一种用于生化分析的多层膜干化学试剂片的制作方法

1.本发明涉及一种用于生化分析的多层膜干化学试剂片，属于临床诊断技术 领域。


背景技术：

2.临床诊断在疾病预防、诊断和治疗中有着非常重要的作用，具体涉及需要 诊断的液体包括血液、尿液、脑脊液等。其中生化诊断是采用生物化学分析方 法，对临床标本进行定性或定量分析。常用的检测方法包括化学比色法、免疫 比浊法、离子选择性电极电位法和电泳法，配套自动生化分析仪进行检测。现 有常使用的生化分析仪器都使用液体生化试剂，即传统的湿化学法检测，需要 配置药液，消耗大量生化用水的同时面临处理废液的问题。此外，检测仪器大 型化，检测时间长，难以满足野外、诊所、病人床头等某些使用场合和急诊及 特殊项目检测的需求；检测门槛要求高，需要专门的检测人员经过专业培训才 能上岗检测，且检测结果受主观影响。基于上面这些缺点，干式生化分析技术 逐渐发展起来，干化学是相对湿化学法而言，将传统方法中的相关液体试剂固 定于硬质型基质上，分析时只需将少量待检样品(约10μl血液、血清、尿液 等)加在膜上，以被检测样品中的液体作为反应媒介，即可进行定性或定量分 析。
3.目前，各大医院和血站等使用的干式化学分析试剂基本是国外公司的产品。 第一类是以奥森多公司为代表的多层膜干片，此种产品延续了感光胶片的涂层 技术，将扩散层、光线阻挡层、试剂层、反应指示层等各种需要的功能层按照 顺序依次涂布或同时涂布在透明的支持体上，加样孔在扩散层上面，测试孔在 支持体的反面，通过测定反射光密度的变化分析待测物的浓度。此类多层膜干 片测试结果准确，但生产工艺复杂，扩散层的生产需要使用多种有机溶剂，产 生大量有机废气，对环境有害的同时增加生产过程的危险性。第二类是日本京 都公司的干化学技术，其组成为一个塑料支持层，一端为反应区包括样品层和 试剂层，试剂层采用织物作为试剂载体，加样和测试均在其上部进行。
4.专利号为201911056555.7的专利公开了一种用于体外生化诊断的干化学法 多层膜试剂，此方法仍然会使用到多种有机溶剂，会产生很多对环境有害的有 机废气物。专利号为201811397103.0的专利公开了一种用于制作α-羟丁酸脱 氢酶测定用干化学试纸的反应液及干化学试纸，其中扩散层采用网布，试剂层 和显色层需要单独制作然后组装，流程繁琐且网布扩散层缺乏均一性和精密性。 而专利200720072185.2和200720073442.4，这些专利用的方法是用反应液体浸 泡滤纸，干燥后粘在支持体上进行测试，此种方法与ph试纸类似，只可做到 定性和半定量，无法用于临床检测。


技术实现要素：

5.本发明为克服现有技术弊端，提供一种用于生化分析的多层膜干化学试剂 片，能够实现生产制备过程环保化，制备出的扩散层具有各向均性的特性，测 试结果准确度高，适用于临床生化检测。
6.本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
7.一种用于生化分析的多层膜干化学试剂片，所述干化学试剂片由上至下依 次包括上支持层、扩散层、试剂层、支持体、和下支持层，所述扩散层、试剂 层和支持体依次设置在所述上支持层和下支持层之间的中间位置，所述上支持 层和下支持层的两端空隙处通过中间支持层粘结，所述扩散层为各向均性的多 孔扩散膜，由水性聚合物乳液和白色反光材料组成，所述水性聚合物乳液为水 性苯丙乳液和/或水性聚丙烯酸酯乳液，所述白色反光材料为二氧化钛、硫酸钡、 氧化锌、硅藻土、微晶纤维素、超细硅微粉和煅烧高岭土中的一种或多种。
8.上述用于生化分析的多层膜干化学试剂片，所述水性聚合物乳液的分子量 为2000-50000，固含量为30.0-50.0％。
9.上述用于生化分析的多层膜干化学试剂片，所述水性苯丙乳液中丙烯酸正 丁酯与苯乙烯比例为(50-80)：(20-50)；所述水性聚丙烯酸酯乳液中的聚 丙烯酸酯与丙烯酸或甲基丙烯酸的比例为(60-80):(20-40)。
10.上述用于生化分析的多层膜干化学试剂片，所述扩散层的湿膜厚度为 100-500μm，干膜厚度为50-300μm，优选的干膜厚度为100-250μm。
11.上述用于生化分析的多层膜干化学试剂片，所述上支持层的中间设置有加 样孔，所述下支持层上与所述加样孔的位置对应处设置有测试孔。
12.上述用于生化分析的多层膜干化学试剂片，所述支持体为200nm-900nm波 长光下的透光率在80％以上的透明塑料基材，优选的95％以上透明塑料基材， 如：聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚碳酸酯、聚丙烯、聚乙烯制备而成，优选聚对 苯二甲酸乙二醇酯作为塑料基材，其厚度为50-300μm，优选厚度为100-200 μm。
13.上述用于生化分析的多层膜干化学试剂片，所述试剂层由水溶性材料和参 与化学反应的化学试剂/酶构成，其湿膜厚度为50-200μm，干膜厚度为10-100 μm。
14.上述用于生化分析的多层膜干化学试剂片，所述水溶性材料为明胶、琼脂 糖、葡聚糖、聚乙烯醇、聚丙烯酰胺、亲水纤维素衍生物中的一种或多种的混 合物；所述参与化学反应的化学试剂/酶包括反应底物或酶以及缓冲液、稳定剂、 保护剂和表面活性剂中的一种或多种。
15.本发明的有益效果是：
16.本发明多层膜干化学试剂片制备过程中不使用有机溶剂，生产制备过程更 加环保化，制备出的扩散层具有各向均性的特性，测试结果准确度高，适用于 临床生化检测。
附图说明
17.图1为本发明多层膜干化学试剂片结构示意图。
18.图中：1、上支持层；1-1、加样孔；2、扩散层；3、试剂层；4、支持体； 5、下支持层；5-1、测试孔；6、中间支持层。
具体实施方式
19.本发明多层膜干化学试剂片使用过程中，样品通过加样孔加至扩散层上表 面，扩散层有着均匀分布待测样品、过滤红细胞及蛋白等大分子物质、标本预 处理、提供反射特定的背景四方面作用。根据测试项目的需要，可以向扩散层 中加入某些化学试剂或者酶
(如表面活性剂、磷酸盐缓冲液)，预先将可能造 成干扰的物质加以去除，以达到标本预处理的效果。扩散层是一层各向均性的 多孔扩散膜，由水性聚合物乳液及白色反光材料组成，所述水性聚合物乳液为 水性苯丙乳液和/或水性聚丙烯酸酯乳液，分子量为2000-50000，其中水性苯丙 乳液中丙烯酸正丁酯与苯乙烯比例在80:20-50：50，水性丙烯酸酯乳液中的聚 丙酸酯与丙烯酸或甲基丙烯酸的比例在80:20-60:40，水性乳液的固含量为 30.0-50.0％；白色反光材料为二氧化钛、硫酸钡、氧化锌、硅藻土、微晶纤维 素、超细硅微粉、煅烧高岭土的一种或多种。水性苯丙乳液或水性聚丙烯酸酯 乳液均采用水作介质，价廉安全，成膜性好，具有优异的静电排斥和空间位阻 效应，添加少量乳液即可具有优异的附着力，微观上可与白色反光材料在干燥 过程中形成多孔膜结构，粘结良好的同时可有效地控制膜孔径的尺寸和孔的分 布。
20.所述试剂层是待测物质发生生化反应的区域，根据需要多种试剂可以按照 实验要求一层一层涂布、控制反应顺序。支持体上先涂覆试剂层，涂层干燥后 依次再涂覆扩散层，并固定在上下支持层之间。
21.本发明多层膜干化学试剂片主要测试的样品是全血、血清、尿液和脑脊液 等。
22.下面结合实施例对本发明作进一步说明。
23.实施例1
24.支持体4采用厚度175μm的pet膜，在550nm透光率达到95％。试剂层 2的涂布液配方如表1所示，将配制好的涂布液均匀涂布于pet膜之上，涂膜 厚度为100μm。干燥后在其上涂布扩散层2，涂膜厚度为250μm，扩散层2 的配方如表2所示，其中水性苯丙乳液的主要组成成分为丙烯酸正丁酯/苯乙烯 共聚物，单体比例为75：25。干燥后切成1.2cm2的小片，然后使用白色pet 塑料片作为上支持层1、下支持层5和中间支持层6，组装后即可用于测定。
25.表1试剂层配方
26.试剂浓度明胶150g/l葡萄糖氧化酶200ku/l过氧化物酶70ku/l1,7-二羟基萘7.5g/l4-氨基安替比林6.3g/l甘油50g/l表面活性剂3.0g/l
27.表2扩散层配方
28.材料浓度水性苯丙乳液128g/l二氧化钛580g/l表面活性剂7.5g/l磷酸盐缓冲液ph＝6.0
29.实施例2
30.支持体4采用厚度180μm的pet膜，在550nm透光率达到95％。试剂层 3的涂布液配方不变，按照实施例1配制，将配制好的涂布液均匀涂布于pet 膜之上，涂膜厚度为100μm。
干燥后在其上涂布扩散层2，涂膜厚度为300μ m，扩散层2的配方如表3所示，其中水性苯丙乳液的主要组成成分为丙烯酸 正丁酯/苯乙烯共聚物，单体比例为50：50。干燥后切成1.2cm2的小片，然后 使用白色pet塑料片作为上支持层1、下支持层5和中间支持层6，组装后即 可用于测定。
31.表3扩散层配方
32.材料浓度水性苯丙乳液105g/l二氧化钛500g/l表面活性剂10g/l磷酸盐缓冲液ph＝6.0
33.实施例3
34.支持体4采用厚度155μm的pet膜，在550nm透光率达到95％。试剂层 3的涂布液配方不变，按照实施例1配制，将配制好的涂布液均匀涂布于pet 膜之上，涂膜厚度为100μm。干燥后在其上涂布扩散层2，涂膜厚度为350μ m，扩散层2的配方如表4所示，其中水性聚丙烯酸酯乳液的主要组成成分为 丙烯酸丁酯/丙烯酸共聚物，单体比例为60：40。干燥后切成1.2cm2的小片， 然后使用白色pet塑料片作为上支持层1、下支持层5和中间支持层6，组装 后即可用于测定。
35.表4扩散层配方
36.材料浓度水性丙烯酸酯乳液150g/l硫酸钡540g/l表面活性剂6.0g/l磷酸盐缓冲液ph＝6.0
37.实施例4
38.支持体4采用厚度170μm的pet膜，在550nm透光率达到95％。试剂层 3的涂布液配方不变，按照实施例1配制，将配制好的涂布液均匀涂布于pet 膜之上，涂膜厚度为100μm。干燥后在其上涂布扩散层2，涂膜厚度为400μ m，扩散层2的配方如表5所示，其中水性聚丙烯酸酯乳液的主要组成成分为 丙烯酸丁酯/丙烯酸共聚物，单体比例为75：25。干燥后切成1.2cm2的小片， 然后使用白色pet塑料片作为上支持层1、下支持层5和中间支持层6，组装 后即可用于测定。
39.表5扩散层配方
40.材料浓度水性丙烯酸酯乳液100g/l硅藻土420g/l表面活性剂5.5g/l磷酸盐缓冲液ph＝6.0
41.实施例5
42.支持体4采用厚度180μm的pet膜，在550nm透光率达到95％。试剂层 3的涂布液配
方不变，按照实施例1配制，将配制好的涂布液均匀涂布于pet 膜之上，涂膜厚度为100μm。干燥后在其上涂布扩散层2，涂膜厚度为200μ m，扩散层2的配方如表6所示，其中亲水性苯丙乳液的主要组成成分为丙烯 酸正丁酯/苯乙烯共聚物，单体比例为75：25，水性聚丙烯酸酯乳液的主要组成 成分为丙烯酸丁酯/丙烯酸共聚物，单体比例为70：30。干燥后切成1.2cm2的 小片，然后使用白色pet塑料片作为上支持层1、下支持层5和中间支持层6， 组装后即可用于测定。
43.表6扩散层配方
44.材料浓度水性苯丙乳液85g/l水性聚丙烯酸酯乳液65g/l煅烧高岭土650g/l表面活性剂9.0g/l磷酸盐缓冲液ph＝6.0
45.对比例1
46.支持体4采用厚度175μm的pet膜，在550nm透光率达到95％。试剂层 3的涂布液配方不变，按照实施例1配制，将配制好的涂布液均匀涂布于pet 膜之上，涂膜厚度为100μm。干燥后在其上涂布扩散层2，涂膜厚度为300μ m，扩散层2的配方如表7所示。干燥后切成1.2cm2的小片，然后使用白色pet 塑料片作为上支持层1、下支持层5和中间支持层6，组装后即可用于测定。
47.表7扩散层配方
48.材料浓度醋酸纤维素50g/l丙酮450ml/l二甲苯75ml/l二氧化钛330g/l表面活性剂7.5g/l
49.各项性能测试方法如下：
50.(1)扩散面积：从加样孔处加样，滴加10μl血清校准品，观察直至扩散 层血清扩散至最大直径，使用游标卡尺测量扩散圆斑直径，按照圆形面积公式 s＝πd2/4计算扩散面积。
51.(2)扩散时间：从加样孔处加样，滴加10μl血清校准品的同时使用秒表 开始计时，直至血清扩散至最大面积时停止计时，记录为扩散时间。
52.(3)渗透均一性：从加样孔处加样，滴加10μl 5.55mmol/l的血清校准 品，均匀扩散至最大面积后从支持体面观察反应圆斑颜色均一程度，按以下方 法进行评级：
53.◆
：圆斑颜色均一，深浅程度相同；
54.◇
：圆斑颜色较均一；深浅轻微不同；
55.×
：圆斑颜色不均一，深浅程度不同。
56.(4)准确度：以血糖含量为16.65mmol/l的血清校准品进行梯度稀释，配 置浓度分别为1.11、1.67、2.78、4.16、5.55、8.33、11.10、16.65mmol/l的血清 校准品。从加样孔处加
样，分别在每孔滴加10μl浓度梯度的血清，滴加血清 后分别在37℃下反应5min，用反射分光光度计在550nm波长下测定光反射值， 根据williams-clapper定律拟合标准曲线。
57.将实施例1-5和对比例1制备的试剂片分别通过以上方法进行性能测试， 测试结果如表8所示。
58.表8实施例与对比例性能测试结果
59.性能实施例1实施例2实施例3实施例4实施例5对比例1扩散面积1.10cm21.02cm21.06cm21.03cm21.05cm21.00cm2扩散时间25s23s27s31s26s25s渗透均一性
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60.准确度测定结果：
61.实施例1：y＝0.6079-0.181lnx，r2＝0.9979，线性范围为1.11-16.65mmol/l。
62.实施例2：y＝0.6083-0.179lnx，r2＝0.9981，线性范围为1.11-16.65mmol/l。
63.实施例3：y＝0.6085-0.180lnx，r2＝0.9974，线性范围为1.11-16.65mmol/l。
64.实施例4：y＝0.6088-0.183lnx，r2＝0.9980，线性范围为1.11-16.65mmol/l。
65.实施例5：y＝0.6090-0.185lnx，r2＝0.9984，线性范围为1.11-16.65mmol/l。
66.对比例1：y＝0.6089-0.184lnx，r2＝0.9982，线性范围为1.11-16.65mmol/l。
67.从上述表格8和准确度测定结果可以看出，本发明中的多层膜干化学试剂 片与使用有机溶剂体系的扩散层有着相同的各项均性扩散特性，且制备过程无 有机溶剂产生，测试结果准确度较高，可满足临床生化检测需求。
68.上述实施例只是为了说明本发明的技术构思及特点，其目的是在与让本领 域内的普通技术人员能够了解本发明的内容并据以事实，并不能以此限制本发 明的保护范围。凡是根据本发明内容的实质所作出的等效的替换或改进等，均 应包含在本发明的权利要求范围以内。