一种香蕉胚性细胞悬浮系低温保存方法与流程

1.本发明涉及种质资源保存技术领域，特别涉及一种香蕉胚性细胞悬浮系低温保存方法。


背景技术：

2.香蕉(musa spp.)是芭蕉科(musaceae)植物，属于芭蕉属(musa)中的真蕉组(eumusa)。是全世界贸易量最大的水果，也是发展中国家继水稻、小麦、玉米之后的第4大食物来源。但栽培香蕉起源于尖叶蕉(m.acuminata colla aa)和长梗蕉(m.balbisiana colla bb)这两个原始野生种，果实含有大量种子，可食用部分少。进过长期进化及杂交，产生了果实无种子且风味香甜的三倍体栽培香蕉品种，但三倍体香蕉存在单性结实和雌雄高度不育的情况，给新品种创制及种质资源保存工作带来巨大挑战。
3.胚性悬浮细胞系(ecs)是研究细胞周期、细胞代谢影响因素的重要工具，是香蕉建立植物高效稳定的遗传转化体系及进行体细胞无性系突变体的筛选的重要材料。但受基因型、外植体、培养基组成的因素影响，胚性悬浮系的建立困难重重，且建立好的ecs连续继代易产生细胞活力下降、胚性丢失、细胞死亡等现象。
4.超低温保存方法是指在-80℃以下超低温条件中保存生物种质的一套生物学技术，是目前植物种质资源长期稳定保存的最好方法。在超低温条件下，细胞内的一切物质代谢和生长活动几乎停止，植物材料在快速降温过程中处于相对稳定的生物学状态，使被保存材料终止代谢衰老过程，变异频率降低，达到长期保存种质的目的。因此，目前超低温保存被认为是长期香蕉种质保存最好且最稳定的方法。但是香蕉超低温保存还存在以下问题：1.香蕉种质资源超低温保存主要采以茎尖及丛生芽等作为保存材料，利用快速冷冻玻璃化法对植物材料进行保存。实验材料体积较大，玻璃化时间越长，对细胞造成的损伤越大，冷冻后的恢复率低。2.在冷冻过程中，将盛有茎尖或丛生芽的离心管直接冻于液氮中，离心管及冷冻保护液拖慢了液氮的冷冻速度，也会对冷冻效果造成影响，影响其恢复率。3.传统解冻方法即将冷冻管放入40℃恒温水浴中解冻90s，对于小液滴法保存香蕉ecs来说，温度过高，时间过长，影响细胞回复生长。


技术实现要素：

5.鉴以此，本发明提出一种香蕉胚性细胞悬浮系低温保存方法，解决香蕉种子育种的萌发率低、污染率高的问题。
6.本发明的技术方案是这样实现的：
7.一种香蕉胚性细胞悬浮系的低温保存方法，包括以下步骤：
8.(1)预培养：将香蕉ecs细胞置于m2培养基中培养，待细胞生长达到指数期，离心，去除上清，将悬浮细胞置于预培养培养基中培养2～3d；
9.(2)装载：将预培养好的ecs细胞，离心，去除上清液，在25
±
2℃下加入装载液进行装载；
10.(3)脱水：取装载好的ecs细胞，离心，去除上清装载液，加入玻璃化溶液，于0～4℃条件下脱水处理40～50min，离心，去除上清液，再向离心管中加入玻璃化溶液，取离心管中的ecs细胞滴于灭菌后的金属材料上，然后迅速投于装有液氮的带金属套的离心管中预冻；
11.(4)液氮保存：将步骤(3)预冻后的离心管投入液氮中保存；
12.(5)解冻处理和再培养：取出带有细胞的金属材料，迅速投入解冻培养基中解冻8～10s，离心，吸弃上清，洗涤，转移到过渡培养基中过渡培养24～26h，然后转移到m2培养基中进行恢复培养，待细胞恢复生长后转移到体细胞胚诱导培养基中诱导体细胞胚的发生或m2培养基中重新进行悬浮培养。
13.优选的，所述m2培养基，以ms为基本培养基，包括以下组分：1～1.2mg/l2.4-d、1～1.2mg/lbio(生物素) l00～110mg/l谷氨酰胺 l00～110mg/lme(麦芽提取物)、30～35g/l糖，ph5.3～5.5。
14.优选的，所述预培养培养基，以ms为基本培养基，包括以下组分：1～1.2mg/l2,4-d、1～1.2mg/lbio、100～110mg/l谷氨酞胺、100～110mg/lme、0.4～0.45mol/l糖，ph5.3～5.5。
15.优选的，所述装载液，以m2培养基为溶剂，包括以下组分：2.0～2.4mol/l甘油、0.4～0.45mol/l蔗糖，ph5.3～5.5。
16.优选的，所述装载液的加入量为预培养好的ecs细胞体积的1～1.1倍。
17.优选的，所述装载的处理时间为40～45min。
18.优选的，所述玻璃化溶液为在0～4℃预冷后的pvs2玻璃化溶液。
19.优选的，所述pvs2玻璃化溶液的加入量为预培养好的ecs细胞体积的1～1.1倍。
20.优选的，所述pvs2玻璃化溶液，以m2培养基为溶剂，包括以下组分：30wt％甘油、15wt％乙二醇、15wt％二甲基亚砜、0.4～0.45mol/l蔗糖，ph5.3～5.5。
21.优选的，所述金属材料为锡箔纸或铝箔纸。
22.优选的，所述步骤(3)的整个处理过程在0～4℃条件下进行。
23.优选的，所述液氮保存的时间≧2h。
24.优选的，所述解冻培养基，以m2培养基为基本培养基，包括：1.2～1.4mol/l蔗糖；所述解冻培养基的温度为26～28℃。
25.优选的，所述洗涤的次数为3次；所述洗涤的时间为10min/次。
26.优选的，所述过渡培养基，以m2培养基为基本培养基，包括：0.5～0.6mol/l糖。
27.优选的，所述1500～1800rpm离心12～15min。
28.优选的，所述体细胞胚诱导培养基为常规可诱导香蕉体细胞胚发生的培养基，本发明一实施例使用的体细胞胚诱导培养基为ms 100mg/l me(麦芽提取物) 4mg/l 2.4-d 1mg/l iaa 1mg/l naa 1mg/l bio l00mg/l gln(谷氨酰胺) 30g/l糖 7g/l琼脂，ph5.8。
29.与现有技术相比，本发明的有益效果是：
30.1.本发明采用香蕉ecs作为实验材料，冷冻面积小，玻璃化彻底冷冻速度快，利于细胞内结构保护及恢复后细胞活性的保持。
31.2.本发明采用小液滴冷冻法，将香蕉ecs细胞加入冷冻保护剂后在0～4℃条件下将ecs细胞滴到灭菌后的金属材料上，然后将金属材料快速投入液氮中冷冻，再装入预冷后的离心管置于液氮中保存2h以上。
32.3.本发明采用小液滴冷冻法进行低温保存，在温度为26～28℃的条件下处理10～12s即可解冻，既保证了解冻速度，又不会影响ecs的生长，保存后的细胞存活率高。
附图说明
33.图1为本发明实施例1香蕉胚性细胞悬浮系低温保存过程中各阶段细胞状态示意图；图1a为体细胞胚；图1b为体细胞胚悬浮培养；图1c为香蕉悬浮细胞系；图1d为台盼蓝染色结果，图中显示白色的细胞为活细胞；
具体实施方式
34.为了更好理解本发明技术内容，下面提供具体实施例，对本发明做进一步的说明。
35.实施例1
36.一种香蕉胚性细胞悬浮系的低温保存方法，包括以下步骤：
37.(1)预培养：将巴西蕉的ecs细胞置于m2培养基中，培养10d，细胞生长达到指数期，在1500rpm离心15min，去除上清，将ecs细胞置于预培养培养基中培养2d；所述m2培养基，以ms为基本培养基，包括以下组分：lmg/l2.4-d、1mg/lbio、l00mg/l谷氨酰胺、l00mg/lme和30g/l糖；所述预培养培养基，以ms为基本培养基，包括以下组分：1mg/l 2,4-d、1mg/lbio、100mg/l谷氨酞胺、100mg/lme和0.4mol/l糖，ph5.3；
38.(2)装载：取10ml预培养好的ecs细胞，在1500rpm离心15min，去除上清液，在室温下加入10ml装载液进行装载；所述装载液，以m2培养基为溶剂，包括以下组分：2.0mol/l甘油和0.4mol/l蔗糖，ph5.3；
39.(3)脱水：取装载好的ecs细胞，在1500rpm离心15min，去除上清装载液，加入10ml在0℃预冷后的pvs2玻璃化溶液，于0℃条件下脱水处理40min，在1500rpm离心15min，去除上清液，再向离心管中加入10ml在0℃预冷后的pvs2玻璃化溶液，将离心管中的ecs细胞滴于灭菌后的锡箔纸上，细胞滴量为50μl/滴，滴毕，然后迅速投于装有液氮的带金属套的离心管中预冻，整个处理过程在0℃条件下进行；所述pvs2玻璃化溶液，以m2培养基为溶剂，包括以下组分：30wt％甘油、15wt％乙二醇、15wt％二甲基亚砜、0.4mol/l蔗糖，ph5.3；
40.(4)液氮保存：将步骤(3)预冻后的离心管投入液氮中保存，保存时间为2h；
41.(5)解冻处理和再培养：取出带有细胞的锡箔纸，迅速投入26℃的每升含有1.2mol蔗糖的m2培养基中解冻10s，在1500rpm离心15min，吸弃上清，洗涤3次，每次洗涤10min，洗涤结束后转移到加有0.5mol/l糖的m2培养基中过渡培养24h，然后更换新的m2培养基，待细胞恢复生长后转移到体细胞胚诱导培养基中诱导体胚的发生或m2培养基中重新进行悬浮培养。
42.体细胞胚诱导培养基：ms 100mg/l me 4mg/l 2.4-d 1mg/l iaa 1mg/l naa 1mg/l bio l00mg/l gln 30g/l糖 7g/l琼脂，ph5.8。
43.实施例2
44.一种香蕉胚性细胞悬浮系的低温保存方法，包括以下步骤：
45.(1)预培养：将粉蕉的ecs细胞置于m2培养基中，培养10d，细胞生长达到指数期，在1500rpm离心15min，去除上清，将ecs细胞置于预培养培养基中培养2d；所述m2培养基，以ms为基本培养基，包括以下组分：lmg/l2.4-d、1mg/lbio、l00mg/l谷氨酰胺、l00mg/lme和30g/
l糖；所述预培养培养基，以ms为基本培养基，包括以下组分：1mg/l 2,4-d、1mg/lbio、100mg/l谷氨酞胺、100mg/lme和0.4mol/l糖，ph5.3；
46.(2)装载：取10ml预培养好的ecs细胞，在1500rpm离心15min，去除上清液，在室温下加入10ml装载液进行装载；所述装载液，以m2培养基为溶剂，包括以下组分：2.0mol/l甘油和0.4mol/l蔗糖，ph5.3；
47.(3)脱水：取装载好的ecs细胞，在1500rpm离心15min，去除上清装载液，加入10ml在0℃预冷后的pvs2玻璃化溶液，于0℃条件下脱水处理40min，在1500rpm离心15min，去除上清液，再向离心管中加入10ml在0℃预冷后的pvs2玻璃化溶液，将离心管中的ecs细胞滴于灭菌后的锡箔纸上，细胞滴量为50μl/滴，滴毕，然后迅速投于装有液氮的带金属套的离心管中预冻，整个处理过程在0℃条件下进行；所述pvs2玻璃化溶液，以m2培养基为溶剂，包括以下组分：30wt％甘油、15wt％乙二醇、15wt％二甲基亚砜、0.4mol/l蔗糖，ph5.3；
48.(4)液氮保存：将步骤(3)预冻后的离心管投入液氮中保存，保存时间为2h；
49.(5)解冻处理和再培养：取出带有细胞的锡箔纸，迅速投入26℃的每升含有1.2mol蔗糖的m2培养基中解冻10s，在1500rpm离心15min，吸弃上清，洗涤3次，每次洗涤10min，洗涤结束后转移到加有0.5mol/l糖的m2培养基中过渡培养24h，然后更换新的m2培养基，待细胞恢复生长后转移到体细胞胚诱导培养基中诱导体胚的发生或m2培养基中重新进行悬浮培养。
50.体细胞胚诱导培养基：ms 100mg/l me 4mg/l 2.4-d 1mg/l iaa 1mg/l naa 1mg/l bio l00mg/l gln 30g/l糖 7g/l琼脂，ph5.8。
51.实施例3
52.一种香蕉胚性细胞悬浮系的低温保存方法，包括以下步骤：
53.(1)预培养：将桂抗2号香蕉的ecs细胞置于m2培养基中，培养10d，细胞生长达到指数期，在1500rpm离心15min，去除上清，将ecs细胞置于预培养培养基中培养2d；所述m2培养基，以ms为基本培养基，包括以下组分：lmg/l2.4-d、1mg/lbio、l00mg/l谷氨酰胺、l00mg/lme和30g/l糖；所述预培养培养基，以ms为基本培养基，包括以下组分：1mg/l 2,4-d、1mg/lbio、100mg/l谷氨酞胺、100mg/lme和0.4mol/l糖，ph5.3；
54.(2)装载：取10ml预培养好的ecs细胞，在1500rpm离心15min，去除上清液，在室温下加入10ml装载液进行装载；所述装载液，以m2培养基为溶剂，包括以下组分：2.0mol/l甘油和0.4mol/l蔗糖，ph5.3；
55.(3)脱水：取装载好的ecs细胞，在1500rpm离心15min，去除上清装载液，加入10ml在0℃预冷后的pvs2玻璃化溶液，于0℃条件下脱水处理40min，在1500rpm离心15min，去除上清液，再向离心管中加入10ml在0℃预冷后的pvs2玻璃化溶液，将离心管中的ecs细胞滴于灭菌后的锡箔纸上，细胞滴量为50μl/滴，滴毕，然后迅速投于装有液氮的带金属套的离心管中预冻，整个处理过程在0℃条件下进行；所述pvs2玻璃化溶液，以m2培养基为溶剂，包括以下组分：30wt％甘油、15wt％乙二醇、15wt％二甲基亚砜、0.4mol/l蔗糖，ph5.3；
56.(4)液氮保存：将步骤(3)预冻后的离心管投入液氮中保存，保存时间为2h；
57.(5)解冻处理和再培养：取出带有细胞的锡箔纸，迅速投入26℃的每升含有1.2mol蔗糖的m2培养基中解冻10s，在1500rpm离心15min，吸弃上清，洗涤3次，每次洗涤10min，洗涤结束后转移到加有0.5mol/l糖的m2培养基中过渡培养24h，然后更换新的m2培养基，待细
胞恢复生长后转移到体细胞胚诱导培养基中诱导体胚的发生或m2培养基中重新进行悬浮培养。
58.体细胞胚诱导培养基：ms 100mg/l me 4mg/l 2.4-d 1mg/l iaa 1mg/l naa 1mg/l bio l00mg/l gln 30g/l糖 7g/l琼脂，ph5.8。
59.对比例1
60.一种香蕉胚性细胞悬浮系的保存方法，包括以下步骤：
61.(1)预处理：用指数生长期即在培养基中继代培养的细胞为材料，在预培养培养基中培养2d；所述预培养培养基，以ms为基本培养基，包括以下组分：1mg/l 2,4-d、1mg/lbio、100mg/l谷氨酞胺、100mg/lme和0.4mol/l糖，ph5.3；
62.(2)装载：将10ml预培养好的细胞，静置使细胞沉淀，去除上部上清液，在室温下加入10ml装载液进行装载40min；所述装载液以ml培养基为溶剂，包括以下组分：2.0mol/l甘油和0.4mol/l蔗糖，ph5.3；
63.(3)脱水：去除上清液，加入10mlpvs2，于0℃条件下脱水处理40min，完毕后将离心管中的细胞分装于冷冻管；所述pvs2以ml培养基为溶剂，包括以下组分：30wt％甘油、15wt％乙二醇、15wt％二甲基亚砜、0.4mol/l蔗糖，ph5.3；
64.(4)液氮保存：将冷冻管装在金属套上,套上一根细线，将材料迅速投入液氮中保存，保存时间2h以上。
65.(5)解冻处理和再培养：将保存材料从液氮中取出，快速投入37℃水浴中解冻，然后吸去pvs2，用ml培养基 1.2mol/l蔗糖的洗涤培养基洗涤三次，每次10min，再转移到ml培养基 0.5mol/l蔗糖的液体培养基中过渡培养24h，然后更换新鲜ml培养液，待恢复生长后转移到体细胞胚诱导培养基中诱导体胚的发生或ml培养基中重新起动悬浮培养。
66.体细胞胚诱导培养基：ms 100mg/l me 4mg/l 2.4-d 1mg/l iaa 1mg/l naa 1mg/l bio l00mg/l gln 30g/l糖 7g/l琼脂，ph5.8。
67.采用mtt试剂盒，按照使用说明书测定实施例1-3和对比例1冷冻后过渡培养24h的ecs细胞的吸光值，结果见表1-3；在恢复培养第0d和30d后，记录scv(settled cell volume，简称scv，是指悬浮细胞静置后所得的细胞沉淀体积)；
68.表1巴西蕉esc细胞的低温保存处理结果
[0069][0070]
表2粉蕉esc细胞的低温保存处理结果
[0071][0072]
表3桂抗2号香蕉ecs细胞的低温保存处理结果
[0073][0074]
结果显示，本发明低温保存方法冷冻保存三个品种香蕉ecs均可存活，在恢复培养30d后，其scv从初始的0.5ml恢复增长到0.5-0.7ml。
[0075]
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。