一种从沙门氏菌中分离持留菌的方法与流程

1.本发明涉及微生物学领域、医学领域，具体涉及一种从沙门氏菌中分离持留菌方法。


背景技术：

2.沙门氏菌是一种常见的食源性致病菌，在细菌性食物中毒中，沙门氏菌引起的食物中毒常列榜首，其主要污染肉蛋奶等食品。持留菌是细菌群体中的一小部分，可耐受高倍致死剂量的抗生素，其处于生长缓慢状态或休眠不生长状态，具有一定的异质性，在去除抗生素压力后可恢复生长，但其药物耐受并不是药物敏感性改变引起的且恢复生长后药物敏感性不会发生变化。尽管鸡、牛、羊、虾等饲养环境各不相同，但均易感染沙门氏菌患病。在利用高剂量抗生素治疗沙门氏菌引起的疾病时极容易形成抗生素残留，导致持留菌的形成。在食品抽检时，细菌可能由于未从持留状态恢复出现“漏检”。当我们食用携带“持留菌”的食品后，抗生素代谢后(去除抗生素压力)，持留菌又会恢复生长，爆发毒性对人体造成危害。
3.持留菌非常难以分离、获得和培养，这给持留菌的研究带来了很大的困难；且持留菌本身休眠或者生长缓慢的状态，但在致死浓度药物或致死因素去除或者一定营养条件下，持留菌可以恢复到正常细胞的状态，继续正常生长，恢复后的细胞功能与其他正常细胞没有任何差异。因此，需要开发一种分离持留菌的方法。


技术实现要素：

4.发明目的：本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种从沙门氏菌中分离持留菌方法。
5.为了解决上述技术问题，本发明公开了一种从沙门氏菌中分离持留菌的方法，即利用持留菌对抗生素敏感，而普通细菌对抗生素不敏感的性质去除非持留菌。
6.其中，所述的分离持留菌的方法，具体包括如下步骤：
7.(1)向沙门氏菌菌液中加入环丙沙星母液，培养；
8.(2)将步骤(1)培养所得的菌液离心，所得沉淀物即为含有持留菌的物质，沉淀物中的活菌即为持留菌。
9.步骤(1)中，所述的沙门氏菌菌液的制备方法为将沙门氏菌活化至菌数达到108cfu/ml，用生理盐水将其稀释至菌数为105cfu/ml，再将稀释后的菌液加入到lb肉汤培养基中在37℃培养至菌数为108cfu/ml。
10.步骤(1)中，所述的环丙沙星母液中，环丙沙星的浓度为1000μg/ml以上，优选为1280μg/ml，溶剂为0.3vt％磷酸水溶液。
11.步骤(1)中，控制环丙沙星母液的加入量，使其终浓度为环丙沙星对沙门氏菌最低抑菌浓度的25
‑
100倍，优选为50倍。
12.其中，所述的环丙沙星最低抑菌浓度的检测方法包括如下步骤：
13.(i)通过lb肉汤培养基将环丙沙星药液稀释两倍，混匀，得到第一混合液；通过lb肉汤培养基将第一混合液体积稀释两倍，混匀，得到第二混合液；重复前述步骤，直至第十二混合液；其中，第一混合液～第十二混合液的体积相等；
14.(ii)分别向第一混合液～第十二混合液中加入等体积的沙门氏菌的菌悬液，得到第十三混合液～第二十四混合液；所得第十三混合液～第二十四混合液中环丙沙星的浓度分别为16μg/ml、8μg/ml、4μg/ml、2μg/ml、1μg/ml、0.5μg/ml、0.25μg/ml、0.125μg/ml、0.0625μg/ml、0.032μg/ml、0.016μg/ml、0.008μg/ml；
15.(iii)将第十三混合液～第二十四混合液培养后观察，第十三混合液～第二十四混合液中没有出现沉淀的混合液中，其对应的最低浓度即为环丙沙星的最低抑菌浓度。
16.步骤(i)中，所述的环丙沙星药液为采用无菌水将环丙沙星母液稀释至环丙沙星的浓度为64μg/ml。
17.步骤(ii)中，所述的沙门氏菌的菌悬液的制备方法包括如下步骤：
18.(a)将沙门氏菌菌种活化后的第一菌液于lb肉汤培养基中再次活化，得到第二菌液；
19.(b)用生理盐水将第二菌液稀释至菌数为106±
101cfu/ml；
20.(c)将步骤(b)稀释后的第二菌液加入到lb肉汤培养基中，混匀，即得沙门氏菌的菌悬液。
21.步骤(a)中，第一菌液与lb肉汤培养基的体积比为100μl：40ml；活化时间为1.5
‑
2h。
22.步骤(b)中，用生理盐水将第二菌液稀释五倍梯度稀释两次，得到第一菌悬液和第二菌悬液，从第一菌悬液和第二菌悬液中选择与108cfu/ml最接近的菌悬液；再次用生理盐水稀释两次至106±
101cfu/ml。
23.步骤(c)中，步骤(b)稀释后的第二菌液与lb肉汤培养基的体积比为1:9。
24.步骤(iii)中，所述的培养为37℃恒温培养16
‑
20h。
25.步骤(1)中，所述的培养为37℃、130rpm摇床培养2
‑
6h。
26.有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优势：
27.本发明首次开发了一种沙门氏菌持留菌的分离方法。
附图说明
28.下面结合附图和具体实施方式对本发明做更进一步的具体说明，本发明的上述和/或其他方面的优点将会变得更加清楚。
29.图1为测定环丙沙星mic的流程图。
30.图2为分离持留菌的流程图。
31.图3为对比例1中抗生素不同倍数不同处理时间下的实验结果图。
32.图4为对比例1中50倍延长处理时间下的实验结果图。
具体实施方式
33.以下实施例中，所用的实验器材、化学试剂盒菌种如下：
34.耗材：两块96孔板、2根试管、3个150ml锥形瓶、若干一次性培养皿、一个50ml烧杯、
若干10μl、200μl、1000μl枪头、若干1.5ml离心管、lb肉汤培养基、琼脂粉、0.85％的生理盐水、up水。
35.设备：10μl、200μl、1000μl移液枪各一把、麦氏比浊管、超净工作台、高压灭菌锅、生化培养箱。
36.菌种：鼠伤寒沙门氏菌(atcc 14028广东微生物)
37.抗生素：环丙沙星。
38.实施例1：
39.1、实验准备：
40.(1)配制150ml lb肉汤培养基(1根10ml lb(试管) 3个40ml lb(锥形瓶))，2.4l lb琼脂培养基。
41.(2)配制2000ml生理盐水、1000ml灭菌水、配制1280μg/ml的环丙沙星母液0.3vt％磷酸水溶液置于4℃冰箱保存，保存期不超过6个月。
42.(3)将以上准备的培养基、生理盐水、烧杯、枪头、离心管、试管、锥形瓶等在121℃条件下灭菌15min。
43.2、测定环丙沙星mic，如图1所示
44.(1)菌悬液的配制
45.从4℃冰箱取出保存的沙门氏菌菌种活化16
‑
20h。取100μl活化后的菌液加入40ml lb肉汤培养基活化1.5
‑
2h后，五倍梯度稀释两次(吸取1ml的菌液加入到4ml的0.85wt％的生理盐水中)得到菌悬液，选择108cfu/ml左右的菌悬液(对比0.5麦氏比浊管)，将选好的菌悬液用0.85wt％的生理盐水十倍系列稀释两次后选第二支试管(即浓度约为106cfu/ml左右的菌悬液)，再吸取0.5ml加入到4.5ml lb肉汤培养基中，用枪头混匀待用，得到稀释好的菌悬液。
46.(2)药液的配制
47.从4℃冰箱取出保存的环丙沙星母液(1280μg/ml)，稀释至64μg/ml，即取1ml母液加入19ml无菌水中，得到环丙沙星药液。
48.(3)实验步骤
49.(i)在96孔板每个孔加入lb肉汤培养基100μl。
50.(ii)在a/b/c三排的第一孔加配好的环丙沙星药液100μl，然后对药物进行二倍稀释。即，第一孔中加入药液后用移液枪充分混匀(至少三次以上)使药物与lb肉汤培养基充分混匀，然后吸取100μl加入第二孔再充分吹打使之与肉汤充分混匀，照此重复直至最后一孔，第12列吸出100μl扔掉。
51.(iii)再在每一孔中加入步骤(1)所制备的稀释好的菌悬液100μl,重复做三次(a/b/c三排样品)。则每一孔的抗生素浓度为16μg/ml、8μg/ml、4μg/ml、2μg/ml、1μg/ml、0.5μg/ml、0.25μg/ml、0.125μg/ml、0.0625μg/ml、0.032μg/ml、0.016μg/ml、0.008μg/ml。
52.(iv)de两排为空白对照，即只加培养基，即在同一块板上的g排上做一排阴性对照(仅加空白肉汤不加菌液)和在h排上做一排阳性对照(加菌液不加药液)。
53.(v)将96孔板放入37℃恒温培养箱16
‑
20h后，观察结果。
54.(4)观察实验结果
55.(i)若有菌生长孔板底部会有白色沉淀。
56.(ii)mic值的判定：96孔板上横排中未有沉淀的最后一孔所对应的浓度便为该药的mic值。
57.(iii)观察所做的阴性对照和阳性对照结果阴性为全部未浑浊，阳性为全部浑浊。
58.(iv)记录结果即药物的mic值，本实施例中mic为0.032μg/ml。
59.3、培养沙门氏菌
60.(1)活化沙门氏菌、挑取单菌落在10ml lb肉汤培养基中在37℃、130rpm条件下过夜培养，称为预活化液。
61.(2)取100μl预活化菌液在40ml lb肉汤培养基中37℃培养2小时，达到108cfu/ml，称为活化液。
62.(3)取1μl活化液加入1ml生理盐水稀释至105cfu/ml，取80μl加入40ml lb肉汤培养基(初始菌浓在103cfu/ml左右)中在37℃培养至108cfu/ml(约为6.5h)。
63.(4)该步骤为验证初始浓度：在步骤(3)中取1ml菌液10倍梯度稀释至10
4 105106后，取100μl在lb琼脂培养基涂布并在培养37℃条件下培养24h计数，得到初始菌液浓度约为108cfu/ml左右。
64.4、分离沙门氏菌持留菌，如图2所示
65.(1)将步骤3中(3)中剩余菌液加入50μl环丙沙星母液，使环丙沙星终浓度为50倍mic，在37℃、130rpm摇床中培养4小时，结果得到有5.96log cfu
·
ml
‑1存活的沙门氏菌。
66.(2)取出步骤(1)培养后的菌液1ml，在8000rpm离心10min后，去除上清液，将沉淀物用1ml无菌生理盐水重悬并10倍梯度稀释至10
2 10
3 104后，取100μl在lb琼脂培养基涂布并在培养37℃条件下培养24h计数，得到活菌数即为持留菌的数量约为103cfu/ml。
67.5、验证抗生素敏感性
68.挑取步骤4(2)中的任意稀释梯度的涂布平板中的单菌落进行活化，取100μl活化后的菌液接种至lb液体培养基在37℃、130rpm摇床中培养至108cfu/ml后稀释进行抗生素mic判断(重复实验步骤2)。
69.实验结果为：mic仍然与抗生素处理之前的结果一致为0.032μg/ml，若mic变大则说明该菌性质发生变化可能变成耐药菌从而耐受高倍致死浓度抗生素，未发生变化则认为菌为持留菌，即本表明步骤4(2)中稀释液中的菌为持留菌。
70.6、通过上述步骤，说明通过本实施例所提供的分离方法，其能够稳定的得到较多数量的持留菌，并有效区别耐药菌。
71.对比例1
72.将抗生素倍数和抗生素处理时间进行的对比试验，其他参数同实施例1。
73.如图3和图4所示，在25
‑
100倍mic，时间在2
‑
6小时左右都可以筛选出一定量的持留菌(过低可能得到的不是持留菌，过高得到的持留菌的数量偏低)。但是如果处理时间过长会逐渐杀死持留菌降低分离量(24h内)，或者会使菌发生耐药性突变(24h以后)，造成实验失败。
74.对比例2
75.用本发明的方法分离其他菌种(大肠杆菌和金黄色葡萄球菌)的持留菌，将不同菌种的分离效果进行比较，其他参数同实施例1。
76.通过实验得出大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的环丙沙星mic分别是0.125μg/ml和
0.25μg/ml，都比沙门氏菌的环丙沙星mic(0.032μg/ml)高。最后分离出来的大肠杆菌持留菌的数量约为105～106cfu/ml，而金黄色葡萄球菌持留菌的数量为106cfu/ml，均比分离出来的沙门氏菌持留菌的数量(103cfu/ml)高。这可能是因为环丙沙星对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的杀伤力不强，最后分离出来的活菌里不仅有持留菌还有没有被杀死的菌种，所以分离出来的活菌数比较多。因此本发明的分离持留菌的方法只适用于沙门氏菌。
77.本发明提供了一种从沙门氏菌中分离持留菌方法的思路及方法，具体实现该技术方案的方法和途径很多，以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。本实施例中未明确的各组成部分均可用现有技术加以实现。