新型多肽及其制备方法和应用与流程

1.本发明涉及医药领域，具体涉及新型多肽及其制备方法和其在镇痛治疗中的用途。


背景技术：

2.疼痛是临床上最常见的症状之一，也是当今困扰人类健康的严重问题之一。已有大量研究表明，疼痛同时也会导致个体认知和情绪障碍。美国疼痛学报告显示，疼痛在美影响其总人口的35.5％，年疼痛相关直接医疗卫生费用支出和因工作时间丧失所致成本合计超过1000亿美元。
3.疼痛治疗主要有药物治疗，心理疏导以及行为疗法。目前临床用药主要有阿片类镇痛药、非甾体抗炎药物、抗癫痫药、抗抑郁药、局部麻醉药物等。其中，阿片类药物是临床治疗疼痛常用药物，至今仍被认定为最有效的严重疼痛治疗药物，且在疼痛治疗市场上占有主要份额。虽然目前止痛药物的类别及具体品种为数不少，但仍有多达1/4的用药患者不能获得适当的疼痛缓解效果。此外，现有止痛药物也常存在耐受性差和副反应大、长期安全性问题和滥用倾向及使用不便等缺陷，如非甾体类抗炎药物，可能会引起胃肠道，肝功能损伤等毒副作用；而长期使用阿片类药物则会容易导致成瘾，耐药性等。鉴于人口老龄化、慢性疼痛性疾病发病率上升、新止痛药物上市和医患双方对疼痛及其治疗药物认识提高等因素，预计未来疼痛治疗市场仍将持续增长并得到进一步的发展。
4.阿片类药物作为一类经典镇痛药物，广受医学界的关注。阿片类药物的镇痛作用是通过阿片受体发生生物学效应。目前公认的阿片受体主要有四种类型，分别是μ、κ、δ、σ亚型。阿片类受体亚型均属于g蛋白偶联受体家族，主要通过g蛋白参与的信号转导途径进行跨膜信号转导。细胞外的阿片类药物或者配体结合到不同类型的阿片受体，受体被激活，通过激活g蛋白异源三聚体将信号传递到下游的效应器，通过第二信使调节胞膜离子通道和核转录的活性。阿片类受体也可以通过非g蛋白介导的途径发放信号，如β-抑制蛋白的招募到受体的方式。阿片类药物广泛应用于临床，但是此类药物伴有一系列严重副作用，例如呼吸抑制，成瘾性等方面。一些典型的阿片类药物几乎均存在成瘾性，其中吗啡的成瘾性和依赖性最强。
5.因此，寻找更加安全有效，副作用小，不具成瘾性和依赖型的新型阿片类镇痛药物迫在眉睫。


技术实现要素：

6.本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。
7.神经肽在痛觉感受及痛觉调制方面的研究一直是神经科学研究的热点之一。目前，最为熟悉的是内源性阿片肽，该类多肽是哺乳动物体内天然生成的具有阿片样的肽类物质的总称。这一家族主要包含5个大类：内啡肽(endorphin，ep)、脑啡肽(enkephalin，enk)和强啡肽(dynorphin，dyn)、孤啡肽(orphanin-fq，ofq)和内吗啡肽(endomorphin，
em)。这些内源性的多肽具有很大的潜力成为镇痛新药。而大部分的内源性多肽均存在半衰期过短，限制了其在临床上的应用。因此，亟需寻找和内源性阿片肽具有相似生物学活性，但是能在体内长期作用的阿片类多肽药物。
8.本发明基于内源性强啡肽进行序列改造，得到一强啡肽类似物(vac001-3)，通过htrf高通量筛选技术验证了vac001-3具有对κ、δ、μ型阿片受体激活的作用。通过血浆稳定性实验验证了改造后的多肽具有更长的半衰期。本发明提供的内源性阿片肽-强啡肽类似物，能够激活κ、δ、μ型阿片受体，可作为未来靶向阿片受体药物的前体。
9.为此，本发明第一方面提供一种新型多肽。根据本发明的实施例，所述新型多肽的氨基酸序列为yggfarrbrpkckwdnq，其中，a、b和c均独立地为d型氨基酸。
10.氨基酸具有两种不同的构型，即l型和d型，构成天然蛋白质的氨基酸都是l型，而d型氨基酸可以经过人工合成。同一种氨基酸的l型和d型是按照fischer投影式区分的，手性碳原子相连的羧基在上方，氨基在左侧的为l型，氨基在右侧的为d型。本发明提供的新型多肽及其类似物能够激活κ、δ、μ型阿片受体，可作为未来靶向阿片受体药物的前体，并且具有更长的半衰期。
11.根据本发明实施例的新型多肽，还可以具有以下附加技术特征的至少之一：
12.根据本发明的实施例，所述d型氨基酸选自d-亮氨酸、d-异亮氨酸。
13.根据本发明的实施例，所述新型多肽的第五位、第八位以及第十二位的氨基酸可独立地为d-亮氨酸或d-异亮氨酸。
14.根据本发明的实施例，所述新型多肽的氨基酸序列如seq id no:1所示，其中，第五位、第八位以及第十二位的氨基酸均为d型氨基酸。
15.seq id no:1所示的氨基酸序列为yggflrrirpklkwdnq，其中，l为d-亮氨酸，i为d-异亮氨酸。
16.本发明第二方面提供一种制剂。根据本发明的实施例，所述制剂含有第一方面所述的新型多肽和/或其类似物。
17.所述新型多肽类似物是指在新型多肽的基础上进行一些改造，但具有与新型多肽类似的生物学活性，即均能够激活κ、δ、μ型阿片受体。
18.根据本发明的实施例，所述制剂为含有所述新型多肽和/或其类似物的注射剂、缓释剂、片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊或口服液。
19.根据本发明的实施例，所述制剂还包含一种或多种药学上可接受的载体和/或赋形剂。
20.本发明第三方面提供本发明第一方面所述的新型多肽和/或其类似物和/或本发明第二方面所述的制剂在制备镇痛产品中的用途。
21.本发明第四方面提供一种镇痛产品。根据本发明的实施例，所述镇痛产品包含本发明第一方面所述的新型多肽和/或其类似物和/或本发明第二方面所述的制剂。
22.根据本发明的实施例，所述镇痛产品的活性成分是本发明第一方面所述的新型多肽和/或其类似物和/或本发明第二方面所述的制剂。
23.本发明第五方面提供一种药物组合物。根据本发明的实施例，所述药物组合物包含本发明第一方面所述的新型多肽和/或其类似物和/或本发明第二方面所述的制剂。
24.本发明第六方面提供本发明第五方面所述的药物组合物在制备镇痛产品中的用
途。
25.本发明第七方面提供一种靶向阿片受体药物。根据本发明的实施例，所述靶向阿片受体药物的前体包括本发明第一方面所述的新型多肽和/或其类似物。
26.本发明第八方面提供一种延长强啡肽半衰期的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括人工改造强啡肽氨基酸序列，使其氨基酸序列为yggfarrbrpkckwdnq，其中，a、b和c均独立地为d型氨基酸。
27.由于内源性强啡肽在体内的半衰期较短，限制了其在临床上作为镇痛新药的应用。本发明的发明人经过大量的实验探究，创造性的发现一种新型的多肽，其氨基酸序列为yggfarrbrpkckwdnq，其中，a、b和c均独立地为d型氨基酸，该新型多肽基于内源性强啡肽进行序列改造获得，本发明将其命名为vac001-3，并通过htrf高通量筛选技术验证了vac001-3具有对κ、δ、μ型阿片受体激活的作用。通过血浆稳定性实验验证了改造后的多肽具有更长的半衰期。
28.根据本发明实施例的延长强啡肽半衰期的方法，还可以具有以下附加技术特征的至少之一：
29.根据本发明的实施例，所述d型氨基酸选自d-亮氨酸、d-异亮氨酸。
30.本发明中“目标多肽”、“强啡肽类似物”、“vac001-3”均指本发明的发明人创造性发现的新型多肽。
31.本发明基于内源性强啡肽进行序列改造，得到一强啡肽类似物(vac001-3)，通过htrf高通量筛选技术进行目标多肽对阿片受体通道的激活作用，结果表明，vac001-3具有对κ、δ、μ型阿片受体激活的作用，目标多肽能有效的激活阿片受体。同时血浆稳定实验验证了改造后的强啡肽类似物具有更好的血浆稳定性。
32.本发明提供既具有内源性阿片肽相似的生物学活性，有具有延长的半衰期，能在体内长期作用的多肽，可将其用作镇痛药物，应用于临床治疗。
33.本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
34.本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
35.图1显示了利用实施例1中方法制备的强啡肽类似物vac001-3的hplc色谱图；
36.图2显示了利用实施例1中方法制备的强啡肽类似物vac001-3的质谱结果；
37.图3显示了目标多肽对κ型阿片受体的激活作用；
38.图4显示了目标多肽对δ型阿片受体的激活作用；
39.图5显示了目标多肽对μ型阿片受体的激活作用；
40.图6显示了强啡肽类似物vac001-3及野生型vac001的血浆稳定性实验结果。
具体实施方式
41.下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文
no:2所示；δ阿片受体质粒中目的片段，即编码δ阿片受体的核酸序列如seq id no:3所示；μ阿片受体质粒中目的片段，即编码μ阿片受体的核酸序列如seq id no:4所示。分子克隆所用酶切位点均为bamhi和xhoi。
59.2)复苏293t细胞，铺板于6孔板，293t细胞铺板密度30万/孔，次日进行质粒转染；
60.3)转染体系：
61.取出两个ep管，其中一管加入10μl lipo2000(转染试剂)，另一管加入4μg的质粒，然后分别加入250μl omem(培养基)，静置5min，将lipo2000加入到质粒中，混匀静置20min，然后加入到细胞中，该试剂用量为6孔板的1孔的量，κ、δ、μ三种质粒同样操作。
62.过夜转染；
63.4)镜检加药：
64.转染24h后观察，换液后加20μg/ml嘌呤霉素处理，每2天换液一次，换液后加入相应浓度嘌呤霉素培养；
65.5)单克隆筛选：
66.在两轮加药处理后，将6孔板中细胞消化分散，铺板于48孔板进行单克隆筛选，梯度稀释法进行稀释；
67.6)单克隆细胞扩大培养，存留种，后用该稳转细胞株进行camp实验；
68.7)多肽的溶解：
69.1mg vac001-3多肽用466μl无菌水溶解，分装成40μl/管，共9管，冻存于-80℃；
70.8)hek293t(κ)、hek293t(δ)、hek293t(μ)三种细胞进行camp实验
71.a)配制新鲜的dmem/f12 500μm ibmx的培养基；
72.b)处理细胞，吸掉原培养基，加入1ml pbs洗涤，加入1ml非胰酶消化液进行消化(37℃消化3min)，加入1ml上述新鲜培养基，重悬，取出计数，离心，将细胞稀释成30万/ml；
73.c)用上述新鲜的培养基配制14个多肽梯度浓度溶液，最高浓度100μm，10倍浓度进行稀释；
74.d)分细胞，将重悬好的细胞分装于384孔板中，每孔5ul(每孔细胞为1500个)；
75.e)加入配体多肽溶液4ul，每个浓度3个复孔，共14个浓度加一个对照组；
76.f)室温避光37℃孵育30min；
77.g)加入10
×
forskolin 1ul；
78.h)室温避光37℃孵育45min；
79.i)加入两种荧光染料各5ul，室温避光孵育1h；
80.j)酶标仪读数；
81.k)graphpad prism软件进行数据分析，获得附图3-5结果，得出结论。
82.附图3-5结果显示，目标多肽对κ、δ、μ型阿片受体具有明显的激活作用，能够激活κ、δ、μ型阿片受体。
83.实施例3目标多肽的血浆稳定性
84.为了探索目标多肽(vac001-3)的血浆稳定性，进行了如下血浆稳定性实验，实验步骤如下：
85.1)血浆获取
86.选取雌性sd大鼠，大小约250g。腹腔注射10％的水合氯醛(溶解于生理外液中)1ml
进行麻醉处理。等待麻醉药起效之后，可以进行颈动脉取血实验。使用75％的乙醇消毒灭菌，剪开脖颈出的皮肤和肌肉，暴露出气管。使用弯头镊子分离出颈动脉，颈动脉位于气管两侧，有明显的搏动性，可以很容易的分离。接下来使用动脉夹夹住靠近心脏一侧的动脉，阻止血液流动。使用静脉留置针，扎入颈动脉，放开动脉夹，抽取血液。一只大鼠大约可以抽取7-8ml的血液。为了防止血液凝固，抽取的器械都预先使用肝素钠润洗数次。血浆稳定性实验。抽取的血液使用4℃，3000rpm，离心15分钟，收集上清血浆部分，用于血浆稳定性实验。先将血浆预热到37℃，之后在血浆中加入5μm浓度的多肽，分别在0小时，3小时，6小时，9小时，12小时，24小时取样。本实验中分为两组，实验组vac001-3，野生型强啡肽vac001作为对照组。
87.2)多肽的血浆萃取
88.吸取不同时间的血浆样品200μl，加入600μl的乙腈混合均匀，将血浆中的蛋白质完全的沉淀下来。之后使用16000g，室温离心30分钟。此时的血浆中大部分蛋白已经在沉淀中，而多肽则位于上清中。我们取400μl的上清使用离心蒸发浓缩的方法，浓缩样品。这一步主要是为了去除样品中的乙腈。接下来使用40μl的0.1％甲酸水，溶解浓缩样品。就可以进行质谱鉴定。
89.3)质谱鉴定：质谱鉴定使用的waters公司的tof质谱仪器和uplc超高压液相色谱检测。使用是acquity uplc beh色谱柱，检测过程分为两步。第一步是2分钟的多肽结合过程，使用99％的水相，5μl/min的流速，使得多肽结合在c18柱子上，同时也把样品中的盐洗脱下来。结合过程样品是不经过质谱检测的。接下来使用30分钟的梯度洗脱的方式检测多肽。使用流速是5μl/min。使用梯度是10％乙腈至50％的乙腈。
90.结果如附图6所示：实验结果表明野生型强啡肽(vac001)在最初的3个小时内，在血浆中降低了80％，vac001-3在血浆中最初的3小时内降低不到20％。24小时后，vac001在血浆中残余量大约10％。而vac001-3残余量大约为20％。使用logistics曲线进行数据拟合得到，强啡肽vac001在血浆中的半衰期大约在1小时，vac001-3在血浆中的半衰期大约为7小时。结果表明vac001-3的稳定性优于野生型(vac001)。
91.在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
92.尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。