UBE3A基因和表达盒及其应用的制作方法

ube3a基因和表达盒及其应用
1.优先权声明
2.本技术依据35u.s.c.
§
119(e)要求2019年5月22日提交的美国临时申请序号62/851,411的权益，其全部内容通过引用并入本文。
3.关于序列表电子递交的声明
4.提供了依据37c.f.r.
§
1.821递交的ascii文本格式的序列表，其命名为5470-867wo_st25.txt,大小为49,256字节，于2020年5月22日生成，并通过efs-web提交，代替纸质副本。本序列表在此通过引用将其公开内容并入本说明书中。
发明领域
5.本发明涉及包含ube3a开放阅读框(orf)序列的多核苷酸、包含其的载体以及使用其向细胞或受试者递送orf并治疗受试者中与ube3a基因的异常表达或ube3a基因产物的异常活性相关的病症(例如天使人综合征)的方法。
6.发明背景
7.天使人综合征(as)是一种累及约1:15,000人的神经发育性病症。as个体一生中有癫痫发作、运动障碍、智力残疾和言语缺失。个体通常在出生后第一年出现共济失调。神经元中功能性ube3a基因的丢失导致as。
8.ube3a位于15号染色体上，且是15q11-q13区域内唯一的基因，其表现出来自母源等位基因的偏倚表达。由于父源印记，父源等位基因在神经元中沉默。因此，母源15q11-13的缺失和母源ube3a的功能丧失突变均导致as(见图1)。损害ube3a蛋白(也称为e6ap泛素蛋白连接酶(e6ap))e3泛素连接酶功能的点突变足以产生全谱as表型，强调了ube3a对于as发病机制的重要性。一致观点是，神经元丢失ube3a导致as。神经胶质不太可能发挥作用，因为与神经元不同，它们双等位基因(biallelically)表达ube3a，且水平非常低。
9.目前尚无针对as有用的特定治疗。罹患as的患者通过支持性对症治疗进行管理。
10.发明概述
11.本发明部分基于优化的能够提供治疗水平的ube3a表达的ube3a基因、表达盒和载体的开发，用于治疗与ube3a错误表达相关的病症，如天使人综合征。本发明的方面通过提供密码子优化的能够提供治疗水平的ube3a表达的ube3a基因、表达盒和载体而克服了本领域中的缺点，用于治疗与ube3a表达相关的病症如as，。
12.因此，本发明的一方面涉及包含人ube3a开放阅读框的多核苷酸，其中所述人ube3a开放阅读框编码人ube3a短亚型和长亚型。
13.本发明的另一方面涉及表达盒，其包括包含人ube3a开放阅读框的多核苷酸和包含本发明的多核苷酸的载体、转化的细胞和转基因动物。
14.本发明的另一方面涉及药物制剂，其在药学上可接受的载体中包含本发明的多核苷酸、表达盒、载体和/或转化的细胞。
15.本发明的另一方面涉及在细胞中表达ube3a开放阅读框的方法，其包括使细胞与本发明的多核苷酸、表达盒和/或载体接触，从而使ube3a开放阅读框在细胞中表达。
16.本发明的另一方面涉及在受试者中表达ube3a开放阅读框的方法，其包括向受试者递送本发明的多核苷酸、表达盒、载体和/或转化的细胞，从而使ube3a开放阅读框在受试者中表达。
17.本发明的另一个方面涉及在需要其的受试者中治疗与ube3a基因的异常表达或ube3a基因产物的异常活性相关的病症的方法，其包括对受试者施用治疗有效量的本发明的多核苷酸、表达盒、载体和/或转化的细胞，使得ube3a开放阅读框在受试者中表达。
18.本发明的另一个方面涉及在需要其的受试者中治疗天使人综合征(as)的方法，其包括对受试者施用治疗有效量的本发明的多核苷酸、表达盒、载体和/或转化的细胞，使得ube3a开放阅读框在受试者中表达。
19.本发明的另一方面涉及本发明的多核苷酸、表达盒、载体和/或转化的细胞在需要其的受试者中治疗与ube3a基因的异常表达或ube3a基因产物的异常活性相关的病症的方法中的用途。
20.本发明的这些和其他方面将在下面对本发明的描述中更详细地阐述。
21.附图简要说明
22.图1显示了ube3a的神经元调节示意图，其中神经元具有ube3a的父源沉默。
23.图2a-2b显示了针对野生型(wt)小鼠、缺乏长ube3a的小鼠(iso2-ko)和缺乏短ube3a的小鼠(iso3-ko)的氟替尔(flurothyl)点燃和再激发的实验设计(图2a)及全身性癫痫发作阈值(gst，图2b)。
24.图3a显示了wt人类和小鼠ube3a亚型的n端氨基酸序列(seq id nos：15-19)。小鼠亚型1(未显示)被截短，且不表达稳定的蛋白质。
25.图3b显示密码子优化的hube3a1》》3开放阅读框的5’dna序列(seq id no：20)(上图)，与所得的hube3a蛋白(seq id no：21)的相应氨基酸残基(下图)比对。长hube3a和短hube3a均在同一阅读框中编码。对不同强度的kozak序列进行工程改造，以偏好从第二个起始密码子(caggatga)开始从hube3a短亚型开始的翻译。
26.图3c显示了描绘用于表达hube3a的长亚型(亚型3)和短亚型(亚型1)的全as基因治疗构建体的示意图(seq id nos：22-24)。
27.图4显示了取自wt和as模型小鼠(ube3a
m-/p
)的ube3a染色矢状面切片，as小鼠表现出神经元ube3a表达几乎完全丧失(jiang等人，neuron,1998:21(4):799-811)。
28.图5显示了检测从小鼠海马mrna逆转录的内源性小鼠ube3a转录物(mube3a，左图)或密码子优化的人ube3a转录物(hube3a-opt，右图)的液滴数字pcr实验的结果。在p1时icv注射媒介物或as基因治疗病毒(php.b/hube3a)后，从成年wt和as小鼠中收集海马。请注意，在基因治疗处理的as aav组中选择性检测hube3a-opt。
29.图6显示了使用同等结合小鼠和人ube3a的ube3a抗体的p9小鼠全脑裂解物的蛋白质印迹，不管亚型如何。在wt样品(最左侧)中，代表短ube3a亚型的主带与紧邻的对应于长ube3a的前场次带并置(长亚型与短亚型的比例为约5:1)。在缺乏短ube3a神经元表达的母源iso3-ko小鼠(最右侧)的样品中，长ube3a:短ube3a的比例降低，能够非常清晰地分辨两个离散的ube3a亚型条带。来自纯合iso3-ko小鼠的样品(左起第二个)仅产生长亚型条带。来自经php.b/hube3a处理的as小鼠的样品(右起第二个)均以约3:1的比例表达短hube3a和长hube3a亚型，从而证明了双亚型方法的可行性。
30.图7a-7b显示了wt和as模型小鼠的免疫组织化学。图7a显示了在p1时icv注射as基因治疗病毒(php.b/hube3a)之后，从处于不同出生后年龄(p10、p15、p25)的小鼠收获的外侧到内侧系列的ube3a染色矢状切片。图7b显示了高倍共焦显微照片中海马ca3区内hube3a基因转移的效率。箭头指示不再表达ube3a的罕见神经元(neun )。ube3a蛋白显示明显的核定位，与短hube3a亚型的显性表达一致。
31.图8显示了hube3a基因转移后亚细胞定位的胞质至核的转移。图a-c显示了as模型小鼠在p1时icv注射php.b/hube3a病毒后，在p10(图a)、p15(图b)和p20(图c)时的ube3a染色层的2/3新皮层。随着发育，可见核中病毒转导的hube3a逐渐积累，忠实地重述如图d-f所示的来自judson等人，j comparative neurology，2014:522(8):1874-1896的内源性ube3a表达的时空模式。
32.图9显示了在出生后第0-2天icv注射媒介物或as基因治疗病毒(php.b/hube3a)的雄性wt和as模型小鼠的每月总体重增加。各实验组(wt 媒介物、wt aav、as 媒介物、as aav)一个月大时的体重在统计学上相似，证明了对hube3a基因转移的良好耐受性且无明显毒性。至2个月，并持续至成年期，在体重增加方面as 媒介物小鼠出现具有统计学上显著的增加。在as aav小鼠中完全挽救了这种表型。
33.图10显示了在出生后第0-2天icv注射媒介物的成年wt和as模型小鼠(wt 媒介物、as 媒介物)或php.b/hube3a as基因治疗病毒的成年wt和as模型小鼠(wt aav、as aav)的行为测试结果。图a显示了实验时间线的示意图。图b总结了测试自主活动的旷场实验。数据以5分钟时间段(左图)显示，并显示为1小时记录时段的活动总和(右图)。如前所报告的，as 媒介物和wt 媒介物小鼠之间无统计学意义的下降，尽管有明显的趋势，在as aav小鼠中似乎未得到挽救。值得注意的是，wt aav小鼠表现出中度高运动性(ube3a过表达的潜在副作用)。图c描述了旋转棒运动性能测定的结果，该试验在两个不同的日期进行：第1天，由三次采集试验组成；第2天，48小时后进行，由2次重新测试试验组成。所有试验持续5分钟。与as 媒介物小鼠不同，as aav小鼠在采集期间显著克服了其运动缺陷，接近wt 媒介物对照组的表现水平，这些在重测期间得以维持。图d显示了弹珠掩埋的结果，这是一种测量自发性挖掘和挖洞行为的测定。as 媒介物小鼠在30分钟的时段中通常掩埋很少的弹珠，表明它们在这种行为学相关行为方面存在严重缺陷。在大多数as aav小鼠中这种表型得到部分(如果不是完全)挽救。图e证明了php.b/hube3a治疗显著改善了as aav组中的筑巢行为(as小鼠严重缺乏的另一先天性行为)。php.b/hube3a治疗的as小鼠将更多可用的筑巢材料加到它们的巢中(左图)，并筑起比其媒介物治疗对应组更高质量的巢。
34.图11显示了在出生后第0-2天icv注射媒介物(wt 媒介物、as 媒介物)或php.b/hube3a as基因治疗病毒(wt aav、as aav)的成年wt和as模型小鼠的氟替尔点燃和再激发测试结果。图a显示了实验时间线的示意图。图b总结了8天氟替尔点燃期及随后第36天的氟替尔再激发期间的肌阵挛性(左图)和全身性癫痫发作(右图)的平均组延迟。as 媒介物小鼠再激发后强烈倾向于具有降低的肌阵挛性癫痫发作阈值(mst)和全身性癫痫发作阈值(gst)。在as aav组中癫痫发作阈值恢复正常，证明了as基因治疗预防癫痫大发作的潜力。
35.图12显示了氟替尔癫痫发作点燃后癫痫发作易感性增强的解剖学相关性。图a显示了背侧海马矢状断面中神经元周围网络(品红色)的wfa染色。齿状回中的wfa荧光平均值定量证实，该结构中的神经元周围网络沉积增强是as 媒介物小鼠独有的。图b显示跨海马
和皮质的矢状断面中星形胶质细胞的gfap染色。海马中强烈染色的星形胶质细胞指示存在反应性星形胶质细胞增生(颞叶癫痫的标志)，且如海马gfap平均荧光定量所示，仅在as 媒介物组中观察到。
36.图13显示了具有wt-kozak序列的编码人ube3a亚型3和亚型1的ube3a orf的wt(天然)编码序列(seq id no:26)。调节各自表达亚型的kozak序列以粗体显示，翻译起始位点用下划线标出。
37.图14显示了具有修饰的kozak序列的编码人ube3a亚型3和亚型1的ube3a orf的wt(天然)编码序列(seq id no:27)。调节各自表达的亚型的kozak序列以粗体显示，翻译起始位点用下划线标出。
38.发明详述
39.下面将更详细地解释本发明。该描述并不旨在详细列举本发明可以实施的所有不同方式，或者可以添加到本发明中的所有特征。例如，关于一种实施方案说明的特征可以并入到其他实施方案中，并且关于特定实施方案说明的特征可以从该实施方案中删除。此外，根据本公开，本文所建议的对多种实施方案的许多变化和添加对本领域的技术人员来说应是明显的，而不脱离本发明。因此，以下说明书旨在说明本发明的一些特定实施例，而不是详尽地具体指定其所有排列、组合和变化。
40.除非上下文另有规定，否则特别意图的是本文所描述的本发明的各种特征可以任意组合地使用。此外，本发明还考虑到，在本发明的一些实施方案中，可以排除或省略本文列出的任何特征或特征的组合。举例来说，如果说明书指出复合物包含组分a、b和c，那么特别意图的是，a、b或c中的任何一种或其组合均可单独或以任何组合被省略和放弃。
41.除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。本文对本发明的描述中使用的术语仅仅是为了描述特定的实施方案，并不旨在限制本发明。
42.核苷酸序列在本文中仅以单链形式，5’到3’方向，从左到右呈现，除非另外特别说明。根据37c.f.r.
§
1.822和既定用途，本文中核苷酸和氨基酸以iupac-iub生物化学命名委员会推荐的方式表示，或(对于氨基酸)以单字母代码或三字母代码表示。
43.除非另有说明，本领域技术人员已知的标准方法可用于生产重组和合成的多肽、抗体或其抗原结合片段、操纵核酸序列、生产转化的细胞、构建raav构建体、修饰的衣壳蛋白、表达aav rep和/或cap序列的包装载体以及瞬时和稳定转染的包装细胞。此类技术对本领域技术人员是已知的。参见例如，sambrook等人，molecular cloning:a laboratory manual第二版(cold spring harbor,ny,1989)；f.m.ausubel等人，current protocols in molecular biology(green publishing associates,inc.and john wiley&sons,inc.,new york)。
44.本文提及的所有出版物、专利申请、专利、核苷酸序列、氨基酸序列和其他参考文献均通过引用全部并入本文。
45.定义
46.如在本发明的描述和所附权利要求书中所使用的，单数形式“一个/种(a，an)”和“所述/该(the)”也包括复数形式，除非上下文另有明确说明。
47.如本文使用的，“和/或”是指并涵盖一个或更多个相关所列项目的任一和所有可
能的组合，以及当在替代方案中解释时无组合(“或”)。
48.而且，本发明还考虑到，在本发明的一些实施方案中，可以排除或省略本文列出的任何特征或特征的组合。
49.此外，当指可测量的值如本发明的化合物或剂的量、剂量、时间、温度等时，本文所用的术语“约”意指包括指定量的
±
10％、
±
5％、
±
1％、
±
0.5％或甚至
±
0.1％的变化。
50.如本文所用，过渡短语“主要由
……
组成”应被解释为包括所列举的材料或步骤以及实质上不影响所要求保护的发明的基本和新型特征的材料或步骤。因此，本文使用的术语“主要由
……
组成”不应被解释为等同于“包括/含(comprising)”。
51.当应用于本发明的多核苷酸或多肽序列时，术语“基本上由
……
组成”(和语法变体)是指这样的多核苷酸或多肽，其由所列举的序列(例如，seq id no)和在所列举的序列的5’和/或3’末端或n末端和/或c末端上的、或在两端之间(例如，在结构域之间)的总共十个或更少(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)的额外核苷酸或氨基酸(使得多核苷酸或多肽的功能没有实质性改变)组成。十个或更少的额外核苷酸或氨基酸的总和包括一起添加的额外核苷酸或氨基酸的总数目。当应用于本发明的多核苷酸时，术语“实质上改变”是指与由所列举的序列组成的多核苷酸的表达水平相比，表达所编码的多肽的能力增加或降低至少约50％或更多。当应用于本发明的多肽时，术语“实质上改变”是指与由所列举的序列组成的多肽的活性相比，生物活性增加或降低至少约50％或更多。
52.本文所用的术语“细小病毒”涵盖细小病毒科(parvoviridae)，包括自主复制的细小病毒和依赖病毒。自主性细小病毒包括细小病毒属(parvovirus)、红病毒属(erythrovirus)、浓病毒属(densovirus)、艾特拉病毒属(iteravirus)和康特拉病毒属(contravirus)的成员。示例性的自主性细小病毒包括但不限于小鼠的微小病毒、牛细小病毒、犬细小病毒、鸡细小病毒、猫泛白细胞减少症病毒、猫细小病毒、鹅细小病毒、h1细小病毒、番鸭细小病毒、蛇细小病毒和b19病毒。其他自主性细小病毒为本领域技术人员所知。参见，例如fields等人，virology，第2卷，第69章(第4版，lippincott-raven publishers)。
53.依赖病毒属包含腺相关病毒(aav)，包括但不限于aav 1型、aav 2型、aav 3型(包括3a和3b型)、aav 4型、aav 5型、aav 6型、aav 7型、aav 8型、aav 9型、aav 10型、aav 11型、aav 12型、aav 13型、禽aav、牛aav、犬aav、山羊aav、蛇aav、马aav和绵羊aav。参见，例如fields等人，virology，第2卷，第69章(第4版，lippincott-raven publishers)；和表1。
54.本发明上下文中的术语“腺相关病毒”(aav)包括但不限于aav 1型、aav 2型、aav 3型(包括3a型和3b型)、aav 4型、aav 5型、aav 6型、aav 7型、aav 8型、aav 9型、aav 10型、aav 11型、禽aav、牛aav、犬aav、马aav和绵羊aav以及现在已知或以后发现的任何其他aav。参见，例如，bernard n.fields等人，virology，第2卷，第69章(第4版，lippincott-raven publishers)。已鉴定了许多其他aav的血清型和分支(参见，例如gao等人，(2004)j.virol.78:6381-6388和表1)，这些血清型和分支也包含在术语“aav”中。
55.本发明的细小病毒颗粒和基因组可以来自但不限于aav。aav和自主性细小病毒的各种血清型的基因组序列，以及天然itr、rep蛋白和衣壳亚单位的序列是本领域已知的。这类序列可在文献或公共数据库(如genbank)中找到。参见，例如，genbank登录号nc_002077、nc_001401、nc_001729、nc_001863、nc_001829、nc_001862、nc_000883、nc_001701、nc_001510、nc_006152、nc_006261、af063497、u89790、af043303、af028705、af028704、j02275、
j01901、j02275、x01457、af288061、ah009962、ay028226、ay028223、ay631966、ax753250、eu285562、nc_001358、nc_001540、af513851、af513852和ay530579；其公开内容通过引用并入本文以教导细小病毒和aav核酸和氨基酸序列。也参见，例如，bantel-schaal等人,(1999)j.virol.73:939；chiorini等人,(1997)j.virol.71:6823；chiorini等人,(1999)j.virol.73:1309；gao等人,(2002)proc.nat.acad.sci.usa 99:11854；moris等人,(2004)virol.33-:375-383；mori等人,(2004)virol.330:375；muramatsu等人,(1996)virol.221:208；ruffing等人,(1994)j.gen.virol.75:3385；rutledge等人,(1998)j.virol.72:309；schmidt等人,(2008)j.virol.82:8911；shade等人,(1986)j.virol.58:921；srivastava等人,(1983)j.virol.45:555；xiao等人,(1999)j.virol.73:3994；国际专利公开号wo 00/28061、wo 99/61601、wo98/11244；和美国专利号6156303；它们的公开内容通过引用并入本文以教导细小病毒和aav核酸和氨基酸序列。也见表1。xiao，x.(1996)，宾夕法尼亚州匹兹堡市匹兹堡大学博士论文“characterization of adeno-associated virus(aav)dna replication and integration”(整体并入本文)中提供了aav1、aav2和aav3 itr序列的早期描述。
[0056]“嵌合”aav核酸衣壳编码序列或aav衣壳蛋白是结合了两个或更多个衣壳序列的多个部分的序列。“嵌合”aav病毒粒子或颗粒包含嵌合aav衣壳蛋白。
[0057]
本文使用的术语“嗜性”是指载体(例如病毒载体)优先但不一定排他地进入特定细胞或组织类型和/或优先但不一定排他地与细胞表面相互作用，该相互作用有助于进入某些细胞或组织类型，任选地并且优选地随后表达(例如转录和任选地翻译)细胞中的载体内容物(例如病毒基因组)携带的序列，例如，对于重组病毒，表达异源核苷酸序列。本领域技术人员应理解，来自病毒基因组的异源核酸序列的转录可以在不存在反式作用因子的情况下启动，例如对于诱导型启动子或以其它方式被调节的核酸序列。在raav基因组的情况下，来自病毒基因组的基因表达可以来自稳定整合的前病毒和/或来自未整合的游离基因，以及病毒核酸在细胞内可能采取的任何其他形式。
[0058]
术语“嗜性特征谱”是指一种或更多种靶细胞、组织和/或器官的转导模式。嵌合aav衣壳的代表性实例具有以有效转导中枢神经系统(cns)细胞而仅低转导外周器官为特征的嗜性特征(参见例如mccown等人的美国专利号9,636,370和gray等人的美国专利公开号2017/0360960)。表达特定嗜性特征谱的载体(例如，病毒载体，例如，aav衣壳)由于其嗜性特征谱(例如，嗜神经性、嗜肝性等)可被称为“嗜
……
性”。
[0059]
表1
[0060]
[0061][0062]
本文所用术语“与ube3a基因异常表达相关的病症”是指由受试者中ube3a基因的表达水平相对于正常受试者或人群中的表达降低或改变引起的疾病、病症、综合征或状况或其症状。
[0063]
本文所用术语“与ube3a基因产物异常活性相关的病症”是指由受试者中ube3a基因产物的活性相对于正常受试者或人群的活性的降低或改变引起的疾病、病症、综合征或状况或其症状。在一些实施方案中，与ube3a基因产物的异常活性相关的病症可以是天使人综合征。
[0064]
天使人综合征(as)是由母源ube3a等位基因缺失或突变引起的单基因病症。在健
康和as患者的神经元中，通过反义dna转录物ube3a-ats使完整父源等位基因沉默，如图1所示意的。有三种人ube3a蛋白亚型(图3a)。最短的(即人亚型1)具有独特的定位到细胞核的能力，且其表达超过了两种长亚型——人亚型2和3，这两种长亚型通过与小鼠长亚型2的n-末端对齐的氨基酸延伸来区分(miao等人，j neuroscience，2013；33(1):327-333)。短亚型缺陷小鼠(小鼠中的亚型3；iso3-ko)已被证明广泛表型模拟as模型小鼠的电生理和行为缺陷(avagliano等人，nat neurosci，2019:22(8):1235-1247)。最近，发明人证明了iso3-ko小鼠与as小鼠相似(gu等人，j clin invest，2019；129(1):163-168)，对氟替尔点燃后的癫痫再激发表现出增强的敏感性。相比之下，携带长ube3a亚型(小鼠中的亚型2；iso2-ko)选择性缺失的互补小鼠模型至今未能表达任何as小鼠表型(图2b；avagliano等人，nat neurosci，2019:22(8):1235-1247)。最近的临床数据同样支持短ube3a至关重要，但显示长ube3a尽管以较低水平表达，但也有助于健康的大脑发育和功能(sadhwani等人，am j med genet a，2018；176(7):1641-1647)。尽管不希望受理论束缚，来自外源添加的表达盒的短ube3a亚型和长ube3a亚型的内源性表达比例可以通过调节控制其翻译的kozak序列的相对强弱来模拟。
[0065]
如本文所用，kozak序列是指包含起始密码子上游、下游的核苷酸以及包括起始密码子(即翻译起始位点)的核苷酸序列。核糖体将kozak序列识别为翻译起始位点。来自已知kozak共有序列(例如gccrccaugg(seq id no:24))的序列变异(例如，通过天然和/或人为修饰)可以改变起始强度(见图3c的kozak共有序列)，其中带下划线的核苷酸表示起始密码子，大写字母表示高度保守的碱基，r表示保守的嘌呤(最常见的是腺嘌呤)，小写字母表示常见但可变的碱基。已知的共有kozak序列是基于大量人mrna的每个位置上最常见核苷酸的共有代表序列；单个基因和/或开放阅读框的天然/野生型kozak序列可能会有所不同。如本领域已知的，dna序列中的胸苷(t)核苷酸对应于(例如转录为)相应mrna中的尿苷(u)核苷酸(例如，对应于mrna aug的dna atg起始密码子等)。本文公开的任何序列应认为对于dna和rna分别公开t和u。
[0066]
如本文所用，病毒载体(例如aav载体)对细胞的“转导”是指载体进入细胞，并通过将核酸掺入病毒载体将遗传物质转移到细胞中，并随后通过病毒载体转移到细胞中。
[0067]
除非另有说明，“有效转导”或“有效嗜性”或类似术语可通过参考合适的阳性或阴性对照(例如，相应地是阳性对照的转导或嗜性的至少约50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％或更多，或相应地是阴性对照的转导或嗜性的至少约110％、120％、150％、200％、300％、500％、1000％或更多)来确定。
[0068]
类似地，通过参考合适的对照，可以确定对于靶组织，病毒是否“未有效地转导”或“无有效嗜性”，或类似的术语。在特定实施方案中，病毒载体未有效转导(即，无有效嗜性)cns外的组织，例如肝、肾、生殖腺和/或生殖细胞。在特定实施方案中，组织(例如，肝)的非期望转导是期望的靶组织(例如，cns细胞)的转导水平的20％或更低、10％或更低、5％或更低、1％或更低、0.1％或更低。
[0069]
术语“5
‘
部分”和“3
‘
部分”是相对术语，用于定义两个或更多个元件之间的空间关系。因此，例如，多核苷酸的“3’部分”表示位于另一片段下游的多核苷酸片段。术语“3’部分”并不意在表示该片段必须位于多核苷酸的3’末端，或者甚至其必须位于多核苷酸的3’那半部分，尽管其可以如此。同样，多核苷酸的“5’部分”表示多核苷酸的一个片段位于另一
片段的上游。术语“5’部分”并不意在表示该片段必须位于多核苷酸的5’末端，或者甚至其必须位于多核苷酸的5’那半部分，尽管其可以如此。
[0070]
如本文使用的，术语“多肽”包括肽和蛋白质，除非另有说明。
[0071]“多核苷酸”、“核酸”或“核苷酸序列”可以是rna、dna或dna-rna杂交序列(包括天然存在和非天然存在的核苷酸)，但优选单链或双链dna序列。
[0072]
术语“调控元件”是指控制核酸序列表达的某些方面的遗传元件。例如，启动子是促进可操作连接的编码区转录起始的调控元件。其他调控元件是剪接信号、多聚腺苷酸化信号、终止信号等。其中存在一种或更多种调控元件的核酸序列或多核苷酸的区域可以称为“调控区域”。
[0073]
如本文所用，关于核酸，术语“可操作连接”是指两个或更多个核酸之间的功能性连接。例如，启动子序列可以被描述为与异源核酸序列“可操作连接”，因为启动子序列启动和/或调节异源核酸序列的转录。在一些实施方案中，可操作连接的核酸序列是连续的和/或在相同的阅读框中。
[0074]
如本文所用，术语“开放阅读框(orf)”是指编码多肽的多核苷酸(例如，基因)部分，并且包括起始多肽转录的起始启动位点(即，kozak序列)。术语“编码区”可以与开放式阅读框互换使用。
[0075]
如本文所用，术语“密码子优化的”是指通过用相同氨基酸的密码子取代通常存在于编码序列中的一个或更多个密码子而被优化以增加表达的基因编码序列(例如，在野生型序列中，包括例如ube3a的编码序列)。这被称为同义密码子。这样，基因编码的蛋白是相同的，但基因的基础核酸碱基序列或相应mrna是不同的。在一些实施方案中，优化用更频繁出现的同义密码子替代一个或更多个稀有密码子(即，在特定种类的细胞中相对罕见出现的trna的密码子)，以提高翻译效率。例如，在人密码子优化中，编码序列中的一个或更多个密码子被在人类细胞中对于相同氨基酸更频繁出现的密码子替换。密码子优化还可以通过其他可以提高转录和/或翻译效率的机制来增加基因表达。策略包括但不限于增加总gc含量(即整个编码序列中鸟嘌呤和胞嘧啶的百分比)、降低cpg含量(即编码序列中cg或gc二核苷酸的数量)、去除隐性剪接供体或受体位点和/或添加或去除核糖体进入和/或起始位点，例如kozak序列。理想地，密码子优化的基因表现出提高的蛋白质表达，例如，与野生型基因在其他类似细胞中提供的蛋白表达水平相比，由此编码的蛋白在细胞中以可检测的更高水平表达。密码子优化还提供了区分密码子优化的基因和/或来自内源基因的相应mrna和/或体外或体内相应mrna的能力。
[0076]
如本文所用，术语“序列同一性”具有本领域的标准含义。如本领域所知，许多不同的程序可用于鉴定多核苷酸或多肽是否与已知序列具有序列同一性或相似性。序列同一性或相似性可以使用本领域已知的标准技术(包括但不限于smith&waterman，adv.appl.math.2:482(1981)的局部序列同一性算法)通过needleman&wunsch，j.mol.biol.48:443(1970)的序列同一性比对算法、pearson&lipman，proc.natl.acad.sci.usa 85:2444(1988)的相似性搜索方法、通过这些算法的计算机化实现(威斯康星遗传学软件包中的gap、bestfit、fasta和tfasta,genetics computer group,575 science drive,madison,wi)，devereux等人，nucl.acid res.12:387(1984年)中描述的最佳拟合序列程序，优选使用默认设置，或通过检查来确定。
[0077]
有用算法的实例是pileup。使用渐进成对比对，pileup从一组相关序列创建多序列比对。它还可以绘制显示用于创建比对的聚类关系的树。pileup采用了feng&doolittle,j.mol.evol.35:351(1987)的渐进比对方法的简化法：该方法类似于higgins&sharp,cabios 5:151(1989年)所描述的方法。
[0078]
另一个有用算法的实例是blast算法，在altschul等人，j.mol.biol.215:403(1990年)和karlin等人，proc.natl.acad.sci.usa90:5873(1993年)中有所描述。一个特别有用的blast程序是获自altschul等人，meth.enzymol.,266:460(1996)，blast.wustl/edu/blast/readme.html.的wu-blast-2程序。wu-blast-2使用多个搜索参数，这些参数优选设置为默认值。这些参数是动态值，并且由程序本身根据特定序列的组成和正在搜索目的序列的特定数据库的组成来建立；但是，可以调整这些值以增加灵敏度。
[0079]
另一个有用的算法是带空位的blast，正如altschul等人，nucleic acids res.25:3389(1997)中所报告的。
[0080]
氨基酸序列同一性值百分比由匹配的相同残基数除以比对区域中“较长”序列的残基总数确定。“较长”序列是在比对的区域中具有最多实际残基的序列(忽略了wu-blast-2为使比对评分最大化而引入的空位)。
[0081]
以类似的方式，核酸序列同一性百分比被定义为候选序列中与本文具体公开的多核苷酸中核苷酸相同的核苷酸残基的百分比。
[0082]
比对可包括在待比对的序列中引入间隙。此外，对于比本文具体公开的多核苷酸含有更多或更少核苷酸的序列，应当理解的是，在一个实施方案中，序列同一性的百分比将基于相对于核苷酸总数的相同核苷酸的数量来确定。因此，例如，在一个实施方案中，将使用较短序列中的核苷酸的数量来确定比本文所具体公开的序列更短的序列的序列同一性。在同一性百分比计算中，相对权重不分配给序列变异例如插入、缺失、取代等的各种表现。
[0083]
在一个实施方案中，只有相同被评分为正( 1)，并且所有形式的序列变化包括空位被指定为“0”值，这消除了对如下所述的用于序列相似性计算的加权量表或参数的需要。例如，可以通过将匹配的相同残基数除以比对区域中“较短”序列的残基总数，然后乘以100来计算序列同一性百分比。“较长”序列是在比对区域中具有最多实际残基的序列。
[0084]
如本文使用的，“分离的”核酸或核苷酸序列(例如，“分离的dna”或“分离的rna”)是指与天然存在的生物体或病毒的至少一些其他组分分离或基本上不含天然存在的生物体或病毒的至少一些其他组分的核酸或核苷酸序列，例如细胞或病毒结构组分，或其他多肽，或通常发现的与所述核酸或核苷酸序列缔合的核酸。
[0085]
同样，“分离的”多肽是指与天然存在的生物体或病毒的至少一些其他组分分离或基本上不含天然存在的生物体或病毒的至少一些其他组分的多肽，例如细胞或病毒结构组分，或其他多肽，或通常发现的与所述多肽缔合的核酸。
[0086]
如本文所用，当应用于多核苷酸或多肽序列时，术语“修饰的”是指由于一个或更多个缺失、添加、取代或其任意组合而与野生型序列不同的序列。
[0087]
如本文所用，“分离”(或语法等价词)病毒载体，是指病毒载体至少部分地与起始材料中的至少一些其他组分分离。
[0088]
术语“治疗(treat)”、“治疗(treating)”或“治疗(treatment of)”(或语法等价术语)是指降低或至少部分改善或减轻受试者状况的严重程度和/或减轻、缓解或减少至少一
种临床症状和/或延迟状况的进展。
[0089]
如本文所用，术语“预防(prevent)”、“预防(prevents)”或“预防(prevention)”(和其语法等价术语)是指延迟或抑制疾病发作。这些术语并不意在要求完全消除疾病，而是包括任何类型的预防性治疗，以减少状况的发生率或延迟状况的发作。
[0090]
本文所用的“治疗有效”量是足以给受试者提供一些改善或益处的量。换言之，“治疗有效”量是将对受试者的至少一种临床症状提供某种缓解、减轻、减少或稳定的量。本领域技术人员应理解，只要向受试者提供一些益处，治疗效果不必是完全的或治愈性的。
[0091]
如本文所用，“预防有效”量是指足以预防和/或延迟受试者的疾病、病症和/或临床症状发作和/或相对于在无本发明的方法存在下会发生的情况减轻和/或延迟受试者的疾病、病症和/或临床症状发作的严重程度的量。本领域技术人员应理解，只要向受试者提供一些益处，预防水平不必是完全的。
[0092]
用于描述核酸序列或蛋白的术语“异源”是指核酸或蛋白来源于与表达该核酸或蛋白的宿主细胞或受试者不同的生物体或同一生物体的不同种类。当述及质粒、表达盒或载体中的蛋白或核酸使用术语“异源”时，表示该蛋白或核酸与在自然界中没有关系的另一个序列或亚序列一起存在。典型地，异源核酸为包含编码多肽的开放阅读框目的核酸，和/或包含未翻译的rna，其中每一个在本文中均可称为“转基因”。目的核酸可以编码治疗性多肽或治疗性rna，或诊断性多肽或诊断性rna。目的核酸/异源核酸通常以表达盒为背景。
[0093]
如本文所用术语，“表达盒”包括与适当的调控元件序列(调控元件)可操作连接/缔合的目的核酸，例如转录/翻译控制信号、复制起点、多聚腺苷酸化信号、内部核糖体进入位点(ires)、启动子和/或增强子等。在本发明的一些实施方案中，表达盒包含与目的核酸可操作连接的启动子(例如，真核的)，和任选的(真核的)转录终止序列。通常，表达盒在载体的背景下(例如，两侧是载体序列)。当在病毒载体的背景下时，通常其两侧为病毒载体的病毒包装信号。例如，对于aav病毒载体，包装信号是位于表达盒附近的至少一个反向末端重复序列，任选地表达盒侧翼为5’反向末端重复序列(itr)和3’itr。
[0094]“载体”是指用作媒介物将外源遗传物质携带至另一细胞中的化合物，该外源遗传物质可在该另一细胞中复制和/或表达。含有外源核酸的克隆载体被称为重组载体。核酸载体的实例是质粒、病毒载体、粘粒和人工染色体。重组载体通常含有复制起点、多克隆位点和可选择标记。核酸序列通常由插入物(重组核酸或转基因)和作为载体“骨架”的较大序列组成。将遗传信息转移到另一个细胞的载体的目的通常是在靶细胞中分离、繁殖或表达插入物。表达载体(表达构建体)用于外源基因在靶细胞中的表达，且通常具有驱动外源基因/orf表达的启动子序列。将载体插入靶细胞是指对细菌和真核细胞的转化或转染，但是病毒载体的插入通常被称为转导。术语“载体”通常也可用于描述用于将外源遗传物质携带到另一个细胞中的物质，例如但不限于转化的细胞或纳米颗粒。
[0095]
如本文所用，在特定实施方案中，术语“载体”、“病毒载体”、“递送载体”(和类似术语)通常是指起核酸递送媒介物作用的病毒颗粒，且其包含包装在病毒粒子内的病毒核酸(即载体基因组)。根据本发明的病毒载体包含根据本发明的嵌合aav衣壳，并且可以包装aav或raav基因组或包括病毒核酸的任何其它核酸。或者，在一些背景中，术语“载体”、“病毒载体”、“递送载体”(和类似术语)可用于指在不存在病毒粒子的情况下的载体基因组(例如，vdna)和/或指充当转运体以递送拴系到衣壳或包装在衣壳内的分子的病毒衣壳。
[0096]
本发明的病毒载体还可以是国际专利公开号wo 01/92551(其公开内容通过引用整体并入本文)中所述的双链细小病毒颗粒。因此，在一些实施方案中，可以包装双链的(双链体)基因组。
[0097]“重组aav载体基因组”或“raav基因组”是aav基因组(即vdna)，其包含至少一个反向末端重复序列(例如，一个、两个或三个反向末端重复序列)和一个或更多个异源核苷酸序列。raav载体通常保留145个顺式碱基末端重复序列(tr)，以产生病毒；但是，修饰的aav tr和非aav tr(包括部分或完全合成的序列)也可用于此目的。所有其他病毒序列都是可有可无的，且可以反式提供(muzyczka，(1992年)curr.topics microbiol.immunol.158:97)。raav载体任选包含两个tr(例如，aav tr)，其通常位于异源核苷酸序列的5’端和3’端，但不必与其邻接。tr可以彼此相同或不同。载体基因组也可以在其3’或5’端包含单个itr。
[0098]
术语“末端重复序列”或“tr”包括任何病毒末端重复序列或合成序列，其形成发夹结构并起反向末端重复序列(itr)的作用(即介导所需的功能，如复制、病毒包装、整合和/或前病毒挽救等)。tr可以是aav tr(本文称为aav itr)或非aav tr。例如，非aav tr(本文中称为非aav itr)序列，如其他细小病毒(例如，犬细小病毒(cpv)、小鼠细小病毒(mvm)、人细小病毒b-19)的序列或作为sv40复制起点的sv40发夹序列，可用作tr，其可通过截短、取代、缺失、插入和/或添加进一步修饰。此外，tr(itr)可以是部分或完全合成的，如samulski等人的美国专利号5478745中所述的“双d序列”。
[0099]
细小病毒基因组的5’和3’端都有回文序列。序列的回文性质导致形成发夹结构，该结构通过互补碱基对之间形成氢键而稳定。这种发夹结构被认为是采用“y”或“t”形。参见，例如fields等人，virology，第2卷，第69&69章(第4版，lippincott-raven publishers)。
[0100]“aav反向末端重复序列”或“aav itr”可以来自任何aav血清型或分离株，包括但不限于血清型1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或任何其他现在已知或以后发现的aav(参见，例如，表1)。aav itr不需要具有天然itr(例如，天然aav itr序列可通过插入、缺失、截短和/或错义突变而改变)，只要itr介导所需的功能，例如复制、病毒包装、整合和/或前病毒挽救等。
[0101]
术语“raav颗粒”和“raav病毒粒子”在此可互换使用。“raav颗粒”或“raav病毒粒子”包含包装在aav衣壳内的raav载体基因组。
[0102]
如国际专利公开号wo 00/28004和chao等人(2000年)mol.therapy2:619中所述，本发明的病毒载体还可以是“靶”病毒载体(例如，具有定向嗜性)和/或“杂交”细小病毒(即，其中病毒itr和病毒衣壳来自不同的细小病毒)。
[0103]
此外，病毒衣壳或基因组元件可以包含其他修饰，包括插入、缺失和/或取代。
[0104]
如本文所用，术语“氨基酸”涵盖任何天然存在的氨基酸及其修饰形式和合成的氨基酸，包括非天然存在的氨基酸。
[0105]
天然、左旋(l-)氨基酸如表2所示。
[0106]
表2
[0107][0108]
或者，氨基酸可以是修饰的氨基酸残基(表3中显示了非限制性实例)或可以是通过翻译后修饰(例如，乙酰化、酰胺化、甲酰化、羟基化、甲基化、磷酸化或硫酸化)而被修饰的氨基酸。
[0109]
表3：氨基酸残基衍生物
[0110]
[0111][0112]
此外，wang等人，(2006年)annu.rev.biophys.biomol.struct.35:225-49中所述，非天然存在的氨基酸可以是“非天然”氨基酸。这些非天然氨基酸可以有利地用于将目的分子与aav衣壳蛋白化学连接。
[0113]
本文所用术语“模板”或“底物”是指可被复制以产生细小病毒dna的多核苷酸序列。出于载体生产的目的，模板通常被包埋在较大的核苷酸序列或构建体中，包括但不限于质粒、裸dna载体、细菌人工染色体(bac)、酵母人工染色体(yac)或病毒载体(例如腺病毒、疱疹病毒、eb病毒、aav、杆状病毒、逆转录病毒载体等)。或者，模板可以稳定地整合到包装细胞的染色体中。
[0114]
如本文所用，细小病毒或aav“rep编码序列”表示编码介导病毒复制和新病毒颗粒产生的细小病毒或aav非结构蛋白的核酸序列。细小病毒和aav复制基因和蛋白已在，例如，fields等人，virology，第2卷，第69&70章(第4版，lippincott-raven publishers)中描述。
[0115]“rep编码序列”不需要编码所有细小病毒或aav rep蛋白。例如，就aav而言，rep编码序列不需要编码所有四种aav rep蛋白(rep78、rep68、rep52和rep40)，事实上，认为aav5仅表达剪接的rep68和rep40蛋白。在代表性的实施方案中，rep编码序列至少编码病毒基因组复制和包装成新病毒粒子所必需的那些复制蛋白。rep编码序列通常编码至少一种大rep蛋白(即rep78/68)和一种小rep蛋白(即rep52/40)。在特定的实施方案中，rep编码序列编码aav rep78蛋白和aav rep52和/或rep40蛋白。在其他实施方案中，rep编码序列编码rep68和rep52和/或rep40蛋白。在另一个实施方案中，rep编码序列编码rep68和rep52蛋白、rep68和rep40蛋白、rep78和rep52蛋白或rep78和rep40蛋白。
[0116]
如本文所用，术语“大rep蛋白”是指rep68和/或rep78。要求保护的发明的大rep蛋白可以是野生型或合成型。野生型大rep蛋白可以来自任何细小病毒或aav，包括但不限于血清型1、2、3a、3b、4、5、6、7、8、9、10、11或13，或任何其他现在已知或以后发现的aav(参见，例如，表1)。合成型大rep蛋白可能因插入、缺失、截短和/或错义突变而改变。
[0117]
本领域技术人员应进一步理解，复制蛋白不必由相同的多核苷酸编码。例如，对于mvm，ns-1和ns-2蛋白(其为剪接变体)可以彼此独立表达。同样，对于aav，p19启动子可能失活，而大rep蛋白表达自一种多核苷酸，小rep蛋白表达自不同的多核苷酸。然而，通常从单个构建体表达复制蛋白更方便。在一些系统中，病毒启动子(如aav p19启动子)可能不被细胞识别，因此有必要从单独的表达盒中表达大rep蛋白和小rep蛋白。在其他情况下，可能需要即在不同的转录和/或翻译控制元件的控制下，分开表达大rep和小rep蛋白。例如，可能需要控制大rep蛋白的表达，以降低大rep蛋白与小rep蛋白的比例。在昆虫细胞的情况下，下调大rep蛋白的表达(例如，rep78/68)以避免对细胞的毒性可能是有利的(参见，例如，urabe等人，(2002年)human gene therapy 13:1935)。
[0118]
如本文所用，细小病毒或aav“cap编码序列”编码形成功能性细小病毒或aav衣壳(即，可包装dna并感染靶细胞)的结构蛋白。通常，cap编码序列将编码所有细小病毒或aav衣壳亚基，但只要产生功能性衣壳，可编码少于全部的衣壳亚基。通常但不一定，cap编码序
列将存在于单个核酸分子上。
[0119]
自主细小病毒和aav的衣壳结构在bernard n.fields等人，virology，第2卷，第69&70章(第4版，lippincott-raven publishers)中有更详细的描述。
[0120]
所谓“基本上保留”一种特性例如，活性或其他可测量特性，是指至少保留该特性的约75％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％(。
[0121]
ube3a表达盒和载体
[0122]
本发明涉及提供治疗水平的ube3a蛋白的细胞内(例如，非分泌性)表达(也称为e6ap泛素-蛋白连接酶(e6ap))的ube3a表达盒的设计、由ube3a基因编码的酶以及该表达盒在受试者中获得治疗水平ube3a/e6ap的用途。
[0123]
因此，本发明的一个方面涉及包含哺乳动物ube3a开放阅读框的多核苷酸。开放阅读框是ube3a基因编码ube3a/e6ap的部分。在一些实施方案中，哺乳动物ube3a开放阅读框可以是人ube3a开放阅读框。人ube3a开放阅读框可在同一阅读框中编码一种或更多种人ube3a亚型。例如，在一些实施方案中，哺乳动物ube3a开放阅读框可以是人ube3a短亚型(即人ube3a亚型1)，和/或人ube3a长亚型(例如人ube3a亚型2和/或3)开放阅读框。在一些实施方案中，哺乳动物ube3a开放阅读框可以是人ube3a亚型1和亚型3开放阅读框。在其他实施方案中，哺乳动物ube3a开放阅读框可以是人ube3a亚型1和亚型2开放阅读框。如本文所用，哺乳动物ube3a开放阅读框指编码哺乳动物ube3a/e6ap的核苷酸序列，例如，人ube3a开放阅读框指编码人ube3a/e6ap的核苷酸序列。在功能合适的情况下，由于术语ube3a开放阅读框在本文中用于指编码人ube3a短亚型和人ube3a长亚型的开放阅读框，因此开放阅读框包括包含影响长亚型表达的kozak序列的5’上游核酸序列。图13和图14显示了这种开放阅读框。
[0124]
seq id no:1.野生型人ube3a短亚型(亚型1；genbank登录号：#nm_130838.3)
[0125]
[0126][0127]
seq id no:2.野生型人ube3a长亚型(亚型2；genbank登录号：#nm_000462.5)
[0128]
[0129][0130]
seq id no:3.野生型人ube3a长亚型(亚型3；genbank登录号：#nm_130839.4)
[0131]
[0132]
[0133][0134]
尽管不希望受理论束缚，但对人脑组织中ube3a亚型表达的分析表明，短ube3a亚型1与长ube3a亚型相比以至少4:1和至多8:1的比例表达，取决于所分析的特定脑区域(mele等人，science，2015；348(6235):660-665)。因此，在一些实施方案中，哺乳动物ube3a开放阅读框可包含一个或更多个自wt或对照修饰的kozak序列，例如，包含这样的多核苷酸序列、基本上由这样的多核苷酸序列组成或由这样的多核苷酸序列组成，其与wt或对照例如共有kozak序列和/或野生型ube3a kozak序列相比，其中的1、2、3、4、5或更多个核苷酸被置换、添加和/或缺失。在一些实施方案中，哺乳动物ube3a开放阅读框可包含一个或更多个kozak序列，其包含降低和/或增强开放阅读框中的一个或更多个起始密码子(即，一个或更多个起始密码子，也称为翻译起始位点)的起始活性的核苷酸修饰(例如，置换)。在一些实施方案中，哺乳动物ube3a开放阅读框可包含一个或更多个kozak序列，其包含与对照(例如共有kozak序列或野生型(例如，未修饰的)ube3a kozak序列)相比一个或更多个起始密码子起始活性降低(例如亚型的表达降低)5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的核苷酸修饰(例如置换)。在一些实施方案中，哺乳动物ube3a开放阅读框可包含一个或更多个kozak序列，其包含与对照(例如共有kozak序列或野生型(例如，未修饰的)ube3a kozak序列)相比一个或更多个起始密码子起始活性增强(例如亚型的表达增强)5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、100％、150％、200％或更多的核苷酸修饰(例如置换)。在一些实施方案中，哺乳动物ube3a开放阅读框可包含一个或更多个核苷酸修饰，以提供短亚型与长亚型的表达相比以约1∶1至约15∶1的比例，例如约1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、11:1、12:1、13:1、14:1、15:1或其中的任何值或范围的比例表达。例如，在一些实施方案中，哺乳动物(例如人)ube3a开放阅读框可包含一个或更多个核苷酸修饰，以提供短亚型与长亚型的表达相比以约2:1至约4.5:1、约1:1至约10:1、约3:1至约8.5:1或约3:1至约4:1的比例表达。例如，在一些实施方案中，哺乳动物(例如人)ube3a开放阅读框可包含一个或更多个核苷酸修饰，以提供短亚型与长亚型的表达相比以约2.5:1，约3:1、约4:1，约6.5:1、约8:1或约10:1的比例表达。
[0135]
在一些实施方案中，哺乳动物ube3a开放阅读框包含第一kozak序列，其包含以下核苷酸序列、基本上由以下核苷酸序列组成或由以下核苷酸序列组成：seq id no:6或与其至少约50％相同(例如与其至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同)的序列组成。在一些实施方案中，第一kozak序列(例如，seq id no:6)与亚型3或亚型2可操作连接，例如通过取代或修饰wt亚型3或wt亚型2kozak序列(分别为seq id no:5或4)。
[0136]
seq id no:4.野生型人ube3a长亚型2kozak序列(起始密码子用下划线标记)。
[0137]
ugcaggaugg
[0138]
seq id no:5.野生型人ube3a长亚型3kozak序列(起始密码子用下划线标记)。
[0139]
caccgaaugg
[0140]
seq id no:6.具有降低起始活性的修饰的人ube3a第一kozak序列(起始密码子用
下划线标记)。
[0141]
uuuuuuaugg
[0142]
在一些实施方案中，哺乳动物ube3a开放阅读框包含第二kozak序列，其包含以下核苷酸序列、基本上由以下核苷酸序列组成或由以下核苷酸序列组成：seq id no:8或与其至少约50％相同(例如与其至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同)的序列。在一些实施方案中，第二kozak序列(例如，seq id no:8)与短亚型1可操作连接，例如分别通过取代或修饰wt人ube3a亚型1kozak序列(seq id no:7)。
[0143]
seq id no:7.野生型人ube3a短亚型(亚型1)kozak序列(起始密码子用下划线标记)。
[0144]
agccgaauga
[0145]
seq id no:8.具有增强起始活性的修饰的人ube3a第二kozak序列(起始密码子用下划线标记)。
[0146]
agcaggauga
[0147]
在一些实施方案中，哺乳动物ube3a开放阅读框的唯一密码子优化的核苷酸序列是针对一个或两个kozak序列的，如图14对于人ube3a所示的。在一些实施方案中，额外的(除了kozak序列之外)密码子优化的核苷酸序列在哺乳动物ube3a开放阅读框内，以影响哺乳动物细胞中的表达。本文所用术语“哺乳动物”包括但不限于人类、灵长类、非人灵长类(例如，猴和狒狒)、牛、绵羊、山羊、猪、马、猫、狗、兔、啮齿动物(例如，大鼠、小鼠、仓鼠等)等。密码子优化是本领域熟知的技术，用于在不同物种中表达的最佳密码子是已知的。密码子优化的ube3a序列的使用允许技术人员区分受试者中被转导的序列的表达与内源性ube3a序列的表达。在一些实施方案中，包含本发明的人ube3a开放阅读框的多核苷酸可经密码子优化以在人细胞中表达。
[0148]
在一些实施方案中，密码子优化的ube3a开放阅读框包含以下核苷酸序列、基本上由以下核苷酸序列组成或由以下核苷酸序列组成：seq id no:9、seq id no:26或seq id no:27或与其至少约70％相同，例如与其至少约70％、75％、76％、77％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列。在一些实施方案中，seq id no:27(图14)中的一个或两个kozak序列未被进一步修饰，而其它核苷酸序列进一步被密码子优化以产生与seq id no:27(图14)中的相应序列至少约70％相同例如至少约70％、75％、76％、77％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的ube3a开放阅读框(当比较忽略kozak序列时)，从而保留kozak序列(seq id no:8)与短亚型1可操作连接和/或kozak序列(seq id no:6)与亚型3或亚型2可操作连接。
[0149]
seq id no:9.人密码子优化的ube3a亚型1和亚型3的开放阅读框(hube3a1》》3)
[0150][0151]
本发明的另一方面涉及包含多核苷酸的表达盒，该多核苷酸包含本发明的哺乳动物(例如人)ube3a开放阅读框。在某些实施方案中，多核苷酸是人密码子优化的序列，例如包含核苷酸序列seq id no:9，或与其至少约70％相同(例如与其至少约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列的多核苷酸。在本文所述的本发明的多个实施方案中，seq id no:9的ube3a核苷酸序列还包含额外的5’碱基对序列(例如，导致seq id no:6的修饰的kozak序列的6个胸腺嘧啶)，以包括第一个kozak序列。
[0152]
表达盒中的ube3a开放阅读框可与一个或更多个可修饰(即，增强、减少或限制)ube3a和/或e6ap表达的表达元件，如启动子、增强子、多聚腺苷酸化信号、定位信号和/或本领域已知的其它表达元件可操作连接。
[0153]
在一些实施方案中，多核苷酸可操作地连接到启动子，例如神经元特异性启动子，例如人突触素(hsyn)、神经元特异性烯醇化酶(nse)、微管蛋白α1(ta1)、mecp2(mep)。
[0154]
在一些实施方案中，多核苷酸可操作地连接到人突触素启动子，例如包含以下核苷酸序列、基本上由以下核苷酸序列组成或由以下核苷酸序列组成：seq id no:10的或与其至少约70％相同例如至少与其约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列的启动子。
[0155]
seq id no:10.人突触素(hsyn)启动子
[0156][0157]
在一些实施方案中，ube3a开放阅读框可操作地连接到多聚腺苷酸化信号，例如牛生长激素(bgh)多聚腺苷酸化信号(bghpa)，例如包含以下核苷酸序列、基本上由以下核苷酸序列组成或由以下核苷酸序列组成：seq id no:11或与其至少约70％相同例如与其至少约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％相同的序列的多聚腺苷酸化信号。
[0158]
seq id no:11.牛生长激素多聚腺苷酸化信号(bghpa)
[0159][0160]
在一些实施方案中，ube3a开放阅读框可操作地连接到多聚腺苷酸化信号，例如合成的多聚a(spa)，例如包含以下核苷酸序列、基本上由以下核苷酸序列组成或由以下核苷酸序列组成：seq id no:12或与其至少约70％相同例如与其至少约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列的多聚腺苷酸化信号。
[0161]
seq id no:12.合成的多聚腺苷酸化信号(spa)
[0162][0163]
在一些实施方案中，ube3a开放阅读框可操作地连接到多聚腺苷酸化信号，例如猿猴病毒40(sv40)多聚腺苷酸化信号(sv40pa)，例如包含以下核苷酸序列、基本上由以下核苷酸序列组成或由以下核苷酸序列组成：seq id no:13或与其至少约70％相同例如与其至少约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％相同的序列的多聚腺苷酸化信号。
[0164]
seq id no:13.sv40多聚腺苷酸化信号(sv40pa)
[0165][0166]
本领域技术人员还应理解，根据所需的水平和组织特异性表达，可以使用多种启动子/增强子元件。启动子/增强子可以是组成型的或诱导型的，这取决于所需的表达模式。启动子/增强子可以是天然的或外源的，并且可以是天然的或合成的序列。外源意指在转录起始区所导入的野生型宿主中不存在的转录起始区。
[0167]
启动子/增强子元件可以是靶细胞或待处理受试者天然存在的和/或异源核酸序列天然存在的。通常对启动子/增强子元件的选择使得其在目的靶细胞中发挥作用。在代表
性的实施方案中，启动子/增强子元件是哺乳动物启动子/增强子元件。启动子/增强子元件可以是组成型或诱导型的。
[0168]
诱导型表达控制元件通常用于需要对异源核酸序列表达提供调控的那些应用中。用于基因递送的诱导型启动子/增强子元件可以是组织特异性或组织优选的启动子/增强子元件，并且包括肌肉特异性或优选的(包括心肌、骨骼肌和/或平滑肌)、神经组织特异性或优选的(包括脑特异性)、眼特异性的(包括视网膜特异性和角膜特异性的)、肝特异性的或优选的、骨髓特异性或优选的、胰腺特异性或优选的、脾特异性或优选的和肺特异性或优选的启动子/增强子元件。其他诱导型启动子/增强子元件包括激素诱导型和金属诱导型元件。示例性诱导型启动子/增强子元件包括但不限于tet on/off元件、ru486诱导型启动子、蜕皮激素诱导型启动子、雷帕霉素诱导型启动子和金属硫蛋白启动子。
[0169]
在其中所述ube3a开放阅读框在靶细胞中被转录然后被翻译的实施方案中，特异性起始信号通常用于所插入蛋白编码序列的有效翻译。这些可以包括atg起始密码子(即翻译起始位点)和相邻序列的外源翻译控制序列可以是多种来源的，既有天然的也有合成的。这些其他外源翻译控制序列的非限制性实例包括kozak序列(例如，其他kozak共有序列)。
[0170]
在某些实施方案中，表达盒还包含至少一个腺相关病毒(aav)反向末端重复序列(itr)，例如两个aav itr。这两个itr可以具有相同的核苷酸序列或不同的核苷酸序列。aav itr可以来自任何aav血清型或分离株(例如，aav 1型、aav 2型、aav 3型(包括3a型和3b型)、aav 4型、aav 5型、aav 6型、aav 7型、aav 8型、aav 9型、aav 10型、aav 11型、aav 12型、aav 13型，或表1所示的任何一种)。在一些实施方案中，itr是/来自aav2。每个itr可以独立地是野生型序列或修饰的序列。在一些实施方案中，修饰的itr可能具有d-元件缺失(wo 01/92551)。d-元件缺失定义为itr中被称为d-元件的部分的去除。d-元件也可以指或称为d区、或d序列、和/或不形成回文发夹结构的itr核苷酸。在一些实施方案中，表达盒是aav单链载体。在一些实施方案中，表达盒是aav基因组，例如自身互补的aav基因组。
[0171]
在某些实施方案中，表达盒任选地以所述顺序包含启动子、哺乳动物ube3a开放阅读框和多聚腺苷酸化位点。在某些实施方案中，表达盒任选地以所述顺序包含启动子、人ube3a开放阅读框和多聚腺苷酸化位点。在某些实施方案中，表达盒任选地以所述顺序任选包含aav itr、启动子、人ube3a开放阅读框、多聚腺苷酸化位点和aav itr。在某些实施方案中，表达盒任选地以所述顺序包含人突触素启动子、人ube3a开放阅读框和bgh多聚腺苷酸化位点。在某些实施方案中，表达盒任选地以所述顺序任选包含aav itr、人突触素启动子、人ube3a开放阅读框、bgh多聚腺苷酸化位点和aav itr。在某些实施方案中，表达盒任选地以所述顺序包含aav2 itr、启动子、人ube3a开放阅读框、bgh多聚腺苷酸化位点和aa2v itr。在某些实施方案中，表达盒任选地以所述顺序包含aav2 itr、人突触素启动子、包含人ube3a短亚型和长亚型的人ube3a开放阅读框、bgh多聚腺苷酸化位点和aa2v itr。在某些实施方案中，表达盒任选地以所述顺序包含aav2 itr、人突触素启动子、包含人ube3a短亚型(即亚型1)和长亚型3的人ube3a开放阅读框、bgh多聚腺苷酸化位点和aa2v itr。在某些实施方案中，表达盒任选地以所述顺序包含aav2 itr、人突触素启动子、包含人ube3a短亚型和长亚型2的人ube3a开放阅读框、bgh多聚腺苷酸化位点和aav2 itr。上述组分处于可操作连接。在某些实施方案中，表达盒任选地以所述顺序包含aav2 itr、人突触素启动子、包含人ube3a短亚型和人长亚型(即，亚型2或3且还包含一个或更多个kozak序列的人ube3a开放
阅读框、bgh多聚腺苷酸化位点和aa2v itr，所述kozak序列包含以下、基本上由以下组成或由以下组成：seq id no:6和/或seq id no:8或与其至少约50％相同例如至少与其约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列。上述组分处于可操作连接。
[0172]
在一些实施方案中，表达盒包含以下核苷酸序列、基本上由以下核苷酸序列组成或由以下核苷酸序列组成：seq id no:14或与其至少约70％相同例如与其至少约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列。
[0173]
seq id no:14.不包括itr的人ube3a表达盒
[0174][0175]
本发明的另一个方面涉及包含本文所述的多核苷酸或表达盒的载体。合适的载体包括但不限于质粒、噬菌体、病毒载体(例如，aav载体、慢病毒载体、腺病毒载体、疱疹病毒载体、甲病毒载体或杆状病毒载体)、细菌人工染色体(bac)或酵母人工染色体(yac)。例如，
核酸可以包含以下aav载体、由以下aav载体组成或基本上由以下aav载体组成，该aav载体包含5’和/或3’末端重复序列(例如，5’和/或3’aav末端重复序列)。在一些实施方案中，载体是递送媒介物，如表达盒所附着的或其中表达盒被包埋于其中的粒子(例如，微粒或纳米粒)或脂质体。载体可以是任何适合携带表达盒进入细胞的递送媒介物。在一些实施方案中，载体可以是嗜神经性载体。
[0176]
在一些实施方案中，载体是病毒载体，例如慢病毒载体和/或aav载体。在一些实施方案中，载体是aav载体。aav载体可以是任何aav血清型或分离株(例如，aav 1型、aav 2型、aav 3型(包括3a型和3b型)、aav 4型、aav 5型、aav 6型、aav 7型、aav 8型、aav 9型、aav 10型、aav 11型、aav 12型、aav 13型，或表1所示的任何一种)。在一些实施方案中，aav载体是aav9载体。在一些实施方案中，aav载体可以是aav9和/或aav9来源的变体，例如但不限于php.b、php.eb或aav9.hr。在一些实施方案中，aav载体可以是合成的aav载体，例如anc80。在一些实施方案中，aav载体可包含野生型衣壳蛋白。在其他实施方案中，aav载体可包含与野生型衣壳蛋白相比具有嗜性改变的修饰的衣壳蛋白，例如，修饰的衣壳蛋白是去除肝靶向的或对特定细胞具有增强嗜性。
[0177]
在一些实施方案中，载体是单链aav(ssaav)载体。在一些实施方案中，载体是自身互补或双链aav(scaav)载体。在国际专利公开号wo 01/92551(其公开内容通过引用整体并入本文)中描述了scaav载体。使用scaav表达ube3a orf可能提供被转导细胞的数量增加、每个转导细胞的拷贝数增加或两者都增加。
[0178]
本发明的另一方面涉及包含本发明所述的多核苷酸、表达盒和/或载体的转化的细胞。在一些实施方案中，多核苷酸、表达盒和/或载体被稳定地整合到细胞基因组中。细胞可以是体外、离体或体内细胞。
[0179]
本发明的另一方面涉及包含本发明的多核苷酸、表达盒、载体和/或转化的细胞的转基因动物。在一些实施方案中，动物是实验动物，例如小鼠、大鼠、兔、犬、猴或非人灵长类动物。
[0180]
本发明的另一方面涉及药物制剂，其在药学上可接受的载体中包含本发明的多核苷酸、表达盒、载体和/或转化的细胞。
[0181]
在具体的实施方案中，本发明的多核苷酸、表达盒、载体和/或转化的细胞被分离。
[0182]
在另一个具体实施方案中，本发明的多核苷酸、表达盒、载体和/或转化的细胞被纯化。
[0183]
产生病毒载体的方法
[0184]
本发明还提供了产生病毒载体的方法。在一个特定的实施方案中，本发明提供了产生重组aav粒子的方法，包括在足以复制和包装重组aav模板的条件下向允许aav复制的细胞提供：(a)重组aav模板，其包含(i)本发明的多核苷酸或表达盒，和(ii)itr；(b)包含rep编码序列和cap编码序列的多核苷酸，由此在细胞中产生重组aav粒子。足以复制和包装重组aav模板的条件可以是，例如，存在足以复制aav模板并包封到aav衣壳中的aav序列(例如，aav rep序列和aav cap序列)和来自腺病毒和/或疱疹病毒的辅助序列。在特定的实施方案中，aav模板包含两个aav itr序列，其位于本发明的多核苷酸的5’和3’方向，但是它们不需要与5’和3’直接挨着。
[0185]
在一些实施方案中，如国际专利公开号wo 01/92551中所述，重组aav模板包含未
被rep分解的itr来制备双链aav载体。
[0186]
在使得在细胞中产生包含包装在aav衣壳内的aav模板的病毒载体的条件下提供aav模板和aav rep和cap序列，。该方法还可以包括从细胞中收集病毒载体的步骤。可以从培养基中和/或通过裂解细胞来收集病毒载体。
[0187]
细胞可以是允许aav病毒复制的细胞。可以使用本领域已知的任何合适的细胞。在特定的实施方案中，细胞是哺乳动物细胞(例如，灵长类或人细胞)。作为另一种选择，细胞可以是提供从复制缺陷辅助病毒中删除的功能的反式互补包装细胞系，例如293细胞或其它e1a反式互补细胞。
[0188]
aav复制和衣壳序列可通过本领域已知的任何方法提供。目前的方案通常在单个质粒上表达aav rep/cap基因。aav复制和包装序列不需要一起提供，尽管这样做可能很方便。aav rep和/或cap序列可以由任何病毒或非病毒载体提供。例如，rep/cap序列可由杂交腺病毒或疱疹病毒载体提供(例如，插入缺失性腺病毒载体的e1a或e3区)。ebv载体也可用于表达aav cap和rep基因。该方法的一个优点是，ebv载体是游离型，但在整个连续细胞分裂过程中保持高拷贝数(即作为染色体外元件稳定整合到细胞中，称为“基于ebv的核附加体”，见margolski，(1992年)curr.top.microbiol.immun.158:67)。
[0189]
作为另一种选择，rep/cap序列可以稳定地整合到细胞中。
[0190]
通常，aav rep/cap序列两侧不是tr，以防止这些序列的挽救和/或包装。
[0191]
可以使用本领域已知的任何方法将aav模板提供给细胞。例如，模板可以由非病毒(例如质粒)或病毒载体提供。在特定实施方案中，aav模板由疱疹病毒或腺病毒载体提供(例如，插入缺失性腺病毒的e1a或e3区)。作为另一个示例，palombo等人，(1998年)j.virology 72:5025描述了杆状病毒载体，其携带位于aav tr两侧的报告基因。按照上文关于rep/cap基因所描述的，ebv载体也可用于递送模板。
[0192]
在另一个代表性实施方案中，aav模板由复制型raav病毒提供。在其他实施方案中，将包含aav模板的aav前病毒稳定整合到细胞的染色体中。
[0193]
为了提高病毒滴度，可以向细胞提供促进生产性aav感染的辅助病毒功能(例如腺病毒或疱疹病毒)。aav复制所必需的辅助病毒序列是本领域已知的。通常，这些序列由辅助腺病毒或疱疹病毒载体提供。或者，腺病毒或疱疹病毒序列可由另一非病毒或病毒载体提供，例如作为携带所有辅助基因的促进有效产生aav的非感染性腺病毒小质粒，如ferrari等人，(1997年)nature med.3:1295和美国专利号6,040,183和6,093,570所述。
[0194]
此外，辅助病毒功能可由包装细胞提供，其中辅助序列嵌入染色体中或保持为稳定的染色体外元件。通常，辅助病毒序列不能被包装到aav病毒粒子中，例如，侧翼不是itr。
[0195]
本领域技术人员应理解，在单个辅助构建体上提供aav复制和衣壳序列以及辅助病毒序列(例如腺病毒序列)可能是有利的。该辅助构建体可以是非病毒或病毒构建体。作为一个非限制性示例，辅助构建体可以是包含aav rep/cap基因的杂交腺病毒或杂交疱疹病毒。
[0196]
在一个特定的实施方案中，aav rep/cap序列和腺病毒辅助序列由单个腺病毒辅助载体提供。该载体还可以包含aav模板。aav rep/cap序列和/或aav模板可以插入腺病毒的缺失区(例如e1a或e3区)。
[0197]
在另一个实施方案中，aav rep/cap序列和腺病毒辅助序列由单个腺病毒辅助载
体提供。根据该实施方案，可以提供aav模板作为质粒模板。
[0198]
在另一个说明性实施方案中，aav rep/cap序列和腺病毒辅助序列由单个腺病毒辅助载体提供，并且aav模板作为前病毒整合到细胞中。或者，aav模板由ebv载体提供，该载体作为染色体外元件(如基于ebv的核附加体)保留在细胞内。
[0199]
在另一个示例性实施方案中，aav rep/cap序列和腺病毒辅助序列由单个辅助腺病毒提供。aav模板可以作为单独的复制病毒载体提供。例如，aav模板可以由aav粒子或第二重组腺病毒粒子提供。
[0200]
根据前述方法，杂交腺病毒载体通常包含足以进行腺病毒复制和包装的腺病毒5’和3’顺式序列(即腺病毒末端重复序列和pac序列)。aav rep/cap序列和(如果存在的话)aav模板被嵌入腺病毒骨架中，并侧翼是5’和3’顺式序列，因此这些序列可被包装到腺病毒衣壳中。如上所述，腺病毒辅助序列和aav rep/cap序列通常侧翼不是itr，因此这些序列不被包装到aav病毒粒子中。
[0201]
zhang等人((2001年)gene ther.18:704-12)描述了包含腺病毒和aav rep和cap基因的嵌合辅助载体。
[0202]
疱疹病毒也可在aav包装方法中用作辅助病毒。编码aav rep蛋白的杂交疱疹病毒可有利地促进可扩展的aav载体产生方案。已经描述了表达aav-2rep和cap基因的杂交单纯疱疹病毒i型(hsv-1)载体(conway等人，(1999年)gene ther.6:986和wo 00/17377)。
[0203]
作为另一种选择，本发明的病毒载体可以在昆虫细胞中使用杆状病毒载体产生，以递送rep/cap基因和aav模板，例如，urabe等人(2002年)human gene ther.13:1935-43所述。
[0204]
可以通过本领域已知的任何方法获得不含污染性辅助病毒的aav载体储备物。例如，aav和辅助病毒很容易根据大小区分。基于对肝素底物的亲和力，也可将aav病毒与辅助病毒分离(zolotukhin等人(1999年)gene therapy 6:973)。可以使用缺失的复制缺陷型辅助病毒，使得任何污染性辅助病毒都不能复制。作为另一种选择，可以使用缺乏晚期基因表达的腺病毒辅助载体，因为只需要腺病毒早期基因表达来介导aav包装。晚期基因表达缺陷的腺病毒突变体是本领域已知的(例如ts100k和ts149腺病毒突变体)。
[0205]
ube3a载体的使用方法
[0206]
本发明还涉及将ube3a开放阅读框递送至细胞或受试者以增加ube3a和/或e6ap产生的方法，例如用于体外、离体和/或体内的治疗或研究目的。因此，本发明的一个方面涉及在细胞中表达ube3a开放阅读框的方法，包括使细胞与本发明的多核苷酸、表达盒和/或载体接触，从而在细胞中表达ube3a开放阅读框。在一些实施方案中，所述细胞是体外细胞、离体细胞和/或体内细胞。本发明的体外表达可能有益于研究目的，例如，表达重组蛋白、研究蛋白对细胞的作用、在体内表达之前评价疗效和/或安全性、和/或研究进展和医疗诊断和/或筛选方法。
[0207]
本发明的另一方面涉及在受试者中表达ube3a开放阅读框的方法，其包括向受试者递送本发明的多核苷酸、表达盒、载体和/或转化的细胞，从而在受试者中表达ube3a开放阅读框。在一些实施方案中，受试者是与异常ube3a基因表达相关的病症的动物模型。
[0208]
本发明的另一个方面涉及在需要其的受试者中治疗与ube3a基因的异常表达或ube3a基因产物(例如，e6ap)的异常活性相关的病症的方法，其包括对受试者递送治疗有效
量的本发明的多核苷酸、表达盒、载体和/或转化的细胞，从而治疗与受试者中ube3a基因的异常表达或ube3a基因产物的异常活性相关的病症。本发明提供了在需要其的受试者中治疗与ube3a基因的异常表达或ube3a基因产物(例如e6ap)的异常活性相关的病症的方法，其包括对受试者施用治疗有效量的本发明的多核苷酸、表达盒、载体和/或转化的细胞，使得ube3a开放阅读框在受试者中表达。在一些实施方案中，与ube3a基因或基因产物异常表达相关的病症可以是天使人综合征。
[0209]
本发明还提供了在需要其的受试者中治疗天使人综合征的方法，其包括对受试者施用治疗有效量的本发明的多核苷酸、表达盒、载体和/或转化的细胞，使得ube3a开放阅读框在受试者中表达。
[0210]
在某些实施方案中，将多核苷酸、表达盒、载体和/或转化的细胞递送至受试者，例如全身性递送(例如，静脉内)或直接递送至受试者的中枢神经系统(例如，通过鞘内或脑室内或小脑延髓池内注射递送至脑脊液)。在一些实施方案中，静脉内递送多核苷酸、表达盒、载体和/或转化的细胞。在一些实施方案中，脑室内递送多核苷酸、表达盒、载体和/或转化的细胞。
[0211]
根据本发明的重组病毒载体在兽医和医学应用中均实用。合适的受试者包括鸟类、爬行动物、两栖动物、鱼和哺乳动物。本文所用术语“哺乳动物”包括但不限于人类、灵长类、非人灵长类(例如，猴和狒狒)、牛、绵羊、山羊、猪、马、猫、犬、兔、啮齿动物(例如，大鼠、小鼠、仓鼠等)等。人类受试者包括胚胎、胎儿、新生儿、婴儿、青少年和成人。任选地，受试者“需要”本发明的方法，例如，因为受试者具有或被认为处于包括本文所述的疾病的风险，或者受益于包括本文所述的多核苷酸的递送。作为进一步的选择，受试者可以是实验动物和/或疾病的动物模型。优选地，受试者是人类。
[0212]
在某些实施方案中，例如，一旦受试者被诊断为具有异常的ube3a和/或e6ap表达或活性或任一上述疾病或病症，本发明的多核苷酸在需要其的受试者的一生中尽可能早地给予受试者。在一些实施方案中，例如在新生儿筛查已经鉴定出异常的ube3a和/或e6ap表达或活性之后，将多核苷酸施用于新生儿受试者。在一些实施方案中，在10岁之前，例如在1、2、3、4、5、6、7、8、9或10岁之前，向受试者施用多核苷酸。在一些实施方案中，将多核苷酸施用于10岁以上的青少年或成人受试者。在一些实施方案中，例如，在产前筛选已鉴定出异常的ube3a和/或e6ap表达或活性或存在上述疾病或病症之一之后，将多核苷酸施用于子宫内胎儿。在一些实施方案中，一旦受试者出现与异常ube3a和/或e6ap表达或活性相关的症状，或疑似或诊断为具有异常ube3a和/或e6ap表达或活性或上述疾病或病症之一，就将多核苷酸施用于受试者。在一些实施方案中，在受试者出现与异常ube3a和/或e6ap表达或活性或疾病/病症相关的症状之前，将多核苷酸施用于受试者，例如，疑似或诊断为具有异常ube3a和/或e6ap表达或活性或上述疾病或病症之一但尚未开始表现出症状的受试者。
[0213]
在特定实施方案中，本发明提供了药物组合物，其包含在药学上可接受的载体中的本发明的多核苷酸、表达盒、载体和/或转化的细胞，以及任选的其它药用制剂、药剂、稳定剂、缓冲剂、载体、佐剂、稀释剂等。对于注射，载体通常是液体。对于其他施用方法，载体可以是固体或液体。对于吸入施用，载体是可吸入的，并且将优选为固体或液体颗粒形式。在一些实施方案中，药物载体可以包含d-山梨醇(例如，pbs 5％(w/v)d-山梨醇)。
[0214]“药学上可接受的”是指没有毒性或没有其他不想要的物质，即该物质可以施用于
受试者而不引起任何不想要的生物效应。
[0215]
本发明的一个方面是将ube3a开放阅读框转移到体外细胞的方法。本发明的多核苷酸、表达盒和/或载体可以以适当的量导入细胞。根据适用于特定靶细胞的标准转导方法，可将病毒载体以适当的感染复数导入细胞。待施用的病毒载体或衣壳的滴度可根据靶细胞类型和数量以及特定病毒载体或衣壳而变化，并且可由本领域技术人员在没有过度实验的情况下确定。在特定实施方案中，将至少约103个感染单位，更优选至少约105个感染单位导入细胞。
[0216]
可导入本发明的多核苷酸、表达盒和/或载体(例如，病毒载体)的细胞可以是任何类型，包括但不限于神经细胞(包括外周和中枢神经系统的细胞，特别是脑细胞，例如神经元、少突胶质细胞、胶质细胞、星形胶质细胞)、肺细胞、眼细胞(包括视网膜细胞、视网膜色素上皮和角膜细胞)、上皮细胞(例如肠道和呼吸道上皮细胞)、骨骼肌细胞(包括成肌细胞、肌管和肌纤维)、膈肌细胞、树突状细胞、胰腺细胞(包括胰岛细胞)、肝细胞、胃肠道细胞(包括平滑肌细胞、上皮细胞)、心脏细胞(包括心肌细胞)、骨细胞(例如骨髓干细胞)、造血干细胞、脾细胞、角质形成细胞、成纤维细胞、内皮细胞、前列腺细胞、关节细胞(包括例如软骨、半月板、滑膜和骨髓)、生殖细胞等。或者，细胞可以是任一祖细胞。作为另一种选择，细胞可以是干细胞(例如，神经干细胞、肝干细胞)。还作为另一种选择，细胞可以是癌症细胞或肿瘤细胞。此外，细胞可以来自如上所述的任何来源的物种。
[0217]
本发明的多核苷酸、表达盒和/或载体，例如病毒载体，可以在体外导入细胞中，以用于将修饰的细胞施用于受试者的目的。在特定实施方案中，已经从受试者体内取出细胞，将本发明的多核苷酸、表达盒和/或载体(例如病毒载体)导入其中，然后将细胞再放回受试者体内。从待治疗的受试者体内取出细胞进行离体治疗，然后导回受试者体内的方法是本领域已知的(参见例如，美国专利号5,399,346)。或者，将本发明的多核苷酸、表达盒和/或载体，例如病毒载体，导入来自另一受试者的细胞、导入培养的细胞、或导入来自任何其它合适来源的细胞，并将细胞施用于需要其的受试者。
[0218]
用于离体基因治疗的合适细胞如上所述。施用于受试者的细胞剂量将根据受试者的年龄、状况和物种、细胞类型、由细胞表达的核酸、施用方式等而变化。通常，每剂将在药学上可接受的载体中施用至少约102至约108或约103至约106个细胞。在特定实施方案中，将有效量的经病毒载体离体转导的细胞与药物载体组合施用于受试者。
[0219]
本发明的另一方面是向受试者施用本发明的多核苷酸、表达盒和/或载体(例如，病毒载体)的方法。在特定实施方案中，该方法包括向动物受试者递送ube3a开放阅读框的方法，该方法包括：向动物受试者施用有效量的根据本发明的病毒载体。可以通过本领域已知的任何方式将本发明的病毒载体施用于需要其的人类受试者或动物。任选地，病毒载体在药学上可接受的载体中以有效剂量递送。
[0220]
待施用于受试者的病毒载体的剂量将取决于施用模式、待治疗的疾病或状况、个体受试者的条件、具体的病毒载体和待递送的核酸，并且可以以常规方式确定。实现治疗效果的示例性剂量是至少约102、103、104、105、106、107、108、109、10
10
、10
11
、10
12
、10
13
、10
14
、10
15
、10
16
个转导单位(tu)或更多的病毒滴度，例如约107、108、109、10
10
、10
11
、10
12
、10
13
、10
14
或10
15
tu，但更优选地，采用剂量约108至10
14
tu，或约10
10
、10
11
、10
12
、10
13
、10
14
或10
15
tu。剂量和病毒滴度转导单位可以按载体或病毒基因组(vg)和/或vg/kg受试者进行计算。在一些实施
方案中，剂量为至少约102、103、104、105、106、107、108、109、10
10
、10
11
、10
12
、10
13
、10
14
、10
15
、10
16
vg/kg受试者，例如约107、108、109、10
10
、10
11
、10
12
、10
13
、10
14
或10
15
vg/kg受试者，或约108至10
14
vg/kg受试者，在一些实施方案中为约10
10
、10
11
、10
12
、10
13
、10
14
或10
15
vg/kg受试者。
[0221]
在一些实施方案中，本发明的方法可以包括表达和/或以一定剂量(例如，病毒滴度)施用ube3a开放阅读框，使得ube3a短亚型与长亚型的表达相比以约1:1至约15:1的比例例如约1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、11:1、12:1、13:1、14:1或15:1或其中的任一数值或范围的比例表达。例如，在一些实施方案中，可以施用哺乳动物(例如，人)ube3a开放阅读框，使得ube3a短亚型与长亚型的表达相比以约2:1至约4.5:1、约1:1至约10:1、约3:1至约8.5:1或约3:1至约4:1的比例表达。在一些实施方案中，可以施用哺乳动物(例如，人)ube3a开放阅读框，使得短亚型与长亚型的表达相比以约2.5:1、约3:1、约4:1、约6.5:1、约8:1或约10:1的比例表达。
[0222]
在特定实施方案中，可以采用多于一次的施用(例如，两次、三次、四次或更多次施用)以在不同的时间间隔(例如，每天、每周、每月、每年等)内实现期望的基因表达水平。
[0223]
示例性施用方式包括口服、直肠、经粘膜、局部、鼻内、吸入(例如，通过气雾剂)、含服(例如，舌下)、阴道、鞘内、眼内、透皮、子宫内(或卵子内)、肠胃外(例如，静脉内、皮下、皮内、肌肉内)[包括骨骼肌、膈肌和/或心肌施用]、皮内、胸膜内、脑内和关节内)、局部(如对皮肤和粘膜表面包括气道表面，和透皮施用)、淋巴管内等，以及直接组织或器官注射(例如，对肝脏、骨骼肌、心肌、膈肌或大脑)。也可以向肿瘤施用(例如，在肿瘤或淋巴结中或附近)。在任何给定的情况下，最合适的途径将取决于所治疗状况的性质和严重程度以及所用特定载体的性质。在一些实施方案中，可以使用多于一种施用方式和/或途径，例如，实质内施用和脑室内施用。
[0224]
在一些实施方案中，将包含表达盒的载体(例如，病毒载体、aav载体)施用于cns、外周神经系统或两者。在一些实施方案中，将病毒载体直接施用于cns，例如脑或脊髓。直接施用可导致cns细胞转导的高特异性，例如，其中至少80％、85％、90％、95％或更多的转导细胞是cns细胞。可以使用本领域已知的将载体直接施用于cns的任一方法。可以将载体导入脊髓、脑干(延髓、脑桥)、中脑(下丘脑、丘脑、上丘脑、垂体、黑质、松果体)、小脑、端脑(纹状体、脑包括枕叶、颞叶、顶叶和额叶、皮质、基底神经节、海马和杏仁核)、边缘系统、新皮层、纹状体、大脑和下丘。也可以将载体施用于眼睛的不同区域，例如视网膜、角膜或视神经。可以将载体递送到脑脊液中(例如，通过腰椎穿刺)，以便更分散地施用载体。
[0225]
可以通过本领域已知的任一途径将包含表达盒的载体(例如，病毒载体、aav载体)施用至cns的所需区域，包括但不限于鞘内、脑内、脑室内、小脑延髓池内、实质内、鼻内、耳内、眼内(例如，玻璃体内、视网膜下、前房)和眼周(例如，眼球筋膜囊下区域)递送或其任何组合。
[0226]
可以以产生更广泛的、弥漫性的组织转导的方式施用载体，包括cns、外周神经系统和/或其他组织。
[0227]
通常，包含表达盒的载体(例如，病毒载体、aav载体)将以液体制剂的形式通过直接注射(例如，立体定向注射)至cns和/或其他组织中的所需区域或隔室进行施用。在一些实施方案中，载体可以通过储存器和/或泵递送。在其他实施方案中，载体可以通过局部施用到所需区域或通过经鼻内施用气溶胶制剂来提供。对眼睛或耳朵的给药可以通过局部施
用液滴来实现。作为另一替代方案，载体可以固态缓释制剂形式施用。国际专利公开号wo 01/91803描述了细小病毒和aav载体的控释。
[0228]
注射剂可以以常规形式制备，要么是液体溶液或悬浮液，要么是适合于注射前在液体中溶解或混悬的固体形式，或者是乳剂。或者，技术人员可以以局部而非全身方式施用病毒载体，例如以长效制剂或缓释制剂形式。此外，可以将病毒载体干燥后递送至可手术植入的基质，例如骨移植替代物、缝合线、支架等(例如，如美国专利7,201,898中所述)。
[0229]
适用于口服的药物组合物可以以分散单元存在，如胶囊、扁囊剂(cachet)、糖锭或片剂，每种含有预定量的本发明的组合物；以粉末或颗粒的形式存在；以在水性液体或非水性液体中的溶液或混悬液的形式存在；以水包油乳剂或油包水乳剂的形式存在。口服递送可以通过将本发明的病毒载体与能够耐受动物肠道中消化酶降解的载体络合来进行。此类载体的实例包括本领域已知的塑料胶囊或片剂。此类制剂通过任何合适的药学方法制备，其包括使组合物与合适载体(其可包含一种或更多种如上所述的辅助成分)结合的步骤。一般来说，根据本发明实施方案的药物组合物是通过将组合物与液体或细碎固体载体或两者均匀和紧密地混合，然后，如果需要，将所产生的混合物成形来制备。例如，片剂可通过压制或模制含有组合物的粉末或颗粒来制备，任选地含有一种或更多种辅助成分。压制片剂是通过在合适的机器中压制自由流动形式的组合物(例如任选地与粘合剂、润滑剂、惰性稀释剂和/或表面活性/分散剂混合的粉末或颗粒)来制备。模制片是通过在合适的机器中模制用惰性液体粘合剂润湿的粉末状化合物制成的。
[0230]
适用于含服(舌下)施用的药物组合物包括在调味基中含有本发明组合物的糖锭，通常是蔗糖和阿拉伯胶或黄蓍胶；以及在惰性基质中含有组合物的锭剂，例如明胶和甘油或蔗糖和阿拉伯胶。
[0231]
适用于肠胃外给药的药物组合物可包含本发明的组合物的无菌水性和非水性注射溶液，该制剂任选地与预期受体的血液等渗。这些制剂可以含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和溶质，使组合物与预期受体的血液等渗。水性和非水性无菌悬浮液、溶液和乳液可以包括悬浮剂和增稠剂。非水溶剂的实例是丙二醇、聚乙二醇、植物油(如橄榄油)和可注射有机酯(如油酸乙酯)。水性载体包括水、醇/水溶液、乳液或悬浮液，包括盐水和缓冲介质。肠胃外媒介物包括氯化钠溶液、林格氏葡萄糖、葡萄糖和氯化钠、乳酸林格氏液或固定油。静脉内媒介物包括液体和营养补充剂、电解质补充剂(例如基于林格氏葡萄糖的补充剂)等。还可能存在防腐剂和其他添加剂，诸如例如，抗菌剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体等。
[0232]
组合物可以存在于单位剂量或多剂量容器中，例如，在密封的安瓿和小瓶中，并可储存在冻干条件下，其仅需要在使用前立即加入无菌液体载体，例如盐水或注射用水。
[0233]
即配即用的注射溶液和悬浮液可以由前述种类的无菌粉末、颗粒和片剂制备。例如，可以提供在密封容器中的可注射的、稳定的、无菌的单位剂量的本发明组合物。该组合物可以冻干物的形式提供，其可以用合适的药学上可接受的载体重构以形成适合注射到受试者中的液体组合物。单位剂型可为约1μg至约10g的本发明组合物。当组合物基本上不溶于水时，可以包括足够量的生理上可接受的乳化剂，以使该组合物在水性载体中乳化。磷脂酰胆碱就是这样一种有用的乳化剂。
[0234]
适用于直肠施用的药物组合物可以单位剂量栓剂存在。这些可以通过将组合物与一种或更多种常规固体载体(例如可可脂)混合，然后将所得混合物成形来制备。
[0235]
适用于皮肤局部应用的本发明的药物组合物可以采用软膏、霜剂、洗剂、糊剂、凝胶、喷雾剂、气雾剂或油剂的形式。可以使用的载体包括但不限于凡士林、羊毛脂、聚乙二醇、醇、透皮促进剂及其两种或更多种的组合。在一些实施方案中，例如，局部递送可以通过将本发明的药物组合物与能够进入皮肤的亲脂性试剂(例如，dmso)混合来进行。
[0236]
适用于透皮施用的药物组合物可以是离散贴剂的形式，其适于长时间与受试者的表皮保持紧密接触。适用于透皮施用的组合物也可以通过离子电渗疗法递送(例如，参见pharm.res.3:318(1986))，通常采用本发明组合物的任选缓冲水溶液形式。合适的制剂可包含柠檬酸盐或双\三缓冲液(ph6)或乙醇/水，并可含有0.1m至0.2m的活性成分。
[0237]
本文公开的病毒载体可通过任何合适的方式施用于受试者的肺部，例如，通过施用包含病毒载体的可吸入颗粒的气溶胶悬浮液(其被受试者吸入)。可吸入颗粒可以是液体或固体。如本领域技术人员所知，包含病毒载体的液体颗粒的气溶胶可以通过任何合适的方式产生，例如使用压力驱动的气溶胶雾化器或超声波雾化器。例如，参见美国专利号4,501,729。包含病毒载体的固体颗粒的气溶胶同样可以通过医药领域中已知的技术使用任何固体颗粒药物气溶胶发生器产生。
[0238]
本发明可以如以下任一编号的段落中所定义。
[0239]
1.一种多核苷酸，其包含人ube3a开放阅读框，其中所述人ube3a开放阅读框编码人ube3a短亚型和长亚型。
[0240]
2.根据段落1所述的多核苷酸，其中所述人ube3a开放阅读框编码人ube3a短亚型(即，亚型1)和长亚型2。
[0241]
3.根据段落1所述的多核苷酸，其中所述人ube3a开放阅读框编码人ube3a短亚型(即，亚型1)和长亚型3。
[0242]
4.根据段落1-3中任一项所述的多核苷酸，其包含的人ube3a开放阅读框与缺少一个或更多个降低表达的核苷酸修饰的天然orf的表达相比，包含一个或更多个降低所述长亚型的表达的核苷酸修饰。
[0243]
5.根据段落4所述的多核苷酸，其中所述长亚型的表达与不包含降低表达的核苷酸修饰的天然orf相比降低至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％。
[0244]
6.根据段落1-5中任一项所述的多核苷酸，其中与不包含增强表达的核苷酸修饰的天然orf相比，所述人ube3a开放阅读框包含一个或更多个增强所述短亚型的表达的核苷酸修饰(例如，使表达增强10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或更多)。
[0245]
7.根据段落6所述的多核苷酸，其中与不包含增强表达的核苷酸修饰的天然orf相比，所述短亚型的表达增强至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％。
[0246]
8.根据段落1-7中任一项所述的多核苷酸，其中所述人ube3a开放阅读框包含一个或更多个核苷酸修饰来编码所述短亚型，使其与所述长亚型的表达相比以约1:1至约15:1的比例表达。
[0247]
9.根据段落1-8中任一项所述的多核苷酸，其包含可操作地连接至所述长亚型的编码序列的第一kozak序列，所述第一kozak序列包含seq id no:6。
[0248]
10.根据段落1-9中任一项所述的多核苷酸，其包含可操作地连接至所述短亚型的编码序列的第二kozak序列，所述第二kozak序列包含seq id no:8。
[0249]
11.根据段落1-10中任一项所述的多核苷酸，其中所述人ube3a开放阅读框针对在人细胞中表达被密码子优化。
[0250]
12.根据段落12所述的多核苷酸，其中所述人ube3a开放阅读框针对在人细胞中的细胞内表达或非分泌性表达被密码子优化的。
[0251]
13.根据段落1-12中任一项所述的多核苷酸，其中所述人ube3a开放阅读框包含核苷酸序列seq id no:9、seq id no:25或seq id no:26，或与其具有至少约70％、75％、76％、77％、80％、85％或90％同一性的核苷酸序列。
[0252]
14.一种表达盒，其包含段落1-13中任一项所述的多核苷酸。
[0253]
15.根据段落14所述的表达盒，其中所述人ube3a开放阅读框可操作地连接至启动子。
[0254]
16.根据段落15所述的表达盒，其中所述启动子是神经元特异性启动子。
[0255]
17.根据段落15或16所述的表达盒，其中所述启动子是人突触素启动子。
[0256]
18.根据段落14-17中任一项所述的表达盒，其中所述人ube3a开放阅读框可操作地连接至多聚腺苷酸化信号。
[0257]
19.根据段落18所述的表达盒，其中所述多聚腺苷酸化信号是牛生长激素(bgh)多聚腺苷酸化信号(bghpa)。
[0258]
20.根据段落14-19中任一项所述的表达盒，其还包含至少一个腺相关病毒(aav)反向末端重复序列(itr)。
[0259]
21.根据段落20所述的表达盒，其中所述表达盒包含两个aav itr。
[0260]
22.根据段落21所述的表达盒，其中所述aav itr选自由以下组成的组：aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aaav8、aav9、aav10、aav11、aav12和aav13 itr。
[0261]
23.根据段落22所述的表达盒，其中所述aav itr是aav2 itr。
[0262]
24.根据段落14-23中任一项所述的表达盒，其中所述表达盒是单链aav基因组。
[0263]
25.根据段落14-24中任一项所述的表达盒，其中所述表达盒包含启动子、人ube3a开放阅读框和多聚腺苷酸化位点。
[0264]
26.根据段落14-25中任一项所述的表达盒，其中所述表达盒包含aav itr、启动子、人ube3a开放阅读框、多聚腺苷酸化位点和aav itr。
[0265]
27.根据段落14-26中任一项所述的表达框，其中所述表达框包含aav2 itr、人突触素启动子、包含人ube3a短亚型和长亚型2的人ube3a开放阅读框、bghpa和aav2 itr。
[0266]
28.根据段落14-26中任一项所述的表达盒，其中所述表达盒包含aav2 itr、人突触素启动子、包含人ube3a短亚型和长亚型3的人ube3a开放阅读框、bghpa和aav2 itr。
[0267]
29.根据段落14-28中任一项所述的表达盒，其中所述表达盒包含aav2 itr、人突触素启动子、包含人ube3a短亚型和长亚型2、还包含一个或更多个kozak序列的人ube3a开放阅读框、bghpa和aav2 itr，所述kozak序列包含seq id no:6和/或seq id no:8、基本上由seq id no:6和/或seq id no:8组成或由seq id no:6和/或seq id no:8组成。
[0268]
30.根据段落14-28中任一项所述的表达盒，其中所述表达盒包含aav2 itr、人突触素启动子、包含人ube3a短亚型和长亚型3、还包含一个或更多个kozak序列的人ube3a开
放阅读框、bghpa和aav2 itr，所述kozak序列包含seq id no:6和/或seq id no:8、基本上由seq id no:6和/或seq id no:8组成或由seq id no:6和/或seq id no:8组成。
[0269]
31.根据段落30所述的表达盒，其包含核苷酸序列seq id no:14或与其至少约90％相同的序列。
[0270]
32.一种载体，其包含段落1-13中任一项所述的多核苷酸或段落14-31中任一项所述的表达盒。
[0271]
33.根据段落32所述的载体，其中所述载体是嗜神经载体。
[0272]
34.根据段落32或33所述的载体，其中所述载体是病毒载体。
[0273]
35.根据段落34所述的载体，其中所述载体是aav载体。
[0274]
36.根据段落34所述的载体，其中所述aav载体选自由以下组成的组：aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9、aav10、aav11、aav12、aav13及其组合。
[0275]
37.根据段落35所述的载体，其中所述aav载体是aav9或aav9来源的载体。
[0276]
38.根据段落37所述的载体，其中所述aav9来源的载体是php.b、php.eb或aav9.hr。
[0277]
39.一种转化的细胞，其包含段落1-13中任一项所述的多核苷酸、段落14-31中任一项所述的表达盒和/或段落32-38中任一项所述的载体。
[0278]
40.根据段落39所述的转化的细胞，其中所述多核苷酸、表达盒和/或载体被稳定整合到细胞基因组中。
[0279]
41.一种转基因动物，其包含段落1-13中任一项所述的多核苷酸、段落14-31中任一项所述的表达盒、段落32-38中任一项所述的载体和/或段落39或40所述的转化的细胞。
[0280]
42.一种药物组合物，其在药学上可接受载体中包含段落1-13中任一项所述的多核苷酸、段落14-31中任一项所述的表达盒、段落32-38中任一项所述的载体和/或段落39或40所述的转化的细胞。
[0281]
43.一种在细胞中表达ube3a开放阅读框的方法，其包括使细胞与段落1-13中任一项所述的多核苷酸、段落14-31中任一项所述的表达盒和/或段落32-38中任一项所述的载体接触，从而使ube3a开放阅读框在所述细胞中表达。
[0282]
44.一种在受试者中表达ube3a开放阅读框的方法，其包括将段落1-13中任一项所述的多核苷酸、段落14-31中任一项所述的表达盒、段落32-38中任一项所述的载体和/或段落39或40所述的转化的细胞递送给受试者，从而使所述ube3a开放阅读框在所述受试者中表达。
[0283]
45.一种在需要其的受试者中治疗与ube3a基因的异常表达或ube3a基因产物的异常活性相关的病症的方法，其包括对所述受试者施用治疗有效量的段落1-13中任一项所述的多核苷酸、段落14-31中任一项所述的表达盒、段落32-38中任一项所述的载体和/或段落39或40所述的转化的细胞，使得所述ube3a开放阅读框在所述受试者中表达。
[0284]
46.根据段落45所述的方法，其中与ube3a基因表达相关的所述病症为天使人综合征。
[0285]
47.一种在需要其的受试者中治疗天使人综合征的方法，其包括对所述受试者施用治疗有效量的段落1-13中任一项所述的多核苷酸、段落14-31中任一项所述的表达盒、段落32-38中任一项所述的载体和/或段落39或40所述的转化的细胞，使得所述ube3a开放阅
读框在所述受试者中表达。
[0286]
48.根据段落43-47中任一项所述的方法，其中所述人ube3a短亚型与所述亚型的表达相比以约1:1至约15:1的比例表达。
[0287]
49.根据段落44-48中任一项所述的方法，其中所述受试者在递送所述多核苷酸、表达盒、载体和/或转化的细胞之前表现出疾病的症状。
[0288]
50.根据段落44-49中任一项所述的方法，其中所述多核苷酸、表达盒、载体和/或转化的细胞被递送至子宫内。
[0289]
51.根据段落44-50中任一项所述的方法，其中所述受试者是人类。
[0290]
52.根据段落44-51中任一项所述的方法，其中所述多核苷酸、表达盒、载体和/或转化的细胞被递送至所述受试者的神经系统。
[0291]
53.根据段落44-52中任一项所述的方法，其中所述aav载体以至少约102、103、104、105、106、107、108、109、10
10
、10
11
、10
12
、10
13
、10
14
、10
15
或10
16
病毒基因组/千克，任选地108至10
14
病毒基因组/千克的剂量施用至受试者。
[0292]
54.根据段落52所述的方法，其中所述多核苷酸、表达盒、载体和/或转化的细胞通过静脉内递送。
[0293]
55.根据段落52所述的方法，其中所述多核苷酸、表达盒、载体和/或转化的细胞通过鞘内、脑内、小脑延髓池内、实质内、脑室内、鼻内、耳内、眼内或眼周递送或其任意组合来递送。
[0294]
56.根据段落55所述的方法，其中所述多核苷酸、表达盒、载体和/或转化的细胞通过鞘内递送。
[0295]
57.根据段落55所述的方法，其中所述多核苷酸、表达盒、载体和/或转化的细胞通过脑室内递送。
[0296]
已经描述了本发明，将在以下实施例中更详细地解释本发明，本文包含的实施例仅用于说明的目的，并不旨在限制本发明。
实施例
[0297]
实施例1：用于细胞内表达的人ube3a密码子优化构建体的生成。
[0298]
设计了一种新的天使人综合征疗法，其能够以适当的表达比例共同递送短ube3a亚型和长ube3a亚型(即，人亚型1(也称为“短”)和人亚型3(也称为“长”))，本文称为php.b/syn-ube3a，其包含开放阅读框(orf)hube3a_亚型1》》3。这是一个重要的技术优势，因为病毒载体包装限制通常只允许一种亚型的表达。该构建体克服了两个主要挑战：(1)将ube3a广泛递送至整个脑；和(2)避免可能与自闭症的综合征形式(dup15q综合征)相关联的ube3a过表达。aav9来源的衣壳，在生命早期递送时，可以在整个大脑中广泛转导神经元。虽然有其他aav衣壳可能在非人灵长类动物和人类的大脑中实现更广泛的基因转移，但是选择aav9来源的衣壳以关注限制ube3a过表达。
[0299]
此外，该构建体是为了细胞内(例如，细胞质和/或核)表达ube3a而产生的，与其他实验室中进行的一些工作不同，因为它不包含外源性添加的分泌信号，从而阻止细胞外表达和分泌形式ube3a的产生。虽然不希望受理论的束缚，但据信这种导致分泌性ube3a的ube3a工程化将去除调节适当水平的ube3a表达的能力，这可能导致危险的过表达。ube3a的
de heus等人，am j med genet a，2020:182(1):53-63)一致。在as aav组中，php.b/hube3a治疗完全挽救了该表型。
[0306]
进一步检测新生儿icv php.b/hube3a治疗挽救高渗透和重现性as小鼠模型缺陷的能力(图10的图a；rotaru等人,neuroscience,2020:epub印刷前)。图10的图b显示了未被基因治疗影响的as 媒介物小鼠的运动功能减退趋势。as 媒介物和as aav在旋转杆任务的首次试验中表现出类似的不良表现，表明as中一定程度的运动功能障碍可能对新生儿icv php.b/hube3a治疗无动于衷。然而，重复的旋转杆测试显示，在as aav小鼠中，运动学习能力和可塑性得到了恢复，在连续的采集试验中提高了运动性能，并随着时间的推移保持在接近对照水平(图10的图c)。
[0307]
在as小鼠中，挖洞和筑巢等先天行为也是已知的严重缺陷(rotaru等人，neuroscience,2020:epub印刷前)。图10的图d和图e显示，这些表型在as 媒介物小鼠中重复出现，如通过它们与wt 媒介物对照相比在成熟的弹珠掩埋和筑巢测定中表现差证明的。在as aav组中，这些表型的外显率大大降低，许多个体受试者以对照水平执行任务。然而，有一小子集的as aav差应答者在弹珠掩埋数据的散布中尤其明显。这些结果需要对hube3a生物分布进行仔细的事后分析，以确保不会因为技术错误(注射靶向或扩散差)而低估治疗的真实功效，这会混淆行为挽救的测量结果。
[0308]
图11显示了as 媒介物小鼠的严重致痫的证据，其通过氟替尔癫痫发作点燃和再激发被揭示。这一结果与之前的研究(gu等人，j clin invest,2018:129(1):163-168)的结果一致，其中as小鼠对点燃后一个月再次暴露于氟替尔表现出类似的增高的敏感性。此外，在出生后发育过程中，可通过他莫昔芬诱导的ube3a恢复挽救as小鼠中过度的癫痫发生，因此，新生儿icv php.b/hube3a治疗使as aav小鼠对氟替尔再激发易于恢复(图11的图b)。
[0309]
脑回路的解剖和生理学变化定义癫痫发生。氟替尔点燃的as小鼠显示海马中神经元周围网络(pnn)沉积增强，特别是在齿状回的分子层中(gu等人，j clin invest,2018:129(1):163-168)。图12的图a显示，这种异常pnn表型在as 媒介物小鼠中也是外显的，但在as aav小鼠中完全被挽救。反应性星形胶质细胞增生是致痫灶的另一个标志。图12的图b显示，在as 媒介物小鼠的海马中，强烈gfap染色的星形胶质细胞急剧增加，这证明在as aav组中是完全正常化的。总之，这些研究提供了补强证据，表明新生儿icv php.b/hube3a治疗在改善as的癫痫发作结局方面可能非常有效。
[0310]
在这些研究中，wt aav小鼠用作ube3a过表达耐受性的事实检验(de facto test)。在大多数情况下，wt aav和wt 媒介物组的表现相似，表明由php.b/hube3a治疗导致的ube3a过表达相对良好耐受。然而，wt aav小鼠的确被证明为中等高运动性(图10的图b)，并且它们在弹珠掩埋任务中表现欠佳(图10的图d)。因此，某些行为和潜在的神经回路可能比其他的更容易受到ube3a过表达的影响。
[0311]
实施例3：体外和体内人源化细胞的构建体治疗。
[0312]
将实施例1中所述的构建体体外递送至患者来源的ipsc，其已分化为神经元并表现出as细胞表型。然后，与未接受构建体的合适对照细胞相比，观察受体细胞特征性as细胞表型的逆转情况。
[0313]
as ipsc系可由患者外周皮肤或血细胞产生，其多能性由表达关键转录因子oct4、sox2、klf4、myc和lin28的逆转录病毒或慢病毒载体赋予(takahashi等人，cell,2007:131:
861-872；sommer等人，stem cells,2008:27:543-549)。在某些制剂中，crispr/cas9编辑可用于将导致ube3a缺失的as引入来自神经典型患者的ipsc，从而产生新的as-ipsc系，并伴有等基因对照。根据既定方案，可使用含有补充剂和神经生长因子的神经诱导培养基使as ipsc分化为神经元(chamberlain等人，proc.natl.acad.sci.,2010:107:17668-17673)。
[0314]
已显示患者来源的as神经元表现出电生理特性(包括静息膜电位的超极化和动作电位的激发)的特征性延迟成熟，这可以通过药物使父源ube3a不再沉默挽救(fink等人，nat.comm.,2017:apr 24；8:15038)。类似地，将该构建体递送到患者来源的as神经元(体外和体内)，以恢复hube3a的表达并纠正电生理学成熟的延迟。对于非人灵长类动物和人类的概念验证治疗，在1至3名患者的早期干预阶段(即，小于2岁)递送构建体，基于安全性和疗效研究按需要增加剂量。将评估临床获益和安全性(即，与合适的对照比较)。
[0315]
前述实施例是对本发明的说明，不应理解为对其的限制。尽管已参考优选实施方案详细描述了本发明，但是在如以下权利要求书所述和限定的本发明的范围和精神内存在变化和修改。