一种白介素2突变体的制作方法

1.本发明涉及蛋白质工程领域。具体地说，本发明涉及新颖的白介素-2(il-2)突变体及其制备方法，所述白介素-2(il-2)突变体相比于野生型il-2原始蛋白消除了与il-2rα的结合，降低了与il-2rβγ二聚体的结合，但保留了刺激肿瘤免疫细胞，包括但不限于t细胞和nk细胞的增殖。本发明的白介素2突变体更加适用于融合蛋白、抗体的缀合物。可以用于免疫治疗，但没有利用天然il-2进行免疫治疗产生的各种副作用。


背景技术：

2.白细胞介素-2(il-2，interleukin-2)是由活化的cd4 和cd8 t细胞产生的i型细胞因子，又称为t细胞生长因子。活化的树突状细胞(dcs)、天然杀伤(nk)细胞和nkt细胞也可以产生il-2。il-2是一多功能细胞因子，在淋巴细胞的稳态中具有非常重要的作用。
3.il-2能够增加nk细胞的活性，并介导活化诱导的细胞死亡。il-2可以诱导t细胞扩增以增强过继免疫治疗。il-2能够促进调节性t细胞(treg)的增殖发育，维持treg的体内平衡及其功能。在20世纪80年代被fda批准用于治疗黑素瘤和肾细胞癌，但是由于il-2在体内半衰期短，大约为15min，在治疗过程中每8h大约需要注射60,000-720,000iu/kg，因此，导致一些不良反应的出现。另外，高剂量il-2在患者中可引起血管(或毛细管)渗漏综合征(vls)，已在患者中测试低剂量il-2方案以避免vls，然而，这是以降低治疗结果为代价的。
4.il-2有三个受体亚基：il-2rα、il-2rβ和il-2rγ。根据结合亚基的不同可以分为不同亲和力的受体，il-2rαβγ为高亲和力(kd 10-11
)、il-2rβγ为中等亲和力(kd 10-9
)，il-2rα为低亲和力(kd 10-8
)受体。不同类型的受体在不同细胞表面表达。调节性t细胞(treg)表面表达高亲和力的受体(il-2rαβγ)，对低剂量的il-2比较敏感；而效应t细胞(teff)表面表达中等程度亲和力的受体(il-2rβγ)，对高剂量的il-2敏感。
5.il-2是一多功能的细胞因子。低剂量的il-2能够选择性的刺激treg细胞的增殖，其治疗机制为treg细胞表面能够表达高亲和力的il-2受体(il-2rαβγ)。在临床实验中，低剂量的il-2在治疗系统性红斑狼疮(sle)，i型糖尿病(t1d)等自身疾病方面已经取得很好的疗效，有望成为治疗自身免疫疾病的潜在药物。teff细胞表面表达中等程度亲和力的受体，对高剂量的il-2敏感。高剂量的il-2能够诱导teff细胞的增殖，用于治疗癌症和艾滋病(aids)等，但高剂量的il-2在治疗过程中产生一系列的毒性，例如心律失常，呼吸困难和缺氧，肺水肿等。il-2是一种已知有效的t细胞及nk细胞促生长因子，但由于上述副作用限制了其应用。
6.肿瘤免疫是近年来一种有效治疗肿瘤的方法，通过pd-1或者pd-l1抑制剂，其他类似的免疫抑制剂如ctla-4，cd-47抗体等实现体内t细胞及nk细胞对肿瘤细胞的杀伤。近年来，越来越多的双特异性抗体在肿瘤免疫方面受到重视，如罗氏公司选用pd1单抗偶连il-2四重突变体(us20180326010)，用于肿瘤免疫。该il-2四重突变体(cn103492411a)突变了il-2中f44a、y45a和l72g三个位点的氨基酸，降低了il-2蛋白对高亲和力il-2受体的亲和力并保留所述突变体il-2蛋白对中等亲和力il-2受体的亲和力，但同时所得il-2突变体的
生物学活性也降低。
7.因此，本领域存在利用il-2进行肿瘤免疫，稳定生产有效治疗肿瘤的il-2突变体的需求。


技术实现要素：

8.本发明提供了一种白介素2突变体蛋白、包含该白介素2突变体蛋白的融合蛋白、抗体或缀合物以及包含所述白介素2突变体蛋白、融合蛋白、抗体或缀合物的药物组合物。与野生型白介素2相比，本发明的白介素2突变体消除了与il-2rα的结合，降低了与il-2rβγ二聚体的结合，仍能够保留所需的生物学活性，刺激肿瘤免疫细胞，包括但不限于t细胞和nk细胞的增殖。本发明的白介素2突变体蛋白更加适用于融合蛋白、抗体的缀合物。本发明的白介素2突变体蛋白潜在的免疫原性极低。本发明的白介素2突变体蛋白能够克服与il-2免疫治疗相关的问题。
9.在第一方面，本发明提供一种il-2突变体，与野生型il-2相比，所述il-2突变体的氨基酸残基发生突变，从而使得il-2与其受体的结合能力发生改变；所述il-2突变体对高亲和力il-2受体的亲和力消除，同时降低对中等亲和力il-2受体的亲和力。
10.在优选的实施方式中，所述高亲和力il-2受体是il-2受体的异型三聚体形式，其由受体α亚基、受体β亚基和受体γ亚基组成；所述中等亲和力il-2受体是仅包含il-2受体β亚基和il-2受体γ亚基而无il-2受体α亚基。
11.在优选的实施方式中，与野生型il-2相比，所述il-2突变体与高亲和力il-2受体的结合亲和力降低55％以上，更优选60％以上、65％以上、70％以上、75％以上、80％以上、85％以上、90％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上，最优选所述il-2突变体与高亲和力il-2受体不结合；
12.所述il-2突变体与中等亲和力il-2受体的结合亲和力是野生型il-2与中等亲和力il-2受体的结合亲和力降低10％以上，更优选20％以上、30％以上、40％以上、50％以上、60％以上、70％以上、80％以上、90％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上；最优选地，所述il-2突变体与中等亲和力il-2受体的结合亲和力于野生型il-2与中等亲和力il-2受体的结合亲和力降低。
13.在优选的实施方式中，所述il-2突变体保留激活肿瘤免疫细胞，包括但不限于t细胞和nk细胞的增殖作用。
14.在具体的实施方式中，所述il-2突变体在对应于野生型il-2的42位、44位的氨基酸残基发生突变。
15.在具体的实施方式中，所述il-2突变体在对应于野生型il-2的以下一个或两个位点发生氨基酸残基突变：42和44。
16.在优选的实施方式中，所述il-2突变体在对应于野生型il-2的42位发生选自下组的氨基酸残基突变：f42n，f42a，f42g，f42p，f42s，f42t，f42e，f42d；或者
17.所述il-2突变体在对应于野生型il-2的44位发生选自下组的氨基酸残基突变：f44a，f44g，f44p，f44s，f44t，f44e，f44d。
18.在优选的实施方式中，所述il-2突变体在对应于野生型il-2的以下一个或两个氨基酸残基处发生以下突变：f42n、f44t。
19.在优选的实施方式中，所述il-2突变体消除了o糖位点。
20.在优选的实施方式中，所述il-2突变体在对应于野生型il-2的3位发生突变，从而消除o糖位点。
21.在优选的实施方式中，所述il-2突变体在对应于野生型il-2蛋白的3位发生以下氨基酸残基突变：t3a、t3g、t3q、t3e、t3n、t3d、t3r、t3k和t3p；优选t3a。
22.在优选的实施方式中，所述il-2突变体突变了125位cys位点：c125l、c125s、c125a；优选c125s。
23.在第二方面，本发明提供一种il-2突变体，与野生型il-2相比，所述il-2突变体的氨基酸残基发生突变；所述il-2突变体对高亲和力il-2受体的亲和力消除，同时降低对中等亲和力il-2受体的亲和力。
24.在优选的实施方式中，所述高亲和力il-2受体是il-2受体的异型三聚体形式，其由受体α亚基、受体β亚基和受体γ亚基组成；所述中等亲和力il-2受体是仅包含il-2受体β亚基和il-2受体γ亚基而无il-2受体α亚基。
25.在优选的实施方式中，与野生型il-2相比，所述il-2突变体与高亲和力il-2受体的结合亲和力降低55％以上，更优选60％以上、65％以上、70％以上、75％以上、80％以上、85％以上、90％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上，最优选所述il-2突变体与高亲和力il-2受体不结合；
26.所述il-2突变体与中等亲和力il-2受体的结合亲和力是野生型il-2与中等亲和力il-2受体的结合亲和力降低10％以上，更优选20％以上、30％以上、40％以上、50％以上、60％以上、70％以上、80％以上、90％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上；最优选地，所述il-2突变体与中等亲和力il-2受体的结合亲和力于野生型il-2与中等亲和力il-2受体的结合亲和力降低。
27.在优选的实施方式中，所述il-2突变体保留激活肿瘤免疫细胞，包括但不限于t细胞和nk细胞的增殖作用。
28.在具体的实施方式中，相比于野生型il-2，所述il-2突变体的氨基酸残基发生突变，从而影响与il-2受体的结合。
29.在具体的实施方式中，所述il-2突变体在对应于野生型il-2的42位、44位的氨基酸残基发生突变。
30.在具体的实施方式中，所述il-2突变体在对应于野生型il-2的以下一个或多个位点发生氨基酸残基突变：42和44。
31.在优选的实施方式中，所述il-2突变体在对应于野生型il-2的42位发生突变：f42n,f42a，f42g，f42q，f42e，f42d，f42p，f42s，f42t，f42k，f42r，f42v。
32.在优选的实施方式中，所述il-2突变体在对应于野生型il-2的44位发生突变：f44t，f44a，f44g，f44q，f44e，f44d，f44p，f44s，f44n,f44k，f44r，f44v。
33.在优选的实施方式中，所述il-2突变体消除了o糖位点。
34.在优选的实施方式中，所述il-2突变体在对应于野生型il-2的3位发生突变，从而消除o糖位点。
35.在优选的实施方式中，所述il-2突变体在对应于野生型il-2蛋白的3位发生以下氨基酸残基突变：t3a、t3g、t3q、t3e、t3n、t3d、t3r、t3k和t3p；优选t3a。
36.在优选的实施方式中，所述il-2突变体突变了125位cys位点：c125l、c125s、c125a；优选c125s。在优选的实施方式中，非il-2功能部分选自下组：
37.在第三方面，本发明提供一种融合蛋白或缀合物，所述融合蛋白或缀合物包含第一方面或第二方面所述的il-2突变体和非il-2功能部分。
38.在优选的实施方式中，非il-2功能部分选自下组：
39.fc片段，包括但不限于：人igg1、igg2、igg3、igg4的fc片段，及其同源性在90％以上的fc片段突变体；
40.人血清白蛋白(hsa)；
41.抗hsa抗体及其片段；
42.抗白蛋白多肽或抗体；
43.转铁蛋白；
44.人绒毛膜促性腺激素β亚基羧基末端肽(ctp)；
45.类弹性蛋白多肽(elastin-like peptide，elp)；
46.抗原结合部分。
47.细胞受体或配体。
48.在优选的实施方式中，所述融合蛋白中的il-2突变体与非il-2功能部分可以直接连接，也可以通过连接物连接；所述连接物可以是aaa或gs的重复序列，包括但不限于g3s的重复序列或g4s的重复序列；例如(g3s)4。
49.在优选的实施方式中，所述il-2突变体或融合蛋白可以进一步作以下修饰形成缀合物：
50.聚乙二醇修饰(peg化)；
51.聚唾液酸化修饰(psa化)；
52.饱和脂肪酸修饰；
53.透明质酸修饰(hyaluronic acid，ha)；
54.聚氨基酸修饰(proline-alamine-serine polymer，pas化)。
55.在第四方面，本发明提供一种双特异性抗体或三特异性抗体，所述双特异性抗体或三特异性抗体包含第一方面或第二方面所述的il-2突变体和抗体部分。
56.在优选的实施方式中，抗体部分选自下组：
57.fc片段，包括但不限于：人igg1、igg2、igg3、igg4的fc片段，及其同源性在90％以上的fc片段突变体；
58.在优选的实施方式中，所述抗原结合部分是：
59.抗体或其活性抗体片段；
60.fab分子、scfv分子和vhh分子；或
61.在优选的实施方式中，所述双特异性抗体或三特异性抗体中的il-2突变体与非il-2功能部分可以直接连接，也可以通过连接物连接；所述连接物可以是aaa或gs的重复序列，包括但不限于g3s的重复序列或g4s的重复序列；例如(g3s)4。
62.在优选的实施方式中，所述il-2突变体，非il-2功能部分可以与其它细胞因子或肿瘤标志物进行连接，形成三特异性抗体。
63.在第五方面，本发明提供一种多核苷酸，所述多核苷酸编码第一方面或第二方面
所述的il-2突变体，或第三方面所述的融合蛋白或缀合物，或第四方面所述的双特异性抗体或三特异性抗体。
64.在第六方面，本发明提供一种表达载体，所述表达载体包含第五方面所述的多核苷酸。
65.在第七方面，本发明提供一种宿主细胞，所述宿主细胞包含第六方面所述的表达载体，或者所述宿主细胞的基因组整合有第五方面所述的多核苷酸。
66.在优选的实施方式中，所述宿主细胞为真核细胞；优选酵母、昆虫细胞、动物细胞；更优选动物细胞；最优选哺乳动物细胞，例如中国仓鼠卵巢细胞。
67.在第八方面，本发明提供一种药物组合物，所述药物组合物包含第一方面或第二方面所述的il-2突变体，或第三方面所述的融合蛋白或缀合物，或第四方面所述的双特异性抗体或三特异性抗体与药学上可接受的辅料。
68.在第九方面，本发明提供第一方面或第二方面所述的il-2突变体，或第三方面所述的融合蛋白或缀合物，或第四方面所述的双特异性抗体或三特异性抗体在制备用于体外扩增t淋巴细胞、自然杀伤nk细胞或用于治疗个体的疾病的药物的用途。
69.在优选的实施方式中，所述疾病是应用il-2作免疫治疗的疾病。
70.在优选的实施方式中，所述疾病是癌症、免疫疾病、人类免疫缺陷病毒hiv感染、丙型肝炎病毒hcv感染、风湿性关节炎，特应性皮炎等。
71.在优选的实施方式中，所述癌症、系统性红斑狼疮、免疫疾病、糖尿病、人类免疫缺陷病毒hiv感染、丙型肝炎病毒hcv感染、风湿性关节炎，特应性皮炎等通过刺激免疫系统或通过增殖免疫细胞来治疗。
72.应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
73.应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
74.图1il-2突变体及il-2野生型融合蛋白纯化产物sds-page检测图；图中，m：prestained protein ladder；1：il-2-hsa；2：il-2gm17-hsa；
75.图2显示了利用biacore检测的il-2突变体、il-2野生型与il-2rα的结合力，其中il-2gm17-hsa的r最大值为0，il-2-hsa的r最大值为140；
76.图3显示了利用biacore检测的il-2突变体、il-2野生型与il-2rβγ二聚体的结合力；其中il-2gm17-hsa的r最大值为2.5，il-2-hsa的r最大值为17。如图3所示，il-2gm17-hsa相对于il-2-hsa降低了与il-2rβγ二聚体的亲和力；
77.图4显示了白介素-2突变体和野生型il-2刺激nk92细胞增殖情况；
78.图5显示了il-2gm17-hsa及野生型il-2-hsa对nk细胞的增殖情况；
79.图6显示了il-2gm17-hsa及野生型il-2-hsa对treg细胞的增殖情况；和
80.图7a-f显示了本发明所用的序列seq id no:1-6。
具体实施方式
81.发明人经过广泛而深入的研究，出乎意料地发现对il-2多肽作定点突变后发生糖基化修饰的新型il-2突变体或未发生糖基化修饰的新型il-2突变体多肽能够消除il-2蛋白对高亲和力il-2受体的亲和力，并降低所述突变体il-2蛋白对中等亲和力il-2受体的亲和力，同时保留了il-2的生物学活性，可以刺激肿瘤免疫细胞，包括但不限于t细胞和nk细胞增殖，达到治疗的目的。该突变体更适用于融合蛋白、抗体的连缀组合物，通过刺激免疫细胞的增殖达到对肿瘤的抑制或治疗效果。在此基础上完成了本发明。
82.本发明的il-2突变体
83.在本发明中，通过定点突变使得il-2多肽发生氨基酸残基改变，进而改变il-2与其受体的结合能力或亲和力，但能保留生物学活性。本发明的il-2突变体不仅可以更好地刺激肿瘤免疫细胞，包括但不限于t细胞和nk细胞增殖，相比于野生型il-2，其副作用还显著降低，从而能够实现更好的治疗目的。
84.本发明的il-2突变体优选用真核细胞表达，通过细胞培养获得。可以选择酵母，昆虫细胞，动物细胞，也可以选择转基因动物。在具体的实施方式中，所述宿主细胞为真核细胞；优选酵母、昆虫细胞、动物细胞；所述动物细胞可以是哺乳动物细胞，包括但不限于cho细胞、293细胞、sp/20细胞、ns0细胞。
85.当采用酵母细胞或昆虫细胞作为宿主细胞时，可能得到的il-2突变体的糖型是非人的。本领域技术人员知晓可以进一步将非人糖型改造成人糖型。
86.在其它实施方式中，也可以使用原核细菌表达发酵或体外无细胞合成获得il-2突变体。
87.就引入的突变位点数量而言，可以在野生型il-2中的两个位点，42和44位中的任一位点发生氨基酸残基突变。因此，本发明的il-2突变体可以在对应于野生型il-2蛋白的42位发生以下氨基酸残基突变：f42n,f42a，f42g，f42q，f42e，f42d，f42p，f42s，f42t，f42k，f42r，f42v；和/或在对应于野生型il-2蛋白的44位发生以下氨基酸残基突变：f44t，f44a，f44g，f44q，f44e，f44d，f44p，f44s，f44n,f44k，f44r，f44v；
88.优选地，所述il-2突变体在对应于野生型il-2的42位发生选自下组的氨基酸残基突变：f42n,f42a，f42g，f42p，f42s，f42t，f42e，f42d；或者
89.所述il-2突变体在对应于野生型il-2的44位发生选自下组的氨基酸残基突变：f44a，f44g，f44p，f44s，f44t，f44e，f44d。
90.基于本领域的常规作法，也可以消除il-2多肽中原有的o-糖位点，去除o糖不影响il-2生物学活性，o糖结构复杂，分析困难，为了减少生产质控的复杂性，通常可以利用基因工程突变技术消除该糖基化位点。因此，本发明的il-2突变体可以在对应于野生型il-2蛋白的3位发生以下氨基酸残基突变：t3a、t3g、t3q、t3e、t3n、t3d、t3r、t3k和t3p；优选t3a。在il-2基因产物的提纯和复性过程中，如二硫键配错或分子间形成二硫键都会降低il-2的活性。现已有应用点突变，将第125号位半胱氨酸突变为亮氨酸或丝氨基，使只能形成一种二硫键，保证了在il-2复性过程的活性。还有报道用蛋白工程技术生产新型ril-2，将il-2分子第125位半胱氨酸改为丙氨酸，改构后il-2比活性比天然il-2明显增加。因此，本发明的il-2突变体可以在对应于野生型il-2蛋白的125位发生以下氨基酸残基突变：c125l、c125a、c125s；优选c125s。
[0091]“对应于”[0092]
本文所用的术语“对应于”具有本领域普通技术人员通常理解的意义。具体地说，“对应于”表示两条序列经同源性或序列相同性比对后，一条序列与另一条序列中的指定位置相对应的位置。因此，例如，“对应于野生型il-2”表示将某条氨基酸序列与野生型il-2的氨基酸序列进行比对，找到该氨基酸序列上与野生型il-2相对应的位点。
[0093]
本发明的融合蛋白或缀合物
[0094]
基于本发明的il-2突变体，本领域技术人员知晓可以将本发明的il-2突变体与非il-2的其它功能部分制成融合蛋白或缀合物。在本文中，缀合物是指一种水溶性聚合物共价连接突变体il-2多肽的残基。在具体的实施方式中，所述非il-2功能部分包括但不限于：fc片段、人血清白蛋白(hsa)、抗hsa抗体或抗体片段、转铁蛋白、人绒毛膜促性腺激素β亚基羧基末端肽(ctp)、类弹性蛋白多肽(elastin-like peptide，elp)和抗原结合部分，还包括细胞因子，具体为白细胞介素、干扰素、肿瘤坏死因子超家族、集落刺激因子、趋化因子、生长因子等。
[0095]
基于本领域的常规操作，本领域技术人员知晓如何获得包含本发明的il-2突变体的融合蛋白或缀合物。例如，可以将本发明的il-2突变体与其它非il-2功能部分直接连接，也可以通过连接物连接。所述连接物可以是aaa或gs的重复序列，包括但不限于g3s的重复序列或g4s的重复序列；例如(g3s)4。
[0096]
进一步地，还可以对所述il-2突变体或融合蛋白缀合物聚乙二醇修饰(peg化)、聚唾液酸化修饰(psa化)、饱和脂肪酸修饰、透明质酸修饰(hyaluronic acid，ha)或聚氨基酸修饰(proline-alamine-serine polymer，pas化)形成缀合物。
[0097]
本发明的双特异性抗体或三特异性抗体
[0098]
疾病的发生通常由多种致病因素导致，对多个靶点同时进行阻断可能会实现更好的治疗效果，因此双特异性抗体(bispecific antibody，bsab)应运而生。肿瘤免疫疗法是目前治疗肿瘤的新方向。双特异性抗体可结合两种不同的抗原，因而在肿瘤治疗领域的开发前景十分广阔。双特异性抗体最初是利用化学偶联法或杂交瘤杂交法来制备。如今，dna重组技术的迅速发展使得双特异性抗体的结构发生了革命性变化，主要分为含有fc区的igg型和不含fc区的非igg型两大类。igg型双特异性抗体的结构与单克隆抗体类似，蛋白相对分子质量较大，血浆半衰期长。非igg型双特异性抗体的结构形式更加多样，蛋白相对分子质量较小，组织渗透性更强，但血浆半衰期较短。
[0099]
基于本发明的il-2突变体，本领域技术人员知晓可以将本发明的il-2突变体与抗体结构域共价连接。在具体的实施方式中，所述抗体结构域包括但不限于：igg型抗体和非igg型抗体。在优选的实施方式中，所述抗体结构域可以是抗体或其活性抗体片段，fab分子、scfv分子和vhh分子、免疫球蛋白分子、受体蛋白分子或配体蛋白分子；所述免疫球蛋白分子可以是igg分子。
[0100]
基于本领域的常规操作，本领域技术人员知晓如何获得包含本发明的il-2突变体的双特异性抗体。例如，可以将本发明的il-2突变体与其它非il-2功能部分直接连接，也可以通过连接物连接。所述连接物可以是aaa或gs的重复序列，包括但不限于g3s的重复序列或g4s的重复序列；例如(g3s)4。
[0101]
任选的本发明的突变体可以与t细胞表面抗原抗体进行偶连，还可以与肿瘤细胞
表面抗原抗体进行偶连。优选地，本发明的突变体可以与t细胞表面抗原抗体偶连。
[0102]
任选的本发明的突变体可以与t细胞表面抗原抗体进行偶连，形成双特异性抗体，还可以与肿瘤细胞表面抗原抗体进行偶连，形成双特异性抗体。任选的本发明的突变体可以与t细胞表面抗原抗体进行偶连，形成三特异性抗体，还可以与肿瘤细胞表面抗原抗体进行偶连，形成三特异性抗体。任选的本发明的突变体可以与t细胞表面抗原抗体或肿瘤细胞表面抗原抗体进行偶连，形成三特异性抗体。
[0103]
本发明的药物组合物及其给药方式
[0104]
在本发明的il-2突变体的基础上，本发明还提供了药物组合物。在具体的实施方式中，本发明的药物组合物包含本发明的il-2突变体或权利要求5所述的融合蛋白或缀合物或权利要求7所述的双特异性抗体或三特异性抗体以及任选的药学上可接受的辅料。
[0105]
任选地，本发明的组合物进一步包含一种药学上可接受的赋形剂。如果希望的话，可以添加药学上可接受的赋形剂到本发明的il-2突变体多肽、融合蛋白或缀合物、双特异性抗体或三特异性抗体中以形成一种组合物。
[0106]
本发明的il-2突变体的用途以及使用方法
[0107]
如上所述，本发明的il-2突变体能够消除il-2蛋白对高亲和力il-2受体的亲和力并降低所述突变体il-2蛋白对中等亲和力il-2受体的亲和力，同时保留了il-2的生物学活性，从而更好地刺激肿瘤免疫细胞，包括但不限于t细胞和nk细胞增殖。因此，本发明的il-2突变体、融合蛋白、缀合物、双特异性抗体或三特异性抗体、药物组合物可以制备成相应的药物。所述药物可以用于体外扩增t淋巴细胞、自然杀伤nk细胞或治疗利用il-2作免疫治疗的疾病。在具体的实施方式中，所述疾病是癌症；例如，需要通过刺激免疫系统或通过增殖免疫细胞来治疗的癌症。在具体的实施方式中，所述疾病可以是系统性红斑狼疮、免疫疾病、糖尿病、人类免疫缺陷病毒hiv感染、丙型肝炎病毒hcv感染、风湿性关节炎，特应性皮炎等。
[0108]
本发明亦可以作为cat-t、car-nk等细胞治疗过程中体外扩增细胞中替代野生型il-2使用。
[0109]
本发明的优点：
[0110]
1.本发明的il-2突变体蛋白消除了与高亲和力il-2受体的亲和力并降低了与中等亲和力il-2受体的亲和力，同时，保留了il-2的生物学活性；
[0111]
2.相比于现有技术中的其它il-2突变体，本发明的il-2突变体的突变位点极少，仅两个突变点即可达到亲和力降低，并保留生物学活性的作用；
[0112]
3.本发明的il-2突变体蛋白避免了叠加突变降低比活，仅通过两个位点的突变就可影响两个不同受体区域的结合，降低了潜在的免疫原性；
[0113]
4.本发明的il-2突变体便于生产和质量控制，一般不需要体外再修饰的过程，减少步骤提高生产效率；
[0114]
5.本发明的il-2突变体便于与其它分子组成双功能或多功能的融合蛋白或免疫组合物；
[0115]
6.本发明的il-2突变体可以用于免疫治疗，但不会导致天然il-2导致的血管(或毛细管)渗漏综合征(vls)；和
[0116]
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明
而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如sambrook等人，分子克隆：实验室手册(new york:cold spring harbor laboratory press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
[0117]
实施例
[0118]
实施例1.突变体白介素-2(il-2)蛋白的合成
[0119]
1.基因合成
[0120]
将编码白介素-2(il-2)蛋白的突变体氨基酸序列的核苷酸序列通过自动化基因合成的方法获得。实施例中，基因片段末端添加hsa标签有利于纯化，该标签也是一种常见的延长蛋白药物半衰期的手段。基因片段侧翼带有单一限制性内切酶切割位点。所有基因合成序列均设计为具有编码前导肽的5’端dna序列，该前导肽在真核细胞中使蛋白质靶向分泌。
[0121]
突变个数突变位点实施例突变体名称蛋白标签33、42和44il-2gm17(t3a,f42n,f44t)hsa
[0122]
2.质粒构建
[0123]
将合成后的基因亚克隆到ptt5质粒中，方法依照制造商用法说明书使用分子生物学试剂。
[0124]
3.突变体白介素-2(il-2)蛋白的表达
[0125]
将il-2突变体分子命名为il-2gm17-hsa(seq id no:1)及野生型il-2-hsa(seq id no:2)，通过分子克隆手段分别构建至真核表达载体中以制备il-2gm17-hsa和il-2-hsa表达载体。使用freestyle培养基培养的293e细胞进行il-2突变体分子的瞬时转染表达。转染前24小时，在1l细胞培养瓶中接种0.5
×
106细胞/ml的293e细胞150ml，37℃5％co2温箱中120rpm摇床培养。转染时先取150μl的293fectin加入到2.85ml的optimem中，充分混匀后，室温孵育2分钟；同时分别将用于表达的质粒150μg使用optimem稀释至3ml。将上述稀释后的转染试剂及质粒充分混合，室温孵育15分钟，然后将混合物全部加入细胞中，混匀。37℃，5％co2温箱中120rpm摇床培养7天。收集细胞培养上清，将上清用0.22微米的滤膜过滤，然后利用q-hp离子交换层析柱(ge)进行纯化，利用20mm tris 0-500mm nacl，ph8.0线性洗脱，按体积连续收集样品。利用4～20％梯度胶(金斯瑞公司)进行sds-page检测各收集组分，并根据电泳纯度进行合样。在利用sds-page检测合样后纯化蛋白质纯度，结果如图1所示。m泳道为蛋白marker，1泳道为il-2-hsa，7泳道为il-2gm17-hsa。
[0126]
实施例2.受体蛋白的制备
[0127]
为研究il-2突变体分子与il-2rα受体及il-2rβγ异源二聚化受体的结合能力，制备了人il-2rα受体及il-2rβγ异源二聚化受体蛋白。
[0128]
人源il-2rα受体的设计为将il-2rα胞外结构域编码序列与6
×
his tag编码序列相连(seq id no:3)，克隆至真核表达载体中。使用freestyle培养基培养的293e细胞进行il-2rα受体的瞬时转染表达。转染前24小时，在1l细胞培养瓶中接种0.5
×
106细胞/ml的293e细胞150ml，37℃5％co2温箱中120rpm摇床培养。转染时先取150μl的293fectin加入到2.85ml的optimem中，充分混匀后，室温孵育2分钟；同时将用于表达il-2rα受体的质粒150μg使用optimem稀释至3ml。将上述稀释后的转染试剂及质粒充分混合，室温孵育15分钟，然后将混合物全部加入细胞中，混匀，37℃5％co2温箱中120rpm摇床培养7天。收集细胞培养
上清，将上清用0.22微米的滤膜过滤，然后利用ni-nta亲和层析柱(ge)进行纯化，在20mm pb-0.5m nacl-100mm咪唑条件下洗脱。利用4～20％梯度胶(金斯瑞公司)进行sds-page检测纯化蛋白质。
[0129]
人源il-2rβγ异源二聚化受体的设计利用了“knobs into holes”技术，将il-2rβ胞外结构域编码序列与编码“knobs”fc片段连接(seq id no:4)，克隆至真核表达载体中；将il-2rγ胞外结构域编码序列与编码“holes”fc片段连接(seq id no:5)，克隆至真核表达载体中。使用freestyle培养基培养的293e细胞进行il-2rβγ异源二聚化受体的瞬时转染表达。转染前24小时，在1l细胞培养瓶中接种0.5
×
106细胞/ml的293e细胞150ml，37℃，5％co2温箱中120rpm摇床培养。转染时先取150μl的293fectin加入到2.85ml的optimem中，充分混匀后，室温孵育2分钟；同时将用于表达il-2rβγ异源二聚化受体的质粒各75μg使用optimem稀释至3ml。将上述稀释后的转染试剂及质粒充分混合，室温孵育15分钟，然后将混合物全部加入细胞中，混匀，37℃5％co2温箱中120rpm摇床培养7天。收集细胞培养上清，将上清用0.22微米的滤膜过滤，然后利用mabselect sure亲和层析柱(ge)进行纯化，在20mm枸橼酸-枸橼酸纳，ph3.0条件下洗脱，用1m tris base调节ph至中性。利用4～20％梯度胶(金斯瑞公司)进行sds-page检测纯化蛋白质。
[0130]
实施例3.利用biacore检测结合受体的亲和力实验
[0131]
为研究il-2突变体相对于野生型与受体的亲和力，在以下条件下使用重组单体il-2rα亚基通过biacore 8k(ge)测定il-2突变体分子il-2gm17-hsa及野生型il-2-hsa对人il-2rα亚基的亲和力：将人il-2rα亚基固定化于cm5芯片上(190ru)。在25℃在hbs-ep缓冲液中将il-2gm17-hsa及il-2-hsa用作分析物。对于il-2rα，分析物浓度为200nm降至1.526nm(1:2稀释)，流动为30μl/分(结合时间180秒，解离时间300秒)。对于il-2rα，再生用20mm naoh,30ul/min进行10秒。对于il-2rα，使用1:1结合，ri≠0，r最大值＝全局拟合数据。
[0132]
结果如图2所示，il-2gm17-hsa的r最大值为0，il-2-hsa的r最大值为140。il-2gm17-hsa相对于il-2-hsa消除了与il-2rα的亲和力。
[0133]
在以下条件下使用重组il-2rβγ异二聚体通过biacore 8k(ge)测定il-2突变体分子il-2gm17-hsa及野生型il-2-hsa对人il-2rβγ异二聚体的亲和力：将人hil-2rβ,γecd-n-higg1fc固定化于protein a芯片上(400ru)。25℃在hbs-ep缓冲液中将il-2gm17-hsa及il-2-hsa用作分析物。对于il-2rβγ，分析物浓度为200nm降至1.5625nm(1:2稀释)，流动为30μl/分(结合时间180秒，解离时间300秒)。对于il-2rβγ，再生用10mm glycine(ph1.5),30ul/min,30秒。对于il-2rβγ，使用1:1结合，ri≠0，r最大值＝局部拟合数据。
[0134]
结果如图3所示，il-2gm17-hsa的r最大值为2.5，il-2-hsa的r最大值为17。如图3所示，il-2gm17-hsa相对于il-2-hsa降低了与il-2rβγ二聚体的亲和力。因此，il-2gm17-hsa相对于il-2-hsa消除了与il-2rα的亲和力并降低了与il-2rβγ二聚体的亲和力。
[0135]
实施例4.利用nk92细胞进行细胞增殖分析
[0136]
nk92细胞是一株从一位患有急进性非霍奇金淋巴瘤的50岁白人男性外周血单核细胞衍生来的il-2依赖型nk细胞株。其部分细胞表面表达cd25。il-2gm1-hsa(seq id no:6)，该il-2突变体消除了白介素2蛋白对高亲和力il-2受体的亲和力，同时降低了对中等亲和力il-2受体的亲和力。本发明人利用nk92细胞在细胞增殖分析中评估il-2gm17-hsa和
il-2-hsa的活性。
[0137]
收获处于对数生长期的nk-92细胞，用基础培养基mem-α清洗一遍，将其(5000个/孔)与不同浓度的il-2gm17-hsa、il-2gm1-hsa和il-2-hsa在实验培养基(来自gibco(货号32561-037)的mem-α培养基，添加12.5％胎牛血清和12.5％的马血清)中，于37℃、5％二氧化碳培养箱中共培养48h。每孔加入100μl atp检测底物celltiter-glo(来自promega(货号g7571))，于酶标仪(购自molecular devices(型号i3x))下终点法检测全波长荧光值。
[0138]
使用细胞增殖分析测量il-2gm17-hsa和il-2-hsa的活性，并且在图4中示出了结果的概述。所有测试物品均以剂量依赖性方式诱导nk92细胞生长。在细胞增殖倍数相当的情况下，ec
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越大，证明其刺激nk92生长的活性越弱。而这种改变是由于其突变体蛋白影响的与cd25结合所致，而il-2gm1-hsa突变体蛋白保留了通过il-2rβγ异二聚体激活il-2r信号传导，所以在浓度增加后，细胞还是得到了有效增殖。il-2gm1-hsa相对于il-2-hsa刺激nk92细胞增殖的比活为1.07％，证明il-2gm1-hsa对部分表面表达cd25的nk92细胞消除与cd25的结合，由于没有形成il-2rαβγ异三聚体造成刺激作用减弱。il-2gm1-hsa相对于il-2-hsa刺激nk92细胞增殖效应下降了约100倍。il-2gm17-hsa突变体蛋白不仅影响与cd25结合，还减弱了通过il-2rβγ异二聚体激活il-2r信号传导，所以在浓度加大后，细胞还是得到了有效增殖。il-2gm17-hsa相对于il-2-hsa刺激nk92细胞增殖的比活为0.0055％，证明il-2gm17-hsa对部分表面表达cd25的nk92细胞消除与cd25的结合，没有形成il-2rαβγ异三聚体同样造成刺激作用降低。il-2gm17-hsa相对于il-2-hsa刺激nk92细胞增殖效应下降了约10000倍。说明il-2gm17-hsa突变体蛋白减弱了通过il-2rβγ异二聚体激活il-2r信号传导，所以在浓度加大后，细胞还是得到了有效增殖，保留了生物学活性。
[0139]
实施例5.测量il-2突变体诱导pbmc增殖实验
[0140]
采集中国健康人(n＝2)的新鲜血液样品于肝素钠管中并分离pbmc，用rpmi-1640培养基(含10％fbs)将pbmc重悬后接种于48孔板(1*106个/孔)，用不同浓度的il-2gm17-hsa，及野生型il-2-hsa刺激pbmc，于37℃、5％二氧化碳培养箱中共培养6天。用细胞表面和胞内标志物抗体实施facs染色以检测不同细胞群体，样品均通过lsrfortessatm细胞分析仪获得。
[0141]
nk细胞限定为cd3-/cd56 ，而treg细胞限定为cd3 cd4 cd25 foxp3 。
[0142]
与不同浓度的il-2gm17-hsa及野生型il-2-hsa一起温育6天后nk细胞的增殖情况如图5所示。
[0143]
在0-20nm浓度下，il-2gm17-hsa相对于野生型il-2-hsa对nk细胞的刺激增殖作用稍差；在20-1000nm浓度下，il-2gm17-hsa相对于野生型il-2-hsa对nk细胞的刺激增殖作用明显增多。
[0144]
与不同浓度的il-2gm17-hsa及野生型il-2-hsa一起温育6天后treg细胞的增殖情况如图6所示。
[0145]
在0-20nm浓度下，il-2gm17-hsa相对于野生型il-2-hsa对treg细胞的刺激增殖作用略微降低；在20nm和1000nm浓度下，il-2gm17-hsa相对于野生型il-2-hsa对treg细胞的刺激增殖作用明显减弱。
[0146]
在该实验中，il-2gm17-hsa对nk细胞起到明显的刺激增殖作用，对treg细胞起到明显的抑制增殖作用。
[0147]
在本发明提及的所有文献都在本技术中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本技术所附权利要求书所限定的范围。