薄壳山核桃Mahan、Pawnee和Greenriver的SSR分子标记及其应用的制作方法

薄壳山核桃mahan、pawnee和greenriver的ssr分子标记及其应用
技术领域
1.本发明涉及薄壳山核桃品种鉴定技术领域，具体涉及鉴别薄壳山核桃品种mahan、pawnee和greenriver的ssr分子标记及其应用。


背景技术：

2.薄壳山核桃(carya illinoinensis)，是胡桃科(juglandaceae)山核桃属(carya)的植物，是世界范围重要的干果和木本油料树种。该树种原产于美国南部和墨西哥北部，中国引种已有100余年的历史。早期作为绿化树种引进，目前主要转为果用。薄壳山核桃在中国又称碧根果，其坚果含油率高，其中不饱和脂肪酸占总脂肪含量的90％以上，同时含有丰富的酚类物质、矿物质元素、氨基酸、维生素等，营养丰富、经济价值高。随着薄壳山核桃种植的推广，对于良种苗木的需求迅速增加，良种是确保果园能够优质丰产的基础，如何确保苗木品种的真实性成为亟待解决的问题。
3.‘
mahan’、
‘
pawnee’和
‘
greenriver’是中国薄壳山核桃生产中较早引种且应用较多的品种。
‘
mahan’的中文译名通常为
‘
马汉’或
‘
马罕’，大果型品种，单果重9克以上，雌蕊先熟型品种。
‘
pawnee’的中文译名通常为
‘
波尼’，由
‘
mohawk
’ב
starking hardy giant’两个品种杂交而成，单果重在8克左右，为雄蕊先熟型品种。
‘
greenriver’实生选育，与品种
‘
major’等在同一林分选出，单果重为6.5g，雌蕊先熟型品种。这几个品种在坚果品质和丰产性等方面表现良好，深受种植户的青睐。薄壳山核桃雌雄同株异花，雌雄花期不遇，需对不同品种进行配置才能充分授粉，实现优质丰产。不同品种之间也存在区域适应性和栽培管理的差异。然而，薄壳山核桃引种和繁育单位较多，过程中可能存在引种不规范，品种混杂，“一物多名”和“多物一名”等现象。而且，苗期不同品种之间表型差异不明显，难以实现有效区分，如果种植的品种与目标不符，往往需要4～6年开花结实之后才能发现，为育种单位和种植户造成较大的人力、时间和经济上的损失。因此，在薄壳山核桃建园初期，确定品种的真实性就显得尤为重要。在生产实践中，通常依靠有经验的专家通过叶片、果实、花、树姿等表型特征实现品种的辨别，但是同一品种在不同气候区域条件、不同生长发育阶段、不同栽培条件下表型性状具有较大差异，造成依赖经验的品种鉴别方法成功率不高。
4.近年来，分子标记因能直接检测dna水平的差异，不依赖于表型性状，稳定性强、可重复性好等优势，已广泛应用于动植物的品种鉴定和亲缘关系研究。在薄壳山核桃方面，已有基于分子标记手段的亲缘关系研究，但存在品种覆盖度低、标记数量多、操作复杂等问题。因此亟需建立一种准确率高、操作简便、鉴别结果稳定的薄壳山核桃品种鉴定方法。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提供一种鉴别薄壳山核桃品种
‘
mahan’、
‘
pawnee’和
‘
greenriver’的ssr分子标记及其应用。
6.为实现上述目的，本发明使用生物信息学的方法，从薄壳山核桃全基因组序列中
发掘超过14万个ssr(简单重复序列标记，simple sequence repeat，ssr)位点，批量设计特异性引物超过6万对。进一步对这些引物进行筛选，主要筛选标准如下：1)ssr位点的类型为2～4个碱基重复；2)上下游引物的退火温度相差不超过1℃；3)引物中不包含未知碱基；4)目标产物在100bp～300bp。初步筛选并合成300对引物。采集在中国应用较多的36个薄壳山核桃品种的嫩叶，提取基因组dna，对pcr反应条件、扩增产物检测条件进行优化。使用优化后的程序对36个品种进行扩增并检测，筛选得到一对扩增效果好、稳定性强、在薄壳山核桃常用品种
‘
mahan’、
‘
pawnee’和
‘
greenriver’中均有特异性条带的ssr引物，从而实现使用1个ssr分子标记准确鉴别
‘
mahan’、
‘
pawnee’和
‘
greenriver’。
7.具体地，本发明提供以下技术方案：
8.第一方面，本发明提供用于鉴定薄壳山核桃品种
‘
mahan’、
‘
pawnee’和
‘
greenriver’的ssr分子标记，所述ssr分子标记由seq id no.1-2所示的引物扩增得到。
9.以上所述的引物序列具体如下：
10.seq id no.1(5
’‑3’
)：gaccaccttacgtgggagaa；
11.seq id no.2(5
’‑3’
)：gcatcgagacacatcctttg。
12.第二方面，本发明提供用于鉴定薄壳山核桃品种
‘
mahan’、
‘
pawnee’和
‘
greenriver’的引物，其核苷酸序列如seq id no.1-2所示。
13.第三方面，本发明提供包含如seq id no.1-2所示的引物的试剂盒。
14.优选地，所述试剂盒还包括用于pcr扩增的其他成分，包括但不限于pcr反应缓冲液、dntp、dna聚合酶、阴性对照、阳性对照等。
15.第四方面，本发明提供的包含如seq id no.1-2所示的引物的dna芯片。
16.第五方面，本发明提供所述ssr分子标记或所述引物或所述试剂盒或所述dna芯片在鉴定薄壳山核桃品种
‘
mahan’、
‘
pawnee’或
‘
greenriver’中的应用。
17.本发明还提供所述ssr分子标记或所述引物或所述试剂盒或所述dna芯片在构建薄壳山核桃品种
‘
mahan’、
‘
pawnee’或
‘
greenriver’的dna指纹数据库中的应用。
18.本发明还提供所述ssr分子标记或所述引物或所述试剂盒或所述dna芯片在薄壳山核桃品种
‘
mahan’、
‘
pawnee’或
‘
greenriver’的分子标记辅助育种中的应用。
19.本发明还提供所述ssr分子标记或所述引物或所述试剂盒或所述dna芯片在薄壳山核桃品种
‘
mahan’、
‘
pawnee’或
‘
greenriver’的种质资源鉴定中的应用。
20.本发明还提供所述ssr分子标记或所述引物或所述试剂盒或所述dna芯片在薄壳山核桃品种
‘
mahan’、
‘
pawnee’或
‘
greenriver’的种苗质量检测中的应用。
21.第六方面，本发明提供一种鉴定薄壳山核桃品种
‘
mahan’、
‘
pawnee’或
‘
greenriver’的方法，该方法包括以下步骤：以待鉴定薄壳山核桃的dna为模板，采用核苷酸序列如seq id no.1-2所示的引物进行pcr扩增，若得到的扩增产物的长度为96bp和108bp，则判断待鉴定薄壳山核桃为
‘
mahan’；若得到扩增产物的长度为96bp，则判断待鉴定薄壳山核桃为
‘
pawnee’；若得到扩增产物的长度为94bp和96bp，则判断待鉴定薄壳山核桃为
‘
greenriver’。
22.具体地，所述鉴定薄壳山核桃品种
‘
mahan’、
‘
pawnee’或
‘
greenriver’的方法包括如下步骤：
23.(1)提取待鉴定薄壳山核桃的基因组dna；
24.(2)以步骤(1)提取的dna为模板，采用核苷酸序列如seq id no.1-2所示的引物进行pcr扩增；
25.(3)根据pcr扩增产物的条带类型，判断待鉴定薄壳山核桃是否为薄壳山核桃品种
‘
mahan’、
‘
pawnee’或
‘
greenriver’。
26.优选地，所述pcr扩增的反应程序包括：95℃，2min；94℃变性40s，56℃退火45s，72℃延伸1min，29个循环；72℃延伸7min。
27.或者，所述pcr扩增的反应程序包括：94℃，3min；94℃变性15s，55℃退火15s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸3min。
28.本发明的有益效果在于：本发明提供的ssr分子标记能够实现薄壳山核桃品种
‘
mahan’、
‘
pawnee’和
‘
greenriver’的鉴定，既可以从不同薄壳山核桃品种中将
‘
mahan’、
‘
pawnee’和
‘
greenriver’鉴别出来，而且，还可用于
‘
mahan’、
‘
pawnee’和
‘
greenriver’之间的区分鉴别。利用该ssr分子标记进行
‘
mahan’、
‘
pawnee’和
‘
greenriver’的鉴定，能够有效降低鉴定成本、提高效率、而且操作简便、鉴定结果准确，该ssr分子标记和鉴定方法具有广阔的应用前景。
附图说明
29.图1为本发明实施例2中利用引物p1和p2(seq id no.1-2)对36个薄壳山核桃品种的45个样品进行pcr扩增得到的扩增产物的电泳图，其中，m泳道为dna marker，从下到上的条带大小分别为：100、150、200、250、300、400、500bp；其他1～45泳道每一个泳道为一个样品，第1～45泳道的样品依次为：
‘
kanza’、
‘
mohawk’、
‘
shawnee’、
‘
mahan’、
‘
mahan’(生物学重复)、
‘
osage’、
‘
pawnee’、
‘
mcmillan’、
‘
lakota’、
‘
silver back’、
‘
carter’、
‘
colby’、
‘
stuart’、
‘
greenriver’、
‘
waco’、
‘
major’、
‘
oconee’、
‘
oconee’(生物学重复)、
‘
navaho’、
‘
gloria grande’、
‘
forkert’、
‘
choctaw’、
‘
creek’、
‘
mohawk’(生物学重复)、
‘
elliott’、
‘
barton’、
‘
creek’(生物学重复)、
‘
desirable’、
‘
graking’、
‘
greenriver’(生物学重复)、
‘
hopi’、
‘
jayhawk’、
‘
kiowa’、
‘
lakota’(生物学重复)、
‘
maramec’、
‘
mohawk’(生物学重复)、
‘
nacono’、
‘
navaho’(生物学重复)、
‘
oconee’(生物学重复)、
‘
posey’、
‘
houma’、
‘
yates68’、
‘
shepherd’、
‘
deerstand’、
‘
chetopa’。
30.图2为本发明实施例2中利用引物p1和p2(seq id no.1-2)扩增得到的薄壳山核桃
‘
mahan’、
‘
pawnee’和
‘
greenriver’的pcr扩增产物的毛细管电泳图。
具体实施方式
31.以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
32.以下实施例中使用的36个薄壳山核桃品种可通过市售购买途径获得，或者从中国林业科学研究院亚热带林业研究所种质资源库获得，其中，
‘
mahan’、
‘
pawnee’、
‘
greenriver’、
‘
mohawk’、
‘
osage’、
‘
lakota’、
‘
mcmillan’、
‘
carter’、
‘
colby’、
‘
stuart’等品种已在文献(zhang c.c.,yao x.h.,ren h.d.,chang j.,wu j.,shao w.z.,fang q.characterization and development of genomic ssrs in pecan(carya illinoinensis).forests.2020,11(1),61.)中公开。
33.实施例1ssr分子标记的开发
34.从薄壳山核桃全基因组序列中发掘超过14万个ssr位点，批量设计特异性引物超过6万对。进一步对这些引物进行筛选，主要筛选标准如下：1)ssr位点的类型为2～4个碱基重复；2)上下游引物的退火温度相差不超过1℃；3)引物中不包含未知碱基；4)目标产物在100bp～300bp。初步筛选并合成300对引物。
35.选取在中国应用较多的36个薄壳山核桃品种，这36个品种中包含与
‘
mahan’和
‘
pawnee’亲缘关系很近的多个品种，包括
‘
mohawk’(
‘
pawnee’的亲本)、
‘
creek’(与
‘
pawnee’有共同的亲本
‘
mohawk’)，以及
‘
mahan’的子代
‘
lakota’、
‘
choctaw’、
‘
kiowa’、
‘
lakota’和
‘
mohawk’等。采集36个薄壳山核桃品种的嫩叶，每个品种至少采集3个样品，分别提取基因组dna，对pcr反应条件、扩增产物检测条件进行优化。使用优化后的程序对36个品种的各样品进行扩增并检测，筛选得到一对扩增效果好、稳定性强、在薄壳山核桃常用品种
‘
mahan’、
‘
pawnee’和
‘
greenriver’中均有特异性条带的ssr引物，可实现使用1个ssr分子标记准确鉴别
‘
mahan’、
‘
pawnee’和
‘
greenriver’，该ssr引物的序列如下：
36.p1：seq id no.1(5
’‑3’
)：gaccaccttacgtgggagaa；
37.p2：seq id no.2(5
’‑3’
)：gcatcgagacacatcctttg。
38.利用上述ssr引物进行pcr扩增，薄壳山核桃品种
‘
mahan’、
‘
pawnee’和
‘
greenriver’均存在特异性条带，其中，
‘
mahan’在96bp和108bp处均有单一条带，
‘
pawnee’仅在96bp处有单一条带，
‘
greenriver’在94bp和96bp处均有单一条带。
39.实施例2利用ssr分子标记鉴定薄壳山核桃品种
‘
mahan’、
‘
pawnee’和
‘
greenriver’40.利用实施例1获得的ssr分子标记及其扩增引物进行薄壳山核桃品种
‘
mahan’、
‘
pawnee’和
‘
greenriver’的鉴定，具体方法如下：
41.1、基因组dna的提取和检测：
42.采集待鉴定薄壳山核桃的幼嫩叶片，使用tsingke植物dna提取试剂盒(通用型)提取待鉴定薄壳山核桃的叶片dna，，具体步骤如下：
43.(1)将spin column置于collection tube中，加入250μl buffer bl，12000rpm/min离心1min活化硅胶膜；
44.(2)取幼嫩叶片组织(不大于100mg)，加入液氮充分研磨。研磨后置于1.5ml离心管中，加入400μl buffer gp1，涡旋振荡1min，65℃水浴10～30min，期间可取出颠倒混匀以充分裂解；
45.(3)加入150μl buffer gp2，涡旋振荡1min，冰浴5min；
46.(4)12000rpm/min离心5min，将上清转移至新的离心管中；
47.(5)加入上清等体积的无水乙醇，立即充分振荡混匀，液体全部转入spin column中，12,000rpm/min离心30s，弃废液；
48.(6)向spin column中加入500μl buffer pw(使用前已加入无水乙醇)，12000rpm/min离心30s，弃废液；
49.(7)向spin column中加入500μl wash buffer(使用前已加入无水乙醇)，12000rpm/min离心30s，弃废液；
50.(8)重复操作步骤7；
51.(9)将spin column放回collection tube中，12,000rpm/min离心2min，开盖晾干
1min；
52.(10)取出spin column，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中央处加50～100μl te buffer(65℃预热te buffer)，20～25℃放置2min，12,000rpm/min离心2min。
53.(11)使用1％琼脂糖凝胶电泳检测基因组dna质量，使用紫外分光光度计检测基因组dna浓度。
54.2、ssr分子标记的pcr扩增
55.以提取的不同样本的基因组dna为模板，使用引物p1和p2(seq id no.1-2)对不同样本进行pcr扩增，pcr反应体系如表1所示。
56.表1 pcr扩增的反应体系
[0057][0058]
pcr反应条件如表2所示。
[0059]
表2 pcr扩增的反应条件
[0060][0061]
3、pcr扩增产物的聚丙烯酰胺凝胶电泳检测
[0062]
采用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测pcr扩增产物，非变性聚丙烯酰胺凝胶配方如表3所示。
[0063]
表3非变性聚丙烯酰胺凝胶配方
[0064]
[0065][0066]
电泳方法如下：
[0067]
电泳缓冲液为0.5
×
tbe，左右端空格避免边缘效应，电泳上样量1μl，两端各设置一个泳道上样50bp marker。电泳条件为：180v，400ma，电泳180min。
[0068]
电泳结束后取出胶，用枪尖进行打孔标记，agno3溶液(1.0g agno3溶于1l水中)银染10-15min；显色液(20g naoh溶于1l水中，加入10ml甲醛)显色5-8min；水漂洗2次后置于灯箱上拍照，人工判定各个样本的扩增产物的条带大小。
[0069]
当扩增产物在96bp和108bp处均有单一条带时确定该样本为
‘
mahan’，当扩增产物仅在96bp处有单一条带时，确定该检测样本为
‘
pawnee’，当扩增产物在94bp和96bp处均有单一条带，确定该检测样本为
‘
greenriver’。
[0070]
利用上述鉴定方法对薄壳山核桃种质资源库采集的36个薄壳山核桃品种的样品进行鉴定，部分样品的聚丙烯酰胺凝胶电泳检测结果如图1所示，图1中包含了36个品种的样品以及
‘
mahan’、
‘
oconee’、
‘
greenriver’、
‘
navaho’、
‘
creek’、
‘
mohawk’等部分品种的生物学重复，共计45个样品，其它各生物学重复之间均具有相同的检测结果，未全部列出。
[0071]
4、pcr扩增产物的毛细管电泳检测
[0072]
以提取的不同样本的基因组dna为模板，使用引物p1和p2(seq id no.1-2)对不同样本进行pcr扩增，pcr反应体系如表4所示。
[0073]
表4 pcr扩增的反应体系
[0074][0075]
pcr反应条件如表5所示。
[0076]
表5 pcr扩增的反应条件
[0077][0078]
abi 3730毛细管电泳检测方法如下：
[0079]
根据琼脂糖凝胶电泳检测结果估计pcr产物浓度，并将产物稀释10倍后，与rox 500内标(大小分别为70,80,100,120,140,160,180,200,240,280,320,360,400,450,490,500base)混匀，反应体系见表6，于95℃反应5min后迅速冰浴3min，然后置于abi3730测序仪样本架上进行毛细管电泳检测，各品种的检测结果见表7，其中，
‘
mahan’、
‘
pawnee’和
‘
greenriver’品种的pcr扩增产物的检测结果如图2所示。
[0080]
表6毛细管电泳反应体系
[0081][0082]
表7 36个薄壳山核桃品种pcr扩增产物的条带大小
[0083][0084]
结果表明，36个品种的各生物学重复之间的带型一致，表明该ssr分子标记在同一品种不同个体间可重复性较好。
‘
mahan’样本的扩增产物在96bp和108bp处均有单一条带，
‘
pawnee’样本的扩增产物仅在96bp处有单一条带，
‘
greenriver’在94bp和96bp处均有单一条带。
[0085]
以上结果表明，本发明提供的ssr分子标记能够实现
‘
mahan’、
‘
pawnee’和
‘
greenriver’与其他33个薄壳山核桃品种的准确区分，从36个薄壳山核桃品种中鉴别出常用品种
‘
mahan’、
‘
pawnee’和
‘
greenriver’，特别是与其亲缘关系很近的品种
‘
lakota’、
‘
choctaw’、
‘
mohawk’、
‘
creek’也不会对检测结果造成干扰。本发明的ssr分子标记实现了使用单一ssr分子标记即可进行
‘
mahan’、
‘
pawnee’和
‘
greenriver’的鉴定。
[0086]
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。