一种用于IgA肾病检测的系统、方法及方法的建立与流程

一种用于iga肾病检测的系统、方法及方法的建立
1.本技术是申请号为201410143612.6的发明专利申请的分案申请，该发明专利申请的申请日为2014年04月10日，发明创造名称为“一种用于iga肾病检测的系统、方法及方法的建立”。
技术领域
2.本发明涉及医疗诊断技术领域，尤其是涉及一种用于iga肾病检测的系统、方法及方法的建立。


背景技术：

3.目前，iga肾病诊断的主要的检测方法是肾活检，特征是肾小球系膜区iga团块样或颗粒样沉积，肾活检时患者呈俯卧位，穿刺针在超声的引导下于患者背部进针，快速取出肾组织，在一系列固定和染色后在光学显微镜或电子显微镜下观察肾脏变化情况，以诊断肾病类型和判断预后，但肾活检存在着至少下列所述的技术缺点：
4.1、肾活检为创伤性检查，在早期患者尿常规正常的情况下，不推荐进行肾活检。在患者病情加重需要重新评估肾脏病理时，多次穿刺不仅加重肾损伤，还有合并出血、感染等并发症的风险，难以反复进行。
5.2、肾活检有许多禁忌症。如绝对禁忌症、出血倾向明显、重度高血压、精神病或不配合者、孤立肾、小肾等；相对禁忌症，肾脏感染呈活动期(如活动性肾盂肾炎、肾结核、肾脓肿)、肾肿瘤或肾动脉瘤、多囊肾、过度肥胖、慢性肾功能衰竭、重度腹水、心功能衰竭、妊娠等。因此，不是每个肾脏病患者都适合做肾活检检查。
6.3、肾活检还有许多的并发症。最常见的如血尿，肾周围脓肿，腰痛及腰部不适，发热，动静脉瘘等。
7.4、肾活检从准备穿刺到得到病理结果耗时较长，准备步骤较多，反应较慢。由于是有创检查，患者需要术前停用抗凝药，对于有心血管疾病必须长期使用抗凝药的患者不利，且患者术后必须躺在床上24小时绝对卧床，不得下床走动。而从穿刺出肾组织到固定、石蜡包埋、免疫组化染色，直到最后显微镜下观察得出病理结果，一般需要5-7天时间，对于进展较快的急进性肾小球肾炎等肾病往往会造成诊断不及时，错诊或漏诊的情况时有发生。
8.因此，目前iga肾病的诊断技术有待进一步改进。


技术实现要素：

9.本发明的一个目的是建立一种用于iga肾病检测方法，旨在解决现有技术中的检测时对机体创伤大、检测时间长、适用范围小、检测步骤复杂的技术问题。
10.本发明的另外一个目的是提供一种用于iga肾病检测方法，旨在提供一种无机体创伤、检测时间短、适用范围大、检测步骤简单的iga肾病检测方法。
11.本发明的又一个目的是提供一种用于iga肾病检测的系统，旨在提供一种适用于无机体创伤、检测时间短、适用范围大、检测步骤简单的iga肾病检测方法的系统。
12.本发明提出了一种用于iga肾病检测方法的建立，包括：
13.s10、采集iga型肾病患者、非iga型肾病的肾病患者以及健康者的尿液；
14.s20、检测尿液中mirna的表达量；
15.s30、利用2-δδct
相对定量法比较所述mirna的表达量；
16.s40、对所述mirna的表达量进行roc曲线分析。
17.可选的，所述mirna为mirna-25、mirna-144以及mirna-486中的至少一种。
18.可选的，检测mirna-25、mirna-144以及mirna-486的表达量是通过选自荧光定量pcr、taqman探针以及lightcycle探针中的至少一种方法进行的。
19.可选的，所述荧光定量pcr为sybr green荧光定量pcr。
20.可选的，mirna-25的引物为：cauugcacuugucucggucuga；
21.和/或，mirna-144的引物为：uacaguauagaugauguacu；
22.和/或，mirna-486的引物为：uccuguacugagcugccccgag。
23.可选的，还包括管家基因的引物为：aaagcaggcuuuaaaggaaccu。
24.可选的，mirna-25的临界值为0.058；
25.和/或，mirna-144的临界值为0.007；
26.和/或，mirna-486的临界值为0.025。
27.本发明的另外一个目的是提出一种用于iga肾病检测方法，所述方法是根据以上所述的方法建立的方法，包括以下步骤：
28.采集尿液；
29.检测尿液中mirna-25、mirna-144以及mirna-486中至少一个的表达量；
30.判断mirna-25、mirna-144或mirna-486的表达量是否高于其各自的所述临界值。
31.可选的，所述荧光定量pcr为sybr green荧光定量pcr。
32.本发明的又一个目的是提出一种用于iga肾病检测的系统，所述用于iga肾病检测的系统利用以上所述的用于iga肾病检测的方法进行检测，所述系统包括：
33.尿液采集装置，以采集尿液；
34.mirna检测装置，以检测尿液中mirna的表达量。
35.根据本发明的用于iga肾病检测方法的建立，可以取得以下所述的至少一种积极技术效果：
36.1、可以有效地建立一种用于iga肾病检测方法。
37.2、由于检测的样本是尿液，而不是肾组织，所以本发明的最明显的优势就是具有无创伤的特点，可以根据疾病的病情变化需要反复或连续留取和测试。另外，所需留取尿液不会给患者带来任何损伤和风险，非常安全可靠。
38.3、由于检测时无明显禁忌症，可以适用于所有患者的检测。
39.4、由于所用的光定量pcr、taqman探针以及lightcycle探针的方法已经是常见的技术手段，并且具有检测准确、安全可靠、简单易行等的优点，一般的医护人员，例如乡镇和社区的基层医护人员，经1周左右的培训就可完全掌握该方法，大大缩短了培训周期，有效解决了现有肾组织活检对于医院和医护人员要求严格限制的问题，从而使本发明具有更广阔的应用空间和巨大的推广价值。
40.5、与现有肾组织活检的3000元的费用相比，本发明所用试剂盒一套仅需5700元左
右，可反复使用50次，从而大大降低了患者的诊断费用。
41.6、现有肾组织活检从患者入院准备到最后给出诊断报告周期大约为1周，而本发明能在24小时内给出结果，且不影响患者的工作、学习和生活，不仅大大缩短了患者等待时间，也为患者争取到了及时对症治疗的宝贵时间，可以有效防止错诊或漏诊情况的发生。
42.7、由于患者的尿液简单易得，且容易保存，还适合偏远地区大量筛查患者时的使用。
附图说明
43.本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
44.图1是根据本发明实施例中的用于iga肾病检测方法的建立的方法流程示意图；
45.图2是根据本发明实施例中的iga肾病患者与健康者对照组间mirna-25表达量的比较图，在图中，横坐标为分组，1为健康者对照组，2为iga肾病患者组，纵坐标为mirna-25的相对表达量；
46.图3是根据本发明实施例中的iga肾病患者与健康者对照组间mirna-144表达量的比较图，在图中，横坐标为分组，1为健康者对照组，2为iga肾病患者组，纵坐标为mirna-144的相对表达量；
47.图4是根据本发明实施例中的iga肾病患者与健康者对照组间mirna-486表达量的比较图，在图中，横坐标为分组，1为健康者对照组，2为iga肾病患者组，纵坐标为mirna-486的相对表达量；
48.图5是根据本发明实施例中的iga肾病患者与非iga型肾病的肾病患者对照组间mirna-25表达量的比较图，在图中，横坐标为分组，1为iga肾病患者组，2为非iga型肾病的肾病患者对照组，纵坐标为mirna-25的相对表达量；
49.图6是根据本发明实施例中的iga肾病患者与非iga型肾病的肾病患者对照组间mirna-144表达量的比较图，在图中，横坐标为分组，1为iga肾病患者组，2为非iga型肾病的肾病患者对照组，纵坐标为mirna-25的相对表达量；
50.图7是根据本发明实施例中的iga肾病患者与非iga型肾病的肾病患者对照组间mirna-486表达量的比较图，在图中，横坐标为分组，1为iga肾病患者组，2为非iga型肾病的肾病患者对照组，纵坐标为mirna-25的相对表达量；
51.图8是根据本发明实施例中的mirna表达量的roc曲线分析图，在图中，横坐标为特异性，纵坐标为敏感性，1为mirna-25，2为mirna-144，3为mirna-486，4为标准参考曲线；
52.图9是根据本发明实施例中的mirna表达量的roc曲线分析图，在图中，横坐标为特异性，纵坐标为敏感性，1为联合上述3个mirna指标，2为标准参考曲线。
具体实施方式
53.下文中将参考附图并结合实施例来详细说明本发明。需要说明的是，在不冲突的情况下，本技术中的实施例及实施例中的特征可以相互组合，另外，实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
54.在本发明中，如无特殊说明，所用专业术语按照以下所述理解：
55.(1)肾活检：通常情况下叫做肾穿刺，是指在超声的引导下，穿刺针在患者背部穿入肾脏，取出部分肾组织，在光学显微镜或电子显微镜下观察肾脏组织病变情况的手术。由于肾脏疾病的种类繁多，病因及发病机制复杂，许多肾脏疾病的临床表现与肾脏的组织学改变并不完全一致，为了明确疾病的病因病理，进一步确诊患者所患的具体病种，这时就需要做肾穿刺活检术。
56.(2)microrna(mirna)：是在真核生物中发现的一类内源性的具有调控功能的非编码rna，其大小长约20～25个核苷酸。成熟的mirnas是由较长的初级转录物经过一系列核酸酶的剪切加工而产生的，随后组装进rna诱导的沉默复合体，通过碱基互补配对的方式识别靶mrna，并根据互补程度的不同指导沉默复合体降解靶mrna或者阻遏靶mrna的翻译。
57.(3)sybr green荧光定量pcr：sybr green荧光定量pcr是一种结合于所有双链dna(人及大多数生物细胞内都是双链dna)双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料，在游离状态下，sybr green i发出微弱的荧光，但一旦与双链dna结合后，荧光大大增强。因此，sybr green i的荧光信号强度与双链dna的数量相关，可以根据定量pcr仪测出的荧光信号强度计算出被测样本中双链dna的初始浓度，由于不能计算出目标基因拷贝数，所以是一种相对定量的方法。
58.(4)2-δδct
相对定量法：是实时定量pcr实验中分析基因表达相对变化的一种简便方法，该方法可以通过管家基因的表达量(ct值)从而计算出目的基因的相对表达量。即
59.(5)基线(baseline)：是指在pcr扩增反应的最初几个循环里，荧光信号变化不大，接近一条直线，这样的直线即为基线。
60.(6)ct值：是荧光定量pcr技术中的一个重要概念，c代表cycle(循环)，t代表threshold(阈值)，具体含义就是每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。而ct值与起始模板的关系研究表明，每个模板的ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，ct值越小。
61.(7)尿沉渣：指尿液进过离心机离心后沉淀下来的物质，里面大多数为肾脏固有细胞及尿路上皮细胞。
62.(8)管家基因：又称内参基因，是指在生物体内所有细胞中都恒定表达，并且为维持细胞基本生命活动所需而时刻都在表达的高度保守的基因。管家基因不仅在各种组织中都恒定表达，而且是在各种情况下都稳定表达(也即表达水平比较稳定)，而且一般不受外界环境及加入药物的影响，因此在pcr中经常作为内部参照物。
63.(9)敏感性：就是指其在诊断疾病的时候不漏诊(假阴性)的机会有多少，敏感性＝真阳性/(真阳性 假阴性)
×
100％。
64.(10)特异性：是指该指标在诊断某疾病时，不误诊(假阳性)的机会有多少，特异性＝真阴性/(真阴性 假阳性)
×
100％。
65.(11)roc曲线：又称受试者工作特征曲线(receiver operator characteristic curve,roc曲线)，最初用于评价雷达性能，又称为接收者操作特性曲线，是根据一系列不同的二分类方式(临界值或决定阈)，以真阳性率(敏感性)为纵坐标，假阳性率(特异性)为横坐标绘制的曲线。医学上主要用于：选择最佳的疾病诊断模型、舍弃次佳的模型；在同一模型中设定(临界值)最佳阈值。
66.(12)mirna芯片：将检测mirna物质(探针)固定在芯片上，在通过杂交方式，与样本中mirna结合，以鉴定mirna表达与否及表达量高低。而mirna芯片采用大规模微阵列技术，一张芯片上包含成千上万个探针，大大提高了筛选的速度和数量。是快速、全面比较样本间mirna差异的首选方法。
67.(13)平行(并联)实验：即几个试验中只要有一个试验呈现阳性即诊断为阳性。其优点是灵敏度增高、漏诊率降低；但同时特异度降低、误诊率增高。
68.本发明的实施例提供了一种用于iga肾病检测方法的建立，如图1所示，该方法包括下列步骤：
69.s10、采集iga型肾病患者、非iga型肾病的肾病患者以及健康者的尿液。
70.在本步骤中，分别采集iga型肾病患者、非iga型肾病的肾病患者以及健康者的三组尿液。本文中的非iga型肾病的肾病患者是指患有肾病但不是iga型肾病的肾病患者。
71.根据本发明的实施例，尿液的种类和采集时间不受特别限制。例如根据本发明的实施例，优选的，采集晨尿。由于本发明检测的样本是尿液，而不是肾组织，所以对患者的机体无创伤，还可以根据疾病病情变化需要反复或连续留取和测试。另外，检测时无明显禁忌症，可以适用于所有患者的检测，所需留取尿液不会给患者带来任何损伤和风险，非常安全可靠。
72.s20、检测尿液中mirna的表达量。
73.在本步骤中，对s10中所采集尿液中的mirna的表达量进行检测。
74.本发明的发明人在研究中发现，iga肾病在发病过程中，可引起mirna的表达量的改变，从而检测mirnas的表达量可以早期无创预警iga肾病。发明人利用mirna芯片对iga型肾病和健康者的尿液中mirna的表达谱进行了比较，初筛出差异基因100余个，进一步再筛出3个iga肾病特异性mirna：mirna-25、mirna-144以及mirna-486，发明人还发现当被观察者的尿液中3个mirna：mirna-25、mirna-144以及mirna-486的表达量超过一定的量时，就患有iga型肾病。
75.因此，优选的，检测尿液中3个mirna：mirna-25、mirna-144以及mirna-486的表达量，就可以快速、准确地提示iga肾病的存在，帮助医师在不用肾活检的情况下，安全可靠的早期发现iga肾病患者。此外，还可以随时无创伤地对iga肾病患者的病情进行评估，调整患者用药，对症治疗，改善患者预后，从而有利于减轻国家、社会和家庭的负担。
76.根据本发明的实施例，检测mirna-25、mirna-144和mirna-486表达量的方法不受特别限制，例如通过选自荧光定量pcr、taqman探针以及lightcycle探针方法进行检测。
77.根据本发明的实施例，优选的，选用sybr green荧光定量pcr的方法，该方法操作简单易行、结果可靠准确，且患者无需做特殊准备，留取尿液即可，所有结果能在24小时内给出，与传统肾活检5-7天的时间相比，十分快速方便，临床应用更为广泛。
78.根据本发明的实施例，优选的，mirna-25的引物为：cauugcacuugucucggucuga；
79.和/或，mirna-144的引物为：uacaguauagaugauguacu；
80.和/或，mirna-486的引物为：uccuguacugagcugccccgag。
81.s30、利用2-δδct
相对定量法比较所述mirna的表达量。
82.在本步骤中，对s20中所检测的mirna的表达量进行比较分析，以确定mirna在iga型肾病患者中的表达量与健康者对照组和非iga型肾病的肾病患者对照组相比较，差异是
否显著。
83.本发明利用2-δδct
相对定量法可以定量分析目的基因的相对表达量，该方法可以通过管家基因的表达量(ct值)从而计算出目的基因的相对表达量，具体如下：
[0084][0085]
由此，可以确定mirna-25、mirna-144以及mirna-486在iga型肾病患者中的表达量与健康者对照组和非iga型肾病的肾病患者对照组之间的差异是否显著。
[0086]
根据本发明的实施例，优选的，还包括u6-25管家基因的引物为：aaagcaggcuuuaaaggaaccu。
[0087]
s40、对所述mirna的表达量进行roc曲线分析。
[0088]
在本步骤中，对s20中的mirna的表达量进行roc曲线分析，以确定预警iga肾病的mirna表达量的临界值。
[0089]
根据本发明的实施例，当mirna-25的表达量高于0.058(临界值)时，此时预警iga肾病的敏感性为81.3％，特异性为100％；
[0090]
和/或，mirna-144的表达量高于0.007(临界值)时，此时预警iga肾病的敏感性为80％，特异性为100％；
[0091]
和/或，mirna-486的表达量高于0.025(临界值)时，此时预警iga肾病的敏感性为93.8％，特异性为90.9％。
[0092]
根据本发明的实施例，优选的，当三个mirna：mirna-25、mirna-144以及mirna-486表达量的三个联合指标一起检测时，当上述三个联合指标中有一个高于它们各自的临界值，即可预警iga肾病，而且通过联合可进一步提高预警的敏感性至89.9％，而预警的特异性为100％。
[0093]
需要特别说明的是，本发明的上述三个mirna：mirna-25、mirna-144以及mirna-486的临界值，是发明人在付出大量艰苦劳动，通过大量的临床观察、实验推导并证明的。
[0094]
本发明之所以使用roc曲线，是因为比起其他观察指标判断标准的方法，roc有着方法简单、直观、可通过图形观察分析检测方法的准确性，可准确反映检测方法的灵敏性和特异性的关系，以及其评价方法不受群体发病率的影响等优点。最佳临界值为最靠近左上角roc曲线的点，这一点是错误最少的最好阈值，其假阳性和假阴性的总数最少。而最佳临界值所对应的敏感性和特异性即为该实验方法的敏感性和特异性。在本发明的三个指标中，mir-25和mir-144的特异性很好，均为100％，但敏感性不高。而mir-486的特异性不高(90.9％)，而敏感性较好(93.8％)。本发明的发明人创造性的采用联合检测试验，当三个指标中有一个指标升高，高于临界值即可预警iga肾病，可以提高灵敏度，降低漏诊率。通过联合检测，将预警的敏感性提升至89.9％，而预警的特异性仍为100％，即本发明在预警iga肾病时不漏诊的机率为89.9％，而误诊率为0％，只要预警检测显示该患者为iga肾病，则可以准确判断该患者为iga肾病。尽管本发明还有10.1％的漏诊机会，但由于本发明的检测方法实施简单且无创，可大大扩大适用人群范围，并且可以多次反复检测，从而能够有效地弥补这一不足。
[0095]
根据本发明实施例的用于iga肾病检测方法的建立，可以取得以下所述的至少一种积极技术效果：
[0096]
1、可以有效地建立一种用于iga肾病检测方法。
[0097]
2、由于检测的样本是尿液，而不是肾组织，所以本发明的最明显的优势就是具有无创伤的特点，可以根据疾病的病情变化需要反复或连续留取和测试。另外，所需留取尿液不会给患者带来任何损伤和风险，非常安全可靠。
[0098]
3、由于检测时无明显禁忌症，可以适用于所有患者的检测。
[0099]
4、由于所用的光定量pcr、taqman探针以及lightcycle探针的方法已经是常见的技术手段，并且具有检测准确、安全可靠、简单易行等的优点，一般的医护人员，例如乡镇和社区的基层医护人员，经1周左右的培训就可完全掌握该方法，大大缩短了培训周期，有效解决了现有肾组织活检对于医院和医护人员要求严格限制的问题，从而使本发明具有更广阔的应用空间和巨大的推广价值。
[0100]
5、与现有肾组织活检的3000元的费用相比，本发明所用试剂盒一套仅需5700元左右，可反复使用50次，从而大大降低了患者的诊断费用。
[0101]
6、现有肾组织活检从患者入院准备到最后给出诊断报告周期大约为1周，而本发明能在24小时内给出结果，且不影响患者的工作、学习和生活，不仅大大缩短了患者等待时间，也为患者争取到了及时对症治疗的宝贵时间，可以有效防止错诊或漏诊情况的发生。
[0102]
7、由于患者的尿液简单易得，且容易保存，还适合偏远地区大量筛查患者时的使用。
[0103]
本发明的实施例又提供了一种用于iga肾病检测方法，所述方法是根据以上所述的方法建立的方法，包括以下步骤：
[0104]
采集尿液；
[0105]
检测尿液中mirna-25、mirna-144以及mirna-486中至少一个的表达量；
[0106]
判断mirna-25、mirna-144或mirna-486的表达量是否高于其各自的所述临界值。
[0107]
本领域技术人员可以理解的是，前面关于用于iga肾病检测方法的建立所描述的特征和效果，当然地也适用于该用于iga肾病检测的方法，在此不再赘述。
[0108]
根据本发明的实施例，检测mirna表达量的方法不受特别限制，例如根据本发明的实施例，优选的，检测方法为sybr green荧光定量pcr，该方法操作简单易行、结果可靠准确，且患者无需做特殊准备，留取尿液即可，所有结果能在24小时内给出，与传统肾活检5～7天的检测时间相比，十分快速方便，临床应用更为广泛。
[0109]
本发明的实施例还提供了一种用于iga肾病检测的系统，所述用于iga肾病检测的系统利用以上所述的用于iga肾病检测的方法进行检测，所述系统包括：
[0110]
尿液采集装置，以采集尿液；
[0111]
mirna检测装置，以检测尿液中mirna的表达量。
[0112]
本领域技术人员可以理解的是，前面关于用于iga肾病检测的方法所描述的特征和效果，当然地也适用于该用于iga肾病检测的系统，在此不再赘述。
[0113]
为了进一步详细阐述本发明的技术方案，结合附图1～9，下面通过具体的实施例对本发明进行说明，需要说明的是这些实施例仅仅是为了说明目的，而不能以任何方式解释成对本发明的限制。另外，在下列实施例中如果没有特别说明，则所采用的设备和材料均为市售可得的。
[0114]
实施例1
[0115]
1、主要材料：
[0116]
1)mircute mirnacdna第一链合成试剂盒：型号kr201，tiangen公司制造，包括：mirna-25的引物为：cauugcacuugucucggucuga，mirna-144的引物为：uacaguauagaugauguacu，mirna-486的引物为：uccuguacugagcugccccgag，u6-25管家基因的引物为：
[0117]
aaagcaggcuuuaaaggaaccu。
[0118]
2)trizol：(carlsbad,c)，life technologies公司制造。
[0119]
3)引物：
[0120]
mirna-25的引物为：cauugcacuugucucggucuga；
[0121]
mirna-144的引物为：uacaguauagaugauguacu；
[0122]
mirna-486的引物为：uccuguacugagcugccccgag；以及
[0123]
u6-25管家基因的引物为：aaagcaggcuuuaaaggaaccu。
[0124]
4)iga型肾病患者：iga型肾病患者为肾穿前或肾穿后1周以上(无明显出血等合并症)。
[0125]
2、主要设备：
[0126]
1)prism 7500real time pcr system：applied biosystems公司制造。
[0127]
2)spss软件：spss 13.0。
[0128]
3、主要操作步骤如下：
[0129]
1)尿沉渣的收集、储存与记录：
[0130]
分别用无菌离心管采集iga型肾病患者、非iga型肾病的肾病患者(膜性肾病，系膜增殖性肾炎，微小病变肾病，局灶节段性肾小球硬化，膜增生性肾小球肾炎)以及健康者的50～100ml三组晨尿，每组1-2管，放入冰盒或4℃条件保存。
[0131]
2)尿沉渣的样本处理及总rna的提取：
[0132]
将晨尿放入离心机离心4℃、3000g离心30min，将离心后的尿上清液倒掉，尿沉渣加入1mlpbs混匀，加入1.5ml ep管中，将ep管离心4℃、13000g离心10min。再次去掉上清液，保留尿沉渣。
[0133]
3)trizol法提取尿沉渣中总rna：
[0134]
加入1ml trizol，混匀，4℃孵育5min，加入200ul三氯甲烷，震荡混匀，4℃孵育5min，4℃、12000rpm离心10min；
[0135]
小心拿出ep管，可见管内液体分为3层，第一层为上层清亮液体—即rna层，中间层为白色的蛋白质层，最下层为红色的dna层，转移上层清亮液体入新的ep管内，记下转移的总体积，加入等体积的异丙醇，上下颠倒混匀，4℃孵育10min；
[0136]
离心4℃、12000rpm离心15min，此时可见管底有少量白色沉淀，即为总rna，倒掉上清液，立即加入1ml 75％酒精(用无rna酶的水配置该酒精)；
[0137]
离心4℃、12000rpm离心5min，倒掉上清液，再次加入1ml 75％酒精；
[0138]
离心4℃、12000rpm离心5min，倒掉上清液，短暂离心4℃、12000rpm离心1min，用枪头吸取剩余的上清液，吸取干净，打开ep管盖，室温放置15min，晾干剩余酒精；
[0139]
加入32ul无rna酶的水，4℃条件放置30min，使rna完全溶解于水中；取2ul rna溶液，在nanodrop 2000c测出rna浓度。
[0140]
4)样本cdna的合成：
[0141]
使用mircute mirna cdna第一链合成试剂盒将总rna逆转录为双链cdna：
[0142]
将样本总rna质量固定为500ng(总体系500ng)，按测出的浓度算出加入rna溶液(total rna)的体积；
[0143]
准备新的无rnam酶的0.5ml ep管，依次加入2ul 10
×
poly(a)polymerase buffer、4ul 5
×
ratp solution、0.4ul e.coli poly(a)，算出的rna溶液体积，加入rnase-free ddh2o使总体积补足为20ul；
[0144]
短暂离心后37℃反应60min，即得到poly(a)反应液；
[0145]
准备新的无rnam酶的0.5ml ep管，依次加入rnase-free ddh2o 11.5ul，poly(a)反应液2ul，10
×
rt primer(10μm)2ul，10
×
rt buffer 2ul，super pure dntp(2.5mm each)1ul，rnase(40u/ul)1ul，quant rtase 0.5ul，即得总体积为20ul的双链cdna溶液。
[0146]
5)检测mirna的表达量：
[0147]
对上述合成cdna中待测基因表达水平的检测基于sybr green荧光定量pcr技术。
[0148]
配置反应体系如下：2
×
mircute mirnapremix 10ul，50
×
rox reference dye 1.6ul，reverse primer 0.4ul，ddh2o 5.6ul，特异性引物0.4ul，上步生成的cdna溶液2ul。
[0149]
反应在prism 7500real time pcr system中进行，反应条件如下：1
×
(1个循环)—94℃，2min(起始模板变性)；而后35-45
×
(35到45个循环)—94℃，20sec(pcr循环中模板变性)和60℃，34sec(退火，延伸)。每个样本的每个指标都设有2个副孔(即所有条件不变，多做2次重复实验)。反应中采用管家基因(u6)与待测样本同时进行扩增，从而确定样本中目的基因的表达水平。
[0150]
6)2-δδct
相对定量法比较mirna的表达量：
[0151]
利用spss软件，采用2-δδct
相对定量法比较mirna-25、mirna-144以及mirna-486的表达量，即表达量，即2-δδct
表示实验组目的基因的表达相对于对照组目的基因的变化倍数，具体操作如下：
[0152]
分别将iga肾病患者与健康者对照组之间的mirna-25、mirna-144以及mirna-486的表达量进行比较，如图2～4所示。
[0153]
分别将iga肾病患者与非iga型肾病的肾病患者对照组之间的mirna-25、mirna-144以及mirna-486的表达量进行比较，如图5～7所示。
[0154]
从以上的图2～7可知mirna-25、mirna-144以及mirna-486在iga肾病患者中的相对表达量显著高于健康者对照组和非iga型肾病的肾病患者对照组，差异显著。因此，通过检测mirna-25、mirna-144和mirna-486在尿液中的表达量能够预警iga肾病。
[0155]
图2，健康者对照组(组1)mir-25的表达量(2-δδct
相对定量法)为0.0272152
±
0.0145227，iga肾病组(组2)mir-25的表达量为0.239375
±
0.3035597，iga型肾病组mir-25的表达量显著高于健康者对照组，p＜0.001。
[0156]
图3，健康者对照组(组1)mir-144的表达量为0.002196
±
0.002328，iga肾病组(组2)为0.124129
±
0.246618，iga型肾病组mir-144的表达量显著高于健康者对照组，p＜0.001。
[0157]
图4，健康者对照组(组1)mir-486的表达量为0.012846
±
0.011028，iga肾病组(组2)为0.272673
±
0.527395，iga肾病组mir-486的表达量显著高于健康者对照组，p＜0.001。
[0158]
图5，iga肾病组(组1)mir-25的表达量为0.239375
±
0.3035597，而非iga型肾病的
肾病患者对照组(组2)为0.064979
±
0.051222，iga肾病组mir-25的表达量显著高于非iga型肾病的肾病患者对照组，p＜0.001。
[0159]
图6，iga肾病组(组1)mir-144的表达量为0.124129
±
0.246618，而非iga型肾病的肾病患者对照组(组2)为0.029361
±
0.062052，iga肾病组mir-144的表达量显著高于非iga型肾病的肾病患者对照组，p＝0.003。
[0160]
图7，iga肾病组(组1)mir-486的表达量为0.272673
±
0.527395，而非iga型肾病的肾病患者对照组(组2)为0.050362
±
0.058641，iga肾病组mir-486的表达量显著高于非iga型肾病的肾病患者对照组，p＜0.001。
[0161]
如图2-7可知，iga肾病组mir-25、mir-144以及mir-486三个指标的表达量均显著高于健康者对照组和非iga型肾病的肾病患者对照组，其升高与iga肾病预警有很强关联，可以作为iga肾病特异性预警指标。
[0162]
7)mirna表达量的roc曲线分析：
[0163]
利用spss软件，将mirna-25、mirna-144以及mirna-486三个指标联合做iga肾病预警价值的roc曲线分析，结果如图8和下面表1所示。
[0164]
表1 mirna表达量的roc曲线分析统计表
[0165][0166][0167]
从图8和表1可知：
[0168]
当mirna-25的表达量高于0.058(临界值)时，此时预警iga肾病的敏感性为81.3％，特异性为100％；
[0169]
和/或，mirna-144的表达量高于0.007(临界值)时，此时预警iga肾病的敏感性为80％，特异性为100％；
[0170]
和/或，mirna-486的表达量高于0.025(临界值)时，此时预警iga肾病的敏感性为93.8％，特异性为90.9％。
[0171]
auc(曲线下面积)可以评价预警的准确性，即auc越大，预警正确的准确性越高。roc曲线下面积值在1.0和0.5之间，当面积值在0.9以上时有很好的准确性。本发明的roc曲线下面积值皆在0.9以上，表明本发明具有很好的准确性，可信度非常高。
[0172]
95％ci指auc的95％置信区间，即auc落在这一范围内的可能性为95％，可知本发明的准确性非常可靠。
[0173]
p值就是用于判断错误的概率，一般认为p值小于0.05，即为小概率事件，它在一次试验中几乎不可能发生，就可以认为判断是正确的。本发明的p值均小于0.0001，即为本发明预警该患者为iga型肾病，而该患者实际上不是(犯错误)iga型肾病的机率小于0.01％，几乎不可能发生，说明本发明判断的准确性非常高。
[0174]
本发明还将上述三个mirna：mirna-25、mirna-144以及mirna-486表达量的联合指标进行roc曲线分析，结果如图9和下面表2所示。
[0175]
表2 mirna表达量的联合指标的roc曲线分析统计表
[0176][0177]
从图9和表2可知：
[0178]
当三个mirna：mirna-25、mirna-144以及mirna-486表达量的三个联合指标一起检测时，当上述三个联合指标中有一个高于它们各自的临界值，即可预警iga肾病，而且通过联合可进一步提高预警的敏感性至89.9％，而预警的特异性为100％。因此，本发明可以提供一种非常准确的预警iga肾病的检测方法。
[0179]
从图2-4中可知，用荧光定量pcr检测尿沉渣mirna时，iga肾病患者mirna-25、mirna-144和mirna-486的表达量显著高于健康者对照组，p＜0.001，差异具有显著的统计学意义。
[0180]
从图5-7中可知，用荧光定量pcr检测尿沉渣mirna时，iga肾病患者mirna-25、mirna-144和mirna-486的表达量显著高于非iga型肾病的肾病患者对照组(膜性肾病，系膜增殖性肾炎，微小病变肾病，局灶节段性肾小球硬化，膜增生性肾小球肾炎)，p＜0.001，差异具有显著的统计学意义。
[0181]
图2-7表明，尿沉渣中iga肾病组mirna-25、mirna-144和mirna-486的表达量不仅显著高于健康者对照组，而且显著高于非iga型肾病的肾病患者对照组，是iga肾病特异性的mirnas。
[0182]
为了分别找到三个指标预警iga肾病的临界值(或阈值)，及其对应的敏感性和特异性，将三个mirnas的表达量带入roc曲线分析，可得图8和表1。从图8和表1中可知，上述三个指标分别单独预警iga肾病时，均有较好的敏感性和特异性，其中mirna-25的敏感性为81.3％，特异性为100％；mirna-144的敏感性为80％，特异性为100％；mirna-486的敏感性为93.8％，特异性为90.9％。且预警的准确性较高(auc＞0.9)。
[0183]
由于发现mirna-25和mirna-144预警iga肾病的特异性非常好(为100％)，而敏感性相对较差，为了提高本发明预警iga肾病的敏感性，提高预警效率，本发明的遂进行了并联实验(联合检测)，即当上述三个指标中有一个高于它们各自的临界值，即可预警iga肾病。从图9和表2可知，通过联合检测三个指标，可将预警的敏感性进一步提高至89.9％，而预警的特异性仍为100％。因此，本发明可以提供一种非常准确的预警iga肾病的检测方法。
[0184]
实施例2
[0185]
为进一步检验本发明的实用性和准确性，发明人随机抽取新入院未行肾组织活检(即将要做)的肾病患者10人，及性别、年龄匹配的健康者10人，随机编号，参照实施例1的技术方案进行检测，预警出iga型肾病患者6人。待起一周后肾组织活检结果出来，iga型肾病患者也为6人，与本发明预警的结果完全一致，而其它4名非iga型肾病的肾病患者(膜性肾病2人，微小病变肾病1人，局灶节段性肾小球硬化1人)与10名健康者的上述mirnas表达量
差异无显著统计学意义。由此，进一步表明本发明的实用性强，准确性高。
[0186]
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。