细胞生长辅助剂及应用其的细胞培养基的制作方法

1.本发明涉及一种细胞生长辅助剂，特别是涉及一种能提供三维(3d)培养条件的细胞生长辅助剂，以及应用其的细胞培养基。


背景技术：

2.通常在使用细胞培养液进行细胞培养时，细胞会在重力作用下沉降于细胞培养装置的某个区域上，而处于2d细胞培养状态。
3.随着科技的进步，科学家开始使用3d细胞培养技术取代2d细胞培养技术，以反映细胞在活体内的生长情况；现有的3d细胞培养技术包括悬滴培养(hanging-drop culture)、3d细胞培养支架(prefabricated scaffolds)以及凝胶包埋培养(gel-embedded culture)等，其中又以凝胶包埋培养最为常见。
4.然而，相较于一般细胞培养液培养，使用凝胶进行3d培养之前需要另外配制凝胶，导致实验时间延长以及实验成本增加。此外，在固态凝胶所形成的3d培养环境中，随着细胞逐渐聚集在一起，养分和气体将难以传递到组织中心，容易造成细胞坏死(necrosis)，在这种状态下无法进行长时间的细胞培养。并且当细胞培养完成后，包埋于凝胶中的细胞并不容易取出，这造成实验人员在操作上的负担，并且可能破坏细胞的完整性。
5.因此，如何通过改良细胞培养基，使体外细胞培养的环境可以贴近细胞在活体内的生长环境，并且使实验人员操作便利，是本发明要解决的重要问题之一。


技术实现要素：

6.本发明所要解决的技术问题之一在于，针对现有技术的不足提供一种细胞生长辅助剂用以创造三维培养环境。并且，提供一种应用该细胞生长辅助剂的细胞培养基。
7.为了解决上述的技术问题，本发明所采用的一种技术方案是提供一种细胞生长辅助剂，所述细胞生长辅助剂具有以下结构式：p-l-s-l-p；s表示底物(substrate)；l表示连接体(linker)；p表示肽(peptide)；其中，所述底物为聚氧乙烯聚氧丙烯醚嵌段共聚物(poloxamer)，所述连接体各自独立地为酸酐类单体，所述肽的氨基酸序列各自独立地选自由甘氨酸—精氨酸—甘氨酸—天冬氨酸(gly-arg-gly-asp，grgd)、精氨酸—甘氨酸—天冬氨酸(arg-gly-asp，rgd)、精氨酸—谷氨酸—天冬氨酸—缬氨酸(arg-glu-asp-val，redv)、亮氨酸—天冬氨酸—缬氨酸(leu-asp-val，ldv)、酪氨酸—异亮氨酸—甘氨酸—丝氨酸—精氨酸(tyr-ile-gly-ser-arg，yigsr)、脯氨酸—天冬氨酸—丝氨酸—甘氨酸—精氨酸(pro-asp-ser-gly-arg，pdsgr)、异亮氨酸—赖氨酸—缬氨酸—丙氨酸—缬氨酸(ile-lys-val-ala-val，ikvav)以及精氨酸—天冬酰胺—异亮氨酸—丙氨酸—谷氨酸—异亮氨酸—异亮氨酸—赖氨酸—天冬氨酸—丙氨酸(arg-asn-ile-ala-glu-ile-ile-lys-asp-ala，rniaeiikda)组成的组。
8.为了解决上述的技术问题，本发明所采用的另一种技术方案是提供一种细胞培养基，其特征在于，所述细胞培养基包含0.5wt％至5wt％的细胞生长辅助剂，所述细胞生长辅
助剂具有以下结构式：p-l-s-l-p；s表示底物；l表示连接体；p表示肽；其中，所述底物为聚氧乙烯聚氧丙烯醚嵌段共聚物，所述连接体各自独立地为酸酐类单体，所述肽的氨基酸序列各自独立地选自由甘氨酸—精氨酸—甘氨酸—天冬氨酸(gly-arg-gly-asp，grgd)、精氨酸—甘氨酸—天冬氨酸(arg-gly-asp，rgd)、精氨酸—谷氨酸—天冬氨酸—缬氨酸(arg-glu-asp-val，redv)、亮氨酸—天冬氨酸—缬氨酸(leu-asp-val，ldv)、酪氨酸—异亮氨酸—甘氨酸—丝氨酸—精氨酸(tyr-ile-gly-ser-arg，yigsr)、脯氨酸—天冬氨酸—丝氨酸—甘氨酸—精氨酸(pro-asp-ser-gly-arg，pdsgr)、异亮氨酸—赖氨酸—缬氨酸—丙氨酸—缬氨酸(ile-lys-val-ala-val，ikvav)以及精氨酸—天冬酰胺—异亮氨酸—丙氨酸—谷氨酸—异亮氨酸—异亮氨酸—赖氨酸—天冬氨酸—丙氨酸(arg-asn-ile-ala-glu-ile-ile-lys-asp-ala，rniaeiikda)组成的组。
9.在本发明的一个实施方案中，所述细胞培养基还包含95wt％至99.5wt％的细胞培养液。
10.在本发明的一个实施方案中，所述细胞生长辅助剂用于使细胞聚集悬浮于所述细胞培养液中。
11.在本发明的一个实施方案中，所述底物为普朗尼克f127(f-127，f127)，并且所述酸酐类单体为顺丁烯二酸酐(maleic anhydride，ma)、丁二酸酐(succinic anhydride)或4-甲基丙烯酰氧基乙基偏苯三酸酐(4-methacryloxyethyl trimellitic anhydride，4meta)。
12.在本发明的一个实施方案中，所述酸酐类单体为顺丁烯二酸酐，并且所述肽的氨基酸序列为甘氨酸—精氨酸—甘氨酸—天冬氨酸(gly-arg-gly-asp，grgd)。
13.在本发明的一个实施方案中，所述酸酐类单体为4-甲基丙烯酰氧基乙基偏苯三酸酐(4-methacryloxyethyl trimellitic anhydride，4meta)，并且所述肽的氨基酸序列为甘氨酸—精氨酸—甘氨酸—天冬氨酸(gly-arg-gly-asp，grgd)。
14.本发明的一种有益效果在于，本发明所提供的细胞生长辅助剂，其在聚氧乙烯聚氧丙烯醚嵌段共聚物两端通过酸酐类单体接枝具有细胞亲和性的肽，能在培养液中形成吸附细胞的微结构载体，使细胞悬浮于细胞培养液中生长，从而提高细胞增殖和存活率。
15.更进一步地说，由于聚氧乙烯聚氧丙烯醚嵌段共聚物具有温感性，本发明的细胞培养基在室温(约25℃)或培养温度(约37℃)下形成接近水凝胶状的微结构载体，其能携带细胞并使细胞始终处于分散悬浮状态，进而在分裂后呈球状聚集。值得注意的是，这些微结构载体可以在低温下(低于10℃)变回液态，方便进行细胞收集或更换细胞培养基。藉此，可以为体外细胞培养提供与体内细胞基本相同的生长条件，并使实验人员的操作更加方便灵活；且不需要另外配制3d凝胶，降低了实验成本。
16.更进一步地说，本发明的细胞生长辅助剂，其利用酸酐类单体连接聚氧乙烯聚氧丙烯醚嵌段共聚物与具有细胞亲和性的肽，可以提高结构稳定性，肽更容易帮助细胞聚集悬浮。
17.为了能够更进一步地了解本发明的特征及技术内容，请参阅以下有关本发明的详细说明与附图，然而所提供的附图仅用于提供参考与说明，并非用来对本发明加以限制。
附图说明
18.图1为本发明实施例2的细胞培养基的示意图。
19.图2为本发明实施例3的细胞培养结果的显微图像。
20.图3为本发明实施例3的细胞存活率的柱形图。
21.图4为本发明实施例3的细胞存活率(吸光值)的折线图。
22.图5为本发明实施例4的细胞培养结果的显微图像。
23.图6为本发明实施例4的细胞存活率的柱形图。
具体实施方式
24.以下是通过特定的具体实施例来说明本发明所公开有关“细胞生长辅助剂及应用其的细胞培养基”的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所公开的内容了解本发明的优点与效果。本发明可通过其他不同的具体实施例加以施行或应用，本说明书中的各项细节也可基于不同观点与应用，在不背离本发明构思的情况下进行各种修改与变更。另外，事先声明，本发明的附图仅为简单示意说明，并非依实际尺寸的描绘。以下的实施方式将进一步详细说明本发明的相关技术内容，但所公开的内容并非用以限制本发明的保护范围。另外，本文中所使用的术语“或”，应视实际情况可能包括相关联的列出项目中的任一个或者多个的组合。
25.实施例1
26.本发明的实施例1提供一种细胞生长辅助剂，其具有以下结构式p-l-s-l-p；s表示底物(substrate)；l表示连接体(linker)；p表示肽(peptide)。实际应用时，本发明的细胞生长辅助剂可以粉末或浓缩液的形式存在，但不限于此。
27.进一步而言，本发明的细胞生长辅助剂中的底物为聚氧乙烯聚氧丙烯醚嵌段共聚物(poloxamer)，具体是一种由中心为疏水性链的聚氧丙烯侧接两个亲水性聚氧乙烯所构成的非离子型三嵌段共聚物；聚氧乙烯聚氧丙烯醚嵌段共聚物的长度可以根据实际需要进行调整，因此存在性质略微不同的形态。在本实施例中，底物为普朗尼克f127(f-127，f127)，普朗尼克f127为温感性材料，处于低温环境(约4℃至10℃)时呈液态，处于接近室温(约25℃)或体温(约37℃)的环境时呈水凝胶状，且在低温下又可以转变回液态。
28.本发明的细胞生长辅助剂中的连接体各自独立地为酸酐类单体，并分别与聚氧乙烯聚氧丙烯醚嵌段共聚物的两个亲水端相连接。在本实施例中，连接体可为顺丁烯二酸酐(maleic anhydride，ma)、丁二酸酐(succinic anhydride)或4-甲基丙烯酰氧基乙基偏苯三酸酐(4-methacryloxyethyl trimellitic anhydride，4meta)，但不限于此；连接体用于将底物与肽稳定地连接在一起。从结构稳定性和可靠性方面考虑，连接体优选为4-甲基丙烯酰氧基乙基偏苯三酸酐(4-methacryloxyethyl trimellitic anhydride，4meta)或顺丁烯二酸酐，更优选为顺丁烯二酸酐。
29.值得注意的是，4-甲基丙烯酰氧基乙基偏苯三酸酐由于分子结构较大(分子量为304.25)，会增加底物与肽的间距，导致同一单位容积内肽的数量较少；相比之下，顺丁烯二酸酐(分子量为98.06)的分子结构较小，可以缩短底物与肽的间距，进而增加同一单位容积内肽的数量。因此，相较于以4-甲基丙烯酰氧基乙基偏苯三酸酐作为连接体的细胞生长辅助剂，以顺丁烯二酸酐为连接体的细胞生长辅助剂更容易使细胞聚集悬浮。
30.进一步而言，本发明细胞生长辅助剂中的肽具有细胞亲和性，其可选自由三至十个氨基酸组成的寡肽(oligopeptide)。在本实施例中，肽的氨基酸序列可各自独立地为甘氨酸—精氨酸—甘氨酸—天冬氨酸(gly-arg-gly-asp，grgd)、精氨酸—甘氨酸—天冬氨酸(arg-gly-asp，rgd)、精氨酸—谷氨酸—天冬氨酸—缬氨酸(arg-glu-asp-val，redv)、亮氨酸—天冬氨酸—缬氨酸(leu-asp-val，ldv)、酪氨酸—异亮氨酸—甘氨酸—丝氨酸—精氨酸(tyr-ile-gly-ser-arg，yigsr)、脯氨酸—天冬氨酸—丝氨酸—甘氨酸—精氨酸(pro-asp-ser-gly-arg，pdsgr)、异亮氨酸—赖氨酸—缬氨酸—丙氨酸—缬氨酸(ile-lys-val-ala-val，ikvav)或精氨酸—天冬酰胺—异亮氨酸—丙氨酸—谷氨酸—异亮氨酸—异亮氨酸—赖氨酸—天冬氨酸—丙氨酸(arg-asn-ile-ala-glu-ile-ile-lys-asp-ala，rniaeiikda)，但不限于此。实际应用时，可以根据待培养的细胞的培养需求来选择合适的肽，例如，为使细胞分裂后形成球状聚集，本发明细胞生长辅助剂可具有grgd肽。
31.在一些实施方案中，可实施的细胞生长辅助剂的结构(p-l-s-l-p)包括：grgd-ma-f127-ma-grgd、grgd-丁二酸酐-f127-丁二酸酐-grgd、grgd-4meta-f127-4meta-grgd、rgd-ma-f127-ma-rgd、rgd-4meta-f127-4meta-rgd、rgd-丁二酸酐-f127-丁二酸酐-rgd。
32.制备例
33.以制备细胞生长辅助剂grgd-ma-f127-ma-grgd(也称为f127-maleic-grgd)为例。
34.首先，按照方案(1)所示，将f127(10g，0.787mmol)溶于200ml无水二氯甲烷(dichloromethane，dcm)中，得到溶液，并在室温、氮气下向该溶液中逐滴添加三乙醇胺(triethanolamine，tea)(956mg，9.444mmol)以及顺丁烯二酸酐(maleic anhydride，ma)(617mg，6.296mmol)。持续于室温下搅拌反应混合物16小时以后，用水清洗两次，收集有机层并使用硫酸镁(mgso4)对其进行干燥。过滤有机层，并用旋转蒸发仪去除大部分溶剂。最后，使用过量的乙醚使产物沉淀，收集过滤的沉淀物，得到f127-顺丁烯二酸酐(f127-maleic)(67％)。
35.方案(1)
[0036][0037]
接下来，按照方案(2)所示，将所得的f127-顺丁烯二酸酐(1.0g，0.078mmol)溶于9ml四氢呋喃(tetrahydrofuran，thf)中，得到溶液，并在室温、氮气下，将n-羟基琥珀酰亚胺(n-hydroxysuccinimide，nhs)(72mg，0.624mmol)、二环己基碳二亚胺(n,n'-dicyclohexylcarbodiimide，dcc)(129mg，0.624mmol)以及4-二甲氨基吡啶(4-dimethylaminopyridine，dmap)加入该溶液中。持续于室温下搅拌反应混合物16小时以后，用水清洗两次，收集有机层并使用硫酸镁(mgso4)对其进行干燥。过滤有机层，并用旋转蒸发仪去除大部分溶剂。最后，使用过量的乙醚使产物沉淀，收集过滤的沉淀物，得到640mg的f127-顺丁烯二酸酐-n-羟基琥珀酰亚胺(f127-maleic-nhs)(64％)。
[0038]
方案(2)
[0039][0040]
最后，按照方案(3)所示，将所得的f127-maleic-nhs(500mg，0.039mmol)以及甘氨酸—精氨酸—甘氨酸—天冬氨酸(gly-arg-gly-asp，grgd)肽(45mg，0.129mmol)溶于3ml二甲基甲酰胺(n,n-dimethylformamide，dmf)中，得到溶液，并在室温、氮气下，将n,n-二异丙基乙基胺(n,n-diisopropylethylamine，dipea)(25mg,0.195mmol)加入该溶液中。持续于室温下搅拌反应混合物16小时以后，将混合物冷冻干燥以除去dmf。最后，使用冷却的甲醇使产物沉淀，收集过滤的沉淀物，在高真空下干燥，得到295mg f127-顺丁烯二酸酐-grgd(f127-maleic-grgd)(59％)。
[0041]
方案(3)
[0042][0043]
以上制备例为制备本发明细胞生长辅助剂的一种示例，并不限于此。
[0044]
实施例2
[0045]
参阅图1所示，本发明的实施例2提供一种细胞培养基m(cell culture medium)，其包含0.5wt％至5wt％的如实施例1所述的细胞生长辅助剂10以及95wt％至99.5wt％的细胞培养液20(cell culture solution)。本发明的细胞培养基m可以为细胞c提供3d培养环境，使细胞始终处于分散悬浮状态下生长，并在分裂后呈球状聚集。
[0046]
进一步而言，细胞培养液可采用基于平衡盐溶液(balanced salt solution，bss)、磷酸盐缓冲盐水(phosphate buffered saline，pbs)等的等渗溶液，并在其中进一步添加待培养细胞所需的营养成分(如氨基酸、维生素、血清等)和/或抗生素。
[0047]
在一些实施方案中，细胞培养液可为最小必需培养基(minimal essential medium，mem)、dmem培养基(dulbecco's modified minimal essential medium，dmem)、rpmi-1640培养基(roswell park memorial institute-1640medium，rpmi-1640)、imdm培养基(iscove's modified dmem，imdm)或无血清培养基(serum free medium，sfm)，但不限于此。
[0048]
在一些实施方案中，本发明的细胞培养基可以通过将细胞生长辅助剂混入到市售的最小必需培养基(minimal essential medium，mem)中制得；例如，可将1ml的细胞生长辅助剂的分散液混入到99ml的最小必需培养基中来制得细胞培养基。然而，本发明不限于上述所举的例子。
[0049]
值得注意的是，使用时，由于普朗尼克f127为温感性材料，可以在温度接近体温(约37℃)的细胞培养液中形成接近水凝胶状的微结构载体，其能吸附细胞并使其分散悬浮于细胞培养液中。并且在完成细胞培养后，可将细胞培养基置于低温环境中，以使微结构载体变回液态，方便进行细胞收集或或更换细胞培养基。
[0050]
实施例3
[0051]
使用含有不同浓度的本发明细胞生长辅助剂的细胞培养基培养人毛囊间充质干细胞(human hair follicle mesenchymal stem cells,hfmscs)7天，并观察其聚集形态及
其存活率。
[0052]
将细胞培养基分为五组，分别为控制组(3be-0)、实验组(3be-1)、实验组(3be-2)、实验组(3be-3)以及实验组(3be-4)。其中，所有组的细胞培养液皆为市售的最小必需培养基。各组的差别在于细胞生长辅助剂在细胞培养基中的浓度不同。具体而言，细胞生长辅助剂在控制组(3be-0)的细胞培养基中的浓度为0％；细胞生长辅助剂在实验组(3be-1)的细胞培养基中的浓度为0.05％；细胞生长辅助剂在实验组(3be-2)的细胞培养基中的浓度为0.1％；细胞生长辅助剂在实验组(3be-3)的细胞培养基中的浓度为0.25％；细胞生长辅助剂在实验组(3be-4)的细胞培养基中的浓度为0.5％。
[0053]
将1x 106细胞数目的hfmscs分别接种至96孔板中，其含有细胞生长辅助剂浓度不同的细胞培养基，并放置于37℃、二氧化碳浓度5％的培养箱中培养7天，每2天更换一次细胞培养基。其中，分别于第1天、第4天以及第7天时，观察细胞聚集形态及其存活率及增殖率。
[0054]
将细胞进行荧光染色，其中，绿色荧光为活细胞，红色荧光为死细胞。参阅图2所示，随着细胞生长辅助剂浓度的提高，细胞呈现球状聚集的效果越好。
[0055]
参阅图3及图4所示，含有细胞生长辅助剂的实验组，其细胞存活率均有70％。
[0056]
本实施例的结果显示，本发明的细胞培养基因为含有细胞生长辅助剂，而可以在体外创造出三维培养环境，帮助细胞以立体聚集方式生长，达到提高细胞增殖和存活率的效果。
[0057]
实施例4
[0058]
使用含有不同浓度的本发明细胞生长辅助剂的细胞培养基培养人乳腺癌细胞株(michigan cancer foundation-7，mcf-7)7天，并观察其聚集形态及其存活率。
[0059]
将细胞培养基分为五组，分别为控制组(3be-0)、实验组(3be-1)、实验组(3be-2)、实验组(3be-3)以及实验组(3be-4)。其中，所有组的细胞培养液皆为市售的最小必需培养基。各组的差别在于细胞生长辅助剂在细胞培养基中的浓度不同。具体而言，细胞生长辅助剂在控制组(3be-0)的细胞培养基中的浓度为0％；细胞生长辅助剂在实验组(3be-1)的细胞培养基中的浓度为0.05％；细胞生长辅助剂在实验组(3be-2)的细胞培养基中的浓度为0.1％；细胞生长辅助剂在实验组(3be-3)的细胞培养基中的浓度为0.25％；细胞生长辅助剂在实验组(3be-4)的细胞培养基中的浓度为0.5％。
[0060]
将5x 103细胞数目的mcf-7分别接种至96孔板中，其含有细胞生长辅助剂浓度不同的细胞培养基，并放置于37℃、二氧化碳浓度5％的培养箱中培养7天，每2天更换一次细胞培养基。其中，分别于第1天、第4天以及第7天时，观察细胞聚集形态及其存活率及增殖率。
[0061]
参阅图5所示，随着细胞生长辅助剂浓度的提高，细胞呈现球状聚集的效果越好。
[0062]
参阅图6所示，含有细胞生长辅助剂的实验组，其细胞存活率均有70％。
[0063]
本实施例的结果显示，本发明的细胞培养基因为含有细胞生长辅助剂，而可以在体外创造出三维培养环境，帮助细胞以立体聚集方式生长，达到提高细胞存活率的效果。
[0064]
本发明的有益效果
[0065]
本发明的一种有益效果在于，本发明所提供的细胞生长辅助剂，其在聚氧乙烯聚氧丙烯醚嵌段共聚物两端通过酸酐类单体接枝具有细胞亲和性的肽，能在培养液中形成吸
附细胞的微结构载体，使细胞悬浮于细胞培养液中生长，从而提高细胞增殖和存活率。
[0066]
更进一步地说，由于聚氧乙烯聚氧丙烯醚嵌段共聚物具有温感性，本发明的细胞培养基(含有grgd肽)在室温(约25℃)或培养温度(约37℃)下形成接近水凝胶状的微结构载体，其能携带细胞并使细胞始终处于分散悬浮状态，进而在分裂后呈球状聚集。值得注意的是，这些微结构载体可以在低温下(低于10℃)变回液态，方便进行细胞收集或更换细胞培养基。藉此，可以为体外细胞培养提供与体内细胞基本相同的生长条件，并使实验人员的操作更加方便灵活；且不需要另外配制3d凝胶，降低了实验成本。
[0067]
更进一步地说，本发明的细胞生长辅助剂，其利用酸酐类单体连接聚氧乙烯聚氧丙烯醚嵌段共聚物与具有细胞亲和性的肽，可以提高结构稳定性，肽更容易帮助细胞聚集悬浮。
[0068]
以上所公开的内容仅为本发明的优选可行实施方式，并非因此限制本发明的权利要求书的保护范围，所以凡是运用本发明说明书及附图内容所做的等效技术变化，均包含于本发明的权利要求书的保护范围内。