一种表达特定STING异构体、细胞系、制备方法、用途与流程

一种表达特定sting异构体、细胞系、制备方法、用途
技术领域
1.本发明属于生物医学技术领域，尤其涉及一种表达特定sting异构体、细胞系、制备方法、用途。


背景技术：

2.目前，干扰素基因刺激因子(stimulator of interferon genes,sting)是一种在天然免疫应答过程中发挥重要作用的新的蛋白分子，在免疫细胞及肿瘤细胞中广泛表达。
3.sting作为抗肿瘤免疫循环的主要调节者，调控了癌症免疫全循环中的各个环节，sting激活产生的i型ifn能够促进多种免疫细胞的活化，增加抗原提呈能力，激活抗肿瘤免疫反应。激活sting已在多种癌症中被证明是有效的，sting激动剂相关的临床试验已多达20余项，在肿瘤中围绕sting的一系列高水平研究、引人注目的体内外数据及制药巨头以巨资投入的研发导向都表明sting已成为小分子肿瘤免疫的新靶点。
4.既往传统观点认为sting驻留在内质网上，然而发明人首次发现，sting基因转录的pre-mrna有两种剪接方式不同的转录本；较长的转录本被翻译加工成经典的ersting定位于内质网上；较短的转录本与较长转录本具有相同的3’末端序列，由于外显子跳跃缺少跨膜区被翻译加工成pmsting定位于细胞质膜上。两种转录分子其序列和细胞位置不同，在人体中可发挥的作用也不一致。然而在研究过程中，需排除其中一种分子表达的干扰，才能准确探寻另一种分子的作用机制。然而现有技术中关于制备表达特定sting异构体的技术未见报道，为进行sting机制研究、研发以sting为靶点的新型小分子免疫治疗药物制造了阻碍。
5.通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：现有技术中关于制备表达特定sting异构体的技术未见报道，缺少pmsting分子机制研究及药物开发的细胞模型。
6.解决以上问题及缺陷的难度为：
7.要解决上述细胞系的构建，填补此类细胞系模型的空白，至少需要对基础医学研究领域有深入的了解，特别是对于试验设计方面。还需要熟悉sting分子，了解其特性和表达。同时还需具有很强的实验技术储备和理论知识储备，可以寻找设计出合适的引物，并有能力构建细胞系相应技术流程。
8.解决以上问题及缺陷的意义为：
9.发明表达特定sting异构体的细胞系有利于更好的明晰sting分子及相关上下游分子发挥的不同作用，从而在未来有针对性的开发药物。如，发明人利用此细胞系已探索出pmsting可被胞外cgamp刺激，诱导tbk1磷酸化，磷酸化的tbk1进一步介导irf3的活化，促进i型干扰素的表达。这一机制对助于理解肿瘤、自身免疫病等各类疾病的发病机制，并在未来以此为基础开发相应靶向药物。


技术实现要素：

10.针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种表达特定sting异构体、细胞系、制
备方法、用途。
11.本发明是这样实现的，所述sting异构体包括ersting和pmsting，sting基因转录的pre-mrna有两种剪接方式不同的转录本；较长的转录本被翻译加工成经典的ersting定位于内质网上；较短的转录本由于外显子跳跃缺少跨膜区；与较长转录本具有相同的3’末端序列，被翻译加工成pmsting定位于细胞质膜上，发明构建了仅表达一种sting转录本的鼠及人细胞系，即仅表达ersting和仅表达pmsting的b16细胞系及仅表达ersting和仅表达pmsting的hek293t细胞系。
12.小鼠ersting序列为seq id no：5所示：
13.14.[0015][0016]
小鼠pmsting序列为seq id no：6所示：
[0017]
[0018][0019]
人ersting序列为seq id no：7所示：
[0020]
[0021]
[0022][0023]
人pmsting序列为seq id no：8所示：
[0024]
[0025]
[0026][0027]
进一步，pmsting与经典的ersting具有相同的c-末端结构域；pmsting可被胞外cgamp刺激，诱导tbk1磷酸化，磷酸化的tbk1进一步介导irf3的活化，促进i型干扰素的表达。
[0028]
本发明的目的在于提供一种表达特定sting异构体的细胞系，所述细胞系包括：表达ersting和表达pmsting的b16细胞系及仅表达ersting和仅表达pmsting的hek293t细胞系。
[0029]
本发明的另一目的在于提供一种细胞系的制备方法，包括：
[0030]
步骤一，进行小鼠脾细胞的培养以及人外周血单个核细胞pbmcs的分离与培养；
[0031]
步骤二，以pbmcs cdna为模板合成人pmsting和ersting的开放阅读框架即orf；以小鼠脾细胞cdna为模板，合成小鼠pmsting和ersting的orf；
[0032]
步骤三，将合成的选择性剪接异构体的orf分别克隆到pcdna3.1-gfp载体中，构建pmsting-gfp和ersting-gfp融合基因质粒；
[0033]
步骤四，将构建好的融合基因质粒转染至预先培养好的b16
tmem173-/-细胞和hek293t细胞，即可得到仅表达ersting和仅表达pmsting的b16细胞系及仅表达ersting和表达pmsting的hek293t细胞系。
[0034]
进一步，步骤一中，所述小鼠脾细胞的培养包括：用含10％胎牛血清和0.1％青霉素-链霉素溶液的rpmi1640培养基在37℃，5％co2环境条件下培养小鼠脾细胞。
[0035]
进一步，步骤一中，所述人外周血单个核细胞的分离包括：
[0036]
首先，获取人血液，并稀释；将稀释的血液加入底部装有5ml淋巴细胞分层液的试管中，1500g离心10分钟；
[0037]
其次，将含有pbmc的中间层分离到一个新的试管中，1500g离心5分钟；除去上清液；
[0038]
然后，将细胞沉淀重新悬浮在1ml红细胞裂解缓冲液中，室温裂解3分钟去除红细胞；
[0039]
最后，除去上清液，细胞沉淀用pbs重新悬浮，1500g离心5分钟，即得到分离的人外周血单个核细胞pbmcs。
[0040]
进一步，所述稀释包括：利用6ml无菌pbs稀释。
[0041]
进一步，所述进行人外周血单个核细胞的培养包括：
[0042]
用含10％胎牛血清和0.1％青霉素-链霉素溶液的rpmi1640培养基在37℃，5％co2环境条件下培养人pbmc细胞。
[0043]
进一步，步骤四中，所述b16
tmem173-/-细胞的培养包括：置于含10％胎牛血清和0.1％青霉素-链霉素溶液的rpmi1640培养基中，在37℃，5％co2环境条件下培养。所述
hek293t细胞的培养包括：置于含10％胎牛血清和0.1％青霉素-链霉素溶液的dmem培养基中，在37℃，5％co2环境条件下培养。
[0044]
进一步，所述构建sting异构体融合基因质粒的引物包括：
[0045]
小鼠tmem 173细胞引物序列如seq id no：1所示；
[0046]
人tmem 173细胞引物序列如seq id no：2所示；
[0047]
小鼠tmem 173-orf细胞引物序列如seq id no：3所示；
[0048]
人tmem 173-orf细胞引物序列如seq id no：4所示。
[0049]
进一步，将构建好的融合基因质粒转染至预先培养好的b16
tmem173-/-细胞和hek293t细胞，即可得到所述表达特定sting异构体的细胞系，即仅表达ersting和仅表达pmsting的b16细胞系及仅表达ersting和表达pmsting的hek293t细胞系。
[0050]
结合上述的所有技术方案，本发明所具备的优点及积极效果为：本发明首次利用仅表达其中一种异构体的方式，建立了一种表达特定sting异构体的细胞系，为阐明sting分子作用机制建立了模型，为以sting为靶点的新型小分子免疫治疗药物的研发奠定了基础。利用本发明，发明人已发现pmsting可被胞外cgamp刺激，诱导tbk1磷酸化，磷酸化的tbk1进一步介导irf3的活化，促进i型干扰素的表达。通过制备仅表达pmsting和ersting的细胞系将有助于对sting各类分子的作用更加明晰，对于如cgamp等信号分子作为免疫递质的作用提供更深入的认识，对于理解肿瘤、自身免疫病等各类疾病的发病机制极具帮助，为新型靶向治疗药物的开发提供了新思路。
附图说明
[0051]
图1是本发明实施例提供的表达特定sting异构体的细胞系的制备方法流程图。
[0052]
图2是本发明实施例提供的免疫沉淀图。
[0053]
图3是本发明实施例提供的免疫荧光图。
[0054]
图4是本发明实施例提供的pmsting亚型被细胞外cgamp激活示意图。
具体实施方式
[0055]
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0056]
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种表达特定sting异构体的细胞系制备方法，下面结合附图对本发明作详细的描述。
[0057]
本发明的sting异构体包括ersting和pmsting，sting基因转录的pre-mrna有两种剪接方式不同的转录本；较长的转录本被翻译加工成经典的ersting定位于内质网上；较短的转录本与较长转录本具有相同的3’末端序列，由于外显子跳跃缺少跨膜区被翻译加工成pmsting定位于细胞质膜上；
[0058]
小鼠ersting序列为seq id no：5所示；
[0059]
小鼠pmsting序列为seq id no：6所示；
[0060]
人ersting序列为seq id no：7所示；
[0061]
人pmsting序列为seq id no：8所示。
[0062]
如图1所示，本发明实施例提供的表达特定sting异构体细胞系的制备方法包括：
[0063]
s101，进行小鼠脾细胞的培养以及人外周血单个核细胞pbmcs的分离与培养；
[0064]
s102，以pbmcs cdna为模板合成人pmsting和ersting的开放阅读框架即orf；以小鼠脾细胞cdna为模板，合成小鼠pmsting和ersting的orf；
[0065]
s103，将合成的选择性剪接异构体的orf分别克隆到pcdna3.1-gfp载体中，构建pmsting-gfp和ersting-gfp融合基因质粒；
[0066]
s104，将构建好的融合基因质粒转染至预先培养好的b16
tmem173-/-细胞和hek293t细胞，即可得到仅表达ersting和仅表达pmsting的b16细胞系及仅表达ersting和表达pmsting的hek293t细胞系。
[0067]
本发明实施例提供的小鼠脾细胞的培养包括：用含10％胎牛血清和0.1％青霉素-链霉素溶液的rpmi1640培养基在37℃，5％co2环境条件下培养小鼠脾细胞。
[0068]
本发明实施例提供的人外周血单个核细胞的分离包括：
[0069]
首先，获取人血液，并利用6ml无菌pbs稀释；将稀释的血液加入底部装有5ml淋巴细胞分层液的试管中，1500g离心10分钟；
[0070]
其次，将含有pbmc的中间层分离到一个新的试管中，1500g离心5分钟；除去上清液；
[0071]
然后，将细胞沉淀重新悬浮在1ml红细胞裂解缓冲液中，室温裂解3分钟去除红细胞；
[0072]
最后，除去上清液，细胞沉淀用pbs重新悬浮，1500g离心5分钟，即得到分离的人外周血单个核细胞pbmcs。
[0073]
本发明实施例提供的进行人外周血单个核细胞的培养包括：
[0074]
用含10％胎牛血清和0.1％青霉素-链霉素溶液的rpmi1640培养基在37℃，5％co2环境条件下培养人pbmc细胞。
[0075]
本发明实施例提供的b16
tmem173-/-细胞的培养包括：置于含10％胎牛血清和0.1％青霉素-链霉素溶液的rpmi1640培养基中，在37℃，5％co2环境条件下培养。hek293t细胞的培养包括：置于含10％胎牛血清和0.1％青霉素-链霉素溶液的dmem培养基中，在37℃，5％co2环境条件下培养。
[0076]
本发明实施例提供的构建sting异构体融合基因质粒的引物包括：
[0077]
小鼠tmem 173细胞引物序列如seq id no：1：gctgtgccatgtccagtc(正向)，caaccgcaagtacccaat(反向)。
[0078]
人tmem 173细胞引物序列如seq id no：2：tctcctcgtcatcatccag(正向)，aggaggatgttcagtgcc(反向)。
[0079]
小鼠tmem 173-orf细胞引物序列如seq id no：3：ggtaccctcttctgctccaggaacac(正向)，gatatcgatgaggtcagtgcggagtgg(反向)。
[0080]
人tmem 173-orf细胞引物序列如seq id no：4：gtgtggatccagagcagccagtgtcc(正向)，tctagaagagaaatccgtgcggagag(反向)。
[0081]
下面结合具体实施例对本发明的技术方案做进一步说明。
[0082]
实施例1：
[0083]
1.c57bl/6
tmem173wt/wt
小鼠购自哈尔滨医科大学附属第二医院动物中心，
c57bl6
tmem173gt/gt
小鼠购自jackson laboratory。取c57bl/6
tmem173wt/wt
和c57bl6
tmem173gt/gt
小鼠的新鲜脾脏，在无菌pbs中用注射器活塞轻轻压碎，将悬浮在pbs中的脾细胞用滤网(100μm)过滤，置于离心机中，1500g离心5分钟。除去上清液，将细胞沉淀重新悬浮于1ml红细胞裂解缓冲液中，室温裂解3分钟去除红细胞。置于离心机中，1500g离心5分钟。去除上清液，细胞沉淀用pbs重悬，1500g条件离心5分钟，即成功分离小鼠脾细胞。
[0084]
2.将健康志愿者的血液收集到5ml edta抗凝管中，用6ml无菌pbs稀释。然后将稀释的血液加入底部装有5ml淋巴细胞分层液的试管中，1500g离心10分钟。离心后，试管中的溶液被分成三层，将含有pbmc的中间层分离到一个新的试管中，1500g离心5分钟。除去上清液，将细胞沉淀重新悬浮在1ml红细胞裂解缓冲液中，室温裂解3分钟去除红细胞。除去上清液，细胞沉淀用pbs重新悬浮，1500g离心5分钟，即成功分离人外周血单个核细胞(pbmcs)。
[0085]
3.b16-blue
tm
isg-ko-sting细胞系购自invivogen公司，b16细胞系购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心，置于含10％胎牛血清和0.1％青霉素-链霉素溶液的rpmi1640培养基中。用含10％胎牛血清和0.1％青霉素-链霉素溶液的rpmi1640培养基培养小鼠脾细胞和人pbmc细胞。所有细胞均在37℃，5％co2环境条件下培养。hek293t细胞系购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心，置于含10％胎牛血清和0.1％青霉素-链霉素溶液的dmem培养基中，在37℃，5％co2环境条件下培养。
[0086]
2.以小鼠脾细胞cdna为模板，合成了小鼠pmsting和ersting的开放阅读框架(orf)。而人pmsting和ersting的orf是以pbmcs cdna为模板合成的。将这些选择性剪接异构体的orf分别克隆到pcdna3.1-gfp载体中，构建pmsting-gfp和ersting-gfp融合基因质粒。用于构建sting异构体融合基因质粒的引物见下表。
[0087][0088]
3.将构建好的融合基因质粒转染至b16
tmem173-/-细胞及hek293t细胞，即制备出了仅表达ersting和仅表达pmsting的b16细胞系及仅表达ersting和仅表达pmsting的hek293t细胞系。
[0089]
下面结合具体试验对本发明的技术方案作进一步描述。
[0090]
免疫沉淀，将小鼠脾细胞或人pbmc与5μg/ml一抗(兔抗sting抗体(ab92605，abcam)、兔抗gapdh抗体(60004-1-ig，proteintech)、兔igg同型抗体(a0418，sigma-aldrich，usa))在4℃条件下孵育1小时。8000转/分，离心5分钟，然后用含pmsf的ripa缓冲液在冰上裂解10分钟。用稀释过的(1：2000)hrp标记的羊抗兔二抗(sa00001-2，proteintech)检测细胞膜上结合的兔igg抗体。
[0091]
免疫荧光，将小鼠脾细胞涂片和人pbmcs涂片标本用2％pfa固定5分钟，后用1％bsa封闭30分钟。用预冷pbst洗涤2次后，用兔抗tmem173抗体(ab92605，abcam，1：200)和抗不同免疫细胞类型细胞表面标志物的荧光标记抗体(biolegend)组成的一抗混合液，在4℃环境下避光染色30分钟。涂片标本用pbst漂洗3次后，用alex fluo 594标记的羊抗兔二抗(proteintech，1：100)在室温中避光染色1小时，转染的细胞用4％pfa固定15分钟，用1％bsa封闭30分钟。用抗绿色荧光蛋白一抗(sc-8334，santa cruze，usa，1:200)于4℃条件下孵育过夜。用alex fluo 594标记的羊抗兔二抗(proteintech，1：100)在室温下避光染色1小时，再用dapi(solarbio)在室温下染色10分钟。后用pbst漂洗，然后用封闭剂(sigma)封闭。
[0092]
通过免疫沉淀(图2)和免疫荧光(图3)可证明仅表达细胞膜上c末端朝外的pmsting的b16细胞系构建成功。
[0093]
pmsting亚型可特异性的识别细胞外cgamp，在稳定表达碱性磷酸酶的b16
tmem173-/-细胞中分别异位表达pmsting和ersting亚型以监测干扰素活性，发现只有pmsting亚型才能被细胞外cgamp激活(图4)。检测干扰素活性的方法为将转染6小时后，用含或不含cgamp(35μm)的无血清培养基代替培养液进行培养。经cgamp处理8小时后，将20μl的b16-blue
tm
isg-ko-sting细胞上清液和180μl的碱性磷酸酶底物(invitgen)置于96孔板中。然后，将培养板在37℃条件下孵育5小时。用双光栅多功能微孔读板机读取630nm处吸光度。对于hek293t细胞，将10μl的培养上清液与底物荧光素(invitrogen)混合于1.5ml ep试管中，并用glomax 20/20化学发光检测仪进行检测。所有检测重复3次。
[0094]
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。