用于样品在线预处理的微流控芯片及其制法和使用方法与流程

1.本发明涉及食品安全监督或食品分析的样品预处理技术领域，尤其涉及一种用于样品在线预处理的微流控芯片及其制法和使用方法。


背景技术：

2.微流控芯片分析具有分析速度快、集成度高、操作自动化等优势，已广泛应用于临床、生物、医药、农业和食品安全等领域。但是目前报道的能与ms方法耦合的在线微流控芯片并未关注多类目标物的同时分离提取，因为很难以一种方式富集具有广泛极性范围和特征的多类药物。在很难找到一种吸附剂来富集多种药物的情况下，另一种实现多残留检测的方法就是去除蛋白质或脂肪共提取物等基质干扰物，保留目标物。对于非芯片系统中的基质去除，基于快速、简单、廉价、有效、坚固、安全(quechers)的策略被广泛报道用于检测水果和蔬菜中的多种农药残留。但是，quechers方法对动物产品中的兽药残留检测仍有诸多限制。例如，该操作浪费人工，需要人工吹氮以提高灵敏度。在quechers 中使用无机盐进行相分离会导致敏感或极性分析物的损失。在微流控芯片系统中，固相萃取(spe)是基于保留-洗脱原理的最广泛使用的净化方法。但它不太适合去除脂肪，尤其是磷脂。事实上，去除动物性食品中的主要基质为蛋白质和脂肪。因此，这是首次尝试通过在微流体系统中选择合适的基质去除颗粒来应用通过式spe方案。
3.另一方面，虽然基于通过式(pass-through)spe方案可以大大减少实验步骤，但缺点是无法在去除基质干扰的同时富集目标。为了提高目标的灵敏度，我们的研究考虑了蒸发部分溶剂。在传统的分析方法中，大多数在氮气下蒸发的步骤都是在样品制备中手动执行的，这通常是最长和更耗时的步骤。这种结合通过式模块和在线溶剂蒸发模块的集成尚未见报道。通过渗透蒸发或气体和蒸汽跨膜传输导致体积减少但分析物得以保存以提高灵敏度。聚二甲基硅氧烷(pdms) 膜是无孔且致密的聚合物膜。在液体混合物中组分蒸气分压差的推动下，利用组分通过膜溶解和扩散速度的不同实现分离。


技术实现要素：

4.发明目的：本发明的目的是提供一种用于样品在线预处理的微流控芯片；本发明的另一目的是提供一种用于样品在线预处理的微流控芯片的制备方法；本发明的另一目的是提供一种用于样品在线预处理的微流控芯片的使用方法。
5.技术方案：本发明的用于样品在线预处理的微流控芯片，包括依次连通的自动提取和过滤模块、通过式净化模块和在线渗透蒸发模块；所述自动提取和过滤模块用于去除样品中颗粒杂质，所述直通净化模块用于去除样品中的脂肪和磷脂；所述在线渗透蒸发模块用于去除自动提取和过滤模块产生的溶剂。
6.进一步地，所述自动提取和过滤模块为含有间距为100-400μm的微柱阵列。
7.进一步地，所述直通净化模块为三通道并联结构，通道内填充有增强型基质去除脂质颗粒。
8.进一步地，每个通道的长为3-10cm且宽为4-10mm，每个通道的增强型基质去除脂质颗粒的填充量为10-100mg。
9.进一步地，在线渗透蒸发模块具有多层结构，包括液体层、膜层和气流层，其中液体层和气流层通道图案相同，均为蛇形通道图案。
10.进一步地，液体层中的液体和气体层中的气体的流动方向为逆向。
11.进一步地，在线渗透蒸发模块置于加热板上，气流层入口接入惰性气体。
12.一种上述微流控芯片的制备方法，包括以下步骤：
13.(1)将自动提取和过滤模块、直通净化模块和在线渗透蒸发模块的各通道图案蚀刻在玻璃基板上；
14.(2)将pdms预聚物倒入另一块平整的玻璃基板，pdms固化后，从玻璃模具上剥离pdms复制品，与有通道的玻璃基板对应打孔位置，进行打孔和密封，得到集成自动提取和过滤模块、直通净化模块的芯片；
15.(3)在一干净的玻璃基板上旋涂pdms，得到一定厚度的的pdms薄膜，与带有蛇形通道的pdms气体层键合，再将pdms膜和膜层从玻璃基板上剥离，膜层的另一面与玻璃基板的蛇形通道键合，得到微流控芯片。
16.一种上述微流控芯片的使用方法，将微流控芯片与生物芯片和/或质谱结合，测定样品中残留的药物含量；待测样品经过提取和过滤模块、通过式净化模块，最后流入渗透蒸发模块，溶液由收集环收集并通过切换阀直接引入ms检测器或者用于生物芯片检测。
17.进一步地，所述样品为牛奶且待测成分为兽药时，在线渗透蒸发模块置的工作温度为60-70℃，膜层厚度为40-70μm。
18.有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下显著优点：(1)无需任何离线人工操作，整个分析检测时间不到30分钟，比传统的lc-ms/ms方法缩短了约 10倍；
19.(2)样品和试剂的消耗量比传统的lc-ms/ms方法少约20倍；
20.(3)微流控集成芯片可与生物芯片和质谱(chip-ms)等平台结合，可实现同时对多种兽药进行全自动多类多残留分析。
附图说明
21.图1为用于样品在线预处理的微流控芯片示意图；
22.图2为在线渗透蒸发模块(m3)结构示意图；
23.图3为净化方法和计算方法对me的影响；
24.图4为emr-脂质净化对基质匹配标准溶液中目标强度的影响：imq，(a)经emr-脂质净化的定量离子强度，(b)未经emr-脂质净化的定量离子强度，(c) emr-脂质净化的定性离子强度，(d)未经emr-脂质净化的定性离子强度；
25.图5为温度和膜厚度对蒸发速率的影响；
26.图6为温度对分析物回收率的影响；
27.图7为在线蒸发对目标物信号强度的影响。
具体实施方式
28.下面结合附图对本发明的技术方案作进一步说明。
29.实施例1
30.如图1所示，用于样品在线预处理的微流控芯片包括依次连通的自动提取和过滤模块(m1)、通过式净化模块(m2)和在线渗透蒸发模块(m3)；具体的，自动提取和过滤模块用于去除样品中颗粒杂质，通过式净化模块用于去除样品中的脂肪和磷脂；在线渗透蒸发模块用于去除自动提取和过滤模块产生的溶剂。
31.可选的，m1为含有间距为100-400μm的微柱阵列；m2为三通道并联结构，通道内填充有增强型基质(emr-lipid)去除脂质颗粒，每个通道的长为 3-10cm且宽为4-10mm，每个通道的增强型基质去除脂质颗粒的填充量为 10-100mg；m3包括液体层(l通道)、膜和气流层(g通道)，l通道由带有蛇形通道(500μm宽
×
50μm深)图案的载玻片制成，总通道长度为823 毫米，宽度为550μm的g通道由pdms制成。
32.可选的，m3中液体和气体的流动方向保持逆流而不是并流，调节的惰性气体源(氮气)连接到气流层的入口，将其置于精密电加热板上，温度误差控制在
±
1℃以内。
33.用于样品在线预处理的微流控芯片的制备包括以下步骤：
34.(1)玻璃模具制备：
35.通道图案转印至玻璃基板：简单地说，将具有设计图案的激光打印薄膜转移到匀胶铬版上，然后进行10分钟的紫外线照射，5分钟的0.5％(w/v)naoh溶液冲洗，在去铬液中浸泡2分钟。
36.玻璃基板上蚀刻各通道图案：用超纯水洗涤后，将带有清晰微图案的匀胶铬版用蚀刻液在37℃下蚀刻150分钟。为避免spe颗粒泄漏，将20μm高的坝制成微型通道。首先，在第一个蚀刻步骤之前，通过式spe柱的末端用1毫米宽的胶带保护。蚀刻150分钟后，取下保护的胶带，在相同条件下再蚀刻15 分钟以形成坝。然后用丙酮超声破坏表面的光刻胶，将铬层置于去铬溶液中除去铬层，带通道的玻璃模具就完成了。然后用超纯水冲洗所得玻璃模具并在80℃下干燥。
37.(2)m1和m2模块制备：将预混合的pdms预聚物和固化剂(质量比为 10:1)倒入步骤一干净的玻璃基片上，在真空室中脱气30分钟，然后在80℃的烘箱中固化1.5小时。从载玻片上小心地剥离pdms复制品，将其与(1) 制得的玻璃模具对应，并使用平头注射器针头打孔。pdms片材在玻璃上用氧等离子体处理60秒后密封，集成m1和m2模块的芯片完成。
38.(3)在微流控芯片中制备m3模块：如图2所示，通过在干净的玻璃基板上旋涂pdms(按重量比为10:1的预聚物和固化剂)层并在80℃下烘烤90 分钟来制备pdms膜，旋涂程序为：步骤1(500r/min，10s)和步骤2(1500r/min， 30s)，再用游标卡尺测量40μm厚度的膜作为膜层。顶部pdms层(带有g通道)首先与膜结合，将膜和g通道一起小心地剥离。底部玻璃层(带有l通道)与膜的另一侧粘合以形成夹层结构，需要仔细对齐g通道与l通道。
39.实施例2
40.微流控芯片结构优化：
41.为了提高微流控芯片的整体分析性能，对三个模块的一些重要因素进行了研究：牛奶样品的流速、m1中微柱阵列的间距、m2中emr-脂质颗粒的填充量。
42.流速对兽药的提取效果至关重要。为了确定新开发的在线方法的最佳条件，研究了样品流速对提取率的影响。因此，样品溶液以10至80μl/min的流速通过m1。加标牛奶的理论浓度为50ng/ml。结果表明流速为10μl/min时获得的浓度最高；将样品流速提高到80μl/
min，提取率降低为仅16.8％(以sm2 为例)。这应该是由于更高的流速会导致样品与提取液相互接触的时间变短，因此提取效率降低。每种药物的提取率不同。例如，磺胺类药物的整体提取效率仅为75％左右。尽管有些药物在25μl/min时具有更高的提取效果，但考虑到所有因素，后续实验的最终进样速率为10μl/min。
43.过滤单元的排列间距由杂质颗粒的大小决定。为防止杂质颗粒堵塞过滤单元，采用了微柱阵列间距从400μm缩小到100μm的过滤器，以获得更好的过滤效果。微柱阵列圆柱体的直径为200μm。还考虑了是否串联双列。过滤单元结构如下：a：400μm-300μm-200μm-100μm，双柱串联；b：400μm-300 μm-200μm，双柱串联；c：400μm-300μm-200μm-100μm，单柱；d： 400μm-300μm-200μm，单柱。比较提取液中共提取物的重量，结构a得到的残渣重量最小，说明过滤效果最好。通过结构a可以获得澄清的提取物，没有通道堵塞。
44.称为emr-lipid的新型吸附剂可选择性地与脂质的未支化烃链相互作用，将目标分析物留在溶液中进行后续分析。emr-lipid直通小柱利用这种选择性去除脂肪，以进一步简化工作流程，并用于脂肪基质中的多类多残留农药和兽药分析。然而，将该吸附剂应用于传统的预处理方法，则需要离线氮气吹扫，无法实现自动化的目的。通过式净化模块中emr脂质的填充量从0毫克到100 毫克不等。通过样品共萃取物重量的测试，共萃取残留物去除率(按重量计)评估了样品净化效率，以从粗样品萃取物中去除基质共萃取物。50毫克emr脂质的量具有最高的基质共提取物去除率，已达到与其他研究报告相同的水平。当然，如果颗粒量增加，基质共萃取物的去除效果可能会更好。考虑芯片的大小和芯片通道中流体的压力，选择50mg的量。
45.实施例3
46.直通净化模块(m2)对基质(me)去除效果：
47.传统的hplc-ms定量方法基于色谱分离，耗时且需要专业设备及人员。我们提出的方法不需要色谱分离，因此必须在在线样品制备方面做出更多努力。 ms的响应信号容易受到来自复杂样本基质的影响，尤其是在esi模式下。然而，尽管消除基质效应对于建立可靠的方法至关重要，文献中发表的大多数微流控芯片-ms/ms方法都没有分析或解决me问题，。基质中性质相似的物质可能与目标分析物共流出并影响目标分析物的电离，从而导致信号抑制或增强。文献中提出了基质匹配校准、同位素稀释和样品稀释，以估计或补偿基质效应。me 值为100％表明，未观察到绝对基质效应。》100％的值表示电离增强，《100％的值表示电离抑制。me是在ms分析中获得可靠结果的一个关键方面。me可分为可忽略(80％《me《120％)、中等(120％
–
150％或50％-80％)和强(me》150％或《50％)。图3显示了集成微流控芯片对me的影响。me是三种不同浓度的基质匹配标准溶液(5ng/ml、20ng/ml和50ng/ml)的平均数据。不经过m2时，me基本处于强抑制区，。通过m2后，12种药物的me由强转为中等抑制，有3种药物可以忽略不计。结果表明，与未净化的相比，用于净化的emr 脂质显着改善了me。me可能源于分析物与共流出的、未检测到的基质成分与ms接口中形成的初级离子反应之间的竞争。emr-脂质颗粒减少了共流出的基质成分，基质共提取物的去除数据证实了这一点。
48.emr-lipid吸附剂与样品基质中不需要的脂质之间的相互作用机制具有高度选择性，因此，emr-lipid净化通常不会导致目标分析物的保留。本研究排除了萃取步骤对分析物回收率的影响，以评估emr-lipid净化前后的分析物回收率。结果表明，emr-lipid不会导
致显着的分析物损失，在经过通过式净化后，目标物回收范围为80.0％-100.2％。
49.虽然通过预处理大大提高了me，改善了峰形，增加了目标物的响应。然而， me仍然是不可避免的。ms分析中的me客观存在，并随不同的基质样品而变化。基于此，引入内标(is)进行检测。is不仅可以补偿ms电离过程中的me，还可以消除样品制备过程中的差异。这里喹诺酮类药物使用ofx-d3，磺胺类药物使用sdm-d6，大环内酯类和林可酰胺类药物使用rom-d7，抗病毒药物使用atd-d15作为is。用is法计算me时，发现净化前基质标准溶液的me相对不稳定，误差线数据显示，9个目标的me均超过120％。事实证明，使用内标也是有条件的，必须在净化比较完全的样品溶液中，否则会造成定量偏差。通过比较净化前后的色谱图，经过emr-脂质净化的峰形没有拖尾，更对称，强度更高。以目标imq为例，使用emr-lipid大大改善了定量离子和定性例子的峰形。在色谱图中中观察到的杂质更少，强度增加了一倍(如图4所示)。因此，由于净化前有更多的基质干扰，在没有通过净化的情况下，峰面积积分容易出现偏差，。is法计算的纯化基质标准溶液的me，所有指标均在图1所示的可忽略 me范围内，表明纯溶液标准品与基质匹配标准品的差异基本可以忽略不计的。因此，is显着补偿了me。后续实验中的定量计算采用纯溶液标准曲线结合内标法代替基质匹配标准进行计算。
50.实施例4
51.在线渗透溶剂蒸发：
52.用于样品渗透蒸发的集成微流控芯片中的m3具有多层结构，具有l通道、膜和g通道(图3)。l通道的穿孔位置与g通道错开，以保证上下通道互不干扰。pdms膜非常薄且容易变形。因此，在生产过程中，先将旋涂在玻璃物质上的固化膜与气体层(g-channel)粘合形成夹层结构，然后将膜和g-channel剥离在一起与l-channel键合，可以大大提高生产的成功率。键合芯片被封闭并连接到n2。液体和气体的流动方向保持逆流而不是并流，在逆流情况下获得的蒸发效率高于在并流情况下获得的效率。原因是在化学工程中，逆流流动比并流流动提供更高的传热和传质平均驱动力。
53.由于每个组分的饱和压力取决于温度，因此预计工作温度会影响渗透蒸发效率。渗透性与膜的厚度成反比。为了最大限度地提高渗透性，膜厚度的最小化和增加膜表面积和停留时间将对渗透蒸发过程产生积极影响。在流速固定的情况下，优化了工作温度和膜的厚度。通过比较进、出口样品的体积变化计算蒸发速率。图5表明，随着温度的升高，不同厚度膜的蒸发速率显着提高。当温度达到60℃时，40μm和70μm的膜可以完全蒸发所有的有机溶液，70℃时蒸发效率最高。但是，如果温度太高，药物会因分解而流失。比较不同温度下药物的回收率，当温度达到70℃时，磺胺类、大环内酯类和部分抗病毒药物的损失增加，尤其是磺胺类药物的平均损失率达到21％(见图6)。图5中的数据还验证了膜越薄，蒸发速度越快。在我们的实验中，低于30μm的pdms膜显得非常脆弱，容易粘在载玻片上并且难以操作。因此将温度和膜的厚度设置为60℃和 40μm。
54.通过集成微流控芯片中蒸发模块的设计，结合之前设计的混合提取、过滤和通过式模块，可以显着提高目标物的响应强度。通过比较芯片m3前后目标物的响应强度来呈现蒸发性能。给出了两种具有代表性的信号强度情况，以显示蒸发效果。图7显示了加标牛奶通过芯片蒸发模块前后检测信号。acv在15 ng/ml的加标浓度下蒸发前无信号，而通过芯片后获得检测信号。加标浓度为 15ng/ml的sm2的峰强度在通过蒸发芯片后增加了6倍。
55.实施例5
56.全自动样品预处理微流控芯片与质谱联用：
57.使用ms/ms进行定量分析的可靠性可能会因me引起的离子抑制而缺乏灵敏度而受到不利影响，大多数方法倾向于使用基质匹配的标准曲线进行定量，以避免基质的不利影响。本研究中设计的集成芯片通过沉淀蛋白质和去除脂肪使牛奶样品得到净化，消除了基质干扰，并通过在线蒸发提高了检测的灵敏度。由于内标物(is)的校正作用，使用标准溶液代替基质溶液进行计算可以大大简化实验步骤。标准曲线由一系列标准溶液浓度(0.5-50ng/ml，内标为10ng/ml) 和目标物蒸发后的峰面积使用内标法绘制。标准工作曲线表明is方法的定量性能比较好(r2＞0.99)。
58.为了实现多残留兽药在线定量分析，我们在这种全自动微流控芯片-esi-ms 平台上使用了内标(is)方法。精密度和准确度对于评估方法开发和验证具有非常重要的意义。在整个分析过程中，在牛奶中加入了三种不同浓度的标准品和内标，内标的浓度与标准曲线中的浓度保持一致。加标的牛奶和提取物同时泵入开发的自动微流控芯片。经过在线萃取、过滤(m1)和通过式净化模块(m2)，最后流入蒸发模块(m3)。溶液由收集环收集并通过切换阀直接引入ms检测器。自动化操作系统无需任何离线人工操作，一个样品的整个分析检测时间不到30 分钟，比传统的lc-ms/ms方法缩短了约10倍。此外，样品和试剂的消耗量比传统的lc-ms/ms方法少约20倍。
59.样品溶液直接通过ms分析，无需色谱分离。为了减少基质效应，牛奶样品的体积仅为100μl。由于emr-脂质颗粒的高效净化和蒸发模块(m3)的配合使用，基于信噪比(s/n＝3)的加标牛奶样品的检测限(lod)在0.23-4.13 ng/ml范围内。。基于信噪比(s/n＝10)的方法的定量限(loq)在0.76-13.7 ng/ml的范围内。根据国家标准(gb 31650-2019)和农业部公告第2292号，本方法的灵敏度可以满足常规检测的要求，23种兽药的检测限远低于现有的 mrl。表1显示了开发的微流控芯片-ms平台上不同目标物的回收率和rsd。
60.表1 23种目标物的线性方程、r2、lod、loq、mrl和回收率(n＝3)
61.[0062][0063]
a mrl的缺失表明这些化合物的尚未在牛奶中建立最大允许残留限量b nd表示不允许在动物产品中检测到这些化合物。
[0064]
如表1所示，在加标浓度为5、15和50ng/ml的牛奶下，分析物的平均回收率为71.7％至118.0％，rsd为1.9％至15.2％。回收率和rsd基本令人满意。开发的微流控-ms平台具有快速、简单和自动化的优点，是多残留分析的快速筛选方法。串联四极杆质谱中的mrm模块的原理是，使用第一个四极杆对前体离子进行质量选择，在碰撞池中碎裂，然后使用第二个四极杆对特定产物离子进行质量选择，因其高选择性和灵敏度而获得广泛认可。本方法中mrm 比值完全满足要求，进一步说明了该芯片-ms方法的可行性。所开发的全自动微流控芯片-ms平台可以有效地同时用于多目标的定性和定量检测。该系统的核心是一个含有emr脂质颗粒的微流控芯片实现净化和pdms膜实现蒸发。在线蒸发去除样品中的有机
溶剂以浓缩目标物。设计的微流控芯片中的三个串联模块尽可能地去除牛奶中的基质干扰物，并允许在没有色谱分离的情况下通过ms 进行在线检测。并且该系统可以扩展到各种食品样品的检测。
[0065]
该集成微流控系统具有灵敏度高、检测速度快、检测结果准确、操作简单、样品用量少、试剂用量少等诸多优点，在多类多残留检测方面具有显着的潜力。此外，微流体系统将成为一种强大的工具，作为食品安全的最佳定量筛选方法。总体而言，所设计的系统可以保证牛奶质量，从而在未来发挥巨大的应用潜力。