一种用于农药检测的离子液体聚合物基电化学修饰材料及其制备方法和应用与流程

1.本发明属于生物电化学领域，涉及一种新型生物传感器，具体的涉及一种离子液体聚合物基电化学修饰材料及其在农药检测中的应用。


背景技术：

2.在过去的几年中，农药以其高效、使用方便、用量小、半衰期短等优点，在农业、工业、医药等领域被广泛用作除草剂、杀虫剂和杀菌剂。通常，由于它们的高毒性，对人和动物都有很大的威胁。因此，有必要开发一种快速、可靠的用于公共食品安全和环境检测的农药检测方法。传统的农药残留检测方法有气相色谱(gc)、液相色谱(lc)、质谱联用(ms)和毛细管电泳(ce)等。虽然这些分析技术在农药分析中具有灵敏、有效的特点，但仍存在仪器复杂、技术复杂、样品前处理复杂耗时等缺点，导致测定成本高。电流型乙酰胆碱酯酶(ache)生物传感器由于其响应快、简单、方便、分析成本低的优点，已被证明是一种合适的替代方案。
3.生物传感器是一种对生物物质敏感并将其浓度转换为电信号进行检测的仪器，是由固定化的生物物质、换能器和信号放大装置构成，近年来获得许多关注。
4.各种各样的技术已经被用于将酶引入固定基质(例如，许多天然和合成材料)，如包埋，共价吸附和吸附。在这些方法中，将酶包埋到固定基质中是相对简单和便宜的，并且对天然酶的结构和功能产生相对较小的干扰。因此，这种方法也经常用于大规模生产。采用聚合物包酶的方法倍受重视，这种方法把酶包埋在由微乳液聚合形成的聚合离子液体(pil)中。
5.pil为酶提供生物相容性的微环境，利于酶活性的保持同时包埋的方法有效减少了酶的流失，这保障了电极材料的高稳定性。然而，由于建立的方法仅由pil和ache这种导电性较差的物质构成，所以，高导电性物质的引入就十分必要。pil还可与金纳米粒子结合，这在保证电化学生物传感器稳定性的同时，进一步增强了导电性。
6.因此，基于以上分析，如果能将ache@pil和金纳米粒子结合起来形成一种复合物，这种复合物将兼具二者的优点。


技术实现要素：

7.为了解决以上问题，本发明提供了一种用于农药检测的离子液体聚合物基电化学修饰材料的制备方法和应用。本发明提供的复合材料ache@pil/aunps兼具优良导电性和生物相容性，既能使固载的酶保持生物活性，又能促进酶与电极表面间的直接电子转移。可应用于电化学分析、生物传感和农药检测等领域。
8.本发明采用的技术方案是：一种用于农药检测的离子液体聚合物基电化学修饰材料，所述离子液体聚合物基电化学修饰材料为ache@pil/aunps，制备方法包括如下步骤：
9.1)分散水相制备：取离子液体、乙酰胆碱酯酶(ache)、交联剂和引发剂溶解于分散
剂tris-hcl溶液中，搅拌均匀，得分散水相；
10.2)油相制备：取十二烷和司盘80，搅拌均匀，得油相；
11.3)ache@pil的合成：向油相中以逐滴滴加的方式，滴加分散水相，得乳液；向乳液中加入四甲基乙二胺(temed)，于25℃下聚合反应60min后，所得沉淀用丙酮和pbs洗涤，离心分离，冷冻干燥，得ache@pil；
12.4)ache@pil/aunps的合成：取ache@pil于离心管中，加入金纳米溶液(aunps)，室温下震荡10min后，离心取固体物，得离子液体聚合物基电化学修饰材料ache@pil/aunps。
13.进一步的，步骤1)中，所述离子液体为1-乙烯基-3-乙基咪唑溴盐(vietim

br-)；所述交联剂为n,n
′
亚甲基双丙烯酰胺；所述引发剂为过硫酸铵。
14.更进一步的，按质量比，1-乙烯基-3-乙基咪唑溴盐:n,n
′
亚甲基双丙烯酰胺:过硫酸铵＝100:5:2。
15.进一步的，步骤2)中，按体积比，十二烷:司盘80＝3:1。
16.进一步的，步骤3)中，按体积比，油相:水相＝1:5。
17.进一步的，步骤4)中，按体积比，金纳米溶液:ache@pil＝200:1。
18.本发明提供的离子液体聚合物基电化学修饰材料在电化学检测农药中的应用。
19.进一步的，方法如下：将离子液体聚合物基电化学修饰材料ache@pil/aunps涂覆于玻碳电极gce上，制备成gce/ache@pil/aunps修饰电极；以gce/ache@pil/aunps修饰电极为工作电极，ag/agcl电极为参比电极，铂电极为辅助电极，组成三电极体系，置于含有农药的溶液中，进行电化学检测。
20.更进一步的，所述农药为敌敌畏。
21.本发明具有如下有益效果：
22.1、本发明提供的离子液体聚合物基电化学修饰材料ache@pil/aunps，制备成生物传感器具有良好的重复性、抗干扰能力和超高的热稳定性和储存稳定性，在桃子、自来水等实际样品分析中具有较高的准确性。
23.2、本发明提供的离子液体聚合物基电化学修饰材料ache@pil/aunps，制备成生物传感器，显示出优异的电化学活性，可以实现对农药的高灵敏度、低检测限、高选择性检测。
24.3、本发明中，离子液体聚合物不仅可以为酶提供生物相容性的微环境，同时利于酶活性的保持，包埋的方法有效减少了酶的流失，保障了电极材料的高稳定性。
附图说明
25.图1是pil(a)、ache@pil(b)和ache@pil/aunps(c)的扫描电镜图。
26.图2是ache，ils，ache@pil和aunps的zeta电位柱状图。
27.图3是aunps(b)和ache@pil/aunps(a)上清液的紫外-可见吸收光谱图(uv-vis)。
28.图4是ache@pil/aunps(a)和ache@pil(b)的x射线衍射光谱图(xrd)。
29.图5是ache@pil/aunps(a)和ache@pil(b)的x射线光电子能谱(xps)。
30.图6是ache(c)，ache@pil/aunps(b)和ache@pil(a)的傅氏转换红外线光谱(ft-ir)。
31.图7是ache@pil/aunps(a)和ache@pil(b)的拉曼光谱。
32.图8是ache@pil/aunps和ache@pil的拉曼差异光谱。
33.图9是gce(a)，gce/pil(b)，gce/ache@pil(c)和gce/ache@pil/aunps(d)在含有5
×
10-3
m fe(cn)
6 3-/4-的0.5m kcl溶液中的循环伏安图(cvs)，扫描速率为0.2vs-1
。
34.图10是gce/pil(a)，gce/ache@pil(b)和gce/ache@pil/aunps(c)在含有5
×
10-3
m fe(cn)
6 3-/4-的0.5m kcl溶液中的阻抗图。
35.图11是gce/pil(c)，gce/ache@pil(b)和gce/ache@pil/aunps(a)在0.1m pbs，ph 7.5的8.0mm atcl溶液中的差分脉冲伏安图(dpvs)。
36.图12是gce/ache@pil/aunps在0.1m pbs，ph 7.5的8.0mm atcl溶液中的阳极峰值电流(a)和扫描速率的关系图(b)。
37.图13是gce/ache@pil/aunps在0.1m pbs，ph 7.5的不同浓度atcl溶液中的差分脉冲伏安图(dpvs)(a)和峰电流对atcl溶液浓度的双倒数线性关系图(b)。
38.图14是gce/ache@pil/aunps的储存稳定性(a)和高温稳定性(b)。
39.图15是gce/ache@pil/aunps在含有8mm atcl的0.1m pbs中，分别存在8mm的葡萄糖(a)，8mm po
43-(b)，柠檬酸(c)，mg
2
(d)，so
42-(e)，no
3-(f)，fe
3
(g)，cu
2
(h)，西维因(i)，甲基对硫磷(j)和马拉硫磷(k)等干扰物孵化10分钟中的剩余信号。
40.图16是gce/ache@pil/aunps在0.1m pbs(ph 7.5)不同浓度敌敌畏抑制10min后及未抑制10min的dpv响应(a)和敌敌畏浓度测定的校正图(b)。
具体实施方式
41.为了更好地理解本发明的技术方案，特以具体的实施例作进一步详细说明，但方案不限于此。
42.实施例1一种离子液体聚合物基电化学修饰材料ache@pil/aunps
43.(一)制备方法如下：
44.1、离子液体的制备
45.在250ml的圆底烧瓶中，加入30.0ml的1-乙烯基咪唑和42.8ml的溴乙烷。将混合溶液在反应温度为70℃的条件下加热回流10h。待反应停止后，冷却至室温，将反应产物转移至烧杯中，用乙腈-乙酸乙酯进行重结晶，过滤后真空干燥，所得产物即为离子液体1-乙烯基-3-乙基咪唑溴盐(vietim

br-)。
46.2、ache@pil的合成
47.分散水相制备：取0.5ml离子液体，0.5mg乙酰胆碱酯酶ache，0.01g交联剂n,n
′
亚甲基双丙烯酰胺和0.0040g引发剂过硫酸铵溶解于1ml浓度为20mm分散剂tris-hcl溶液中，搅拌均匀，得分散水相。
48.油相制备：按体积比，十二烷:司盘80＝3:1，取十二烷和司盘80，搅拌均匀，得油相。
49.按体积比，油相:水相＝1:5，向油相中以逐滴滴加的方式，滴加分散水相，得乳液；向乳液中加入temed，于25℃下聚合反应60min后，所得沉淀用丙酮和pbs洗涤，离心分离(4000rpm，10min)，冷冻干燥，得ache@pil。
50.3、ache@pil/aunps的合成
51.取50μl ache@pil于离心管中，加入10ml金纳米溶液(aunps)，室温下震荡10min后观察到溶液由白色变为紫色，离心(4000rpm，10min)分离得到紫色固体物，为ache@pil/
aunps。
52.(二)对比例pil的合成
53.分散水相制备：取0.5ml离子液体，0.01g交联剂n,n
′
亚甲基双丙烯酰胺和0.0040g引发剂过硫酸铵溶解于1ml浓度为20mm分散剂tris-hcl溶液中，搅拌均匀，得分散水相。
54.油相制备：按体积比，十二烷:司盘80＝3:1，取十二烷和司盘80，搅拌均匀，得油相；
55.按体积比，油相:水相＝1:5，向油相中以逐滴滴加的方式，滴加分散水相，得乳液；向乳液中加入temed，于25℃下聚合反应60min后，所得沉淀用丙酮和pbs洗涤，离心分离(4000rpm，10min)，冷冻干燥，得pil。
56.(三)材料及电极的表征
57.图1是pil(a)，ache@pil(b)和ache@pil/aunps(c)的典型sem图像。三者均是通过浓乳液聚合反应生成的球状结构，图1中c显示aunps的进一步组装并没有改变二元组分的形貌，值得注意的是，并未观察到散落的aunps，这说明aunps完全以组装的形式负载在ache@pil表面。
58.图2是ache，ils，ache@pil和aunps的zeta电位柱状图。ache和ils的zeta电位分别为-6.02mv和6.36mv，带负电荷的ache与带正电荷ils产生较强的相互作用，聚合形成的二元体系和aunps的zeta电位分别为24.9mv和-5.48mv，这使得包埋产生的带正电荷的二元体系可以进一步在静电作用下组装带负电荷的aunps。
59.图3是aunps(b)和ache@pil/aunps(a)上清液的紫外-可见吸收光谱图(uv-vis)。从图3中曲线b可以看到，aunps的特征吸收峰在519nm处，在曲线a中未能观察到此峰，这是由于ache@pil与aunps的静电组装使得aunps出现在沉淀中，而单独的aunps在4000rpm中不能完全沉淀，故观察到位于519nm处的aunps的特征吸收峰，通过对这一组装过程进行监控，明显观察到aunps被有效富集到之前的二元结构表面，ache@pil/aunps三元复合结构形成。
60.图4是ache@pil/aunps(a)和ache@pil(b)的x射线衍射光谱图(xrd)。在ache@pil/aunps的x射线衍射图中能明显观察到在38.184
°
，44.392
°
，64.576
°
和77.547
°
有四处强衍射峰，分别对应于au的(111)，(200)，(220)，(311)晶面的衍射峰，表明aunps的存在。ache@pil/aunps与ache@pil的x射线衍射图同时存在的位于20-30
°
范围内的无定形峰表明二者均含有有机组分，存在无定形结构，表明本发明的ache@pil/aunps复合物中同时存在aunps以及无定形的聚合物结构。
61.图5是ache@pil/aunps(a)和ache@pil(b)的x射线光电子能谱(xps)。与ache@pil(曲线b)相比，ache@pil/aunps(曲线a)的xps谱图在82.96ev和87.79ev处出现了au的特征峰，这与图3和图4所得结论一致。
62.图6是ache(c)，ache@pil/aunps(b)和ache@pil(a)的傅氏转换红外线光谱(ft-ir)。如图6所示，与曲线c相比，曲线b中多出1700-1500cm-1
范围内峰，归属于c＝n特征伸缩振动振动，证实了ache@pil中pil的存在。同时与曲线a相比，曲线b中位于3360cm-1
，3100cm-1
处的峰，分别归属于炔基的c-h伸缩振动和苯环的c-h伸缩振动，此外，位于1735cm-1
处的峰是由于c＝o官能团的伸缩振动，以上证据证实ache@pil中ache和pil的同时存在，这与xps分析所得结论基本一致。
63.图7是ache@pil/aunps(a)和ache@pil(b)的拉曼光谱。如图7所示，对比曲线a和曲
线b，明显观察到aunps的加入可使拉曼信号强度增加，ache@pil/aunps可实现拉曼增强(sers)，证明了aunps和ache@pil之间结合紧密，aunps位于ache@pil表面而非环境中。
64.图8是ache@pil/aunps和ache@pil的拉曼差异光谱。差异光谱非常类似于ache的拉曼特征，证实了电极表面上酶活性位点的可用性，1600cm-1
左右和1265cm-1
左右处的峰分别属于来自ache的二级结构胺
ⅰ
和胺
ⅲ
，1620cm-1
至1700cm-1
和1200cm-1
至1300cm-1
之间的区域与c-o伸缩振动有关，由二级结构(α螺旋和β折叠)调节，1550cm-1
处的条带是色氨酸残基的特征，1400cm-1
至1500cm-1
的条带主要与侧链的ch2的剪切振动有关，1362cm-1
处出现条带是由于ch2弯曲振动，800cm-1
至1150cm-1
之间的带被认为是ache脂肪侧链(c-c和c-n)的拉伸振动。921cm-1
，1072cm-1
处的条带与丙氨酸的存在有关，同时946cm-1
处的条带与赖氨酸、谷氨酸和丝氨酸有关。因此，被pil/aunps包埋的ache仍具有天然酶活性。
65.实施例2离子液体聚合物基电化学修饰材料ache@pil/aunps的应用(一)gce/ache@pil/aunps修饰电极的制备
66.1、玻碳电极的预处理
67.本实验采用直径为3mm的玻碳电极，分别用1.0、0.3、0.05μm的al2o3对玻碳电极进行抛光，用超纯水超声清洗1min。以玻碳电极(gc)为工作电极，铂丝为对电极，ag/agcl电极为参比电极，构成三电极体系。在1mm k3fe(cn)6的1m kcl溶液中进行电化学循环伏安(cv)的测试。当电极的氧化峰与还原峰的峰位差小于70.0mv时，说明该电极达到活化清洁的要求。取出玻碳电极，用超纯水清洗，高纯氮气(n2)吹干备用。
68.2、gce/ache@pil/aunps修饰电极的制备
69.取5mg实施例1制备的ache@pil/aunps和10.0μl浓度为0.5wt％的nafion溶液，混合均匀。取所得ache@pil/aunps溶液滴涂到预处理后的玻碳电极(gce)表面，室温干燥后继续滴涂5μl nafion(0.5wt％)，在4℃下完全干燥，获得gce/ache@pil/aunps修饰电极。
70.(二)gce/ache@pil/aunps修饰电极的电化学性能的表征
71.在电化学表征测试时，本实验是在0.1m ph＝7.5的pbs缓冲溶液中，扫速200mv/s的条件下进行的。采用三电极体系，ag/agcl电极为参比电极，铂电极为辅助电极，gce/ache@pil/aunps修饰电极为工作电极。在相同的实验条件下，每次测试前gce/ache@pil/aunps修饰电极连续扫描50圈。
72.图9是gce(a)，gce/pil(b)，gce/ache@pil(c)和gce/ache@pil/aunps(d)在含有5
×
10-3
m fe(cn)
6 3-/4-的0.5m kcl溶液中的循环伏安图(cvs)，扫描速率为0.2vs-1
。所有修饰电极均显示一对良好的可逆的氧化还原峰，式电位(ep)为0.23v，这是fe(cn)
6 3-/4-电对的特征电位。不同的电位差和峰电流显示了材料的分步组装过程，如曲线b和曲线c所示，gce/pil和gce/ache@pil的电位差分别为93mv和114mv，峰电流分别为123μa和63μa，ache作为一种蛋白质分子，由于其导电性较差，阻碍了电子的传递，因此导致含ache的复合材料修饰电极有较大的峰位差和较低的导电性。如曲线a和曲线b所示，gce/ache@pil/aunps和gce/ache@pil的电位差均为114mv，峰电流分别为155μa和63μa，表明aunps能显著提高电极材料导电性。
73.图10是gce/pil(a)，gce/ache@pil(b)和gce/ache@pil/aunps(c)在含有5
×
10-3
m fe(cn)
6 3-/4-的0.5m kcl溶液中的阻抗图。gce/pil电子转移电阻值为27.53ω，包埋酶之后gce/ache@pil电阻值变为49.21ω，在ache包埋后都出现电阻值的明显增加，证明酶的成功
固载。值得注意的是，在相同的酶用量下，添加aunps的酶电极电子转移电阻较gce/ache@pil有明显降低为26.30ω，这与之前所得的cv测试结果一致，证明gce/ache@pil/aunps具有最低的电子转移电阻值和最高的电导率。
74.图11是gce/pil(c)，gce/ache@pil(b)和gce/ache@pil/aunps(a)在0.1m pbs，ph 7.5的8.0mm atcl溶液中的差分脉冲伏安图(dpvs)。gce/ache@pil/aunps(a)，gce/ache@pil(b)的氧化峰电流分别为6.1μa和2.4μa，前者是后者的2.54倍。可以明显看出，aunps加入的含酶修饰电极峰电流明显高于gce/ache@pil，这是由于aunps明显提高了修饰电极的电子转移能力。
75.图12是gce/ache@pil/aunps在0.1m pbs，ph 7.5的8.0mm atcl溶液中的阳极峰值电流(a)和扫描速率的关系图(b)。如图12中a所示，当扫速在40mv.s-1-220mv.s-1
范围内增加时，氧化峰电流增加，氧化峰向正电位移动。如图12中b所示，峰电流与扫速的平方根成正比，这代表了该电极的扩散控制过程。
76.(三)gce/ache@pil/aunps修饰电极的电催化性能的表征
77.本实验是在含有atcl(氯化乙酰硫代胆碱)的0.1m ph＝7.5的pbs缓冲溶液中，扫速200mv/s的条件下进行的。采用三电极体系，ag/agcl电极为参比电极，铂电极为辅助电极，gce/ache@pil/aunps修饰电极为工作电极。在相同的实验条件下，每次测试前gce/ache@pil/aunps修饰电极连续扫描50圈。
78.图13是gce/ache@pil/aunps在0.1m pbs，ph 7.5的不同浓度atcl溶液中的差分脉冲伏安图(dpvs)(a)和峰电流对atcl溶液浓度的双倒数线性关系图(b)。在0-10mm atcl浓度范围内，随atcl浓度增加，峰电流信号增大，后继续加入atcl，峰电流无明显变化。michaelis menten常数(km)用lineweaver burke eq。(1/iss＝km/imax
·
1/c 1/imax)来评价ache与atcl相互作用的活性，其中iss是注入酶底物后的稳态电流，imax是在饱和浓度下计算的最大电流，c是底物浓度。解得km为9.66mm。
79.图14是gce/ache@pil/aunps的储存稳定性(a)和高温稳定性(b)。生物传感器电流在30天后仍然保持在其初始响应的95％。在35、45和55℃下热处理电极20分钟后，它们的剩余活性表现出先升高后下降的趋势。在55℃下加热20分钟，被包埋的ache保留了73％的初始活性，而未经保护的ache高温易失活，当温度在42-48℃范围内，ache就会有60％的活性降低。很明显，ache的热稳定性因其被包埋而显著提高。
80.(四)gce/ache@pil/aunps的选择性研究
81.图15是gce/ache@pil/aunps在含有8mm atcl的0.1m pbs中，分别存在8mm的葡萄糖(a)，8mm po
43-(b)，柠檬酸(c)，mg
2
(d)，so
42-(e)，no
3-(f)，fe
3
(g)，cu
2
(h)，西维因(i)，甲基对硫磷(j)和马拉硫磷(k)等干扰物孵化10分钟中的剩余信号。在葡萄糖，po
43-，柠檬酸，mg
2
，so
42-，no
3-，fe
3
和cu
2
的存在下，未获得显著干扰。此外，还对试验样品中可能共存的甲基对硫磷和马拉硫磷进行了调查。发现甲基对硫磷和马拉硫磷影响西维因的检测。这种迹象可能是因为这些农药争夺乙酰胆碱酯酶与马拉硫磷的结合位点。结果表明，构建的基于酶抑制的生物传感器具有普遍性，对农药的检测具有可接受的选择性。
82.(五)gce/ache@pil/aunps的农药检测研究
83.本实验是在含有不同浓度敌敌畏(ddvp)的0.1m ph＝7.5的pbs缓冲溶液中，扫速200mv/s的条件下进行的。采用三电极体系，ag/agcl电极为参比电极，铂电极为辅助电极，
gce/ache@pil/aunps修饰电极为工作电极。在相同的实验条件下，每次测试前gce/ache@pil/aunps修饰电极连续扫描50圈。
84.图16是gce/ache@pil/aunps在0.1m pbs(ph 7.5)不同浓度敌敌畏抑制10min后及未抑制10min的dpv响应(a)和敌敌畏浓度测定的校正图(b)。当ddvp浓度为1375ng
·
ml-1
时，酶抑制率达到70％，线性范围为0.125-1375ng
·
ml-1
，线性拟合回归:inhibition(％)＝6.22log c(ddvp) 12.45和inhibition(％)＝27.56log c(ddvp)-17.32，相关系数为0.90和0.96。lod为0.038(按3σ规则计算)。