087144表达的试剂包含基于荧光定量pcr定量检测方法的试剂，荧光定量pcr定量检测方法的试剂包含一对特异性引物：
25.hsa_circ_0087144forward primer5
’‑
ggtccctagcactccatcac-3’；
26.hsa_circ_0087144reverse primer5
’‑
gtaggcctgtcgtgtggata-3’。
27.本发明的目的之一在于表明hrct1可以应用为结直肠癌的诊断标志物以及治疗靶标。
28.本发明所采取的技术方案如下：通过生物信息学技术手段，下载tcga数据库(https://tcga-data.nci.nih.gov/)中的结肠癌(tcga-coad)的exon-seq v2测序数据和临床数据，对转录组数据进行深度挖掘，发现，在tcga公共数据库所收集的各个国家的41对配对的临床组织样本中，相较于癌旁正常组织，hrct1基因在癌组织中mrna水平表达显著下调(图1a)。本发明进一步采用实验室收集的134对结直肠癌临床组织样本通过rt-qpcr技术进行验证，发现在134对临床组织样本中，相较于癌旁正常组织，hrct1基因在癌组织中mrna水平表达显著下调，与tcga数据库一致(图1b)。利用免疫组织化学实验技术(ihc)实验与蛋
白免疫印迹技术(western blotting)分别检测了hrct1基因在临床组织以及细胞系中的蛋白表达情况，发现在134对临床组织样本中，hrct1基因在蛋白水平表达显著下调(图1c)，同时，相较于正常结肠上皮细胞ncm460，hrct1在hct116等癌细胞系中表达显著下调(图1d)。进一步通过ihc实验发现，hrct1的表达与crc病人的分期相关(图1e)。更为关键的是，hrct1的表达与病人的预后相关(图1f),htct1表达越高的病人，其总生存期和无病生存期均显著增加，即hrct1表达越高，病人预后相对越好。
29.通过构建hrct1过表达载体并建立hct116细胞和sw480细胞稳转细胞株后(图2a)，通过soft agar与atp实验发现过表达hrct1显著抑制了crc细胞的增殖能力(图2b-e)。通过transwell实验，体外研究发现，hrct1的下调显著促进了hct116细胞和sw480细胞的迁移与侵袭能力(图2f,g)。
30.采取裸鼠皮下成瘤和尾静脉注射的方式建立裸鼠肺转移模型，观察hct116细胞在裸鼠皮下成瘤和体内肺转移情况。研究发现，hrct1显著抑制了结直肠癌细胞hct116细胞的体内增殖和转移能力(图3a-g)。
31.本发明有益效果如下：通过生物信息学手段对tcga数据库进行分析，并通过q-pcr与ihc等实验技术我们发现，相较于癌旁正常组织在癌组织中hrct1表达水平呈显著下调趋势，并且hrct1基因的表达高低与病人预后显著相关，表明hrct1可以作为结直肠癌转移诊断标志物，并成为病人的预后指标之一。同时，本发明进一步以结直肠癌hct116、sw480细胞为模型，过表达hrct1可显著抑制结直肠癌细胞hct116、sw480的体内外转移能力，表明hrct1可以作为结直肠癌转移的潜在的治疗靶标。
32.综上所述，本发明的方案一以结直肠癌hct116、sw480细胞为模型，过表达hrct1可显著抑制结直肠癌细胞hct116、sw480的体内外增殖和转移能力。并且在癌组织中hrct1在转录水平以及蛋白水平均呈现显著下调趋势，hrct1基因的表达高低与病人预后显著相关。由此可见，本发明表明hrct1可作为结直肠癌的预后标志物与治疗靶标，本发明有望为结直肠癌提供全新的诊断标志物和治疗靶标。
33.本发明的目的之二在于表明hsa_circ_0087144可以应用为结直肠癌的诊断和预后标志物以及治疗靶标。
34.本发明所采取的技术方案如下：通过对临床收集的配对的结直肠癌旁正常组织，原发灶癌组织以及肝转移灶癌组织进行转录组测序我们发现，相较于癌旁正常组织，hsa_circ_0087144在配对的原发灶癌组织中表达显著下调，同时，相较于配对的原发灶癌组织，hsa_circ_0087144在肝转移灶癌组织中表达进一步下调(图4a)。本发明采用rt-qpcr技术对转录组结果进行验证，发现与转录组结果相一致(图4b)。本发明检测了hsa_circ_0087144基因在细胞系中的表达情况，发现相较于正常结肠上皮细胞ncm460，hsa_circ_0087144在dld-1等癌细胞系中表达显著下调(图4c)。hsa_circ_0087144的表达与crc病人的分期相关(图4d)。
35.更为关键的是，hsa_circ_0087144的表达与病人的预后相关，hsa_circ_0087144表达越高的病人，病人预后相对越好(图5)。
36.通过构建hsa_circ_0087144过表达载体并建立dld-1细胞和sw620细胞稳转细胞株后(图6a,6d)，通过soft agar与atp实验发现过表达hsa_circ_0087144显著抑制了crc细胞的增殖能力(图6b-c；6e-f)。
37.采取业内公认的体内研究方案：裸鼠皮下成瘤方式建立裸鼠异位移植瘤模型，观察dld-1细胞在裸鼠皮下成瘤情况。研究发现，hsa_circ_0087144显著抑制了dld-1细胞在裸鼠皮下的生长速度，肿瘤大小以及重量等(图7a-d)。即hsa_circ_0087144显著抑制了结直肠癌细胞dld-1细胞的体内增殖能力。
38.通过transwell实验，体外研究发现，hsa_circ_0087144的下调显著促进了dld-1细胞和sw620细胞的迁移与侵袭能力(图8a,b)。
39.采取业内公认的体内研究方案：建立裸鼠肺转移模型和肝转移模型(肺和肝为结直肠癌公认的主要转移靶器官)，观察dld-1细胞在裸鼠体内肺转移情况。研究发现，hsa_circ_0087144显著抑制了结直肠癌细胞dld-1细胞的体内转移能力(图8c-d)。
40.综上所述，本发明的方案二通过转录组及rt-qpcr等实验技术发现，相较于癌旁正常组织在癌组织以及肝转移灶组织中hsa_circ_0087144表达水平呈显著依次下调趋势，并且hsa_circ_0087144基因的表达高低与病人分期、转移和预后显著相关，表明hsa_circ_0087144可以作为结直肠癌转移的诊断标志物，并成为病人的预后指标。同时，本发明进一步以结直肠癌dld-1、sw620细胞为模型，过表达hsa_circ_0087144可显著抑制结直肠癌细胞dld-1、sw620的体内外增殖和转移能力，表明hsa_circ_0087144可以作为结直肠癌生长和转移的潜在的治疗靶标。
41.目前，现有的抑制结直肠癌增殖和转移的靶标为her1(egfr/erbb1)、vegfr、braf、kras等，hrct1作为蛋白治疗靶点并未被研究报道，且与上述已知靶点无关联性；本发明中的hsa_circ_0087144为核酸靶点。
附图说明
42.下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
43.图1中：
44.图1a,b为通过生物信息学手段分析tcga数据库中hrct1在结直肠癌相较于癌旁组织中转录水平的表达情况以及hrct1在134对临床样本中转录水平表达情况；图1c为hrct1蛋白水平的表达情况；图1d为hrct1在细胞系中的表达情况；图1e为hrct1蛋白在不同分期病人中的表达情况；图1f,g为hrct1表达与病人预后的关系。
45.图2中：
46.图2a为在hct116与sw480细胞中过表达hrct1后通过western-blot实验鉴定过表达效率；图2b-c为atp实验检测hect1对crc细胞增殖的影响；图2d-e为soft agar实验检测hect1对crc细胞增殖的影响；图2f-g通过transwell实验验证hrct1对结直肠癌细胞体外迁移与侵袭能力的影响。
47.图3为采取裸鼠皮下异位移植瘤模型验证hrct1对crc细胞增殖能力的影响，采取尾静脉注射的方式建立了裸鼠肺转移模型，观察过表达hrct1后hct116细胞相较于对照细胞在裸鼠皮下成瘤和肺中转移情况(图3a～g)。
48.图4中：
49.图4a为通过转录组学分析hsa_circ_0087144在结直肠癌相较于癌旁组织中在癌组织中(t)以及肝转移灶(mt)组织中转录水平的表达情况；图4b为qpcr检测hsa_circ_0087144在临床样本中转录水平表达情况；图4c为qpcr检测hsa_circ_0087144在细胞系中
的表达情况；图4d为qpcr检测hsa_circ_0087144在不同分期病人中的表达情况。
50.图5为hsa_circ_0087144表达与病人预后的关系。
51.图6中：
52.图6a,6d为在dld-1与sw620细胞中过表达hsa_circ_0087144后通过qpcr实验鉴定过表达效率；图6b-c为atp实验和softagar实验检测hsa_circ_0087144对crc细胞dld-1增殖的影响；图6e-f为atp实验和soft agar实验检测hsa_circ_0087144对crc细胞sw620增殖的影响。
53.图7为采取裸鼠皮下异位移植瘤模型验证hsa_circ_0087144对crc细胞dld-1增殖能力的影响(图7a-7d)。
54.图8中：
55.图8a,b为采取transwell实验验证hsa_circ_0087144对crc细胞迁移与侵袭能力，及体外转移能力的影响；图8c,d为采取肺转移和肝转移模型验证hsa_circ_0087144对crc细胞体内转移能力的影响。
具体实施方式
56.下面通过本发明的具体实施方式并结合说明书附图，进一步明确本发明的具体内容。
57.实施例一.1
58.通过生物信息学手段分析tcga数据库中hrct1在结直肠癌相较于癌旁组织中转录水平表达相对下调(图1a)。q-pcr与ihc检测hrct1在134对临床样本中转录水平(图1b)、蛋白水平的表达情况(图1c)以及在细胞系中的表达情况(图1d)。
59.具体如下：
60.1)下载tcga数据库(https://tcga-data.nci.nih.gov/)中的结肠癌(tcga-coad)的exon-seq v2测序数据和临床数据。
61.2)首先对数据中低量表达的基因进行剔除(过滤raw count 80％以上为0的基因)。筛选有癌与癌旁配对组织的样本作为对象，进行差异分析。分别使用r包edger(version：3.4，http://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/edger.html)对mrna数据进行预处理，将raw count标化为log-cpm值，进行线性建模，并且使用由voom函数计算的精度权重来调节平均方差关系。使用limma包提供的线性回归和经验贝叶斯方法，分别对mrna数据tumor vs normal进行差异表达分析。所有基因经过得到相应的p.value值，使用benjamini&hochberg方法进行多重检验校正，得到校正后p值即adj.p.value。本研究中mrna差异表达阈值均为adj.p.value《0.05且|log2fc|》2。
62.所得结果:tcga数据库中hrct1在结直肠癌相较于癌旁组织中转录水平表达相对下调(图1a)。
63.3)组织样本
64.临床组织样本由温州医科大学附属第一医院采集，样本采集与利用已通过温州医科大学附属第一医院伦理委员会的伦理批准，严格按照相关制度与流程进行采集与利用。采集到样本后，一部分组织采取液氮速冻的方式保存于液氮罐中，一部分组织立即用4％的pfa固定24h-48h，具体处理流程如下(此为常规技术)：
65.a.组织脱水：组织经4％pfa固定后，流水过夜冲洗组织，除去残余的pfa固定液。之后按照30％酒精1h
→
50％酒精1h
→
70％酒精4℃过夜
→
80％酒精1h
→
90％酒精1h
→
95％酒精1h
→
100％酒精2h的顺序将组织梯度脱水。
66.b.组织透明：组织经梯度脱水后，将组织置入50％无水乙醇与50％二甲苯的混合液玻璃缸中5min，之后将组织转入二甲苯中10min。
67.c.组织浸蜡：组织透明后，将组织浸入软蜡中1h，之后浸入硬蜡中1h。
68.d.组织包埋：将组织从塑料包埋盒中取出，放入金属包埋盒中，将塑料包埋盒掩于其上，滴加适量的硬蜡，使硬蜡充分包裹塑料包埋盒，待硬蜡微凝固后将蜡块继续转入冰盒中，使蜡块与金属包埋盒脱离，取出蜡块，常温或4℃长期保存。
69.4)组织总rna提取
70.a.从超低温冰箱中取出步骤3)所得的结直肠癌临床样本，每个样本取样约50mg于ep管中，加入700μl的qiazol混匀，组织需要剪碎并用组织破碎仪充分破碎。
71.b.加入200μl的氯仿，剧烈震荡15s，冰上静置5min。提前预冷离心机至4℃。4℃离心,12000g，15min。
72.c.用200μl的去酶枪头吸取上清，移至新的ep管中，约400μl。加入等体积的400μl异丙醇，颠倒混匀，冰上静置10min。4℃离心,12000g，10min，弃去上清。
73.d.用depc水配制75％酒精，向上述沉淀中加入1ml配置好的75％酒精，吹打沉淀，4℃离心,12000g，5min,弃去上清，重复此步骤。
74.e.弃去上清后空离5min，用去酶小枪头吸取残留上清，留底部白色沉淀。开盖晾干，待底部白色沉淀透明后加入去酶水。4℃溶解2h，测定rna浓度(浓度约为normal：1129ug/ml；tumor:808ug/ml)。
75.5)rt-qpcr
76.依照步骤4)提取并测定完成rna浓度后，使用购买于invitrogen公司的superscript
tm
iv逆转录试剂盒进行逆转录，根据试剂说明书逆转录反应体系及步骤如下：
[0077][0078]
按照说明书将各组分加入到pcr管中，振荡混匀，点离pcr管，之后将其置于pcr仪，设置pcr仪第一步反应程序：65℃，5min。反应完成后，冰上静置大于1min，加入按照如下表体系(rt反应体系)中各组分进行第二步pcr反应。
[0079][0080]
按照说明书将各组分加入到pcr管中，振荡混匀，点离pcr管，之后将其置于pcr仪，设置pcr仪第二步反应程序：50-55℃10min，80℃10min。得到cdna后，封口膜密封-80℃保存或完成下一步实验后再进行保存处理。将所需细胞获得cdna后，利用qiagen所购试剂盒进行pcr，pcr反应体系如下(4℃操作)：
[0081][0082][0083]
按照以上反应体系将各组分充分混匀，加入384孔板中,每个样本设置3个复孔，离心1000g，1min，使各组分混匀并沉于孔底，置于q6荧光定量pcr仪中进行检测。pcr反应条件为预变性：95℃，30s，变性：95℃，5秒，退火：58℃，30秒，延伸：72℃，30秒，共设置40cycles。
[0084]
hrct1的forward primer：5
’‑
catctctggggtgaacgagg-3’；
[0085]
hrct1的reverse primer：5
’‑
ccactccccaaacccttcag-3’；
[0086]
内参gapdh的forward primer：5
’‑
ggagcgagatccctccaaaat-3’；
[0087]
内参gapdh的reverse primer：5
’‑
ggctgttgtcatacttctcatgg-3’。
[0088]
所得结果为：hrct1在癌组织中表达显著低于癌旁正常组织(图1b)；根据该结果，可得知：hrct1可作为结直肠癌转移的诊断标志物。
[0089]
6)免疫组织化学(ihc)
[0090]
a.烤片脱蜡：65℃烤箱烤片3h，充分融蜡,二甲苯20min
→
50％二甲苯 50％无水乙醇2min。
[0091]
b.水化：无水乙醇100％
→
95％
→
90％
→
80％
→
70％
→
50％各90s。ddh2o漂洗10min。换水3次，洗涤要充分。
[0092]
c.抗原修复(微波修复法)：在白色玻片修复盒中加入一定量的ph6.0,0.01m的抗原修复液，切片插入塑料架中，放入微波炉，预热至沸腾，调节微波火力为30p，7min
×
4。
[0093]
d.待冷却至室温，甩去抗原修复液，用1
×
tbs洗三次，每次5min，洗完后甩去玻片的水渍，组化专用笔圈出组织。在玻片上滴加3％h2o2，阻断内源性过氧化物酶，置于湿盒，
室温孵育30min。
[0094]
e.甩去h2o2，用1
×
tbs洗三次，5min/次。甩去tbs，滴加5％bsa封闭非特异性结合位点，室温孵育30min。
[0095]
f.甩去bsa，不用洗，加样枪加一抗，20微升左右，空白对照加tbs，阴性对照加同属性的igg，湿盒4℃孵育过夜。4℃冰箱取出孵育湿盒，室温复温30min，回收一抗。
[0096]
g.1
×
tbs洗三次，5min/次，甩去tbs，加与一抗对应的生物素化的二抗，37℃湿盒恒温孵育1h。甩去二抗，用1
×
tbs洗三次，5min/次。
[0097]
h.滴加sabc，37℃恒温湿盒孵育1h，甩去sabc，用1
×
tbs洗三次。
[0098]
i.显色：滴加现配适量的dab显色剂，显微镜下控制显色并记录时间。ddh2o清洗5min，换水三次。
[0099]
j.苏木素染色：滴加苏木素到玻片组织上，染色2min，自来水终止染色。自来水洗5min。
[0100]
k.脱水脱色：玻片依次置于50％
→
70％
→
80％
→
95％
→
100％乙醇各90s。
[0101]
l.透明：50％二甲苯 50％无水乙醇2min
‑‑
二甲苯10min。通风橱中晾干30min，中性树胶封片。避免产生气泡，封片完成后置于通风橱中晾干。
[0102]
所得结果为：相较于正常组织，hrct1在癌组织中表达下降(图1c)；相较于早期结直肠癌，hrct1在晚期结直肠癌中表达下降(图1e)。根据该结果，可得知：hrct1可作为结直肠癌转移的诊断标志物。
[0103]
7)蛋白免疫印迹(western blotting技术)
[0104]
a.将稳定转染细胞株(30万个/孔)接种到6孔板中，待到细胞贴壁后用0.1％fbs培养基培养细胞12h，再用对应的10％fbs完全培养基继续培养24h。当细胞密度达到85％左右时，终止培养。然后按照如下步骤进行操作：
[0105]
b.裂解细胞：弃去培养基，pbs洗一遍，弃去pbs，将六孔板置于冰盒上，每孔加入100ul左右的bb细胞裂解液，迅速用细胞刮刮取细胞，使细胞快速、充分裂解。用枪将裂解液吸入提前标记好的1.5mlep管中。
[0106]
c.蛋白样本处理：将装有蛋白样品的1.5mlep管置于100℃的金属浴上，煮沸样本5min。之后待蛋白样本冷却，用超声破碎细胞(1s/次，间隔1s，连续30次左右)，直到样品由粘稠状变为不粘稠的液体状。用biodrop仪器测定样本蛋白浓度，每个样本测两次取平均值，且要求两次测量浓度差别小于0.1，之后用bb与6
×
sb将各个样本蛋白定为统一浓度，定容完成后，将蛋白样品再次置于100℃的金属浴上，煮沸样本5min。
[0107]
d.sds-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)电泳：取约100μg的蛋白样品进行凝胶电泳，调整电压跑浓缩胶时为150v，约15min，待样品进入分离胶时，将电压调整为125v，继续跑胶约1h45 min；待溴酚蓝指示剂到达距胶板底部1cm处时，停止电泳。
[0108]
e.转膜：将长为8cm，宽6cm的pvdf膜用甲醇活化15s左右，然后浸泡于转膜缓冲液中。按照阴极到阳极装配顺序依次为：海棉垫-滤纸-胶-pvdf膜-滤纸-海棉垫，过程中避免气泡产生，装配好电泳装置后，设置电压25v，4.5h。采用湿转法将凝胶上蛋白转移到pvdf膜上。
[0109]
f.封闭：转膜结束后卸去转膜装置，并在pvdf膜上标记对应实验信息，用tbs洗膜5min，之后加入5％脱脂牛奶室温摇床封闭1h。
[0110]
g.一抗孵育：封闭完成后用tbs洗膜5min，洗三次，彻底洗去牛奶残渣，加入检测蛋白对应的稀释好的一抗，4℃孵育过夜。第二天回收一抗，用0.1％tbst洗3遍，每遍5min。
[0111]
h.二抗孵育：加入适当浓度的对应种属的碱性磷酸酶(ap)标记的二抗，根据抗体强弱4℃孵育2-3h。回收二抗，用0.1％tbst洗洗3遍，每遍15min，0.1％tbs洗3遍，每遍5min。
[0112]
i.显影：按1:10配制ap底物ecf显影液，根据不同抗体的强弱差异，将pvdf膜放入显影液中反应5s至1min不等，将pvdf膜置于塑料薄膜中(避免气泡)，用typhoon7000扫膜仪(ge公司)以不同曝光度扫描获取图像，并保存分析记录结果。
[0113]
所得结果为：hrct1在结直肠癌组织与细胞中表达显著低于正常组织与细胞(图1d)。综上所得结果为hrct1在结直肠癌中表达显著下调，并且其表达与病人的分期显著相关。根据该结果，可得知：hrct1可以作为结直肠癌的诊断标志物。
[0114]
实施例一.2、hrct1高表达的患者预后要明显好于hrct1低表达的患者
[0115]
整理预后相关临床信息，包括总生存时间(overall survival,os)、生存状态(os status)、无病生存时间(desease-free survival,dfs)、无病生存状态(dfs status)。将hrct1的mrna分别按照肿瘤组的表达水平将样本分为两组：高表达和低表达，并进行log-rank统计检验，设定p《0.05为统计学显著性阈值。分析mrna与患者预后的关系并绘制k-m生存曲线。
[0116]
所得结果为：hrct1的表达与病人的预后相关(图1f-g)。根据该结果，可得知：hrct1可作为结直肠癌的预后标志物。
[0117]
实施例一.3、hrct1显著抑制结直肠癌细胞的体外增殖能力
[0118]
1)选用hct116细胞与sw480细胞，并采用pcdh-ef1-mcs-t2a-puro-hrct1质粒(常规质粒载体)在hct116与sw480细胞中过表达hrct1(过表达的方法可采用常规的慢病毒质粒包装法)，建立稳定转染细胞hct116-hrct1，sw480-hrct1及其对照hct116-vector，sw480-vector，q-pcr实验验证过表达效率。
[0119]
2)采用atp实验检测肿瘤细胞hct116-hrct1、sw480-hrct1相较于对照hct116-vector、sw480-vector细胞生长活力变化，具体步骤如下：用0.25％胰酶消化处于对数生长期的细胞，用培养基吹打成为单细胞悬液，计数后取相应悬液体积的细胞加入相应细胞数至96孔板中。细胞贴壁后从培养箱取出相应细胞，显微镜下观察状态。从-20℃取出atp检测试剂，室温溶解。甩去96孔板中的旧培养基，每孔加25μl的pbs，再加入每孔25μl的atp检测试剂，避光操作。避光，振荡器上震荡3min，室温静置10min。将96孔板中的西细胞裂解产物转移至避光板，每孔加40μl。上机检测。
[0120]
3)采用软琼脂克隆形成(soft agar)实验评价肿瘤细胞hct116-hrct1、sw480-hrct1相较于对照hct116-vector、sw480-vector细胞锚定非依赖的恶性增殖能力。具体步骤如下：按照每孔取1.2ml的1.25％琼脂糖溶液与1.8ml配制的培养基(即：medium)于15ml离心管中，轻轻吹打混匀后加入6孔板的孔中，避免吹打出气泡，铺板要平而均匀，避免产生气泡。静置至少2h后，按照如下体系铺上层胶：
[0121][0122]
先将1.25％的琼脂糖凝胶与2
×
细胞培养基混匀后放入42℃水浴锅中预热，然后用0.25％胰酶消化处于对数生长期的细胞，用培养基吹打成为单细胞悬液，计数后取相应悬液体积的细胞加入相应细胞数至1.25％的琼脂糖凝胶与2
×
细胞培养基中，铺板。静置1-2小时后，用封口膜密封6孔板，之后放入37℃5％二氧化碳细胞培养箱中继续培养，7天左右开始观察克隆生长状态，待到克隆生长至合适大小时，采用显微镜5倍镜拍照并计数，计算细胞集落数形成率。
[0123]
所得结果为：过表达hrct1抑制了细胞的增殖活性(图2b-c)及软琼脂克隆形成能力(图2d-e)。根据该结果，可得知：hrct1显著抑制结直肠癌细胞的体外增殖能力，hrct1可作为抑制结直肠癌增殖的治疗靶标。
[0124]
实施例一.4、过表达hrct1显著抑制结直肠癌细胞的体内增殖能力
[0125]
1)动物饲养
[0126]
balb/c-nu雌性裸鼠，周龄为3-4周，体重15
±
0.5克，实验动物由江苏集萃药康生物科技有限公司购入，并饲养于温州医科大学实验动物中心spf级实验区域。所进行动物实验的开展已通过温州医科大学实验动物伦理委员会的批准且实验过程符合伦理委员会的动物伦理要求。
[0127]
2)皮下注射
[0128]
0.25％胰酶消化处于对数生长期的hct116-vector细胞、hct116-hrct1细胞、sw480-vector细胞、sw480-hrct1细胞；用培养基终止消化，将所有培养皿的细胞收集至50ml离心管中，1500rpm离心5min，之后弃去上清培养基，用pbs重悬细胞洗一次，再次1500rpm离心5min后弃去pbs，加入1ml pbs重悬，按照一定比例稀释细胞后充池计数，计算所需细胞量。每只裸鼠皮下注射100μl细胞悬液，其中包含300万细胞量。裸鼠皮下注射部位用75％酒精擦拭消毒处理，接种前将细胞充分混匀，用1ml无菌胰岛素注射器吸取100ul细胞悬液，均匀注射于小鼠右背部皮下位置，每组注射5只裸鼠。
[0129]
3)测定拍照
[0130]
1周左右pbs被裸鼠充分吸收，肿瘤细胞初步成瘤，此时用游标卡尺测肿瘤大小计算肿瘤体积(肿瘤体积v＝0.52
×
(a
×
b2)；待裸鼠接种肿瘤细胞生长4周左右时，用0.5％戊巴比妥钠麻醉裸鼠后处死，解剖取出瘤体，拍照并将瘤体称重。
[0131]
所得结果为：过表达hrct1显著抑制了结直肠癌细胞在裸鼠皮下的瘤体体积(图3a-b)及重量(图3c)及ki67(公认的可反应细胞增殖活性的marker分子，其表达与细胞增殖活性成正比)的表达水平(图3d)。根据该结果，可得知：过表达hrct1显著抑制了结直肠癌细胞的体内增殖能力，hrct1可作为抑制结直肠癌增殖的治疗靶标。
[0132]
实施例一.5、hrct1显著抑制结直肠癌细胞的体外迁移与侵袭能力
[0133]
选用hct116细胞与sw480细胞，并采用pcdh-ef1-mcs-t2a-puro-hrct1质粒在hct116与sw480细胞中过表达hrct1，建立稳定转染细胞hct116-hrct1，sw480-hrct1及其对
照hct116-vector，sw480-vector，wb实验验证过表达效率。采用transwell实验，将hct116-hrct1，sw480-hrct1以及对照细胞用0.1％对应的培养基重悬细胞之后种于上室中，下室采用全培培养，24h后采用3.7％甲醛固定5min，100％甲醇渗透20min，吉姆萨染色液进行避光染色15min并拍照，并对迁移和浸润的细胞数定量分析。
[0134]
所得结果为：过表达hrct1显著抑制了结直肠癌细胞的小室的迁移与侵袭比例(图2f-g)。根据该结果，可得知：过表达hrct1显著抑制了结直肠癌细胞的体外迁移与侵袭能力，hrct1可作为抑制结直肠癌转移的治疗靶标。
[0135]
实施例一.6、过表达hrct1显著抑制结直肠癌细胞的体内转移能力
[0136]
1)动物饲养
[0137]
balb/c-nu雌性裸鼠，周龄为3-4周，体重15
±
0.5克，实验动物由江苏集萃药康生物科技有限公司购入，并饲养于温州医科大学实验动物中心spf级实验区域。所进行动物实验的开展已通过温州医科大学实验动物伦理委员会的批准且实验过程符合伦理委员会的动物伦理要求。
[0138]
2)尾静脉注射
[0139]
0.25％胰酶消化处于对数生长期的hct116-vector细胞、hct116-hrct1细胞、sw480-vector细胞、sw480-hrct1细胞；用培养基终止消化，将所有培养皿的细胞收集至50ml离心管中，1500rpm离心5min，之后弃去上清培养基，用pbs重悬细胞洗一次，再次1500rpm离心5min后弃去pbs，加入1ml pbs重悬，按照一定比例稀释细胞后冲池计数，计算所需细胞量。每只裸鼠尾静脉注射100μl细胞悬液，其中包含200万细胞量。裸鼠尾静脉注射部位用75％酒精擦拭消毒处理，接种前将细胞充分混匀，用1ml无菌胰岛素注射器吸取100ul细胞悬液，缓慢尾静脉注射，每组注射6只裸鼠。
[0140]
3)测定拍照
[0141]
待裸鼠接种肿瘤细胞生长8周左右时，用0.5％戊巴比妥钠麻醉裸鼠后处死，解剖取出裸鼠肺组织，拍照并固定包埋肺组织。
[0142]
所得结果为：过表达hrct1显著抑制了结直肠癌细胞的肺转移转移灶的数目(图3e-g)。根据该结果，可得知：过表达hrct1显著抑制了结直肠癌细胞的体内转移能力，hrct1可作为抑制结直肠癌转移的治疗靶标。
[0143]
实施例二.1
[0144]
通过转录组学手段发现在临床样本中hsa_circ_0087144在结直肠癌癌旁组织、原发灶癌组织与肝转移灶组织中转录水平表达相对依次下调(图4a)。q-pcr检测了临床样本以及在细胞系中hsa_circ_0087144的表达情况进一步验证了这一点(图4b-c)，并且hsa_circ_0087144的表达与病人分期有关(图4d)。
[0145]
具体如下：
[0146]
1)、组织样本
[0147]
临床组织样本由温州医科大学附属第一医院采集，样本采集与利用已通过温州医科大学附属第一医院伦理委员会的伦理批准，严格按照相关制度与流程进行采集与利用。采集到样本后，一部分组织采取液氮速冻的方式保存于液氮罐中，一部分组织立即用4％的pfa固定24h-48h，具体处理流程如下：
[0148]
a.组织脱水：组织经4％pfa固定后，流水过夜冲洗组织，除去残余的pfa固定液。之
后按照30％酒精1h
→
50％酒精1h
→
70％酒精4℃过夜
→
80％酒精1h
→
90％酒精1h
→
95％酒精1h
→
100％酒精1h的顺序将组织梯度脱水。
[0149]
b.组织透明：组织经梯度脱水后，将组织置入50％无水乙醇与50％二甲苯的混合液玻璃缸中5min，之后将组织转入二甲苯中5min。
[0150]
c.组织浸蜡：组织透明后，将组织浸入软蜡中1h，之后浸入硬蜡中1h。
[0151]
d.组织包埋：将组织从塑料包埋盒中取出，放入金属包埋盒中，将塑料包埋盒掩于其上，滴加适量的硬蜡，使硬蜡充分包裹塑料包埋盒，待硬蜡微凝固后将蜡块继续转入冰盒中，使蜡块与金属包埋盒脱离，取出蜡块，常温或4℃长期保存。
[0152]
2)、组织总rna提取
[0153]
a.从超低温冰箱中取出如上述所采集的结直肠癌临床样本，每个样本取样约50mg于ep管中，加入700μl的qiazol混匀，组织需要剪碎并用组织破碎仪充分破碎。
[0154]
b.加入200μl的氯仿，剧烈震荡15s，冰上静置5min。提前预冷离心机至4℃。4℃离心,12000g，15min。
[0155]
c.用200μl的去酶枪头吸取上清，移至新的ep管中，约400μl。加入等体积的400μl异丙醇，颠倒混匀，冰上静置10min。4℃离心,12000g，10min，弃去上清。
[0156]
d.用depc水配制75％酒精，向上述沉淀中加入1ml配置好的75％酒精，吹打沉淀，4℃离心,12000g，5min,弃去上清，重复此步骤。
[0157]
e.弃去上清后空离5min，用去酶小枪头吸取残留上清，留底部白色沉淀。开盖晾干，待底部白色沉淀透明后加入去酶水。4℃溶解2h，测定rna浓度。rna浓度为癌旁正常组织：1777ug/ml；癌组织：2146ug/ml；转移灶癌组织：1750ug/ml。
[0158]
3)、rt-qpcr
[0159]
依照2)步骤提取并测定完成rna浓度后，使用购买于invitrogen公司的superscript
tm
iv逆转录试剂盒进行逆转录，根据试剂说明书逆转录反应体系及步骤如下：
[0160][0161]
按照说明书将各组分加入到pcr管中，振荡混匀，点离pcr管，之后将其置于pcr仪，设置pcr仪第一步反应程序：65℃，5min。反应完成后，冰上静置大于1min，加入如下表体系(rt反应体系)各组分进行第二步pcr反应。
[0162][0163]
按照说明书将各组分加入到pcr管中，振荡混匀，点离pcr管，之后将其置于pcr仪，设置pcr仪第二步反应程序：50-55℃10min，80℃10min。得到cdna后，封口膜密封-80℃保存或完成下一步实验后再进行保存处理。将所需细胞获得cdna后，利用qiagen所购试剂盒进行pcr，pcr反应体系如下(4℃操作)：
[0164][0165]
按照以上反应体系将各组分充分混匀，加入384孔板中,每个样本设置3个复孔，离心1000g，1min，使各组分混匀并沉于孔底，置于q6荧光定量pcr仪中进行检测。pcr反应条件为预变性：95℃，30s，变性：95℃，5秒，退火：58℃，30秒，延伸：72℃，30秒，共设置40cycles。引物序列如下：
[0166]
hsa_circ_0087144forwardprimer5
’‑
ggtccctagcactccatcac-3’；
[0167]
hsa_circ_0087144reverseprimer5
’‑
gtaggcctgtcgtgtggata-3’；
[0168]
内参gapdh forward primer：5
’‑
ggagcgagatccctccaaaat-3’；
[0169]
内参gapdh reverse primer5
’‑
ggctgttgtcatacttctcatgg-3’；
[0170]
说明：内参的作用是：q-pcr的计算校准。
[0171]
所得结果为：hsa_circ_0087144相较于癌旁组织，在癌组织中(t)以及肝转移灶(mt)组织中转录水平的表达依次下降(图4a-b)相较于正常细胞系ncm460，hsa_circ_0087144在癌细胞系hct116,dld-1,sw480,sw620中表达下降(图4c)；相较于早期(ⅰ期和ⅱ期)结直肠癌，hsa_circ_0087144在中晚期(ⅲ期和ⅳ期)结直肠癌中表达下降(图4d)。可得知：hsa_circ_0087144可以作为结直肠癌的诊断标志物。
[0172]
实施例二.2
[0173]
hsa_circ_0087144高表达的患者预后要明显好于hsa_circ_0087144低表达的患者
[0174]
整理预后相关临床信息，包括总生存时间(overall survival,os)、生存状态(os status)。以生存期作为横坐标，不同时间点下的生存状态所得生存率作为纵坐标，本发明
将hsa_circ_0087144的rna分别按照肿瘤组的表达水平将样本分为两组：高表达和低表达，并进行log-rank统计检验，设定p《0.05为统计学显著性阈值。分析hsa_circ_0087144与患者预后的关系并绘制k-m生存曲线。
[0175]
所得结果为：hsa_circ_0087144表达与结直肠癌病人的预后相关，hsa_circ_0087144表达越低，结直肠癌病人的预后越差。根据该结果，可得知：hsa_circ_0087144可以作为结直肠癌的预后标志物。
[0176]
实施例二.3
[0177]
hsa_circ_0087144显著抑制结直肠癌细胞的体外增殖能力(图6a-f)
[0178]
选用dld-1细胞与sw620细胞，并采用常规质粒pcdh-ef1-mcs-t2a-puro质粒在dld-1细胞与sw620细胞中过表达hsa_circ_0087144，建立稳定转染细胞dld-1-hsa_circ_0087144，sw620-hsa_circ_0087144及其对照dld-vector，sw620-vector，q-pcr实验验证过表达效率(图6a，6d)。
[0179]
具体如下：
[0180]
1)、采用atp实验检测肿瘤细胞生长活力变化
[0181]
具体步骤如下：用0.25％胰酶消化处于对数生长期的细胞，用培养基吹打成为单细胞悬液，计数后取相应悬液体积的细胞加入相应细胞数至96孔板中。细胞贴壁后从培养箱取出相应细胞，显微镜下观察状态。从-20℃取出atp检测试剂，室温溶解。甩去96孔板中的旧培养基，每孔加25μl的pbs，再加入每孔25μl的atp检测试剂，避光操作。避光，振荡器上震荡3min，室温静置10min。将96孔板中的西细胞裂解产物转移至避光板，每孔加40μl。上机检测
[0182]
检测结果如图6b，图6e，过表达hsa_circ_0087144显著抑制了结直肠癌细胞的增殖活性。
[0183]
2)、采用软琼脂克隆形成(soft agar)实验评价肿瘤细胞增殖能力sw620-hsa_circ_0087144、dld-1-hsa_circ_0087144相较于对照sw620-vector、dld-1-vector细胞锚定非依赖的恶性增殖能力。
[0184]
具体步骤如下：按照每孔取1.2ml的1.25％琼脂糖溶液与1.8ml配制的培养基(即：medium)于15ml离心管中，轻轻吹打混匀后加入6孔板的孔中，避免吹打出气泡，铺板要平而均匀，避免产生气泡。静置至少2h后，按照如下体系铺上层胶：
[0185][0186]
先将1.25％的琼脂糖凝胶与2
×
细胞培养基混匀后放入42℃水浴锅中预热，然后用0.25％胰酶消化处于对数生长期的细胞，用培养基吹打成为单细胞悬液，计数后取相应悬液体积的细胞加入相应细胞数至1.25％的琼脂糖凝胶与2
×
细胞培养基中，铺板。静置1-2小时后，用封口膜密封6孔板，之后放入37℃5％二氧化碳细胞培养箱中继续培养，7天左右开始观察克隆生长状态，待到克隆生长至合适大小时(为第14天)，采用显微镜5倍镜拍照并计数，计算细胞集落数形成率(图6c，6f)。
[0187]
所得结果为：hsa_circ_0087144显著抑制了结直肠癌细胞的体外增殖能力(图6c,f)。根据该结果，可得知：hsa_circ_0087144可以作为抑制结直肠癌生长的治疗靶标。
[0188]
实施例二.4
[0189]
过表达hsa_circ_0087144显著抑制结直肠癌细胞的体内增殖能力
[0190]
1)动物饲养
[0191]
balb/c-nu雌性裸鼠，周龄为3-4周，体重15
±
0.5克，实验动物由江苏集萃药康生物科技有限公司购入，并饲养于温州医科大学实验动物中心spf级实验区域。所进行动物实验的开展已通过温州医科大学实验动物伦理委员会的批准且实验过程符合伦理委员会的动物伦理要求。
[0192]
2)皮下注射
[0193]
0.25％胰酶消化处于对数生长期的dld-1-vector细胞、dld-1-hsa_circ_0087144细胞；用培养基终止消化，将所有培养皿的细胞收集至50ml离心管中，1500rpm离心5min，之后弃去上清培养基，用pbs重悬细胞洗一次，再次1500rpm离心5min后弃去pbs，加入1ml pbs重悬，按照一定比例稀释细胞后充池计数，计算所需细胞量。每只裸鼠皮下注射100μl细胞悬液，其中包含300万细胞量。裸鼠皮下注射部位用75％酒精擦拭消毒处理，接种前将细胞充分混匀，用1ml无菌胰岛素注射器吸取100ul细胞悬液，均匀注射于小鼠右背部皮下位置，每组注射6只裸鼠。
[0194]
3)测定拍照
[0195]
1周左右pbs被裸鼠充分吸收，肿瘤细胞初步成瘤，此时用游标卡尺测肿瘤大小计算肿瘤体积(肿瘤体积v＝0.52
×
(a
×
b2)；待裸鼠接种肿瘤细胞生长4周左右时，用0.5％戊巴比妥钠麻醉裸鼠后处死，解剖取出瘤体，拍照并将瘤体称重(图7a-d)。
[0196]
所得结果为：hsa_circ_0087144显著抑制了结直肠癌细胞的体内增殖能力。根据该结果，可得知：在实施例二.3所得结论的基础上，进一步证实hsa_circ_0087144可以作为抑制结直肠癌生长的治疗靶标。
[0197]
实施例二.5
[0198]
hsa_circ_0087144显著抑制结直肠癌细胞的体内外迁移与侵袭能力
[0199]
1)采用transwell实验，将dld-1-hsa_circ_0087144，sw620-hsa_circ_0087144以及对照细胞用0.1％对应的培养基重悬细胞之后种于上室中，下室采用全培培养，24h后采用3.7％甲醛固定5min，100％甲醇渗透20min，吉姆萨染色液进行避光染色15min并拍照，并对迁移和侵袭的细胞数定量分析，如图8a,b所示，其差异具有统计学意义。
[0200]
2)动物饲养
[0201]
balb/c-nu雌性裸鼠，周龄为3-4周，体重15
±
0.5克，实验动物由江苏集萃药康生物科技有限公司购入，并饲养于温州医科大学实验动物中心spf级实验区域。所进行动物实验的开展已通过温州医科大学实验动物伦理委员会的批准且实验过程符合伦理委员会的动物伦理要求。
[0202]
3)尾静脉与脾脏注射
[0203]
0.25％胰酶消化处于对数生长期的dld-1-vector细胞、dld-1-hsa_circ_0087144细胞，用培养基终止消化，将所有培养皿的细胞收集至50ml离心管中，1500rpm离心5min，之后弃去上清培养基，用pbs重悬细胞洗一次，再次1500rpm离心5min后弃去pbs，加入1ml pbs
重悬，按照一定比例稀释细胞后冲池计数，计算所需细胞量。每只裸鼠经尾静脉和脾脏分别注射100μl细胞悬液，其中分别包含200万细胞量。裸鼠尾静脉注射部位用75％酒精擦拭消毒处理，脾脏进行手术缝合和消毒。接种前将细胞充分混匀，用1ml无菌胰岛素注射器吸取100ul细胞悬液，缓慢尾静脉和脾脏注射，每组注射6只裸鼠。
[0204]
3)测定拍照
[0205]
待裸鼠接种肿瘤细胞生长8周左右时，用0.5％戊巴比妥钠麻醉裸鼠后处死，解剖取出裸鼠肺和肝组织，拍照并固定包埋组织。
[0206]
所得结果为：hsa_circ_0087144显著抑制了结直肠癌细胞的体内外转移能力。根据该结果，可得知：hsa_circ_0087144可以作为抑制结直肠癌转移的治疗靶标。
[0207]
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。