基于溴甲基吡嗪的药物偶联物及ADC的制作方法

基于溴甲基吡嗪的药物偶联物及adc
技术领域
1.本发明涉及基于溴甲基吡嗪的药物偶联物及adc。


背景技术：

2.抗体药物偶联物(antibody-drug conjugate，adc)是通过一个化学链接将具有生物活性的小分子药物连接到单抗上，单抗作为载体将小分子药物靶向运输到目标细胞中。在目标细胞中，药物被释放出来，从而实现治疗目的。
3.adc药物结构较为复杂，且不同adc药物设计之间存在较大的差异。即使同一靶点的不同药物，由于识别位点、连接位点、连接子及所连接小分子的不同，其毒性的差异显而易见。


技术实现要素：

4.本发明第一方面提供具有下式i所示结构的化合物：
5.r
1-l
1-l
2-r
2-d
ꢀꢀꢀ(i)6.式中，
7.r1选自以下任一结构式：
[0008][0009]
其中，r6为溴甲基，即ch2br-，o为1或2，波浪线表示与l1的连接位置；
[0010]
l1为-l
a-l
b-，其中la为c1-c6亚烷基、c2-c6亚烯基、c2-c6亚炔基或-(ch2)
p-conh-[ch2ch
2-o]
q-(ch2)
p-；lb不存在，或者为-co-、-nh-、-coo-或-nh-so
2-，或者为：
[0011][0012]
其中，r’和r”各自独立为-(ch2)
p-o-co-或-[ch2ch
2-o]
q-(ch2)
p-o-co-，虚线表示lb与la连接的位置，波浪线表示lb与l2连接的位置；
[0013]
l2为能被病理环境中的酶识别并水解的肽；
[0014]
r2为任选取代的烷二胺基，或为对氨基苄基氧基或其衍生物；
[0015]
d表示药物分子，所述药物分子d通过其自身羟基中的氧或胺基中的氮与式i化合物的其余部分共价连接；
[0016]
各p独立为1-4的整数；和
[0017]
各q独立为1-8的整数。
[0018]
本发明第二方面提供一种抗体药物偶联物，具有下式iii所示的结构：
[0019]
ab-[x-r1’‑
l
1-l
2-r
2-d]mꢀꢀꢀ
(iii)
[0020]
式中：
[0021]
ab为抗体或其抗原结合片段，通过x与r1’
共价连接；
[0022]
x为抗体或其抗原结合片段的半胱氨酸残基中巯基或赖氨酸中的游离氨基与r1’
进行偶联反应后所得的基团；
[0023]
l1、l2、r2和d如本文式i任一实施方案所述；
[0024]
r1’
为下式基团去掉1个或2个br后获得的二价基团：
[0025][0026]
式中，r6为溴甲基，即ch2br-，o为1或2，波浪线表示与l1的连接位置；
[0027]
m为1到8之间的数值。
[0028]
本发明第三方面提供一种药物组合物，所述药物组合物含有本文任一实施方案所述的抗体药物偶联物和药学上可接受的载体。
[0029]
本发明第四方面提供本文任一实施方案所述的化合物在制备抗体药物偶联物中的应用，以及本文任一实施方案所述的抗体药物偶联物在制备治疗或预防癌症的药物中的应用。
[0030]
本文各方面的详细描述及优选方案如本技术各部分所详述。
附图说明
[0031]
图1：化合物1的核磁氢谱。
[0032]
图2：化合物2的核磁氢谱。
[0033]
图3：化合物3的核磁氢谱。
[0034]
图4：化合物4的核磁氢谱。
[0035]
图5：化合物7的核磁氢谱。
[0036]
图6：ln401-20-1的hic图谱。
[0037]
图7：ln401-20-1的sec图谱。
[0038]
图8：ln401-20-2的hic图谱。
[0039]
图9：ln401-20-2的sec图谱。
[0040]
图10：ln401-89-5的hic图谱。
[0041]
图11：ln401-89-5的sec图谱。
[0042]
图12：ln401-89-6的hic图谱。
[0043]
图13：ln401-89-6的sec图谱。
[0044]
图14：ln401-88-5的hic图谱。
[0045]
图15：ln401-88-5的sec图谱。
[0046]
图16：ln401-31-1的hic图谱。
[0047]
图17：ln401-31-1的sec图谱。
[0048]
图18：ln401-31-2的hic图谱。
[0049]
图19：ln401-31-2的sec图谱。
[0050]
图20：ln401-90-5的hic图谱。
[0051]
图21：ln401-90-5的sec图谱。
[0052]
图22：ln401-90-6的hic图谱。
[0053]
图23：ln401-90-6的sec图谱。
[0054]
图24：ln401-90-4的hic图谱。
[0055]
图25：ln401-90-4的sec图谱。
[0056]
图26：抗cd25 adc对表达cd25( )的su-dhl-1，karpas 299t，hdlm-2和l-540和cd25阴性(-)的daudi人类肿瘤细胞进行5天治疗后的剂量反应曲线。
[0057]
图27：抗her2 adc对表达( )skbr-3和hcc1954和her2阴性(-)mda-mb-468人肿瘤细胞经过5天治疗后的剂量反应曲线。
具体实施方式
[0058]
应理解，在本发明范围中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成优选的技术方案。
[0059]
本发明旨在提供一种基于溴甲基吡嗪的药物偶联物，基于经由该溴甲基吡嗪与抗体共价连接而获得的抗体药物偶联物。和wo2013/173391、cn104379168b的双溴甲基苯并吡嗪的偶联方法相比，采用本发明的连接方式具有不同的反应活性，并且吡嗪部分的亲水性比苯并吡嗪更好，相应的合成、偶联也更简单易控制。
[0060]
术语
[0061]
除非另有定义，否则本文所有科技术语具有的涵义与权利要求主题所属领域技术人员通常理解的涵义相同。除非另有说明，本文全文引用的所有专利、专利申请、公开材料通过引用方式整体并入本文。
[0062]
应理解，上述简述和下文的详述为示例性且仅用于解释，而不对本发明主题作任何限制。在本技术中，除非另有具体说明，否则使用单数时也包括复数。必须注意，除非文中另有清楚的说明，否则在本说明书和权利要求书中所用的单数形式包括所指事物的复数形式。还应注意，除非另有说明，否则所用“或”、“或者”表示“和/或”。此外，所用术语“包括”以及其它形式，例如“包含”、“含”和“含有”并非限制性，其可以是开放式、半封闭式和封闭式的。换言之，所述术语也包括“基本上由
…
构成”、或“由
…
构成”之义。
[0063]
可在参考文献(包括carey and sundberg"advanced organic chemistry 4th ed."vols.a(2000)and b(2001),plenum press,new york)中找到对标准化学术语的定义。除非另有说明，否则采用本领域技术范围内的常规方法，如质谱、nmr、ir和uv/vis光谱法和药理学方法。除非提出具体定义，否则本文在分析化学、有机合成化学以及药物和药物化学的有关描述中采用的术语是本领域已知的。可在化学合成、化学分析、药物制备、制剂和递送，以及对患者的治疗中使用标准技术。例如，可利用厂商对试剂盒的使用说明，或者按照本领域公知的方式或本发明的说明来实施反应和进行纯化。通常可根据本说明书中引用和讨论的多个概要性和较具体的文献中的描述，按照本领域熟知的常规方法实施上述技术和方法。在本说明书中，可由本领域技术人员选择基团及其取代基以提供稳定的结构部分和化合物。
[0064]
当通过从左向右书写的常规化学式描述取代基时，该取代基也同样包括从右向左
书写结构式时所得到的在化学上等同的取代基。举例而言，-ch2o-等同于-och
2-。
[0065]
在本文中定义的某些化学基团前面通过简化符号来表示该基团中存在的碳原子总数。例如，c1-c6烷基是指具有总共1至6个碳原子的如下文所定义的烷基。简化符号中的碳原子总数不包括可能存在于所述基团的取代基中的碳。
[0066]
除前述以外，当用于本技术的说明书及权利要求书中时，除非另外特别指明，否则以下术语具有如下所示的含义。
[0067]
在本技术中，术语“卤素”是指氟、氯、溴或碘。
[0068]“羟基”是指-oh基团。
[0069]“羟基烷基”是指被羟基(-oh)取代的如下文所定义的烷基。
[0070]“羰基”是指-c(＝o)-基团。
[0071]“硝基”是指-no2。
[0072]“氰基”是指-cn。
[0073]“氨基”是指-nh2。
[0074]“羧基”是指-cooh。
[0075]“碳氮氨基”指-ch
2-nh-。
[0076]
在本技术中，作为基团或是其它基团的一部分，“烷基”指完全饱和的直链或支链的烃链基，仅由碳原子和氢原子组成、具有例如1至10个(优选为1至8个，更优选为1至6个)碳原子，且通过单键与分子的其余部分连接。烷基包括但不限于甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、2-甲基丁基、2,2-二甲基丙基、正己基、庚基、2-甲基己基、3-甲基己基、辛基、壬基和癸基等。在一些实施方案中，烷基是c1-c4烷基。
[0077]
在本技术中，作为基团或是其它基团的一部分，“烯基”指仅由碳原子和氢原子组成、含有至少一个双键、具有例如2至10个(优选为2至8个，更优选为2至6个，更优选2至4个)碳原子且通过单键与分子的其余部分连接的直链或支链的烃链基团。烯基包括但不限于乙烯基、丙烯基、烯丙基、丁-1-烯基、丁-2-烯基、戊-1-烯基、戊-1,4-二烯基等。
[0078]
在本技术中，作为基团或是其它基团的一部分，“炔基”指仅由碳原子和氢原子组成、含有至少一个三键、具有例如2至10个(优选为2至8个，更优选为2至6个，更优选2至4个)碳原子且通过单键与分子的其余部分连接的直链或支链的烃链基团。炔基包括但不限于乙炔基、丙炔基等。
[0079]
在本技术中，“亚烷基”、“亚烯基”和“亚炔基”指单价的烷基、烯基或炔基再失去1个氢而形成的二价基团，如-ch
2-、-ch2ch
2-、-ch2ch＝ch-、-ch2c≡cch
2-等。
[0080]
在本技术中，作为基团或是其它基团的一部分，“环烷基”指仅由碳原子和氢原子组成的稳定的非芳香族单环烃基。环烷基的环碳原子数通常为3-8个。环烷基的实例包括但不限于环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基和环辛基。
[0081]
在本技术中，作为基团或是其它基团的一部分，“杂环基”指由2至14个碳原子(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14个碳原子)以及1至6个选自氮、氧和硫的杂原子组成的稳定的5元至10元非芳香族环状基团。除非本说明书中另外特别指明，否则杂环基可以为单环或双环的环体系。杂环基可为部分或完全饱和。杂环基可以经由碳原子或者杂原子并通过单键与分子其余部分连接。杂环基的实例包括但不限于：氮杂环丁烷基、吡咯烷基、吗啉基、哌嗪基、高哌嗪基、哌啶基、硫代吗啉基、吡喃基、四氢吡喃基、噻喃基、四氢呋喃基、噁
嗪基、二氧环戊基、四氢异喹啉基、十氢异喹啉基、咪唑啉基、咪唑烷基、喹嗪基、噻唑烷基、异噻唑烷基、异噁唑烷基、二氢吲哚基、八氢吲哚基、八氢异吲哚基和吡唑烷基等。
[0082]
在本技术中，作为基团或是其它基团的一部分，“芳基”意指具有6至14个碳原子(优选具有6至10个碳原子，例如6、7、8、9或10个碳原子)的共轭烃环体系基团。芳基可以为单环或双环的环体系。芳基的实例包括但不限于苯基和萘基等。
[0083]
在本技术中，“芳烷基”是指被上文所定义的芳基所取代的上文所定义的烷基。
[0084]
在本技术中，作为基团或是其它基团的一部分，“杂芳基”意指环内具有1至15个碳原子(优选具有1至10个碳原子，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个碳原子)和1至6个选自氮、氧和硫的杂原子的5元至16元、优选5-10元共轭环系基团。除非本说明书中另外特别指明，否则杂芳基可为单环、双环、三环或更多环的环体系。杂芳基的实例包括但不限于噻吩基、咪唑基、吡唑基、噻唑基、噁唑基、噁二唑基、异噁唑基、吡啶基、嘧啶基、吡嗪基、哒嗪基、苯并咪唑基、苯并吡唑基、吲哚基、呋喃基、吡咯基、三唑基、四唑基、三嗪基、吲嗪基、异吲哚基、吲唑基、异吲唑基、嘌呤基、喹啉基、异喹啉基、二氮萘基、萘啶基、喹噁啉基、蝶啶基、咔唑基、咔啉基、菲啶基、菲咯啉基、吖啶基、吩嗪基、异噻唑基、苯并噻唑基、吡咯并吡啶基、苯并吡咯基、苯并噻吩基、噁三唑基、噌啉基、喹唑啉基、苯硫基、中氮茚基、邻二氮杂菲基、异噁唑基、吩噁嗪基、吩噻嗪基等。
[0085]
在本技术中，基团可任选地被取代。“任选地”表示随后描述的事件或状况可能发生也可能不发生，且该描述同时包括该事件或状况发生和不发生的情况。例如，“任选取代的芳基”表示芳基被取代或未被取代，且该描述同时包括被取代的芳基与未被取代的芳基。本发明权利要求书和说明书部分所述的“任选”的取代基包括但不限于烷基、烯基、炔基、卤素、卤代烷基、卤代环氧基、卤代烯基、卤代炔基、氰基、环烷基-o-、硝基、氨基、任选取代的氨基、烷氧基、环烷基、任选取代的芳基、任选取代的杂芳基、任选取代的环烃基和任选取代的杂环基中的一个或多个。在优选的实施方案中，取代基包括但不限于c1-c6烷基、卤代烷基、环烷基、氨基、c1-c6烷基取代的氨基、卤素、氰基、c3-c8环烷基-o-、芳基和杂芳基中的一个或多个。在本技术中，当被取代时，视被取代的基团的结构，取代基的数量可以是1-5个，如1-3个。例如，苯基可被1-3个选自c1-c6烷氧基、c3-c8环烷基-o-、卤素和氨基的取代基取代。
[0086]
本领域技术人员还应当理解，在下文所述的方法中，中间体化合物官能团可能需要由适当的保护基保护。这样的官能团包括羟基、氨基、巯基及羧酸。合适的羟基保护基包括三烷基甲硅烷基或二芳基烷基甲硅烷基(例如叔丁基二甲基甲硅烷基、叔丁基二苯基甲硅烷基或三甲基甲硅烷基)、四氢吡喃基、苄基等。合适的氨基、脒基及胍基的保护基包括叔丁氧羰基、苄氧羰基等。合适的巯基保护基包括-c(o)-r”(其中r”为烷基、芳基或芳烷基)、对甲氧基苄基、三苯甲基等。合适的羧基保护基包括烷基、芳基或芳烷基酯类。
[0087]
保护基可根据本领域技术人员已知的和如本文所述的标准技术来引入和除去。保护基的使用详述于greene,t.w.与p.g.m.wuts,protective groups in organi synthesis,(1999),4th ed.,wiley中。在一些实施方案中，本技术的保护基团为氨基的保护基团，如boc(叔丁氧羰基)。保护基还可为聚合物树脂。
[0088]
i.药物偶联物
[0089]
本文提供一种溴甲基吡嗪衍生物修饰或偶联的药物。具体而言，本发明的药物偶
联物具有下式i所示的结构：
[0090]r1-l
1-l
2-r
2-d
ꢀꢀꢀ(i)[0091]
式中，
[0092]
r1为可与多肽中的半胱氨酸残基中的巯基或赖氨酸的游离氨基发生反应，从而将式i所示的药物偶联物连接到该多肽的基团；
[0093]
l1为-l
a-l
b-，其中la为c1-c6亚烷基、c2-c6亚烯基、c2-c6亚炔基或-(ch2)
p-conh-[ch2ch
2-o]
q-(ch2)
p-；lb不存在，或者为-co-、-nh-、-coo-或-nh-so
2-，或者为：
[0094][0095]
其中，r’和r”各自独立为-(ch2)
p-o-co-或-[ch2ch
2-o]
q-(ch2)
p-o-co-，虚线表示lb与la连接的位置，波浪线表示lb与l2连接的位置；
[0096]
l2为能被病理环境中的酶识别并水解的肽；
[0097]
r2为任选取代的烷二胺基，或为对氨基苄基氧基或其衍生物；
[0098]
d表示药物分子，所述药物分子d通过其自身羟基中的氧或胺基中的氮与式i化合物的其余部分共价连接；
[0099]
各p独立为1-4的整数；和
[0100]
各q独立为1-8的整数。
[0101]
优选地，式i中，r1选自以下任一结构式：
[0102][0103]
式中，r6为溴甲基，即ch2br-，o为1或2，波浪线表示与l1的连接位置。
[0104]
进一步优选地，r1选自以下基团：
[0105][0106]
式中，波浪线表示与l1连接的位置。
[0107]
优选地，式i中，la为c1-c6亚烷基或-(ch2)
p-conh-[ch2ch
2-o]
q-(ch2)
p-。在一个具体的实施方式中，la为-(ch2)
3-conh-[(ch2)
2-o]
4-(ch2)
2-。
[0108]
优选地，式i中，l1通过lb与l2共价连接；优选地，lb和l2间形成酰胺基。优选地，lb为-co-或
[0109][0110]
在一些优选的实施方案中，l1为*-(ch2)
3-conh-[(ch2)
2-o]
4-(ch2)
2-co-、*-(ch2)
3-co-、*-(ch2)
5-co-或*-(ch2)
3-co-n(-ch2ch
2-oco-)2，*指示与r1的连接位置。
[0111]
式i中，优选地，l2所述的肽为二肽、三肽、四肽或五肽。在一个或多个实施方案中，所述肽中的氨基酸残基选自：缬氨酸、鸟氨酸、赖氨酸、丝氨酸、甘氨酸和瓜氨酸中的一种或多种。在一个或多个实施方案中，所述肽为val-cit、val-orn、val-lys、ser-val-lys、gly-val-lys、ser-val-cit、gly-val-cit、gly-gly-gly-val-lys、gly-gly或gly-gly-val-lys。在一个优选的实施方案中，所述肽为val-cit、gly-gly或val-lys。
[0112]
优选地，所述肽中的一个或多个氨基酸残基被磷酰胆碱基团修饰。示例性的磷酰胆碱基团修饰的氨基酸如下式ii所示：
[0113]r8-l
3-n(r9)-r
10
ꢀꢀꢀꢀ
(ii)
[0114]
式中，r8为磷酰胆碱基团；n代表氨基酸分子上的氮原子；r9为h、c1-c4烷基或-l
3-磷酰胆碱基团；各l3独立为连接基团；r
10
代表氨基酸分子上除所示n原子外的其余部分，所述其余部分任选地被保护基团保护。
[0115]
磷酰胆碱基团可如下式所示：
[0116][0117]
式中，波浪线表示该磷酰胆碱基团与l3连接的位置。
[0118]
各l3独立表示为-l
c-l
d-，其中lc选自c1-c6亚烷基、c2-c6亚烯基或c2-c6亚炔基；ld不存在，或者为羰基、酯基(-coo-)、-o-so
2-或-nh-so
2-；优选地，ld不存在或为羰基；优选地，l3通过ld与所述n共价连接；优选地，ld和所示的n形成酰胺基或碳氮氨基(-ch
2-nh-)；优选地，各l3独立为c1-c6亚烷基或c1-c6亚烷基羰基。
[0119]r10
所述的氨基酸分子选自：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、色氨酸、丝氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、硒半胱氨酸、吡咯赖氨酸和鸟氨酸；优选地，所述氨基酸分子选自：赖氨酸、鸟氨酸、缬氨酸、酪氨酸、谷氨酰胺、丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、亮氨酸、异亮氨酸、苏氨酸、丝氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸和甘氨酸；更优选地，所述氨基酸分子选自：缬氨酸、鸟氨酸、赖氨酸、丝氨酸、甘氨酸和瓜氨酸。更优选地，所述氨基酸分子选自：鸟氨酸、赖氨酸、丝氨酸和甘氨酸。
[0120]
式ii中所述“n”不是氨基酸分子中的芳基、杂芳基或杂环基上的环氮原子。该“n”可以是氨基酸分子中用来形成肽键的氮原子，也可以是氨基酸分子中存在的游离氨基上的氮原子。
[0121]
在一些优选的实施方案中，所述肽为val-lys，其中，lys侧链上的游离氨基上的氮被磷酰胆碱基团修饰。进一步优选地，所述磷酰胆碱修饰的lys中，l3为-ch
2-co-，r9为氢，l3与lys侧链上的游离氨基的氮形成酰胺基。
[0122]
关于磷酰胆碱修饰的氨基酸以及含磷酰胆碱修饰的氨基酸的能被病理环境中的酶识别并水解的肽的更详细内容，可参见cn 202110303888.6，本文将其全部内容以引用的方式纳入本文。优选地，所述磷酰胆碱修饰的氨基酸可以是cn 202110303888.6所公开的ln001至ln010以及ln012至ln025中任一所示的化合物；所述能被病理环境中的酶识别并水解的肽中，氨基酸残基可选自：缬氨酸、鸟氨酸、赖氨酸、丝氨酸、甘氨酸和瓜氨酸中的一种或多种；所述肽中磷酰胆碱基团修饰的氨基酸残基选自：鸟氨酸、赖氨酸、丝氨酸和甘氨酸中的一个或多个；优选地，所述肽选自val-orn、val-lys、ser-val-lys、gly-val-lys、ser-val-cit、gly-val-cit、gly-gly-gly-val-lys和gly-gly-val-lys中的一种或多种，优选地，所述肽中的鸟氨酸、赖氨酸、丝氨酸和甘氨酸中的一个或多个被磷酰胆碱基团修饰。
[0123]
优选地，式i中，所述酶为蛋白水解酶、蛋白酶或肽酶。在一个或多个实施方案中，所述酶选自：半胱氨酸蛋白酶、天冬酰胺蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、谷氨酸蛋白酶、苏氨酸蛋白酶、明胶酶、金属蛋白酶和天冬酰胺肽裂解酶中的一种或多种。特别优选地，所述酶为天冬酰胺内肽酶(legumain)。
[0124]
优选地，式i的r2中，所述对氨基苄基氧基的衍生物具有以下结构：
[0125][0126]
式中，
[0127]
r3为h、卤素、c1-c4烷基、c3-c8环烷基、c2-c4烯基、c2-c4炔基、c3-c8环烯基、c6-14芳基或c6-14芳基c1-4烷基；优选为h或c1-c4烷基，更优选为h；
[0128]
r4为h或c1-c4烷基；优选为h、甲基或乙基；
[0129]
r5不存在，或者为-nr
6-(ch2)
s-nr
7-co-*，其中，s为2或3，r6和r7各自独立为h或c1-c4烷基，*表示与d连接的位置；
[0130]
虚线表示r2与l2连接的位置，波浪线表示r2与d连接的位置。
[0131]
r2所述任选取代的烷二胺基可表示为-nr
6-(ch2)
s-nr
7-，其中，s为2或3，r6和r7各自独立为h或c1-c4烷基。
[0132]
通常，l2与r2之间通过酰胺基连接。
[0133]
式i中，优选地，所述药物选自：mmae、duo-5、dxd、美登素、pnu-159682(cas no.:202350-68-3)、依沙替康、喜树碱、7-乙基-10-羟基喜树碱、拓扑替康、氟脲苷、去氧氟尿苷、阿糖胞苷、依托泊苷、氟达拉滨、卡培他滨、长春新碱、埃坡霉素b、紫杉醇、多烯紫杉醇、柔红霉素、表阿霉素、甲氨蝶呤、吉西他滨、美法仑、尼莫司汀、米托蒽醌、阿霉素和丝裂霉素。优选药物为mmae、美登素、pnu-159682,喜树碱或7-乙基-10-羟基喜树碱。应理解，当所述药物通过其胺基中的氮或羟基中的氧与式i其余部分共价连接时，药物上的连接位置不影响到该药物自身所具有的生物学功能和活性。例如，根据已知的这些药物的活性中心，通过远离活性中心的位置上的氨基或羟基与式i余下部分共价连接。
[0134]
优选地，可与r1共价连接的所述多肽为具有所需生物学活性的多肽，包括但不限于酶和抗体，尤其是本文所述的各种抗体。所述抗体优选为单克隆抗体。
[0135]
优选地，式i化合物为本文化合物1-10。
[0136]
ii.adc
[0137]
本发明的药物偶联物可用于制备抗体药物偶联物(adc)。具体而言，本发明提供下式iii所示的抗体药物偶联物：
[0138]
ab-[x-r1’‑
l
1-l
2-r
2-d]mꢀꢀꢀꢀ
(iii)
[0139]
式中：
[0140]
ab为抗体或其抗原结合片段，通过x与r1’
共价连接；
[0141]
x为抗体或其抗原结合片段的半胱氨酸残基中巯基或赖氨酸中的游离氨基与r1’
进行偶联反应后所得的基团；
[0142]
l1、l2、r2和d如前文任一实施方案所述；
[0143]
r1’
为下式基团去掉1个或2个br后获得的二价或三价基团：
[0144][0145]
式中，r6为溴甲基，即ch2br-，o为1或2，波浪线表示与l1的连接位置；
[0146]
m表示药物抗体比(drug-to-antibody ratio，dar)，为1到8之间的数值。
[0147]
在优选的实施方案中，r1’
为：
[0148][0149]
其中，虚线表示r1’
与ab连接的位置，波浪线表示r1’
与l1连接的位置；
[0150]
l1通过la与r1’
共价连接，通过lb与l2共价连接，其中，la为c1-c6亚烷基或或-(ch2)
p-conh-[ch2ch
2-o]
q-(ch2)
p-，lb为-co-或
[0151][0152]
其中，r’和r”各自独立为-(ch2)
p-o-co-或-[ch2ch
2-o]
q-(ch2)
p-o-co-，虚线表示lb与la连接的位置，波浪线表示lb与l2连接的位置，p为1-4的整数，q为1-8的整数；
[0153]
l2为val-cit、val-orn、val-lys、ser-val-lys、gly-val-lys、ser-val-cit、gly-val-cit、gly-gly-gly-val-lys、gly-gly或gly-gly-val-lys；优选为val-cit；其中，lb与l2之间通过酰胺基连接；优选地，l2中的一个或两个氨基酸残基为本文所述的经磷酰胆碱修饰的氨基酸残基；
[0154]
r2具有以下结构：
[0155][0156]
式中，r3为h或c1-c4烷基；r4为h或c1-c4烷基；r5不存在；虚线表示r2与l2连接的位置，波浪线表示r2与d连接的位置；其中，l2与r2通过酰胺基连接；
[0157]
d所示的药物选自：mmae、duo-5、dxd、美登素、pnu-159682(cas no.:202350-68-3)、依沙替康、喜树碱、7-乙基-10-羟基喜树碱(sn38)、拓扑替康、氟脲苷、去氧氟尿苷、阿糖胞苷、依托泊苷、氟达拉滨、卡培他滨、长春新碱、埃坡霉素b、紫杉醇、多烯紫杉醇、柔红霉素、表阿霉素、甲氨蝶呤、吉西他滨、美法仑、尼莫司汀、米托蒽醌、阿霉素和丝裂霉素；优选为mmae、美登素、pnu-159682，喜树碱或7-乙基-10-羟基喜树碱。
[0158]
本文中，“抗体”具有本领域周知含义，包括具有所需生物活性的任何形式的抗体，如单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、人源化抗体、全人抗体、嵌合抗体和骆驼源化单结构域抗体等。
[0159]“单克隆抗体”是指获自基本均质抗体群的抗体，即组成该群的各个抗体除可少量存在的可能天然存在的突变之外是相同的。单克隆抗体是高度特异性的，针对单一抗原表位。相比之下，常规(多克隆)抗体制备物通常包括大量针对不同表位(或对不同表位有特异性)的抗体。
[0160]“全长抗体”指在天然存在时包含至少四条肽链的免疫球蛋白分子：两条重(h)链和两条轻(l)链通过二硫键互相连接。每一条重链由重链可变区(在本文中缩写为vh)和重链恒定区(在本文中缩写为ch)组成。重链恒定区由3个结构域ch1、ch2和ch3组成。每一条轻链由轻链可变区(在本文中缩写为vl)和轻链恒定区组成。轻链恒定区由一个结构域cl组成。vh和vl区可被进一步细分为具有高可变性的互补决定区(cdr)和其间隔以更保守的称为框架区(fr)的区域。每一个vh或vl区由按下列顺序：fr1、cdr1、fr2、cdr2、fr3、cdr3、fr4从氨基末端至羧基末端排列的3个cdr和4个fr组成。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可介导免疫球蛋白对宿主组织或因子(包括免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一组分(clq))的结合。
[0161]
抗体的“抗原结合片段”包括抗体的片段或衍生物，通常包括亲代抗体的抗原结合区或可变区(例如一个或多个cdr)的至少一个片段，其保持亲代抗体的至少一些结合特异性。抗体结合片段的实例包括但不限于fab，fab'，f(ab')2和fv片段；双抗体；线性抗体；单链抗体分子，例如sc-fv；由抗体片段形成的纳米抗体和多特异性抗体。当抗原的结合活性在摩尔浓度基础上表示时，结合片段或衍生物通常保持其抗原结合活性的至少10％。优选结合片段或衍生物保持亲代抗体的抗原结合亲和力的至少20％、50％、70％、80％、90％、95％或100％或更高。还预期抗体的抗原结合片段可包括不明显改变其生物活性的保守或非保守氨基酸取代(称为抗体的“保守变体”或“功能保守变体”)。术语“结合化合物”是指抗体及其结合片段两者。
[0162]“单链fv”或“scfv”抗体是指包含抗体的vh和vl结构域的抗体片段，其中这些结构域存在于单条多肽链中。fv多肽一般还包含vh和vl结构域之间的多肽接头，其使scfv能够
形成用于抗原结合的所需结构。“结构域抗体”是只含有重链可变区或轻链可变区的免疫功能性免疫球蛋白片段。在某些情况下，两个或更多个vh区与肽接头共价连接形成二价结构域抗体。二价结构域抗体的2个vh区可靶向相同或不同的抗原。“二价抗体”包含2个抗原结合部位。在某些情况下，2个结合部位具有相同的抗原特异性。然而，二价抗体可以是双特异性的。“双抗体”是指具有两个抗原结合部位的小抗体片段，所述片段包含在同一多肽链(vh-vl或vl-vh)中与轻链可变结构域(vl)连接的重链可变结构域(vh)。通过使用短得不允许在同一链的两个结构域之间配对的接头，迫使该结构域与另一链的互补结构域配对并产生两个抗原结合部位。
[0163]
优选地，式iii中，抗体通过该抗体所含的半胱氨酸的巯基或赖氨酸的游离氨基与r1’
相连。因此，x可以是-s-基团或-nh-基团。
[0164]
优选地，式iii中，抗体可以是本领域周知的各类具有所需生物学活性的抗体或其抗原结合片段。例如，抗体或其功能性片段可选自：抗-her2抗体，抗-egfr抗体，抗-vegfr抗体，抗-cd20抗体，抗-cd33抗体，抗-pd-l1抗体，抗-pd-1抗体，抗-ctla-4抗体，抗-tnfα抗体，抗-cd28抗体，抗-4-1bb抗体，抗-ox40抗体，抗-gitr抗体，抗-cd27抗体，抗b-cd40抗体，或抗-icos抗体，抗-cd25抗体，抗-cd30抗体，抗-cd3抗体，抗-cd22抗体，抗-ccr4抗体，抗-cd38抗体，抗-cd52抗体，抗-补体c5抗体，抗rsv的f蛋白，抗-gd2抗体，抗-gitr抗体，抗-糖蛋白受体lib/illa抗体，抗-icos抗体，抗-il2r抗体，抗-lag3抗体，抗-integrinα4抗体，抗-lge抗体，抗-pdgfra抗体，抗-rankl抗体，抗-slamf7抗体，抗-ltigit抗体，抗-tim-3抗体，抗-vegfr2抗体，抗-vista抗体，抗c-met抗体，抗bcma抗体，抗claudin18抗体、抗nectin-4抗体，抗cd79b抗体，和抗trop 2抗体。在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段为抗cd25抗体或其抗结合片段，或为抗-her2抗体或其抗原结合片段。
[0165]
式iii中，与抗体辍合的部分的数量(dar，即m的数值)可以为1到8之间的数值，该数量一般与抗体中二硫键或赖氨酸游离氨基的数量有关，也与参与偶联反应的基团以及偶联反应的条件有关。在一些实施方案中，m的值在3到6之间。本领域技术人员可采用本领域已知的方法，如lc-ms和uv/vis来测定adc的药物抗体比(dar)。
[0166]
在优选的实施方案中，所述式iii化合物为本发明ln401-20-1、ln401-20-2、ln401-89-5，ln401-89-6，ln401-88-5，ln401-31-1，ln401-31-2，ln401-90-5，ln401-90-6和ln401-90-4所示的adc。
[0167]
iii.制备方法
[0168]
可参照本技术实施例所述的方法制备本技术的式i、ii和iii化合物。下文示例性地描述相应的制备方法。
[0169]
式i化合物
[0170]
本发明中，可以从适当取代的甲基吡嗪醇或双甲基吡嗪醇开始，经氧(o)上烷基化后引入带酯基的l1，然后在甲基吡嗪的甲基上引入溴，脱脂基后生成带羧基的r1l1中间体，再和l2r2d或其类似物反应得到式i的化合物。
[0171]
adc的制备
[0172]
可使先还原抗体，然后混合还原的抗体与本发明的式i所示的化合物，室温下静置足够时间后，分离纯化得到本发明的adc。还原抗体的方法为本领域所周知。还原的目的包括使抗体中的二硫键还原成巯基。合适的还原剂包括tcep等。可根据不同的抗体种类选自
不同的还原剂以及缓冲体系。
[0173]
iv.药物组合物、用途和疾病的治疗和预防方法
[0174]
本技术提供一种药物组合物，其含有有效量的本技术任一实施方案所述的adc和药学上可接受的载体。本技术还提供疾病的治疗或预防方法，包括给予需要的对象治疗有效量或预防有效量的本技术的adc或其药物组合物。还提供的是本技术所述式i化合物在制备adc中的应用，以及本文任一实施方案所述的adc在制备治疗或预防疾病的药物中的应用。
[0175]
本文中，“预防”和“预防”包括使病患减少疾病或病症的发生或恶化的可能性；该术语也包括：预防疾病或病症在哺乳动物中出现，特别是当这类哺乳动物易患有该疾病或病症，但尚未被诊断为已患有该疾病或病症时。“治疗”和其它类似的同义词包括以下含义：(i)抑制疾病或病症，即遏制其发展；(ii)缓解疾病或病症，即，使该疾病或病症的状态消退；或者(iii)减轻该疾病或病症所造成的症状。
[0176]
本文中，“给予”指能够将化合物或组合物递送到进行生物作用的所需位点的方法。本领域周知的给药方法均可用于本发明。这些方法包括但不限于口服途径、经十二指肠途径、胃肠外注射(包括肺内、鼻内、鞘内、静脉内、皮下、腹膜内、肌内、动脉内注射或输注)、局部给药和经直肠给药。本领域技术人员熟知可用于本文所述化合物和方法的施用技术，例如在goodman and gilman,the pharmacological basis of therapeutics,current ed.；pergamon；and remington’s,pharmaceutical sciences(current edition),mack publishing co.,easton,pa中讨论的那些。
[0177]
本文中，有效量包括治疗有效量和预防有效量，是指本技术的adc当单独或与其它治疗药物组合给予受试者时，有效预防或改善一种或多种疾病或病况的症状或该疾病或病况的发展的量。治疗有效量还指足以导致症状改善的adc的量，例如治疗、治愈、预防或改善相关医学病况或者提高这类病况的治疗、治愈、预防或改善的速度的量。具体有效量取决于各种因素，例如待治疗的具体疾病，患者的身体状况，如体重，年龄和性别，治疗的持续时间，共同给药的治疗(如果有的话)，以及使用的具体配方。
[0178]
药学上可接受的载体指药物制剂或组合物中除活性成分以外的对受试者无毒的成分。药学上可接受的载体包括但不限于佐剂、载体、赋形剂、助流剂、增甜剂、稀释剂、防腐剂、染料/着色剂、矫味剂、表面活性剂、润湿剂、分散剂、助悬剂、稳定剂、等渗剂、溶剂或乳化剂。可采用本领域周知的药学上可接受的载体来配制本技术的药物组合物。
[0179]
本技术的药物组合物可以配制成各种合适的剂型，包括但不限于片剂，胶囊，注射剂等，并且可以通过任何合适的途径给药以达到预期目的。例如，它可以肠胃外，皮下，静脉内，肌肉内，腹膜内，透皮，口服，鞘内，颅内，鼻内或外给药。药物的剂量可取决于患者的年龄，健康状况和体重，并行进行的治疗，以及治疗的频率等。本技术的药物组合物可以施用于任何有此需要的受试者，例如哺乳动物，尤其是人类。
[0180]
根据adc中的抗体或其抗原结合片段以及药物，本技术的药物组合物可用于治疗或预防相应的疾病。例如，当所述药物是抗癌药时，本技术的药物组合物可用于治疗该抗癌药可治疗的癌症，包括但不限于膀胱，脑，乳腺，子宫颈，结肠-直肠，食道，肾，肝，肺，鼻咽，胰腺，前列腺，皮肤，胃，子宫，卵巢，睾丸和血液中的癌症等。具体而言，癌症包括膀胱癌，肾癌，尿道癌，绒毛膜上皮癌，多形成胶质细胞瘤，黑色素瘤，脑癌，乳腺癌，宫颈癌，结直肠癌，
bp 3.0g)。
[0189]1h nmr(400mhz,cdcl3)δ:8.13(s,1h),7.92(s,1h),4.33(dd,j＝8hz,4hz,2h)2.47(s,3h),2.41(t,j＝8hz,2h),2.06-2.11(m,2h),1.46(s,9h)。
[0190]
ms( )::253.46。
[0191]
制备方法如下：
[0192]
仪器：biotage isolera one中压层析色谱；
[0193]
制备柱：三泰sw220 spherical c18，20-45μm，120a；
[0194]
流动相a：水；流动相b：乙腈；
[0195]
流速：50ml/min。
[0196]
时间(分钟)梯度(b％)0-1020％10-3520％-43％35-6043％60-7543％-95％75-10095％100-11595％-20％
[0197]
步骤2：化合物1-4的合成
[0198]
将化合物1-3(3.0g,11.85mmol,1.0eq)溶解于ccl
4 50ml中，再加入nbs(2.1g,11.85mmol,1.0eq),氮气保护下，加入aibn(1.9g,11.85mmol,1.0eq),加入完毕后，氮气再重新置换3次后，升温至80℃反应，反应2小时后，tlc、lc-ms、hplc检测反应，有目标产品，原料剩余一部分，处理反应。
[0199]
反应液降温至室温30℃左右后，将反应液真空浓缩得油状物粗品，加入乙腈30ml，水15ml，搅拌片刻至溶解，中压反相制备，冻干后得化合物1-4墨绿色油状物2.1g，收率54％。
[0200]1h nmr(400mhz,cdcl3)δ:8.20(s,1h),8.17(s,1h)，4.56(s,2h),4.38(dd,j＝8hz,4hz,2h),2.42(t,j＝8hz,2h),2.10(t,8hz,2h),1.47(s,9h)。
[0201]
ms( )::331.88。
[0202]
制备方法如下：
[0203]
仪器：biotage isolera one中压层析色谱；
[0204]
制备柱：三泰sw220 spherical c18，20-45μm，120a；
[0205]
流动相a：水；流动相b：乙腈；
[0206]
流速：50ml/min。
[0207]
时间(分钟)梯度(b％)0-1520％15-5520％-43％55-9043％90-9543％-95％95-11095％110-11595％-20％
[0208]
步骤3：化合物1-5的合成
[0209]
将化合物1-4(1.8g，5.43mmol，1.0eq)溶于dcm 10ml中，冰浴下控温10-15℃缓慢滴加三氟乙酸2ml,加入完毕后，水浴20-25℃反应3小时后，lc-ms、hplc检测，化合物1-4剩余1.4％，反应结束.反应液真空浓缩，剩余物用dcm 20ml*3夹带，剩余物加入100ml二氯甲烷，用水15ml*4洗涤，有机相用无水硫酸钠干燥后浓缩，得灰色固体1.5g，收率100％。
[0210]1h nmr(400mhz,cdcl3)δ:8.21(s,1h),8.19(s,1h)，4.57(s,2h),4.42(dd,j＝8hz,4hz,2h),2.58(dd,j＝8hz,4hz,2h),2.17(dd,j＝8hz,4hz,2h).
[0211]
ms( )::276.07。
[0212]
步骤4：化合物1的合成
[0213]
化合物1-5(50.0mg,0.1817mmol,1.0eq)、化合物1-6(200.0mg,0.1817mmol,1.0eq)加入单口瓶中，加入8ml thf中，溶解澄清，加入dic(35.0mg,0.2727mmol,1.5eq)。加入完毕后，室温25-30℃反应1小时后，lc-ms、hplc检测反应，有目标产品生成，原料有剩余，处理反应。将反应液真空浓缩得油状物，加入乙腈10ml，水10ml，高压制备，冻干后得化合物1白色固体90mg,收率20％。ms( )::1381.34。化合物1的1h nmr见图1。
[0214]
制备方法如下：
[0215]
仪器：waters2487高压层析色谱；
[0216]
制备柱：gemini 5μm nx-c18，150*50；
[0217]
流动相a：水；流动相b：乙腈；
[0218]
流速：50ml/min。
[0219]
时间(分钟)梯度(b％)0-3030％-90％30-3195％31-3495
[0220]
实施例2：化合物2的合成
[0221]
[0222]
步骤1：化合物2-2的合成
[0223]
将化合物2-1(4.0g，36.33mmol，1.0eq)溶于100ml dmf中，加入nai(5.4g,36.33mmol，1.0eq)、化合物1-2(9.7g，43.59mmol，1.2eq).搅拌下分批加入k2co3(7.5g,54.55mol,1.5eq)，加入完毕后，升温60-65℃反应4小时，hplc监控反应，lc-ms辅助，显示化合物2-1有剩余，但是反应不再进行，停止反应处理。
[0224]
将反应液降至室温，向反应液中加入ea 200ml,然后泼入冰水约300ml中，分液，水相另用ea 100ml*3提取，然后合并有机相，有机相用水100ml*2洗涤。有机层再用无水na2so4干燥后，浓缩得棕色油状物约12g，中压反相制备纯化得棕色油状物化合物2-2(1.3g，收率13％。另得到有n-烷基化副产品2-3-bp 3.2g。
[0225]1h nmr(400mhz,cdcl3)δ:8.01(d,4hz,1h),7.97(s,1h)，4.39(dd,j＝8hz,4hz,2h),2.53(s,3h),2.44(t,j＝8hz,2h),2.12(t,j＝8hz,2h),1.47(s,9h).
[0226]
ms( )::253.40。
[0227]
制备方法如下：
[0228]
仪器：biotage isolera one中压层析色谱；
[0229]
制备柱：三泰sw120 spherical c18，20-45μm，120a；
[0230]
流动相a：水；流动相b：乙腈；
[0231]
流速：30ml/min。
[0232]
时间(分钟)梯度(b％)0-1030％10-1530％-45％15-2545％25-3045-5530-4555％-65％45-7565％75-8065％-85％80-8585％
[0233]
步骤2：化合物2-3的合成
[0234]
将化合物2-2(1.0g,3.95mmol,1.0eq)溶解于ccl
4 15ml中，再加入nbs(0.7g,3.95mmol,1.0eq)，氮气保护下，加入aibn(0.7g,3.95mmol,1.0eq),加入完毕后，氮气再重新置换3次后，升温至80℃反应，反应4小时后,lc-ms、hplc检测反应，有目标产品，原料有剩余，反应不再进行，处理反应。
[0235]
反应液降温至室温30℃左右后，将反应液真空浓缩得粗品，加入乙腈15ml，水5ml，搅拌片刻至溶解，中压反相制备，冻干后得化合物2-3为紫色油状物0.7g，收率54％。
[0236]1h nmr(400mhz,cdcl3)δ:8.11(s,1h),8.09(s,1h)，4.61(s,2h),4.47(dd,j＝8hz,4hz,2h),2.48(dd,j＝4hz,8hz,2h),2.14(dd,j＝8hz,4hz,2h)，1.47(s,9h)。
[0237]
ms( )::276.07。
[0238]
制备方法如下：
[0239]
仪器：biotage isolera one中压层析色谱；
[0240]
制备柱：三泰sw120 spherical c18，20-45μm，120a；
[0241]
流动相a：水；流动相b：乙腈；
[0242]
流速：30ml/min。
[0243]
时间(分钟)梯度(b％)0-1030％10-1230％-45％12-2245％22-2445-5524-4055％40-4455％-65％44-7465％74-7665％-85％76-8685％
[0244]
步骤3：化合物2-4的合成
[0245]
将化合物2-3(0.7g，2.11mmol，1.0eq)溶于dcm 20ml中，冰浴下控温10-15℃缓慢滴加三氟乙酸4ml,加入完毕后，水浴20-25℃反应5小时后，lc-ms、hplc检测,原料剩余约1.5％，反应可以结束。
[0246]
反应液真空浓缩，剩余物用dcm 15ml*3夹带，剩余物加入50ml二氯甲烷,用水10ml*3洗涤，有机相用无水硫酸钠干燥后浓缩，得化合物2-4，为紫色固体0.5g，收率86％。
[0247]1h nmr(400mhz,cdcl3)δ:8.125(d,j＝4hz,1h),8.08(s,1h)，4.60(s,2h),4.51(d,j＝4hz,2h),2.48(d,j＝8hz,2h),2.22(d,j＝8hz,2h)。
[0248]
ms( ):276.07。
[0249]
步骤4：化合物2的合成
[0250]
化合物2-4(50.0mg,0.1817mmol,1.0eq)、化合物1-6(200.0mg,0.1817mmol,1.0eq)加入单口瓶中，加入8ml thf中，溶解澄清，加入dic(35.0mg,0.2727mmol,1.5eq).加入完毕后，室温25-30℃反应2小时后，lc-ms、hplc检测反应，有目标产品生成，原料有剩余，处理反应。
[0251]
将反应液真空浓缩得油状物，加入乙腈10ml，水10ml，中压反相制备，冻干得化合物2为白色固体50mg，收率27％。化合物2的1h nmr见图2。
[0252]
ms( ):1381.34。
[0253]
仪器：biotage isolera one中压层析色谱；
[0254]
制备柱：三泰sw40 spherical c18，20-45μm，120a；
[0255]
流动相a：水；流动相b：乙腈；
[0256]
流速：25ml/min。
[0257]
[0258][0259]
实施例3：化合物3的合成
[0260][0261]
步骤1：化合物3-3的合成
[0262]
将化合物3-1(4.0g，32.22mmol，1.0eq)、化合物3-2(5.2g，32.22mmol，1.0eq)、pph3(10.1g，38.66mmol，1.2eq)溶于200ml thf中，冰浴降温至5℃左右，滴加diad(7.8g,38.66mmol，1.2eq)，滴加完毕后，保温0-10℃反应2小时，hplc检测，化合物3-1反应完全，将反应液浓缩制砂，ea/pe＝30/100柱分，得到化合物3-3，为黄色油状物(7.5g，收率88％)。
[0263]1h nmr(400mhz,cdcl3)δ:7.93(s,1h),4.32(dd,j＝8hz,4hz,2h),2.45(s,3h),2.43(s,3h),2.40-2.42(m,2h),2.06-2.11(m,2h)，1.47(s,9h)。
[0264]
ms( )::267.05。
[0265]
步骤2：化合物3-4的合成
[0266]
将化合物3-3(2.0g,7.51mmol,1.0eq)溶解于ccl4 50ml中，再加入nbs(2.8g,15.77mmol,2.1eq)，氮气保护下，加入aibn(0.6g,7.51mmol,1.0eq)，加入完毕后，氮气再重新置换3次后，升温至75℃反应，反应2小时后,lc-ms、hplc检测反应，有目标产品，原料化合物3-3消失，处理反应。
[0267]
反应液降温至室温30℃左右后，将反应液过滤后滤液真空浓缩得粗品，粗品制砂后ea/pe＝3％。得化合物3-4，为黄色油状物(1.1g，收率34.6％)。
[0268]1h nmr(400mhz,cdcl3)δ:8.12(s,1h),4.70(s,2h),4.59(s,2h),4.41(dd,j＝4hz,8hz,2h),2.43(t,8hz,2h),2.10(dd,j＝8hz,4hz,2h)，1.48(s,9h)。
[0269]
ms( ):369.20。
[0270]
步骤3：化合物3-5的合成
[0271]
将化合物3-4(1.0g，2.36mmol，1.0eq)溶于dcm 20ml中，冰浴下控温10-15℃缓慢滴加三氟乙酸4ml，加入完毕后，水浴20-25℃反应5小时后，lc-ms、hplc检测,原料剩余约1.5％，反应可以结束。
[0272]
反应液真空浓缩，剩余物用dcm 15ml*3夹带，剩余物加入100ml二氯甲烷，用水10ml*3洗涤，有机相用无水硫酸钠干燥后浓缩，得化合物3-5，为紫色固体(0.8g，收率93％)。
[0273]1h nmr(400mhz,cdcl3)δ:8.13(s,1h),4.70(s,2h),4.59(s,2h),4.45(dd,j＝4hz,8hz,2h),2.60(t,j＝8hz,2h),2.17(dd,j＝8hz,4hz,2h)，1.48(s,9h)。
[0274]
ms( ):369.20。
[0275]
步骤3：化合物3的合成
[0276]
化合物3-5(100.0mg,0.27mmol,1.0eq)、化合物1-6(300.0mg,0.27mmol,1.0eq)加入单口瓶中，加入20ml thf中，溶解澄清，加入pyaop(283mg,0.54mmol,2.0eq)。加入完毕后，室温20-25℃反应2小时后，lc-ms、hplc检测反应，有目标产品生成，原料有剩余，处理反应。
[0277]
将反应液真空浓缩得油状物，加入乙腈10ml，水10ml，高压反相制备，冻干得化合物3为白色固体90mg，收率23％。化合物3的1h nmr见图3。
[0278]
ms( ):1473.46。
[0279]
制备方法如下：
[0280]
仪器：waters waters2487高压层析色谱；
[0281]
制备柱：gemini 5μm nx-c18，150*50；
[0282]
流动相a：水；流动相b：乙腈；
[0283]
流速：50ml/min。
[0284]
时间(分钟)梯度(b％)0-3010％-90％31-3290％-95％32-3495％-10％
[0285]
实施例4：化合物4的合成
[0286][0287]
步骤1：化合物4-2的合成
[0288]
将化合物4-1(4.8g，38.68mmol，1.0eq)、化合物1-2(10.4g，46.41mmol，1.2eq)、nai(5.8g，38.68mmol，1.0eq)加入到200ml dmf中，分批加入k2co3(8.0g，58.00mmol，1.5eq)，加入完毕后，升温65℃反应5小时，lc-ms、hplc检测，lnd1070-f-1反应完全，将反应降温至室温会后泼入300ml冰水中，ea 200ml*3萃取。合并有机相，并用h2o 100*2洗涤有机相，有机相干燥后制砂柱分，pe-pe:ea＝20:1，收集产品，浓缩后得到化合物4-2，为无色油状物(3.9g。收率37％)。
[0289]1h nmr(400mhz,cdcl3)δ:7.76(s,1h),4.33(dd,j＝8hz,4hz,2h),2.46(s,2h)，2.44(s,2h),2.10(dd,j＝8hz,4hz,2h),1.47(s,9h)。
[0290]
ms( ):267.27。
[0291]
步骤2：化合物4-3的合成
[0292]
将化合物4-2(3.0g,11.27mmol,1.0eq)溶解于ccl
4 120ml中，再加入nbs(4.0g,22.54mmol,2.0eq),氮气保护下，加入aibn(3.7g,55.54mmol,2.0eq)，加入完毕后，氮气再重新置换3次后，升温至85℃反应，反应2小时后,lc-ms、hplc检测反应有大量原料剩余，补加nbs(3.0g,16.90mmol,1.5eq),继续在85℃反应，反应2小时后，lc-ms、hplc检测反应有主要目标产品生成，处理反应。
[0293]
反应液降温至室温20℃左右后，将反应液过滤后滤液真空浓缩得粗品，粗品加入乙腈10ml水5ml后高压制备。冻干得化合物4-3，为深绿色油状物(1.0g，收率22％)。
[0294]1h nmr(400mhz,cdcl3)δ:8.16(s,1h),4.58(s,2h),4.55(s,2h)，4.47(dd,j＝8hz,4hz,2h)，2.47(dd,j＝8hz,4hz,2h)，2.14(t,j＝8hz,2h)，1.47(s,9h)。
[0295]
ms( ):424.72。
[0296]
制备方法如下：
[0297]
仪器：waters 2767高压层析色谱；
[0298]
制备柱：gemini 5μm nx-c18，150*50；
[0299]
流动相a：水；流动相b：乙腈；
[0300]
流速：50ml/min。
[0301]
时间(分钟)梯度(b％)0-3010％-90％31-3290％-95％32-3495％-10％
[0302]
步骤3：化合物4-4的合成
[0303]
将化合物4-3(1.0g，2.36mmol，1.0eq)溶于dcm 10ml中，冰浴下控温10-15℃缓慢滴加三氟乙酸3ml,加入完毕后，水浴20-25℃反应4小时后，lc-ms、hplc检测，原料剩余约1％，反应可以结束。
[0304]
反应液真空浓缩，剩余物用dcm 15ml*3夹带，剩余物加入100ml二氯甲烷,用水10ml*3洗涤，有机相用无水硫酸钠干燥后浓缩，得化合物4-4，为紫色固体(750mg，收率87％)。
[0305]1h nmr(400mhz,cdcl3)δ:8.17(s,1h),4.57(s,2h),4.55(s,2h)，4.49(dd,j＝8hz,4hz,2h)，2.65(t,j＝8hz,2h)，2.18-2.24(m,2h)。
[0306]
ms( ):369.13。
[0307]
步骤4：化合物4的合成
[0308]
化合物4-4(100.0mg,0.27mmol,1.0eq)、化合物1-6(300.0mg,0.27mmol,1.0eq)加入单口瓶中，加入20ml thf中，溶解澄清，加入pyaop(283mg,0.54mmol,2.0eq).加入完毕后，室温20-25℃反应2小时后，lc-ms、hplc检测反应，有目标产品生成，原料有剩余，处理反应。
[0309]
将反应液真空浓缩得油状物，加入乙腈10ml，水10ml，高压反相制备，冻干得化合物4，为白色固体(90mg，收率23％)。化合物4的核磁氢谱见图4。ms( ):1473.46。
[0310]
制备方法如下：
[0311]
仪器：waters高压层析色谱；
[0312]
制备柱：gemini 5μm nx-c18，150*50；
[0313]
流动相a：水；流动相b：乙腈；
[0314]
流速：50ml/min。
[0315]
时间(分钟)梯度(b％)0-3010％-90％31-3290％-95％32-3495％-10％
[0316]
实施例5：化合物5的合成
[0317][0318]
化合物5-2的合成：
[0319]
将化合物5-1(200mg，0.41mmol)和hatu(233mg，0.61mmol)溶于dmf(2ml)，加入dipea(105mg，0.82mmol)，室温搅拌反应30min，加入fmoc-val-lys-pab-oh(373mg，0.41mmol)，室温搅拌反应30分钟，lcms显示原料反应完全。反应液中压反相纯化，流动相乙腈/水，收集冻干得化合物5-2(256mg，产率51％)。ms：795.4。
[0320]
化合物5-3的合成：
[0321]
将化合物5-2(250mg)溶于5ml dmf中，加入dnpc(408mg)及dipea(9mg)。常温反应18小时。反应液中压反相纯化，流动相乙腈/水，收集冻干得化合物5-3(180mg，产率67％)，ms：960.4。
[0322]
化合物5-4的合成：
[0323]
将化合物5-3(170mg)溶于2ml dmf中，依次加入mmae(140mg)、hobt(16mg)及dipea(50mg)，调节碱性至ph值为9～10。常温反应16小时。反应液中压反相纯化，流动相乙腈/水，收集冻干得化合物5-4(130mg，产率47％)，ms：1538.8。
[0324]
化合物5-5的合成：
[0325]
将化合物5-4(130mg)溶于2ml dmf中，加入dea(0.4ml)。常温反应2小时。反应液中
压反相纯化，流动相乙腈/水，收集冻干得化合物5-5(80mg，产率57％)，ms：1316.8。
[0326]
化合物5的合成：
[0327]
将化合物5-5(50mg，0.038mmol)和化合物1-5(16mg，0.057,mmol)加至thf(3ml)中，加入dic(15mg，0.114mmol)。常温反应5小时。高压制备(％乙腈)得到产品化合物5(23mg)，ms：1572.8。
[0328]
实施例6：化合物6的合成
[0329]
[0330][0331]
步骤一：
[0332]
化合物6-1的合成：
[0333]
将fmoc-ade(10g，30.6mmol)和dnpc(18.6g，61.2mmol)溶于100ml dmf，加入dipea(392mg，3.04mmol)，室温搅拌反应16小时，tlc显示原料反应完全，反应液加入500ml 5％柠檬酸水溶液，分别用500ml乙酸乙酯萃取三次，有机相饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥，过硅胶柱纯化，流动相乙酸乙酯：石油醚＝30:70，得6-1(16.7g，产率84％)。
[0334]
步骤二
[0335]
化合物6-2的合成：
[0336]
将化合物6-1(143mg，0.216mmol)，hobt(58mg，0.433mmol)溶于dmf(7ml)中，加入diea(112mg，0.865mmol)，常温搅拌30min，加入化合物5-5(570mg，0.433mmol)。常温反应24小时，lcms检测无原料剩余。
[0337]
步骤三：
[0338]
化合物6-3的合成：
[0339]
加入3ml dea至上述反应体系中，常温搅拌1h。中压反相得到产品125mg，ms:2790.6。
[0340]
步骤四：
[0341]
化合物6的合成：
[0342]
将化合物6-2(50mg，0.018mmol)，化合物1-5(8mg，0.027mmol)加至4ml thf中，加入dic(12mg，0.09mmol。常温反应14小时。高压制备得到15mg产品化合物6，ms：3046.6。
[0343]
实施例7：化合物7的合成
[0344][0345]
步骤一：
[0346]
化合物7-2的合成：将化合物7-1(3g，25mmol)、化合物1-2(5g,30mmol),k2co3(5.3g,37.5mmol)溶于dmf(50ml)中。升温至65℃反应三小时。tlc板检测原料有少量剩余，中止反应。将反应液过滤，加入500ml ea和500ml饱和nacl溶液，有机相洗两遍，有机相加无水硫酸钠干燥，蒸干得粗品6.14g；正相制备，10g的硅胶制砂，用80g的硅胶柱，4％ea:pe下拿到1.69g化合物7-2。
[0347]1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ:7.91(d,j＝8hz,1h),7.78(d,j＝8hz,2h),7.66(t,j＝8hz,1h)，7.58(t,j＝8hz,1h),4.46(t,j＝8hz,2h)，2.56(s,3h)，2.44(t,j＝8hz,2h)，2.01-2.08(m,2h),1.39(s,9h)。ms( ):303.43。
[0348]
步骤二：
[0349]
化合物7-3的合成：将化合物7-2(1.69g，5.6mmol)，nbs(997mg，5.6mmol)和aibn(920mg,5.6mmol)溶于ccl4(20ml)中，升温至80℃反应1小时。tlc板检测原料有少量剩余，中止反应。将反应液直接蒸干得粗品3.61g。正相制备，5g的硅胶制砂，用40g的硅胶柱，3％ea:pe下拿到500mg化合物7-3，为产品，ms：381.29。
[0350]1h nmr(400mhz,cdcl3)δ:8.00(d,j＝8hz,1h),7.84(t,j＝8hz,2h),7.67-7.71(m,1h)，7.57-7.61(m,1h)，4.73(s,2h)，4.62(dd,j＝8hz,4hz2h),，2.53(t,j＝8hz,2h)，2.21(t,j＝8hz,2h)1.48(s,9h)。ms( ):382.23。
[0351]
步骤三：
[0352]
化合物7-4的合成：将化合物7-3(500mg)溶于5ml dcm中，冰浴下加入tfa(1ml)。常温反应16小时。tlc板检测原料没有。将反应液加50ml dcm，用水洗三遍，有机相用无水硫酸钠干燥，直接蒸干得400mg化合物7-4，为产品。
[0353]1h nmr(400mhz,cdcl3)δ:8.01(d,j＝8hz,1h),7.84(t,j＝8hz,2h),7.69(t,j＝8hz,1h)，7.58-7.61(m,1h)，4.72(s,2h)，4.66(dd,j＝8hz,4hz 2h),，2.71(t,j＝8hz,2h)，2.25-2.32(m,2h)。ms( ):326.25。
[0354]
步骤四：
[0355]
化合物11的合成：将化合物1-6(50mg，0.0445mmol)、化合物7-4(21.7mg，0.0667mmol)溶于thf(3ml)中，加入dic(20mg,0.155mmol)。常温反应四小时。高压制备(％乙腈)得到产品化合物12(20mg)。化合物7的核磁氢谱见图5。
[0356]
ms( )::1430.22。
[0357]
制备方法如下：
[0358]
仪器：waters 2487高压层析色谱；
[0359]
制备柱：gemini 5μm nx-c18，150*50；
[0360]
流动相a：水；流动相b：乙腈；
[0361]
流速：50ml/min。
[0362]
时间(分钟)梯度(b％)0-3010％-90％31-3290％-95％32-3495％-10％
[0363]
实施例8：化合物8的合成
[0364][0365]
步骤一：
[0366]
化合物8-4的合成：
[0367]
将化合物8-2(pct patent application no.pct/cn2020/088565)(25.3g，50.0mmol)，化合物8-1(36.1g，50.0mmol))溶于240ml dmf，用恒压滴液漏斗加入dipea(645mg,5mmol)，再加入hobt(7.26g，53.7mmol)，室温搅拌反应18小时，hplc检测发现原料反应完全，生成化合物8-3。向反应液中加入二乙胺(40ml)，继续室温搅拌1小时，hplc检测
发现反应完全。反应液中压反相纯化，流动相乙腈/水，收集冻干得化合物8-4(36.5g，产率81％)。ms：911.4。
[0368]
化合物8-6的合成：
[0369]
将fmoc-peg4-cooh(200mg，0.41mmol)和hatu(233mg，0.61mmol)溶于dmf(2ml)，加入dipea(105mg，0.82mmol)，室温搅拌反应30min，加入化合物8-4(373mg，0.41mmol)，室温搅拌反应30分钟，lcms显示原料反应完全，生成化合物8-5。向反应液中加入二乙胺(0.5ml)，继续室温搅拌1小时，hplc检测发现反应完全。反应液中压反相纯化，流动相乙腈/水，收集冻干得生成化合物8-6(256mg，产率51％)。ms：1158.6。
[0370]
化合物8的合成：
[0371]
将化合物8-6(60mg，0.052mmol)，化合物1-5(57mg，0.207mg)溶于thf(3ml)中，加入dic(20mg,0.155mmol)。常温反应四小时。反相高压制备，流动相乙腈/水。得到产品8(17mg)，ms：1414.5。
[0372]
实施例9：化合物9的合成
[0373][0374]
将化合物lnd1018(100mg，0.127mmol),化合物1-5(52.65mg，0.191mmol)溶于thf(3ml)中，加入dic(64mg,0.508mmol)。常温反应24h。高压制备(％乙腈)得到化合物9(10mg)，ms：1042.61。
[0375]
实施例10：化合物10的合成
3(150mg，产率45％)，ms：1054.5。
[0381]
化合物10-4的合成：
[0382]
将化合物10-3(100mg，0.0947mmol),化合物1-5(39mg，0.142mmol)溶于thf(3ml)中，加入dic(48mg,0.3788mmol)。常温反应1小时。反相高压制备得到产品化合物10(17mg)，ms：1312.7。
[0383]
实施例11：和cd25抗体偶联
[0384]
取cd25抗体0.75ml,14.85mg/ml,共计11mg,加入5.0eq tcep(10mm),37μl，37℃搅拌2小时，加入7.0eq相应的化合物(5mm)，44μl。37℃保温半小时，30kda超滤管置换纯化，最终得到相应的adc：
[0385]
ln401-20-1:(cd25 化合物1)；
[0386]
ln401-20-2:(cd25 化合物2)；
[0387]
ln401-89-5:(cd25 化合物3)；
[0388]
ln401-89-6:(cd25 化合物4)；
[0389]
ln401-88-5:(cd25 化合物7)。
[0390]
根据下表进行hic和sec测试。
[0391]
hic：
[0392][0393][0394]
sec：
[0395]
色谱柱tskgel g3000sw
xl 5μm*7.8mm*300mm流动相200mm pbs 10％ipa ph7.0
进样量10μl(50μg)检测波长280nm柱温25℃流速0.8ml/min洗脱方式等度分析时间30min
[0396]
ln401-20-1的hic和sec图谱分别如图6和7所示；
[0397]
ln401-20-2的hic和sec图谱分别如图8和9所示。
[0398]
ln401-89-5的hic和sec图谱分别如图10和11所示。
[0399]
ln401-89-6的hic和sec图谱分别如图12和13所示。
[0400]
ln401-88-5的hic和sec图谱分别如图14和15所示。
[0401]
ln401-20-1的结构如下所示，其中a为cd25抗体，平均dar＝4.5：
[0402][0403]
ln401-20-2的结构如下所示，其中a为cd25抗体，平均dar＝5.2：
[0404][0405]
ln401-89-5的结构如下所示，其中a为cd25抗体，平均dar＝3.6：
[0406][0407]
ln401-89-6的结构如下所示，其中a为cd25抗体，平均dar＝4.3：
[0408][0409]
ln401-88-5的结构如下所示，其中a为cd25抗体，平均dar＝5.2：
[0410][0411]
实施例12：和her2抗体偶联
[0412]
取her2抗体0.5ml，11.33mg/ml，共计5.67mg，加入5.0eq tcep(10mm)19μl，37℃搅拌2小时，加入7.0eq相应的化合物(5mm)，27μl。37℃保温半小时，30kda超滤管置换纯化，最终得到相应的adc：
[0413]
ln401-31-1(her2 化合物1)；
[0414]
ln401-31-2(her2 化合物2)；
[0415]
ln401-90-5(her2 化合物3)；
[0416]
ln401-90-6(her2 化合物4)；
[0417]
ln401-90-4(her2 化合物7)。
[0418]
采用与实施例12相同的方法进行hic和sec。
[0419]
ln401-31-1的hic和sec图谱分别如图16和17所示；
[0420]
ln401-31-2的hic和sec图谱分别如图18和19所示；
[0421]
ln401-90-5的hic和sec图谱分别如图20和21所示；
[0422]
ln401-90-6的hic和sec图谱分别如图22和23所示；
[0423]
ln401-90-4的hic和sec图谱分别如图24和25所示。
[0424]
ln401-31-1的结构如下所示，其中b为her2抗体，平均dar＝3.6：
[0425][0426]
ln401-31-2的结构如下所示，其中b为her2抗体，平均dar＝4.7：
[0427][0428]
ln401-90-5的结构如下所示，其中b为her2抗体，平均dar＝3.2：
[0429][0430]
ln401-90-6的结构如下图所示，其中b为her2抗体，平均dar＝4.0：
[0431][0432]
ln401-90-4的结构如下所示，其中b为her2抗体，平均dar＝4.1：
[0433][0434]
实施例13：adc抗肿瘤细胞活性测试
[0435]
试剂
[0436]
10mm的毒素小分子的溶液使用100％dmso制备。抗体药物偶联物(adc)的样品均以pbs形式提供。
[0437]
细胞培养
[0438]
活性测试中使用的人源su-dhl-1，daudi，skbr-3，hcc1954和mda-mb-468癌细胞系购自美国type culture collection(atcc；manassas，va)，l-540和hdlm-2是从德国liebniz institut dsmz(mannheim,germany)购买的，而karpas 299t则是从sigma(st.louis,mo).购买的。除了mda-mb-468是在dmem/f:12培养基(gibco；waltham，ma)中常规培养之外，所有细胞系均基于atcc或dsmz的推荐值，在补充有10-20％热灭活胎牛血清(fbs,corning；corning,ny,usa)的rpmi-1640培养基(gibco)中培养。保持在37℃下5％的co2加湿环境中培养。
[0439]
细胞活力测定
[0440]
粘附的肿瘤细胞通过与细胞解离试剂(corning)进行非酶解分离来收获，悬浮细胞系通过以300
×
g离心5分钟收获。将其接种到384孔透明底白壁板中(在12.5μl全培养基中，对于贴壁细胞而言每孔875细胞，对于悬浮细胞而言，为2500细胞/孔)，并在37℃保持2-4小时让细胞黏附。然后将细胞用12.5μl最终浓度为2x的测试样品一式两份处理，然后在完全培养基中连续稀释，将其在37℃下孵育120小时。根据仪器制造商的使用方案，使用细胞生存力测定法(promega；美国威斯康星州麦迪逊)，确定对癌细胞生长的抑制作用。使用tecan spark多模式酶标仪(tecan group ltd.；瑞士曼多夫)测量发
光。
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数据分析
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使用microsoft excel(美国华盛顿州雷德蒙德)用未加测试样品处理的对照将数据归一化，并使用graphpad prism软件(版本8；美国加利福尼亚州拉霍亚)进行分析。使用适合于4参数对数方程的非线性回归分析，从剂量响应曲线得出半数抑制最大有效浓度(ec50)。
[0443]
结果
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ln401-20-1和ln401-20-2对各细胞的抑制效果如下表1和图26所示。如图26所示，ln401-20-1和ln401-20-2均剂量依赖性地抑制表达cd25的su-dhl-1，karpas 299t，l-540和hdlm-2细胞的细胞活力，以及cd25阴性daudi细胞。
[0445]
ln401-31-1和ln401-31-2对人体肿瘤下表的抑制效果如表2和图27所示。
[0446]
表1：抗cd25 adc在人体肿瘤细胞中的ec50值
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表2：抗her2 adc在人体肿瘤细胞中的ec50值
[0450]