血液循环肿瘤细胞病理芯片的制作方法与流程

1.本发明涉及血液循环肿瘤细胞 (circulating tumor cell, ctc) 的检测，更具体涉及对血液样品中的循环肿瘤细胞进行染色，然后将其制作在病理芯片中进行形态学诊断和生物学鉴定。本发明还涉及用于执行上述方法的病理芯片和试剂盒。


背景技术：

2.常规的细胞病理学（cytology）病理玻片的制备方法一般是利用患者血液和其他体液 (1) 直接在载玻片上涂片，(2) 或者通过离心力把液体中的细胞固定在载玻片上（cytospin），(3)或者通过离心过程把液体中的细胞形成沉淀物（cell block），再进行常规病理切片处理，然后由病理医生在显微镜下观察细胞，进行细胞病理学诊断。
3.血液循环肿瘤细胞 (ctc)以极低频率（平均1个ctc/ml血液）存在于癌症患者的血液中。如果单纯用涂片制备方法检测10毫升癌症患者血液，那需要制备200张血涂片，无法在临床上推广。离心制备离心涂片（cytospin）也存在同样问题。如果利用所有的细胞沉淀物 (cell block) 制备病理切片，只能在切片上观察少部分的沉淀细胞，不适合极少量的循环肿瘤细胞的检测。因此，常规的细胞病理学玻片的制备方法显然无法在临床上筛查患者血液中的循环肿瘤细胞，从而不能对肿瘤或者肿瘤转移进行检测。
4.为了解决ctc在血液中频率低的问题，现有技术采用了富集方法。例如，cn109507427a公开了富集ctc的方法，其中通过加入偶联有生物素的cd45单抗和偶联有链霉亲和素的磁珠，将白细胞吸附在磁珠上之后通过除去磁珠富集循环肿瘤细胞。但是，磁珠和磁力会对肿瘤细胞产生破坏，而且沉降白细胞的过程会裹挟稀少的肿瘤细胞而导致肿瘤细胞丢失，使得原本就很稀有的ctc细胞变得更少。并且磁珠在富集过程中会对ctc进行物理性接触，在磁场中通过结合的膜蛋白对ctc进行物理牵扯，会影响ctc的形态学特点，严重影响细胞的病理形态学诊断。
5.在得到血液循环肿瘤细胞后，需要对这些稀少的肿瘤细胞进行细胞病理学鉴定。细胞病理学常规染色方法包括巴氏（papanicolaou）、瑞氏-吉姆萨 （wright-giemsa）、h&e等。目前最常用的是迪夫快速染色 （diff-quik），其染液是采用世界卫生组织(who)推荐的快速染色方法而配制，与瑞氏-吉姆萨类似都是利用巴氏技术原理改良而来的。染色结果可以显示细胞膜的特点，比如细胞皱褶、细胞囊泡；细胞质的粘液、脂肪颗粒、神经内分泌颗粒；细胞核的特点，包括细胞核的形态和大小、核仁的数目和形状、染色体数目、染色质的质地，为细胞病理学家提供细胞形态学诊断信息。
6.随着科学和技术的发展，细胞病理学家需要对细胞的蛋白或者核酸标志物进行免疫组化染色或者核酸显色原位杂交染色，来进一步帮助诊断、判断预后，和选择药物。但是，血液循环肿瘤细胞样本经过常规形态学染色以后，无法再进一步进行细胞免疫组化或者核酸显色原位杂交染色。这个临床痛点是由以下原因造成的：1）常规细胞病理学染色方法的染料会影响第一抗体或者第一探针和相关靶点的结合，因此需要清洗这些染色，才能更好地实现生物标记物的免疫组化染色。2）清洗后，常常需要
与常规相比更高浓度的蛋白抗体或者核酸探针来进行染色，容易造成假阳性，误导临床诊断、治疗和判断预后。3）细胞涂片在染色过程中处在一个开放的环境，在染色过程中染色液体要不断更换，冲洗，随后丢弃。随着对染色液和冲洗液的不断更换和丢弃，会造成病理玻片上细胞样本脱落而丢失，影响结果的准确性。循环肿瘤细胞本来数目就非常稀少，任何非特异性的流失，都会对检测结果有重大影响。4）即使个别情况下不需要去除常规染色，免疫组化染色或者显色原位杂交染色过程可导致常规染料脱落，导致常规染色下的细胞形态学特点观察效果不佳。5）通常的免疫组织化学或者核酸显色原位杂交染色，为了提高染色的敏感性，会尽量提升化学染色的过程，会造成显色产物过度集中堆积而覆盖细胞，影响观察形态学的诊断。
7.由于以上所述的技术困难，加上血液循环肿瘤细胞非常稀少，目前的常规做法是或者进行细胞的病理形态学鉴定，或者进行细胞肿瘤标志物鉴定，只能选择其中一种方法。例如，cn109239030a公开了对富集的ctc细胞进行免疫荧光染色的方法检测肿瘤的标志物。但是，该方法中是先将细胞固定在载玻片上，在开放系统中对载玻片进行数次冲洗后再进行染色，这样在染色过程中细胞就会有损失，使得原本就很稀有的ctc细胞变得更少。此外，该专利申请使用的是免疫荧光染色，需要荧光显微镜和其他特殊扫描设备，更不能提供可用来病理诊断的细胞形态学特点。
8.因此，本领域需要更好的富集和染色方法来避免稀有的ctc的损失和更有效的鉴定方法。
9.因此，本领域仍然需要用于对ctc进行检测的更方便、有效的装置和方法。


技术实现要素：

10.本发明把癌症患者外周静脉血中的循环肿瘤细胞，形态完整地呈现在病理芯片上，从而能够在普通光学显微镜下，在同一个靶向细胞上，同时提供可用来病理诊断的细胞形态学特点和肿瘤标志物，显示循环肿瘤细胞的个数、病理形态学特点、和肿瘤特异性抗原表达，来指导临床对癌症的诊断和治疗。
11.本发明是通过样本预处理、细胞免疫组化染色和/或显色原位杂交，和病理芯片制作三大部分来实现的。
12.本发明样本预处理过程的核心，是在循环肿瘤细胞形态学和数量上不受影响的前提下，大量减少血液中的红细胞和白细胞数目，使靶向的循环肿瘤细胞制备在1张或者多张病理芯片上，直接在普通光学显微镜下进行细胞病理学鉴定，适合常规的病理科工作流程。
13.本发明涉及细胞病理学领域的一种创新的细胞多重染色方法，可以在同一个样本细胞上，同时显示详细的、可用来病理诊断的细胞形态学特点，和一个或者多个特定生物标记物的表达信息。染色结果适合在普通光学显微镜下观察，在符合病理学家对细胞病理形态学诊断要求的前提下，可以同时观察一个或者多个特定生物标志物在同一细胞上的表达。染色过程不丢失细胞，适合少量细胞样本的多重染色。
14.本发明解决了细胞病理常规染色和生物标志物多重染色的技术困难，对细胞进行免疫组化或者核酸显色原位杂交染色以后，再对同一细胞进行细胞病理学常规染色。最终可以在同一细胞上，在普通光学显微镜下，同时得到诊断级别的细胞形态学特点，和生物标志物的多重信息。染色结果可以显示细胞病理学诊断所需要的形态学特点，包括但不局限
于：细胞膜的形态比如细胞膜皱褶和细胞形态；细胞质的粘液、脂肪颗粒、神经内分泌颗粒；细胞核的特点，包括细胞核的形态和大小、核仁的数目和形状、染色质的质地。该方法清晰地为细胞病理学家提供细胞形态学诊断的基本信息，同时结合了一个或者多个生物标记物在同一个细胞上的表达信息，有助提高细胞病理学诊断的准确性。
15.常规的免疫组化染色或/和显色原位杂交都是以病理玻片为载体来进行的，常规病理玻片上细胞蛋白标记物的表达是通过免疫化学的方法来实现的。通过对病理玻片上的样本加入第一抗体，能够特异性识别第一抗体的显色酶标记的第二抗体，再加入相应的显色酶底物，经过显色酶的催化反应，最终通过产生的显色产物沉淀，在病理玻片显示某种特异性生物标志物在细胞中的表达信号。
16.常规病理玻片上细胞核酸标志物表达是通过核酸显色原位杂交染色的方法来观察的。通过对病理玻片上的样本加入特异性的核酸片段作为原始核酸探针，再加入能够识别原始探针的显色酶标记的特殊试剂，随后加入相应的显色酶底物，经过显色酶的催化反应，最终产生显色产物沉淀，在病理玻片上显示某种特异性核酸在细胞中的表达信号。
17.以上两种方法的最大区别是一个使用抗体，一个使用核酸探针进行初始标记，随后的显色反应原理一致。经过病理制片以后都可以在普通光学显微镜下观察，来帮助病理医生做进一步的诊断。
18.现有的免疫组化和显色原位杂交染色技术对细胞病理学样本来说有以下缺点：1） 细胞病理学样本的核心是细胞，经涂片等方法将每一个细胞单独吸附或者放置在病理玻片上，形成所谓的细胞涂片。细胞涂片样本在染色过程中处在一个开放的环境，在染色过程中染色液体要不断更换，冲洗，随后丢弃。随着对染色液和冲洗液的不断更换和丢弃，不可避免会造成病理玻片上细胞样本脱落而丢失，降低染色结果的敏感性和准确性，容易产生假阴性，尤其在样本包含少量细胞数目的情况下。
19.2） 常规细胞病理学免疫组化染色和核酸显色原位杂交以病理玻片为细胞样本的载体，要求细胞样本和病理玻片两者直接紧密接触，之间不能有间隙而导致细胞从玻片上脱落。但染色液因此也无法到达细胞和玻片接触的位置，在细胞和玻片的接触部位形成染色盲区，从而不能把细胞全方位充分染色，留有染色死角，影响染色结果的敏感性和准确性。
20.3） 免疫组化和显色原位杂交的显色反应在病理玻片上进行，经催化反应产生光学可见的显色产物，在细胞水平上集中沉淀在显色酶附近，成为靶向生物标志物的表达信号。沉淀的显色产物不透光，如果在细胞上沉积过多过密，在普通光学显微镜下观察时，显色产物会覆盖细胞相态学的特点，影响细胞的病理形态学诊断。
21.发明人在免疫组化和显色原位杂交的染色过程中，采用了新型改良的细胞免疫组化和核酸显色原位杂交的染色方法。
22.1） 改变的染色顺序和流程：采用对细胞样本先染色，再涂片的方法。传统的细胞免疫组化和核酸显色原位杂交染色是以病理玻片为载体，细胞样本先涂片固定，再对固定在病理玻片上的细胞进行染色。
23.本发明不用病理玻片为载体染色，而是把样本细胞放置在一个容器中，以细胞悬液的形式进行染色，染好细胞以后再进行涂片固定，显微镜下观察。在样本细胞固定的顺序上，和常规的方法相反。
24.2） 改良的换液和冲洗手段，避免细胞样本的丢失。常规的免疫组化染色或者核酸显色原位杂交都是在病理玻片上进行，细胞涂片在染色过程中处在一个开放的环境，在染色过程中染色液体要不断更换，冲洗，随后丢弃。随着对染色液和冲洗液的不断更换和丢弃，会造成病理玻片上细胞样本脱落而丢失，不可避免会影响样本的最终诊断。
25.在本发明中，发明人把细胞放置于一个容器中，在细胞悬液中完成第一抗体或者核酸探针的孵育，和显色反应等染色过程。在多次变换染色试剂和冲洗液的过程中，通过离心沉淀细胞样本，或者细胞样本通过蛋白吸附的微流通道，或者把细胞样本包含在只能通过高分子蛋白而不能通过完整细胞的微孔膜容器内等手段，使丢弃的上清冲洗液中没有靶向细胞，极大幅度地减少了临床细胞样本在染色过程中的流失。完成全部染色以后，再把染好的细胞涂布在病理玻片上，保证结果的稳定可靠。
26.3） 改变的染色环境避免传统染色方法细胞上的染色盲区。传统的免疫组化和核酸显色原位杂交，是在病理玻片上进行染色的。染色试剂无法到达细胞和玻片的接触部位，形成染色盲区和死角。
27.为使样本细胞能够充分染色，避免细胞上的染色盲区和死角，发明人在染色和化学显色过程中，不用病理玻片为载体，始终让细胞在悬液状态下，充分浸泡和接触在不同的染色试剂中，没有染色盲区和死角，提高细胞的染色效果，对提高染色的敏感性，降低染色的假阴性率，有显而易见的帮助。
28.4） 改良的化学显色方法使显色产物分布均匀。常规的免疫组化染色和核酸显色原位杂交是在病理玻片上进行的，显色反应在固定的组织上进行，催化产生的显色沉淀产物容易在局部集中堆积，因为其不透明，可以遮盖细胞细微结构的形态学特点，影响细胞病理学的形态学诊断。
29.发明人在显色过程中，不断震荡悬浮在液体中的细胞，使催化产生的显色沉淀产物均匀散开，不集中堆积而影响光学路径的通畅。使催化产生的显色产物在细胞上分布合理，既能够显示生物标记物的表达信息，又不妨碍细胞形态学的诊断，大幅提高病理学家对细胞相态学诊断的准确性。
30.5） 改进的更有效的消除染色背景噪音的方法。常规的免疫组化染色和核酸显色原位杂交是在病理玻片上进行的，显色反应在固定的组织上进行，各种染色试剂会非特异性沉淀吸附在病理玻片或者细胞组织上。细胞和玻片接触的部位也可以产生染色过程中所谓的边缘效应，造成染色成分的非特异性吸附和沉淀。需要在病理玻片上多次彻底冲洗，才能消除非特异性的试剂吸附和沉淀，也增加细胞脱落而丢失的可能性。
31.本发明在完成染色反应后，在细胞悬液中对单个细胞全方位无盲区无死角充分冲洗，同时因为不存在病理玻片上的非特异性沉积和边缘效应这些不良环节，能够大幅降低病理玻片上的非特异性背景染色噪音。对提高细胞的染色效果，提高染色的敏感性，降低染色结果的假阳性率，有显而易见的帮助。
32.发明人针对循环肿瘤细胞表面含有众多细胞突触，在粗糙表面移动时，和细胞表面光滑的白细胞有着明显速度差的特点，利用纳米材料，结合微流控技术，全球独创研制了我们特有的循环肿瘤病理芯片。这种病理芯片系统独立，具有一次性的特点，避免交叉污染，提高检测的准确性。芯片之间可以相互串联。可以根据样本中细胞数目的多少，制造一张或者多张病理芯片，能够保证所有的循环肿瘤细胞都被呈现在病理芯片上。在我们特制
的材料填充微流通道以后，避免微流通道的折射，保持光学路径通畅，可以在常规显微镜下直接观察，符合常规的病理科工作流程。
33.现有技术例如cn109239030a和cn102313813a公开了用显微镜观察肿瘤细胞玻片，但其中的玻片并没有本发明芯片中的微流通道和吸附材料，因此无法实现进一步分离ctc与白细胞以及吸附白细胞的作用。
34.具体地，本发明涉及以下技术方案：一方面，本发明涉及对要制作病理芯片的循环肿瘤细胞（ctc）进行免疫组化染色和/或核酸显色原位杂交染色以及可用来病理学诊断的细胞形态学染色的多重染色方法，包括：a）在容器中稀释沉淀的循环肿瘤细胞，制备细胞悬液；b) 在所述容器中的所述细胞悬液中，对所述细胞进行免疫组化染色和/或核酸显色原位杂交染色，包括：i) 在所述细胞悬液中加入特异性结合所述细胞上的抗原和/或核酸标志物的第一抗体和/或第一核酸探针，完成所述第一抗体和/或第一核酸探针与所述抗原和/或核酸标志物的特异性结合；ii) 去除未结合的所述第一抗体和/或第一核酸探针，然后重新制备细胞悬液，iii) 在所述细胞悬液中加入缀合了显色酶的第二抗体和/或显色酶标记的第二核酸探针，使其特异性结合第一抗体和/或第一核酸探针；iv) 去除未结合的所述缀合了显色酶的第二抗体和/或显色酶标记的第二核酸探针，然后重新制备细胞悬液，v) 在所述细胞悬液中加入显色底物进行显色，在显色过程中，不断震荡悬浮在液体中的细胞，使催化产生的显色沉淀产物均匀散开而避免集中堆积；以及vi) 去除多余的显色底物，然后重新制备细胞悬液；以及c) 在所述容器中对所述细胞进行可用来病理诊断的细胞形态学染色，然后将多重染色的细胞涂布到病理玻片上；或者，将经过免疫组化染色和/或核酸显色原位杂交染色的细胞涂布到病理玻片上，进行可用来病理诊断的形态学染色。
35.在一个具体实施方案中，步骤ii)、iv)和vi)中去除未结合的所述第一抗体和/或第一核酸探针、去除未结合的所述缀合了显色酶的第二抗体和/或显色酶标记的第二核酸探针和去除多余的显色底物通过以下步骤：i)清洗细胞；ii)离心沉淀细胞；和iii)丢弃上清液。
36.在一个具体实施方案中，所述可用来病理学诊断的细胞形态学染色选自diff-quik染色、巴氏（papanicolaou）、瑞氏-吉姆萨 （wright-giemsa）染色，和h&e染色，优选diff-quik染色。
37.本发明可以在同一个样本细胞上，同时显示详细的、可用来病理诊断的细胞形态学特点，和一个或者多个特定生物标记物的表达信息。染色结果适合在普通光学显微镜下观察，在符合病理学家对细胞病理形态学诊断要求的前提下，可以同时观察一个或者多个特定生物标志物在同一细胞上的表达。染色过程不丢失细胞，适合少量细胞样本的多重染色。
38.经过上述免疫组化或/和显色原位杂交染色，细胞涂片后可在常规显微镜下直接观察，不需要其他设备。可以在常规显微镜下观察细胞核、细胞质、细胞膜的病理诊断特点，确定肿瘤特异抗原表达部位，包括细胞核、细胞质、和细胞膜。现有技术的免疫荧光的方法虽然可以观察细胞外型轮廓，但无法提供可用来病理诊断的细胞形态学特点，更不能用来病理形态学诊断。
39.由于在同一个细胞上可以同时观察细胞形态学和肿瘤标志物的双重信息，这两个诊断指标的协同作用是显而易见的。比如，在细胞形态学不典型，病理医生的判断遇到困难的时候，特异性的肿瘤标志物表达可以帮助最终的肿瘤细胞病理形态学诊断，提高诊断的敏感性。而当肿瘤标志物染色出现可疑的阳性信号或者非特异性背景噪音信号时，又可以结合细胞形态学的诊断，排除非肿瘤细胞上的假阳性信号，提高诊断的准确性和特异性。
40.本发明独创的双重染色技术大幅度提高了检测的敏感性，而且减少了假阳性，既提高了检测的特异性。在临床检验，尤其是肿瘤筛查领域，有重大意义。
41.另一方面，本发明涉及用于在显微镜下观察ctc的芯片，该芯片包括：a）载玻片，其表面涂布了用于吸附ctc的细胞吸附材料；和b）盖玻片，其中包含了微流通道，微流通道具有突出或凹陷的入液口和出液口阀门；c) 肿瘤细胞通过微流通道涂布在含有细胞吸附材料的载玻片后，在微流通道中填充的透明填充液体，所述填充液体避免微流通道造成的透镜效应，保障光学显微镜的光学路径通畅，从而可以在显微镜下观察ctc的个数、形态学特点，和免疫组化和/或显色原位杂交的染色结果。
42.在一个具体实施方案中，载玻片的大小是常规大小，例如约75毫米 x 25毫米。在一个具体实施方案中，载玻片中约40-50 x 20-25毫米的区域（椭圆或者矩形）包含细胞吸附材料。在一个具体实施方案中，细胞吸附材料包括纳米材料，如100-200纳米的粗糙表面。在一个具体实施方案中，盖玻片的大小是约40-50 x 20-25毫米，厚度约0.15-0.25毫米。在一个具体实施方案中，微流通道为约0.5-1.5毫米宽，约50-100微米高。在一个具体实施方案中，微流通道可以是蛇形单通道，或者直行的多通道。在一个具体实施方案中，入液口和出液口阀门部位突出的高度可以是约0.4-0.8厘米，方便设备泵入细胞悬液。入液口和出液口位置，不阻挡常规显微镜物镜转化时的移动轨迹。多个芯片之间可以通过连接入液口和出液口而相互串联。
43.另一方面，本发明涉及制作循环肿瘤细胞(ctc)病理芯片的方法，包括：a）将包含染色的循环肿瘤细胞和部分存留的白细胞的液体，通过上文所述载玻片上的入液口泵入上文所述的芯片的微流通道；任选地，该步骤使用两个或更多个相互串联的上文所述芯片；b）液体通过微流通道后，经出液口流出，ctc吸附在载玻片的吸附材料上，形成单层细胞吸附层；c）在微流通道中透明填充液体填充微流通道，保障光学显微镜的光学路径通畅，从而可以在显微镜下观察ctc的个数、形态学特点，和免疫组化或/和显色原位杂交染色结果。
44.另一方面，本发明涉及制作循环肿瘤细胞(ctc)病理芯片的方法，包括：i）对要制作病理芯片的血液样品进行预处理，得到富含所需要的循环肿瘤细胞的沉淀物;
ii）对步骤i) 获得的循环肿瘤细胞进行液基的免疫组化或/和显色原位杂交染色；和iii）制作病理芯片，包括：a）将包含染色的循环肿瘤细胞和部分存留的白细胞的液体，通过上文所述载玻片上的入液口泵入上文所述的芯片的微流通道；任选地，该步骤使用两个或更多个相互串联的上文所述的芯片；b）液体通过微流通道后，经出液口流出，ctc吸附在载玻片的吸附材料上，形成单层细胞吸附层；c）在微流通道中透明填充液体填充微流通道，保障光学显微镜的光学路径通畅，从而可以在显微镜下观察ctc的个数、形态学特点，和免疫组化或/和显色原位杂交染色结果。
45.在一个具体实施方案中，步骤i)包括a）去掉样品中的红细胞和血小板；b）加入抗cd45单克隆抗体，所述抗体与白细胞表面的cd45特异结合，产生cd45抗原-抗体复合物；c）在样品中加入含有补体的组合物，补体被白细胞表面的cd45抗原-cd45抗体复合物激活后，在白细胞膜上打孔，使得白细胞膨胀破裂；和d）离心样品，得到富含所需要的循环肿瘤细胞的沉淀物。
46.在一个具体实施方案中，步骤ii)包括：a）稀释沉淀的循环肿瘤细胞，制备细胞悬液；b）在所述细胞悬液中，加入可以增加细胞膜通透性的试剂；c）加入特异性结合所述肿瘤细胞上的抗原的第一抗体，完成特异性抗原抗体结合；d）加入缀合了显色酶的第二抗体,其特异性结合第一抗体；和e）加入显色剂进行显色；或者步骤ii)是通过第一方面所述的多重染色方法进行的。
47.在一个具体实施方案中，填充组合物包含以下成分：a）α-蒎烯（pinene），其是一类具有相同骨架结构的天然有机化合物，属于双环单萜，分子式c
10h16
；b）toluenenene polymer (toluene)；c）2,6-二叔丁基对甲酚，其是抗氧化剂。
48.a)、b)、c)三种成分的重量百分比可以分别是：25%-60%、40%-70%和1-3%。
49.在一个具体实施方案中，a)、b)、c)三种成分的重量百分比分别是27.5%、71.5%和1.0%。
50.本发明还涉及在病理芯片制作过程中保障芯片光学路径通畅的方法，包括：用上文所述的组合物填充上文所述芯片中的微流通道，从而避免透镜效应。
51.在上述方法中，芯片系统独立，一次性使用，避免样本交叉污染。不用打开这个封闭的系统，不移动吸附的细胞，避免造成细胞流失，简化操作流程。多个芯片之间可以通过连接入液口和出液口而相互串联。此外，芯片大小和厚度适合常规光学显微镜直接观察，包括40x高倍物镜观察。符合病理科常规工作流程，不需要给显微镜添加任何特殊设备。可以用特殊的填充微流通道的液体，可凝固，长期保护染色细胞。其折光度和盖玻片材料一致，保证显微镜光学路径通畅，避免折射影响观察。吸附材料对肿瘤细胞有特异吸附功能。免疫
组化染色切片可以长期保存，符合临床医学证据的保存7年的常规要求。而现有技术的免疫荧光仅可以保存一个月，随后因为荧光衰减，无法观察，不能作为医学证据长期保存。
附图说明
52.图1是本发明芯片的设计图。例如，使用常规大小病理载玻片，75毫米 x 25毫米，厚度1mm。当中40 x 20毫米区域（椭圆或者矩形）包含细胞吸附材料（纳米材料）（上图）。其上覆盖50x25毫米盖玻片，厚度150-200微米。其中的微流通道设计为宽度500-1500微米，高度50-100微米（中图）。载玻片和盖玻片形成封闭的系统，细胞悬液通过微流通道，保证稀有的肿瘤细胞和吸附材料充分接触而被吸附在载玻片上。微流通道入液口和出液口阀门部位突出，或者凹陷，高度可达0.5厘米，方便设备泵入细胞悬液，并且形成串联。入液口和出液口位置，不阻挡常规显微镜物镜转化时的移动轨迹。位置可以在两侧，或者在盖玻片上面（下图）。
53.图2显示对血液中膀胱癌肿瘤细胞系t24的富集、双重染色，和病理芯片涂布。显微镜高倍镜照片的一个视野中的三个肿瘤细胞（红箭头标注）被ck-7单克隆抗体细胞免疫组化和diff-quik双重染色的方法染成棕色。背景中可见被diff-quik染色的存留血细胞，包括中性粒细胞，和淋巴细胞。
具体实施方式
54.实施例1血液样品前处理1. edta抗凝管（紫色）10毫升采血管，采取病人静脉血。加入包含100个人类泌尿上皮癌细胞系t24的细胞悬液。
55.2. 加入1毫升溶血素bd facs
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（bd lysing solution 10x concentrate），孵育5分钟，以裂解红细胞。
56.3. 加入 1毫升抗人cd45的单克隆抗体，浓度0.5微克/毫升，孵育30分钟。
57.4. 加入1毫升液体豚鼠血清（g9774, sigma-aldrich）孵育1分钟。
58.5. 将反应完成的液体移入圆底离心管，1000rpm离心5分钟，去除上清液，得到细胞沉淀物。
59.实施例2基于液相的循环肿瘤细胞免疫化学染色方法1. 将实施例1得到循环肿瘤细胞沉淀物稀释悬浮在1毫升的pbs (ph7.4) 缓冲液中，放置到10毫升塑料试管中。
60.2. 加入20微升tween20（增加细胞膜通透性，利于细胞膜、细胞核染色）。
61.3. 加入100微升dual endogenous enzyme block (dako, carpinteria, ca)，去除细胞内源性的过氧化物酶(peroxidase)和碱性磷酸酶 (alkline phosphatase)的活性，孵育5分钟。
62.4. 1000 rpm离心5分钟后去除上清液，去掉多余的dual endogenous enzyme block。
63.5. 加入200微升serum-free block (dako)，孵育10分钟（填充非特异性蛋白结合
点）。
64.6. 加入第一抗体，即，200微升鼠抗人ck-7单克隆抗体，室温下孵育1小时。
65.7. 加入5毫升pbs缓冲液，混匀后离心，去掉上清液。重复1次冲洗未结合的第一抗体。
66.8. 加入200微升结合过氧化物酶的第二抗体（envision, dako）；室温下孵育1小时。
67.9. 用5毫升pbs缓冲液冲洗三次去掉未结合的第二抗体。
68.10. 加入显色剂，孵育2分钟: 过氧化物酶
–ꢀ
liquid dab (dako)。
69.11. 加入5毫升pbs缓冲液，然后离心，去除多余显色剂。
70.12. 对细胞悬液进行diff-quik染色。加入1毫升被pbs缓冲液稀释成5%的迪夫快速染色剂2号（来源fisher scientific， 产品编号 #22750012），孵育20秒然后1000rpm离心5分钟，去除多余显色剂。加入1毫升被pbs缓冲液稀释成5%的迪夫快速染色剂1号（来源fisher scientific， 产品编号 #22750012），孵育20秒然后1000rpm离心5分钟，去除多余显色剂。加入200微升pbs缓冲液，制备细胞悬液。
71.实施例3病理芯片的制作芯片的设计如下：1. 常规大小病理载玻片，75毫米x25毫米；2. 当中40x20毫米区域（矩形）包含细胞吸附材料（100纳米的粗糙表面）；3. 50x25毫米盖玻片，厚度0.2毫米，其中包含 1毫米宽，50-100微米高的微流通道；4. 微流通道为蛇形单通道；5. 载玻片和盖玻片形成封闭的系统，细胞悬液通过微流通道，保证稀有的肿瘤细胞和吸附材料充分接触而被吸附在载玻片上；6. 入液口和出液口阀门部位突出，高度0.5厘米，方便设备泵入细胞悬液；7. 入液口和出液口位置，不阻挡常规显微镜物镜转化时的移动轨迹。
72.将实施例2获得的包含染色的循环肿瘤细胞和部分存留的白细胞的液体，通过上文所述载玻片上的入液口泵入上文所述病理芯片的微流通道；液体通过微流通道后，经出液口流出，ctc吸附在载玻片的吸附材料上，形成单层细胞吸附层。
73.在微流通道中透明填充液体填充微流通道，保障光学显微镜的光学路径通畅。
74.填充液体包含以下成分：a）α-蒎烯（pinene），其是一类具有相同骨架结构的天然有机化合物，属于双环单萜，分子式c10h16；b）toluenenene polymer (toluene)；c）2,6-二叔丁基对甲酚，其是抗氧化剂。
75.a)、b)、c)三种成分的重量百分比分别是27.5%、71.5%和1.0%。
76.直接常规显微镜下观察制作的病理切片：肿瘤细胞被染成棕色（见图2）。