一种基因突变检测试剂盒及其应用的制作方法

1.本发明涉及遗传学领域，更具体地涉及一种基因突变检测试剂盒及其应用。


背景技术：

2.遗传代谢疾病是基因突变导致维持机体正常代谢所必需的某些酶、受体或载体缺乏或蛋白质异常发生的疾病，导致出现相应的病理改变和临床表现。尽管单一遗传代谢病的发病率低，但总体发病却能达到活产婴儿的1/500。目前，遗传代谢病的基因诊断主要基于二代测序技术。然而，二代测序样品制备繁琐，产生的数据量较大，对后期的数据的拼接和生物信息学分析要求较高，不适合大规模推广。此外，尽管随着二代测序技术取得较大的发展，但其的价格仍然相对较高。因此，临床上亟需一种操作简便、易于解读、价格较低的遗传代谢疾病快速基因检测方法。


技术实现要素：

3.本发明的目的在于提供一种基因突变检测试剂盒及其应用。
4.本发明的的目的在于在建立一种操作简便、易于解读、价格较低的用于包含肝豆状核变性致病基因atp7b、苯丙酮尿症致病基因pah和pts，以及甲基丙二酸血症的致病基因mut和mmachc的224个突变的快速检测方法。
5.在本发明的第一方面，提供了一种基因突变检测试剂盒，所述试剂盒包含特异性检测atp7b基因的突变位点的核酸检测试剂；并且，所述atp7b基因的突变位点选自下组a：
6.组a
7.[0008][0009]
在另一优选例中，所述atp7b基因的突变位点选自下组b：
[0010]
组b
[0011]
[0012][0013]
在另一优选例中，所述试剂盒还包含特异性检测mmachc基因的突变位点的核酸检测试剂，并且，所述mmachc基因的突变位点选自下组c：
[0014]
组c
[0015][0016][0017]
在另一优选例中，所述试剂盒还包含特异性检测mut基因的突变位点的核酸检测试剂，并且，所述mut基因的突变位点选自下组d：
[0018]
组d
[0019][0020][0021]
在另一优选例中，所述试剂盒还包含特异性检测pah基因和pts基因的突变位点的核酸检测试剂，并且，所述pah基因和pts基因的突变位点选自下组e：
[0022]
组e
[0023]
[0024][0025]
在另一优选例中，所述pah基因和pts基因的突变位点选自下组f：
[0026]
组f
[0027]
[0028][0029]
在另一优选例中，所述pah基因和pts基因的突变位点选自下组g：
[0030]
组g
[0031]
[0032][0033]
在另一优选例中，所述试剂盒中包含的特异性检测组a、组b、组c、组d、组e、组f、组g的突变位点的核酸检测试剂位于不同的容器中。
[0034]
在另一优选例中，所述试剂盒包含针对所述突变位点的特异性多重pcr引物。
[0035]
在另一优选例中，所述多重pcr引物对通过扩增能够同时得到包含不同突变位点的扩增子，每段扩增子至少含有1-5个突变位点。
[0036]
在另一优选例中，所述多重pcr引物的序列如seq id no:1-103所示。
[0037]
在另一优选例中，所述试剂盒包含针对atp7b基因(组a和组b的突变位点)的多重pcr引物，并且，所述多重pcr引物的序列如seq id no:1-32所示。
[0038]
在另一优选例中，所述试剂盒包含针对mmachc基因(组c的突变位点)的多重pcr引物，并且，所述多重pcr引物的序列如seq id no:33-40所示。
[0039]
在另一优选例中，所述试剂盒包含针对mut基因(组d的突变位点)的多重pcr引物，
并且，所述多重pcr引物的序列如seq id no:41-62所示。
[0040]
在另一优选例中，所述试剂盒包含针对pah基因和pts基因(组e、组f和组g的突变位点)的多重pcr引物，并且，所述多重pcr引物的序列如seq id no:63-103所示。
[0041]
在另一优选例中，所述试剂盒还包含针对所述突变位点的单碱基延伸引物。
[0042]
在另一优选例中，所述单碱基延伸引物为snapshot单碱基延伸引物。
[0043]
在另一优选例中，所述试剂盒包含针对组a的突变位点的单碱基延伸引物，并且所述单碱基延伸引物的序列如seq id no:104-136所示。
[0044]
在另一优选例中，所述试剂盒包含针对组b的突变位点的单碱基延伸引物，并且所述单碱基延伸引物的序列如seq id no:137-171所示。
[0045]
在另一优选例中，所述试剂盒包含针对组c的突变位点的单碱基延伸引物，并且所述单碱基延伸引物的序列如seq id no:172-190所示。
[0046]
在另一优选例中，所述试剂盒包含针对组d的突变位点的单碱基延伸引物，并且所述单碱基延伸引物的序列如seq id no:191-215所示。
[0047]
在另一优选例中，所述试剂盒包含针对组e的突变位点的单碱基延伸引物，并且所述单碱基延伸引物的序列如seq id no:216-251所示。
[0048]
在另一优选例中，所述试剂盒包含针对组f的突变位点的单碱基延伸引物，并且所述单碱基延伸引物的序列如seq id no:252-288所示。
[0049]
在另一优选例中，所述试剂盒包含针对组g的突变位点的单碱基延伸引物，并且所述单碱基延伸引物的序列如seq id no:289-321所示。
[0050]
在另一优选例中，所述试剂盒还包含所述试剂盒中还包括标准品dna。
[0051]
在另一优选例中，所述试剂盒还包含测序酶，较佳地，所述测序酶包括snapshot测序酶。
[0052]
在另一优选例中，所述试剂盒还包含荧光标记的ddntp。
[0053]
在本发明的第二方面，提供了一种检测来自atp7b、pah、pts、mut和mmachc基因的突变位点的方法，包括步骤：
[0054]
(i)提供一待测样品；
[0055]
(ii)提供如本发明第一方面所述的试剂盒，对待测样品进行多重pcr反应以及单碱基延伸反应；
[0056]
(iii)对步骤(ii)所获得的样品进行检测和分型。
[0057]
在另一优选例中，所述单碱基延伸反应为snapshot单碱基延伸反应。
[0058]
在另一优选例中，所述方法还包括对对照样品进行平行检测。
[0059]
在另一优选例中，所述对照样品包括阳性对照样品和阴性对照样品。
[0060]
在另一优选例中，所述阴性对照样品为超纯水。
[0061]
在另一优选例中，在所述步骤(ii)中，待测样品进行复合扩增反应之后，在进行单碱基延伸反应之前，用虾碱性磷酸酶(sap)进行纯化处理。
[0062]
在另一优选例中，在所述步骤(iii)之前，对步骤(ii)所获得的样品进行虾碱性磷酸酶(sap)纯化处理。
[0063]
在另一优选例中，在所述步骤(iii)中，通过毛细管电泳进行检测。
[0064]
在另一优选例中，在所述步骤(iii)中，通过质谱法进行检测。
[0065]
在另一优选例中，所述的方法是非诊断和非治疗性的。
[0066]
在另一优选例中，所述的样本是含人体dna的样本。
[0067]
在本发明的第三方面，提供了一种如本发明第一方面所述的试剂盒的用途，用于检测来自atp7b、pah、pts、mut和mmachc基因的突变位点。
[0068]
在另一优选例中，所述试剂盒用于选自下组的疾病的基因诊断：
[0069]
肝豆状核变性、苯丙酮尿症、四氢生物蝶呤缺乏症、甲基丙二酸血症、或其组合。
[0070]
在本发明的第四方面，提供了一种核酸检测试剂的用途，用于制备基因突变检测试剂盒，其中，所述的核酸检测试剂包括特异性检测atp7b基因的突变位点核酸检测试剂；并且，所述atp7b基因的突变位点选自组a。
[0071]
在另一优选例中，所述atp7b基因的突变位点选自组b。
[0072]
在另一优选例中，所述的核酸检测试剂包括特异性检测mmachc基因的突变位点的核酸检测试剂，并且，所述mmachc基因的突变位点选自组c。
[0073]
在另一优选例中，所述的核酸检测试剂包括特异性检测mut基因的突变位点的核酸检测试剂，并且，所述mut基因的突变位点选自组d。
[0074]
在另一优选例中，所述的核酸检测试剂包括特异性检测pah基因和pts基因的突变位点的核酸检测试剂，并且，所述pah基因和pts基因的突变位点选自组e。
[0075]
在另一优选例中，所述pah基因和pts基因的突变位点选自下组f。
[0076]
在另一优选例中，所述pah基因和pts基因的突变位点选自下组g。
[0077]
在另一优选例中，所述基因突变检测试剂盒用于检测atp7b、pah、pts、mut和/或mmachc基因的突变。
[0078]
在另一优选例中，所述基因突变检测试剂盒用于选自下组的疾病的基因诊断：
[0079]
肝豆状核变性、苯丙酮尿症、四氢生物蝶呤缺乏症、甲基丙二酸血症、或其组合。
[0080]
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
[0081]
图1显示了本发明检测方法的工作原理。
[0082]
图2显示了一例阴性样本atp7b-panel1的毛细管电泳峰形图，包含atp7b基因33个热点突变。
[0083]
图3显示了一例阴性样本atp7b-panel2的毛细管电泳峰形图，包含atp7b基因37个热点突变。
[0084]
图4显示了一例阴性样本pku-panel1的毛细管电泳峰形图，包含pah基因34个热点突变，pts基因4个热点突变。
[0085]
图5显示了一例阴性样本pku-panel2的毛细管电泳峰形图，包含pah基因32个热点突变，pts基因6个热点突变。
[0086]
图6显示了一例阴性样本pku-panel3的毛细管电泳峰形图，包含pah基因31个热点突变，pts基因3个热点突变。
[0087]
图7显示了一例阴性样本mut的毛细管电泳峰形图，包含mut基因的25个热点突变。
[0088]
图8显示了一例阴性样本mmachc的毛细管电泳峰形图，包含mmachc基因的19个热点突变。
[0089]
图9显示了atp7b:c.2621c》t杂合突变的毛细管电泳峰形图(上图为杂合突变样本，下图为阴性样本)。
[0090]
图10显示了atp7b:c.2621c》t杂合突变的一代测序验证图。
[0091]
图11显示了mmachc:c.217c》t杂合突变的毛细管电泳峰形图(上图为杂合突变样本，下图为阴性样本)。
[0092]
图12显示了mmachc:c.217c》t杂合突变的一代测序验证图。
[0093]
图13显示了mut:c.729_730instt杂合突变的毛细管电泳峰形图(上图为杂合突变样本，下图为阴性样本)。
[0094]
图14显示mut:c.729_730instt杂合突变的一代测序验证图。
[0095]
图15显示了pah:c.1033g》a杂合突变的毛细管电泳峰形图(上图为杂合突变样本，下图为阴性样本)。
[0096]
图16显示pah:c.1033g》a杂合突变的一代测序验证图。
具体实施方式
[0097]
本发明人经过广泛而深入地研究，首次意外地发现一种atp7b、pah、pts、mut、mmachc基因突变检测试剂盒及其应用。具体地，本发明利用snapshot技术对atp7b、pah、pts、mut、mmachc基因的224个热点突变进行检测。设计了51对pcr引物用于扩增了包含224个位点的51个100-500bp片段，也设计了224个紧邻目标位点的延伸引物用于单碱基延伸。pcr产物用qiagen公司的hotstartaq进行多重pcr获得，pcr产物经虾碱酶(sap)(from promega)和外切酶i(exo i)(from epicentre)纯化后用abi公司的snapshot multiplex kit进行延伸反应。延伸产物用虾碱酶(sap)(from promega)纯化后在abi3730xl上样。snp分型用genemapper4.0(appliedbiosystems)来分析。
[0098]
本发明的主要的工作原理如图1所示，在一个含有测序酶、四种荧光标记的ddntp、紧邻多态位点5’端的不同长度的延伸引物和pcr模板的反应体系中，引物延伸一个碱基即终止，经abi测序仪毛细管电泳后，根据峰的颜色可知掺入的碱基种类，从而确定该样本的基因型，根据峰图上峰移动的位置确定该延伸产物对应的突变位点。
[0099]
本发明的主要优点包括：
[0100]
(a)本试剂盒在筛查的遗传性疾病涵盖上有所突破。
[0101]
(b)本试剂盒检测了肝豆状核变性、苯丙酮尿症、四氢生物蝶呤缺乏症、甲基丙二酸血症相关基因atp7b、pah、pts、mut、mmachc的224个热点突变，能快速进行相关疾病的基因诊断，为临床医生提供有效参考。
[0102]
(c)本技术采用具有高准确性的snapshot技术，具有非常的高的准确性。
[0103]
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如sambrook等人，分子克隆：实验室手册(new york:cold spring harbor laboratory press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
[0104]
通用材料
[0105]
实施例中的dna样本获自南京市妇幼保健院，分离自人外周血。
[0106]
实施例中涉及的突变位点信息以及对应的引物和分组如表1-4所示。
[0107]
表1突变位点信息
[0108]
[0109]
[0110]
[0111][0112]
表2：pcr引物序列表
[0113]
[0114]
[0115]
[0116][0117]
表3 pcr引物和各个突变位点的对应关系
[0118]
[0119][0120]
表4延伸引物信息
[0121]
[0122]
[0123]
[0124]
[0125]
[0126]
[0127]
[0128]
[0129]
[0130]
[0131][0132]
实施例1突变位点的检测
[0133]
采用snapshot技术，对肝豆状核变性、苯丙酮尿症、四氢生物蝶呤缺乏症、甲基丙二酸血症相关基因atp7b、pah、pts、mut、mmachc的224个热点突变进行检测，具体实验操作步骤如下：
[0134]
1)dna样本取1μl 1％琼脂糖凝胶电泳对其样本进行质量检查以及浓度估计，根据估计的浓度将样本稀释到工作浓度5-10ng/μl.
[0135]
2)pcr反应
[0136]
反应体系(10μl)：
[0137][0138]
pcr循环程序：
[0139]
95℃ 5min；11
×
(94℃ 20s,65℃-0.5℃/循环40s,72℃ 1.5min)；24
×
(94℃ 20s,59℃ 30s,72℃ 1.5min)；72℃ 2min；4℃保温.
[0140]
3)pcr产物纯化
[0141]
在10μl pcr产物中加入1u sap酶和1u exonuclease i酶，37℃温育1小时,然后75℃灭活15分钟。
[0142]
4)snapshot多重单碱基延伸反应
[0143]
延伸反应体系(10μl)：
[0144][0145]
pcr循环程序：
[0146]
96℃ 1min；28
×
(96℃ 10s,50℃ 5s,60℃ 30s)；4℃保温
[0147]
5)延伸产物纯化
[0148]
在10μl延伸产物中加入1u sap酶，37℃温育1小时,然后75℃灭活15分钟.
[0149]
6)延伸产物上abi3730xl测序仪
[0150]
取0.5μl纯化后的延伸产物，与0.5μl liz120 size standard，9μl hi-di混匀，95℃变性5分钟后上abi3730xl测序仪
[0151]
7)abi3730xl测序仪上收集的原始数据用genemapper 4.0(appliedbiosystems co.,ltd.,usa)进行分析。
[0152]
本实施例共检测了5375例样本，其中atp7b基因阳性有119例、mmachc基因阳性有61例、mut基因阳性有14例、pah基因阳性有97例、pts基因阳性有27例。随后，通过sanger测序对检测为阳性的样本进行结果验证，其正确率达到了100％。
[0153]
部分阳性突变样本的检测结果及其阴性对照和验证结果如图9-16所示。
[0154]
在本发明提及的所有文献都在本技术中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本技术所附权利要求书所限定的范围。