改进了安全性及抗肿瘤效果的溶瘤病毒的制作方法

1.本发明设计一种改进了安全性及抗肿瘤效果的溶瘤病毒及其应用。


背景技术：

2.随着基因重组技术的全面使用，已开始使用强化了肿瘤选择性和抗肿瘤效果的溶瘤病毒开展临床研究。首次被文献报道的重组溶瘤病毒是一种单纯疱疹病毒。其后，针对使用其他病毒溶瘤的研究也已积极开展了。
3.随着基于疱疹病毒的t-vec(talimogene laherparepvec)在美国和欧洲已成功地被商业化用于治疗晚期黑色素瘤，溶瘤病毒的使用已经引起了越来越多的注意。另一方面，胸苷激酶(tk)基因缺陷的痘苗病毒也有着大量临床应用；然而，由于其治疗窗较窄，在病毒的临床效果最大化方面有所限制。对于胸苷激酶缺陷痘苗病毒，由于病毒的毒性，狭窄的治疗窗意味着高剂量病毒可获得较好的临床疗效，但也会招致临床风险。
4.事实上，在30名患有原发性肝癌的患者中进行的pexa-vec(jx-594；sillajen,inc.)二期临床试验表明，临床结果为高剂量组(109pfu)相比低剂量组(108pfu)有更高的生存率。然而，在针对瘤内给药进行的一期临床试验中，在3
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109pfu的剂量中观察到剂量限制毒性(dlt)，这使得最大耐受剂量被限定为1
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109pfu。据报道这与药物无关。然而，溶瘤病毒治疗后的早期死亡已有频繁报道，提示了病毒的不良增殖可能导致不可预期的后果。这种剂量依赖性的疗效增加和剂量限制毒性意味着有需要开发一种更安全有效的痘苗病毒。
5.同时，更昔洛韦(gcv)是一种抗病毒药剂，能够有效抗单纯疱疹病毒、巨细胞病毒、和水痘带状疱疹病毒。当gcv与单纯疱疹病毒的tk结合，其5’端将被磷酸化并转变为三磷酸更昔洛韦(gcv-tp)。gcv-tp抑制了dna聚合酶的活性，并结合到病毒dna的3’端，终止dna的延伸。gcv-tp作为一种剧毒物质，能够阻断细胞内dna合成，从而表现出细胞毒性。
6.进来，已开展了将hsv1-tk插入溶瘤病毒中的抗肿瘤研究，获得的溶瘤病毒与gcv联用以诱导肿瘤细胞死亡。该研究显示，原本溶瘤病毒感染肿瘤细胞以诱导直接的抗癌效果；而经过hsv1-tk(自杀基因)磷酸化的gcv通过抑制肿瘤细胞增殖而表现出了额外的抗肿瘤效果(oliver w等人,人类基因治疗,vol.10,no.16,1999)。hsv1-tk/gcv体系主要被用于使用腺病毒作为载体的溶瘤病毒疗法。然而，联合应用gcv所带来的额外细胞毒性效应仍然具有争议。
7.具体地，观察到将hsv-tk基因插入到有复制能力的腺病毒中获得的溶瘤病毒与gcv联用的情况下，在胶质瘤细胞中的细胞毒性效应会显著上升。另一方面，在其他许多将hsv-tk插入到有复制能力的腺病毒的研究中，并不总是表现出由应用gcv带来的额外抗肿瘤效应(lambright es等,gene ther,8:946-53)。据报道这是由于hsv-tk/gcv系统不仅参与抑制肿瘤细胞增殖,也参与抑制病毒增殖，而这些效应是相反和相互抵消的。
8.因此，有需要进行针对特定的将hsv-tk/gcv系统应用于溶瘤病毒的方法，能够在保障安全性的同时加强抗肿瘤效果。


技术实现要素：

9.技术问题
10.据此，作为开发改进了安全性及抗肿瘤效果的溶瘤病毒的研究的结果，本发明开发了无胸苷激酶(tk)活性并能够磷酸化gcv或acv的溶瘤病毒，并且已证实该溶瘤病毒和gcv联用时表现出优异的安全性和抗肿瘤效应，由此完成了本发明。
11.解决技术问题的技术方案
12.为达到上述目的，在本发明的一方面，提供了一种溶瘤病毒，所述溶瘤病毒包含一段编码多肽的核苷酸序列，所述多肽包含一个效应结构域，其中所述效应结构域如seq id no:1所示并且是从单纯疱疹病毒胸苷激酶(hsv-tk)衍生出的。
13.在本发明的另一方面，提供了一种预防或治疗癌症的药物组合物，包含所述溶瘤病毒作为活性成分。
14.在本发明的另一方面，提供了一种预防或治疗癌症的药物组合物，包含所述溶瘤病毒和更昔洛韦(gcv)或阿昔洛韦(acv)作为活性成分。
15.在本发明的另一方面，提供了一种生产溶瘤痘苗病毒的方法，所述溶瘤痘苗病毒包含一段编码突变的hsv-tk的基因，所述方法包括步骤：i)从痘苗病毒中去除tk基因，并使痘苗病毒与野生型hsv-tk基因重组；和ii)在宿主细胞中存在溴化脱氧尿嘧啶核苷(brdu)的情况下，持续进行重组痘苗病毒的传代培养。
16.本发明的有益效果
17.本发明的改进了安全性及抗肿瘤效果的溶瘤病毒可以表达hsv-tk片段，所述片段包括一个效应结构域或其变体以磷酸化gcv或acv，所述效应结构域由能够在无胸苷激酶(tk)活性的情况下磷酸化gcv或acv的最小氨基酸序列组成，从而杀死感染肿瘤病毒的癌细胞，甚至邻近的癌细胞。此外，gcv或acv也参与抑制病毒增殖，并且即使在应用了大剂量病毒时也能由此调控病毒引发的副反应。进一步地，即使gcv对病毒增殖的抑制作用使得病毒颗粒的数量减少了，所述溶瘤病毒也能表现出增强的抗肿瘤效应。因此，本发明的改进了安全性及抗肿瘤效果的溶瘤病毒能够被有效地用于治疗肿瘤。
18.附图简述
19.图1显示了产生突变的痘苗病毒过程的示意图。
20.图2显示了鉴定突变的痘苗病毒(c1到c5)表达hsv1-tk片段的结果，其中每个都是突变的痘苗病毒的一种实施方式。
21.图3显示了鉴定突变的痘苗病毒(c6到c10)表达hsv1-tk片段的结果，其中每个都是突变的痘苗病毒的一种实施方式。
22.图4显示了鉴定突变的痘苗病毒(c11到c20)表达hsv1-tk片段的结果，其中每个都是突变的痘苗病毒的一种实施方式。
23.图5显示了鉴定突变的痘苗病毒(c21到c30)表达hsv1-tk片段的结果，其中每个都是突变的痘苗病毒的一种实施方式。
24.图6显示了鉴定突变的痘苗病毒(c31到c40)表达hsv1-tk片段的结果，其中每个都是突变的痘苗病毒的一种实施方式。
25.图7显示了鉴定突变的痘苗病毒(c41到c50)表达hsv1-tk片段的结果，其中每个都是突变的痘苗病毒的一种实施方式。
26.图8显示了鉴定突变的痘苗病毒(c51到c55)表达hsv1-tk片段的结果，其中每个都是突变的痘苗病毒的一种实施方式。
27.图9显示了鉴定突变的痘苗病毒(c56到c60)表达hsv1-tk片段的结果，其中每个都是突变的痘苗病毒的一种实施方式。
28.图10显示了鉴定突变的痘苗病毒(c61到c70)表达hsv1-tk片段的结果，其中每个都是突变的痘苗病毒的一种实施方式。
29.图11显示了鉴定突变的痘苗病毒(c71到c80)表达hsv1-tk片段的结果，其中每个都是突变的痘苗病毒的一种实施方式。
30.图12显示了鉴定突变的痘苗病毒(c81到c90)表达hsv1-tk片段的结果，其中每个都是突变的痘苗病毒的一种实施方式。
31.图13显示了鉴定突变的痘苗病毒(c91到c100)表达hsv1-tk片段的结果，其中每个都是突变的痘苗病毒的一种实施方式。
32.图14显示了由突变的痘苗病毒(c1、c3、c52、c40/45、c57、wots-418和c19)表达的hsv1-tk片段的示意图，其中每个都是突变的痘苗病毒的一种实施方式。
33.图15中的图表显示了鉴定分离自hela肿瘤细胞系培养液的上清液的荧光素酶活性，该hela肿瘤细胞系经过了穿梭质粒载体和wr(western reserve)系痘苗病毒处理。
34.图16中的图表显示了鉴定分离自hela肿瘤细胞系培养液的颗粒的荧光素酶活性，该hela肿瘤细胞系经过了穿梭质粒载体和wr系痘苗病毒处理。
35.图17中的图表显示了鉴定分离自hela肿瘤细胞系培养液的上清液的荧光素酶活性，该hela肿瘤细胞系经过了穿梭质粒载体和惠氏系痘苗病毒处理。
36.图18显示了鉴定在nci-h460肿瘤细胞系中应用突变的痘苗病毒(c1、c3、c19、c45、或c52)(突变痘苗病毒的一种实施方式)和gcv会引起病毒增殖减少的实验结果。
37.图19显示了鉴定在hela肿瘤细胞系中应用突变的痘苗病毒(c40或c57)(突变痘苗病毒的一种实施方式)和gcv会引起病毒增殖减少的结果。
38.图20显示了鉴定在nci-h460肿瘤细胞系中应用突变的痘苗病毒(c40或c57)(突变痘苗病毒的一种实施方式)和gcv会引起病毒增殖减少的结果。
39.图21显示了鉴定在nci-h460肿瘤细胞系中应用突变的痘苗病毒(c1、c3、c19、c45、或c52)(突变痘苗病毒的一种实施方式)和gcv会引起病毒增殖减少的结果。
40.图22显示了鉴定在hela肿瘤细胞系中联合应用突变的痘苗病毒(c40或c57)(突变痘苗病毒的一种实施方式)和gcv会引起细胞毒性增加的结果。
41.图23显示了鉴定在nci-h460肿瘤细胞系中联合应用突变的痘苗病毒(c40或c57)(突变痘苗病毒的一种实施方式)和gcv会引起细胞毒性增加的结果。
42.图24显示了使用突变的痘苗病毒(wots-418)处理10个肿瘤细胞系，并随后观察每种肿瘤细胞系的细胞活性得到的图表。
43.图25显示了鉴定在a549肿瘤细胞系中联合应用突变的痘苗病毒(wots-418)(突变痘苗病毒的一种实施方式)和acv、gcv、或brdu会引起病毒增殖减少的结果。
44.图26显示了鉴定在nci-h460肿瘤细胞系联合应用突变的痘苗病毒(wots-418)(突变痘苗病毒的一种实施方式)和gcv会引起病毒增殖减少的结果。
45.图27显示了给移植了hct-116肿瘤细胞系的小鼠模型联合应用突变的痘苗病毒
(wots-418)和gcv后，处死小鼠并计算在小鼠肿瘤组织中检测到的病毒颗粒数量得到的图表。
46.图28显示了鉴定在nci-h460肿瘤细胞系中联合应用突变的痘苗病毒(wots-418)(突变痘苗病毒的一种实施方式)和gcv会引起细胞毒性增加的结果。
47.图29显示了鉴定在nci-h460肿瘤细胞系联合应用突变的痘苗病毒(ots-418)(突变痘苗病毒的一种实施方式)和gcv会引起细胞毒性增加的结果。
48.图30显示了用移植了人乳腺癌细胞系(mda-md-231)小鼠模型鉴定突变痘苗病毒和羟基脲联合应用引起的抗癌效果的实验时间表示意图。
49.图31显示了向移植有人乳腺癌细胞系的小鼠单独应用或联合应用突变的痘苗病毒(wots-418)和羟基脲，随后测量小鼠肿瘤大小获得的实验结果。
50.图32显示了对移植有小鼠肾癌细胞系(renca)的小鼠单独应用或联合应用突变的痘苗病毒(wots-418)和羟基脲，随后测量小鼠肿瘤大小获得的实验结果。
51.图33显示了用移植有人结直肠癌细胞系(ct-26)小鼠模型鉴定突变痘苗病毒和羟基脲联合应用引起的抗癌效果的实验时间表示意图。
52.图34显示了向移植有人结直肠癌细胞系(ct-26)的小鼠单独应用或联合应用突变的痘苗病毒(wots-418)和羟基脲，随后测量小鼠肿瘤大小获得的实验结果。
53.图35显示了向移植有人结直肠癌细胞系(ct-26)的小鼠单独应用或联合应用突变的痘苗病毒(wots-418)和羟基脲，从小鼠中分离cd8 t细胞，将cd8 t细胞与肿瘤细胞共培养，随后测定分泌inf-γ的cd8 t细胞数量的图表。
54.图36显示了向移植有人结直肠癌细胞系(ct-26)的小鼠单独应用或联合应用突变的痘苗病毒(wots-418)和羟基脲，从小鼠中分离cd8 t细胞，将cd8 t细胞与肿瘤细胞共培养，随后对分泌inf-γ的cd8 t细胞进行染色的照片。
55.实施本发明的最佳方式
56.在下文中将详细描述本发明。
57.在本发明的一方面，提供了一种溶瘤病毒，其包含一段编码多肽的核苷酸序列，所述多肽包含一个效应结构域，所述效应结构域如seq id no:1所示并且是衍生自单纯疱疹病毒胸苷激酶(hsv-tk)的。
58.如本文所用，术语“单纯疱疹病毒胸苷激酶(hsv-tk)”指一种在单纯疱疹病毒的dna合成过程中参与初始磷酸化反应的酶。此外，hsv-tk还参与抗病毒药剂更昔洛韦(gcv)或阿昔洛韦(acv)的磷酸化。特别地，hsv1-tk对gcv或acv的反应比其他病毒中的tk敏感约10倍。所述hsv可以是1型单纯疱疹病毒(hsv1)或2型单纯疱疹病毒(hsv2)。具体地，所述hsv可以是hsv1。此外，所述hsv-tk可以是1型单纯疱疹病毒胸苷激酶(hsv1-tk)。
59.如本文所用，术语“效应结构域”指由野生型hsv-1tk的1到145位连续氨基酸组成的蛋白结构域，所述hsv-1tk如seq id no:15序列所示，由376个氨基酸组成。相比野生型hsv-1tk，所述效应结构域具有较低的tk活性或无tk活性，因此含有编码包括所述效应结构域的多肽的核苷酸序列的溶瘤病毒无法自我增殖。然而，所述效应结构域包括一个atp结合位并能够磷酸化gcv或acv。当用gcv或acv处理被含有编码包括所述效应结构域的多肽的核苷酸序列的溶瘤病毒感染的细胞时，gcv或acv可能被磷酸化。
60.包含所述效应结构域的多肽可能进一步含有连接到效应结构域c端的0到231个氨
基酸。在此，相比野生型hsv-1tk，所述多肽具有较低的tk活性或无tk活性，因此含有编码所述多肽的核苷酸序列的溶瘤病毒无法自我增殖。此外，所述多肽能够磷酸化gcv或acv。当用gcv或acv处理被含有编码所述多肽的核苷酸序列的溶瘤病毒感染的细胞时，gcv或acv可能被磷酸化。
61.具体地，包含所述效应结构域的多肽可能进一步含有连接到效应结构域c端的0到231、10到200、20到150、或40到100个氨基酸。优选地，包含所述效应结构域的多肽可能进一步含有连接到效应结构域c端的36、82或231个氨基酸。
62.包含所述效应结构域的多肽可由如seq id no:1、3、5、7、9、11、或13所示氨基酸序列组成。编码所述多肽的核苷酸序列可以是编码如seq id no:1、3、5、7、9、11、或13所示氨基酸序列的核苷酸序列。具体地，编码所述多肽的核苷酸序列可以是如seq id no:2、4、6、8、10、12、或14所示的核苷酸序列。
63.为了开发改进了安全性及抗肿瘤效果的溶瘤病毒，本发明制造了一种包含野生型hsv1-tk基因的重组痘苗病毒，并随后诱导病毒在缺乏tk的情况下进行适应性进化。所述痘苗病毒经过适应性进化后接受荧光素酶活性实验、基因组分析和gcv敏感性实验。通过这些实验，将挑选出表达hsv1-tk片段或其变体的部分的突变的痘苗病毒(c1、c3、c40、c45、c52、和c57)。此外，本发明生产了突变的痘苗病毒(wots-418,ots-418)，其含有编码hsv-tk变体的基因，所述变体是由seq id no:15所示的氨基酸序列的一部分突变而来的。随后，对突变的痘苗病毒(c1、c3、c40、c45、c52、c57和wots-418)的核苷酸序列进行分析。结果显示，鉴定出由seq id no:15所示的野生型hsv-1tk的氨基酸序列中直到145位(参考点)的氨基酸都能够磷酸化gcv或acv但不具有tk活性。
64.如本文所用，术语“溶瘤病毒“指一种重组病毒，其基因已被操作以特异性地在肿瘤细胞中复制，以使得该病毒能够摧毁肿瘤细胞。所述溶瘤病毒可以由腺病毒、单纯疱疹病毒、麻疹病毒、慢病毒、逆转录病毒、巨细胞病毒、杆状病毒、呼肠孤病毒、腺相关病毒、粘液瘤病毒、水疱性口炎病毒、脊髓灰质炎病毒、新城疫病毒、细小病毒、柯萨奇病毒、塞尼卡病毒、痘苗病毒或痘病毒衍生而来。优选地，所述溶瘤病毒可由痘苗病毒衍生而来。
65.所述痘苗病毒可以是但不限于一种痘苗病毒株，即西储(wr)、纽约痘苗病毒(nyvac)、惠氏(纽约市卫生局；nycboh)、lc16m8、李斯特、哥本哈根、天坛、ussr、塔什干、埃文斯、国际卫生部-j(ihd-j)、或国际卫生部-white(ihd-w)。
66.在本发明的一方面，提供了一种预防或治疗癌症的药物组合物，所述药物组合物包括溶瘤病毒作为活性成分，所述溶瘤病毒包含一段编码多肽的核苷酸序列，所述多肽包含一个效应结构域，所述效应结构域如seq id no:1所示并且是衍生自单纯疱疹病毒胸苷激酶(hsv-tk)的。
67.作为活性成分包含在药物组合物中的溶瘤病毒如上文所述。
68.所述溶瘤病毒的剂量依据个体情况和体重、疾病严重程度、药物剂型、给药的途径和给药时间而有所不同，且能够由本领域技术人员合理地进行选择。剂量可能使患者接受1
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病毒颗粒、传染性病毒单位(tcid
50
)，或空斑形成单位(pfu)。具体地，剂量可能使患者接受1
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、1
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、或更多的所施用的病毒颗粒、传染性病毒单位、或空斑形成单位，介于上述数值之间各种数值以及范围均包括在内。优选地，溶瘤病毒的给药剂量为1
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pfu。
69.癌症可选自下组：肺癌、结直肠癌、前列腺癌、甲状腺癌、乳腺癌、脑癌、头颈癌、食管癌、皮肤癌、胸腺癌、胃癌、结肠癌、肝癌、卵巢癌、子宫癌、膀胱癌、直肠癌、胆囊癌、胆道癌、胰腺癌、非小细胞肺癌、骨癌、眼内黑色素瘤、肛周癌、输卵管癌、子宫内膜癌、宫颈癌、阴道癌、外阴癌、霍奇金病、小肠癌、内分泌腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、慢性白血病、急性白血病、淋巴细胞淋巴瘤、肾癌、输尿管癌、肾细胞癌、肾盂癌、中枢神经系统肿瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、脊髓肿瘤、脑干胶质瘤、垂体腺瘤、及其组合。
70.本发明的药物组合物可进一步包含药学上可接受的载体。此外，本发明的药物组合物可进一步包含合适的辅料和稀释剂，所述辅料和稀释剂是制备药物组合物过程中常用的。此外，所述药物组合物可以按照常规方法制备为注射剂形式。
71.在制备用于肠外给药的制剂时，可将药物组合物制备为灭菌水溶液、无水溶液、悬浮液、乳液、冻干剂、栓剂等。对于无水溶液或悬浮液，可以使用丙二醇、聚乙二醇、植物油(例如橄榄油)、注射酯(例如油酸乙酯)等。栓剂的基础材料可以使用witepsol
tm
、聚乙二醇、tween
tm
61、可可黄油、月桂酸甘油酯脂肪、甘油明胶等。
72.关于给药途径、剂量和给药频率，可根据患者的病情和副作用存在与否，以多种方式和剂量将药物组合物给予受试者；本领域技术人员可在适当范围内选择最佳给药途径、剂量和给药频率。此外,所述药物组合物可以与对要治疗的疾病有已知疗效的其他药物或生理活性物质联合应用，或可以和其他药物以组合制剂的形式制备。
73.药物组合物可以肠外给药，并可以以任何合适的方式给药，例如肿瘤内、腹膜内、皮下、皮内、鼻内和静脉注射给药。其中优选肿瘤内、腹膜内、或静脉注射给药。另一方面，药物组合物的剂量可以根据给药频率、总剂量、和患者健康状况决定。
74.在本发明的另一方面，提供了一种预防或治疗癌症的药物组合物，所述药物组合物包括溶瘤病毒和更昔洛韦(gcv)或阿昔洛韦(acv)作为活性成分，所述溶瘤病毒包含一段编码多肽的核苷酸序列，所述多肽包含一个效应结构域，所述效应结构域如seq id no:1所示并且是衍生自单纯疱疹病毒胸苷激酶(hsv-tk)的。
75.包含在所述药物组合物中的溶瘤病毒和gcv或acv可以同时给药、或以顺序或相反顺序方式联合给药。具体地，包含在所述药物组合物中的溶瘤病毒和gcv或acv可以同时给药。此外，所述药物组合物的给药方式可以是例如首先给药溶瘤病毒，随后给药gcv或acv，其中这些成分都包含在所述药物组合物中。此外，所述药物组合物的给药方式可以是例如首先给药溶瘤病毒，随后给药gcv或acv，随后再次给药溶瘤病毒，其中这些成分都包含在所述药物组合物中。
76.包含在药物组合物中作为活性成分的溶瘤病毒如上文所描述。
77.所述溶瘤病毒的剂量依据个体情况和体重、疾病严重程度、药物剂型、给药的途径和时间而有所不同，且能够由本领域技术人员合理地进行选择。剂量可能使患者接受1
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病毒颗粒、传染性病毒单位(tcid
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18
、或更多的所施用的病毒颗粒、传染性病毒单位(tcid50)、或空斑形成单位(pfu)，介于上述数值之间各种数值以及范围均包括在内。优选地。溶瘤病毒的给药剂量为1
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pfu。
78.如本文所用，术语“gcv”指一种名为更昔洛韦的抗病毒药剂，其能够有效地抗单纯疱疹病毒、巨细胞病毒和水痘带状疱疹病毒。所述gcv的5’端被病毒tk磷酸化并转变为三磷酸更昔洛韦(gcv-tp)。gcv-tp限制了病毒dna聚合酶的活性，并结合到病毒dna的3’端，从而能够终止dna的延伸。此外，磷酸化的gcv能够阻止细胞dna复制，从而抑制细胞生长。所述gcv如式1所示。
79.[式1]
[0080][0081]
如本文所用，术语“acv”指一种名为阿昔洛韦的抗病毒药剂，其能够有效地抗单纯疱疹病毒、水痘带状疱疹病毒和eb病毒。所述acv被病毒tk磷酸化并转变为三磷酸阿昔洛韦(acv-tp)。acv-tp限制了病毒dna聚合酶的活性，并结合到病毒dna的3’端，从而能够终止dna的延伸。所述acv如式2所示。
[0082]
[式2]
[0083][0084]
此外，所述gcv或acv可以0.1μg/kg到50mg/kg的剂量给药。具体地，所述gcv或acv可以0.1μg/kg到50mg/kg，1μg/kg到40mg/kg，5μg/kg到30mg/kg，或10μg/kg到20mg/kg的剂量给药。
[0085]
癌症可选自下组：肺癌、结直肠癌、前列腺癌、甲状腺癌、乳腺癌、脑癌、头颈癌、食管癌、皮肤癌、胸腺癌、胃癌、结肠癌、肝癌、卵巢癌、子宫癌、膀胱癌、直肠癌、胆囊癌、胆道
癌、胰腺癌、非小细胞肺癌、骨癌、眼内黑色素瘤、肛周癌、输卵管癌、子宫内膜癌、宫颈癌、阴道癌、外阴癌、霍奇金病、小肠癌、内分泌腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、慢性白血病、急性白血病、淋巴细胞淋巴瘤、肾癌、输尿管癌、肾细胞癌、肾盂癌、中枢神经系统肿瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、脊髓肿瘤、脑干胶质瘤、垂体腺瘤、及其组合。
[0086]
本发明的药物组合物可进一步包含药学上可接受的载体。此外，本发明的药物组合物可进一步包含合适的辅料和稀释剂，所述辅料和稀释剂是制备药物组合物过程中常用的。此外，所述药物组合物可以按照常规方法制备为注射剂形式。
[0087]
在制备用于肠外给药的制剂时，可将药物组合物制备为灭菌水溶液、无水溶液、悬浮液、乳液、冻干剂、栓剂等。对于无水溶液或悬浮液，可以使用丙二醇、聚乙二醇、植物油(例如橄榄油)、注射酯(例如油酸乙酯)等。栓剂的基础材料可以使用witepsol
tm
、聚乙二醇、tween
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61、可可黄油、月桂酸甘油酯脂肪、甘油明胶等。
[0088]
关于给药途径、剂量和给药频率，可根据患者的病情和副作用存在与否，以多种方式和剂量向受试者给药；本领域技术人员可在适当范围内选择其最佳给药途径、剂量和给药频率。此外所述药物组合物可以与对要治疗的疾病有已知疗效的其他药物或生理活性物质联合应用，或可以和其他药物以联合制剂的形式制备。
[0089]
所述药物组合物可以肠外给药，并可以以任何合适的方式给药，例如肿瘤内、腹膜内、皮下、皮内、鼻内和静脉注射给药。其中优选肿瘤内、腹膜内、或静脉注射给药。另一方面，所述药物组合物的剂量可以根据给药频率、总剂量、和患者健康状况决定。
[0090]
在本发明的另一方面，提供了一种治疗癌症的方法，所述方法包括步骤：施用溶瘤病毒和更昔洛韦(gcv)或阿昔洛韦(acv)的步骤，所述溶瘤病毒包含一段编码多肽的核苷酸序列，所述多肽包含一个效应结构域，所述效应结构域如seq id no:1所示并且是从单纯疱疹病毒胸苷激酶(hsv-tk)衍生出的。
[0091]
所述溶瘤病毒、gcv、和acv如上文所描述。
[0092]
如本文所用，术语“个体”是指患有或正遭受疾病的人，其状态可通过施用本发明的溶瘤病毒和gcv或acv来缓解、抑制或治疗。
[0093]
在本发明的另一方面，提供了一种溶瘤病毒用于治疗肿瘤的用途，所述溶瘤病毒包含一段编码多肽的核苷酸序列，所述多肽包含一个效应结构域，所述效应结构域如seq id no:1所示并且是从单纯疱疹病毒胸苷激酶(hsv-tk)衍生出的。
[0094]
在本发明的另一方面，提供了一种生产溶瘤痘苗病毒的方法，所述溶瘤痘苗病毒包含一段编码突变的hsv-tk的基因，所述方法包括步骤：i)从痘苗病毒中去除tk基因，并允许痘苗病毒与野生型hsv-tk基因重组；和ii)在宿主细胞中存在溴化脱氧尿嘧啶核苷(brdu)的情况下，持续进行重组痘苗病毒的传代培养。
[0095]
野生型hsv-tk基因可以是如seq id no:16所示的核苷酸序列。
[0096]
所述溶瘤痘苗病毒具有较低的tk活性或无tk活性并能够磷酸化gcv或acv。
[0097]
所述传代培养可持续进行至少3次，并且优选地持续进行至少10次。
[0098]
在本发明的另一方面，提供了一种预防或治疗癌症的药物组合物，所述药物组合物包括溶瘤病毒和羟基脲作为活性成分，所述溶瘤病毒包含一段编码多肽的核苷酸序列，所述多肽包含一个效应结构域，所述效应结构域如seqidno:1所示并且是从单纯疱疹病毒
胸苷激酶(hsv-tk)衍生出的。关于所述溶瘤病毒，见上文描述。
[0099]
如本文所用，术语“羟基脲”是指下式的化合物。
[0100]
[式3]
[0101][0102]
已知羟基脲是一种抗肿瘤药剂，能够抑制dna合成，然而，其确切的机制仍有待阐明。另外，羟基脲可以以含有羟基脲的商业化药物形式包含在所述药物组合物中。含有羟基脲的商业化药物的例子可包括但不限于脲的商业化药物的例子可包括但不限于droxia
tm
、mylocel
tm
、和cap。所述羟基脲可以口服，且肠外给药也是可行的。
[0103]
包含在所述药物组合物中的溶瘤病毒和羟基脲可以同时给药、或以顺序方式或相反顺序方式联合给药。具体地，溶瘤病毒和羟基脲可以同时给药。此外，可先给药羟基脲，随后给药溶瘤病毒。此外，可先给药溶瘤病毒，随后给药羟基脲。此外，可先给药羟基脲，随后给药溶瘤病毒，随后再次给药羟基脲。
[0104]
此外，所述羟基脲可以以1mg/kg/天到100mg/kg/天，或10mg/kg/天到90mg/kg/天的剂量给药。具体地，所述羟基脲可以以10mg/kg/天到90mg/kg/天、15mg/kg/天到80mg/kg/天、20mg/kg/天到70mg/kg/天、25mg/kg/天到65mg/kg/天、或30mg/kg/天到60mg/kg/天的剂量给药。在本发明的一个实施方式中，所述羟基脲以30mg/kg/天或60mg/kg/天给药。根据用量，所述药物组合物可分量多次给药。具体地，所述药物组合物可分剂量给药如每天1到4次或每天1到2次。
[0105]
癌症可选自下组：肺癌、结直肠癌、前列腺癌、甲状腺癌、乳腺癌、脑癌、头颈癌、食管癌、皮肤癌、胸腺癌、胃癌、结肠癌、肝癌、卵巢癌、子宫癌、膀胱癌、直肠癌、胆囊癌、胆道癌、胰腺癌、非小细胞肺癌、骨癌、眼内黑色素瘤、肛周癌、输卵管癌、子宫内膜癌、宫颈癌、阴道癌、外阴癌、霍奇金病、小肠癌、内分泌腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、慢性白血病、急性白血病、淋巴细胞淋巴瘤、肾癌、输尿管癌、肾细胞癌、肾盂癌、中枢神经系统肿瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、脊髓肿瘤、脑干胶质瘤、垂体腺瘤、及其组合。
[0106]
本发明的药物组合物可进一步包含药学上可接受的载体。此外，本发明的药物组合物可进一步包含合适的辅料和稀释剂，所述辅料和稀释剂是制备药物组合物过程中常用的。此外，所述药物组合物可以按照常规方法制备为注射剂形式。
[0107]
在制备用于肠外给药的制剂时，可将药物组合物制备为灭菌水溶液、无水溶液、悬浮液、乳液、冻干剂、栓剂等。对于无水溶液或悬浮液，可以使用丙二醇、聚乙二醇、植物油(例如橄榄油)、注射酯(例如油酸乙酯)等。栓剂的基础材料可以使用witepsol
tm
、聚乙二醇、tween
tm
61、可可黄油、月桂酸甘油酯脂肪、甘油明胶等。
[0108]
关于给药途径、剂量和给药频率，可根据患者的病情和副作用存在与否，以多种方式和剂量向受试者给药；本领域技术人员可在适当范围内选择其最佳给药途径、剂量和给药频率。此外所述药物组合物可以与对要治疗的疾病有已知疗效的其他药物或生理活性物
质联合应用，或可以和其他药物以联合制剂的形式制备。
[0109]
所述药物组合物可以肠外给药，并可以以任何合适的方式给药，例如肿瘤内、腹膜内、皮下、皮内、鼻内和静脉注射给药。其中优选肿瘤内、腹膜内、或静脉注射给药。另一方面，所述药物组合物的剂量可以根据给药频率、总剂量、和患者健康状况决定。
[0110]
在本发明的另一方面，提供了一种治疗癌症的方法，所述方法包括步骤：施用溶瘤病毒。
[0111]
在本发明的另一方面，提供了一种溶瘤病毒用于治疗癌症的用途。
[0112]
在本发明的另一方面，提供了一种溶瘤病毒用于制备治疗癌症的药物的用途。
[0113]
在本发明的另一方面，提供了一种治疗癌症的方法，所述方法包括步骤：施用用于预防或治疗癌症的药物组合物。
[0114]
在本发明的另一方面，提供了一种用于预防或治疗癌症的药物组合物用于治疗癌症的用途。
[0115]
在本发明的另一方面，提供了一种用于预防或治疗癌症的药物组合物用于制备治疗癌症的药物的用途。
[0116]
本发明实施方式
[0117]
接下来，将通过以下实施例更详细地描述本发明。然而，下述实施例仅限于说明作用，并不构成对本发明的限定。
[0118]
实施例1突变的痘苗病毒的制备
[0119]
实施例1.1穿梭质粒载体的构建
[0120]
所使用的穿梭质粒载体是通过合成1型hsvtk基因(pse/l启动子)和萤火虫荧光素酶报告(p7.5启动子)基因并将这些基因重组到puc57amp 质粒(genewiz，美国)产生的穿梭质粒载体。
[0121]
实施例1.2突变的痘苗病毒(c1、c3、c40、c45、c52、和c57)的构建
[0122]
图1显示了制备突变的痘苗病毒的步骤。具体地，首先，为了获得重组病毒，将hela细胞(atcc)以每孔4
×
105个细胞接种在6孔板中，然后添加含有10％胎牛血清的emem培养基。使用惠氏系野生型痘苗病毒(纽约市卫生署株，wr-1536，atcc)进行moi为0.05的处理。2小时后，用含2％胎牛血清的emem培养基替换培养基，并使用xfect
tm
聚合物(clonetech 631317，美国)将4μg穿梭质粒载体(如实施例1.1所构建)递送至细胞中。培养4小时后，用含2％胎牛血清的emem培养基替换培养基，继续培养72小时。通过检测hela细胞中荧光素酶的活性获得含有hsv1-tk基因的重组痘苗病毒。
[0123]
随后，在tk-骨肉瘤(143b tk-)细胞系(atcc)中，在brdu(胸苷类似物，15μg/ml)存在的情况下，通过在能够筛选tk功能缺乏的细胞的生化环境(tk-选择压力)中进行10次连续传代培养，从而诱导引发tk活性缺乏的hsv1-tk突变。将具有荧光素酶活性的突变痘苗病毒克隆的裂解物分配到平板上，然后分离出100个具有荧光素酶活性的单空斑。随后，将单空斑扩增，并通过蛋白质印迹鉴定表达不同蛋白大小的hsv-tk片段的克隆(s3c4#1_c1到s3c4#1_c100)。
[0124]
具体地，用每个15μl的100个克隆进行处理以感染hela细胞系。随后，在24小时后收集并溶解细胞，以提取蛋白质。将提取的蛋白质进行变性，随后将每个样品40μg上样至sds-page凝胶进行电泳。在电泳后，将样品转移到pvdf膜，并与作为一抗的抗hsv1-tk抗体
(bethyl a50-101p)反应。随后，pbst洗涤样品，然后与作为二抗的带hrp标签的抗山羊抗体(santacruz,sc-28037)反应。再次pbst洗涤样品，使用化学荧光试剂处理，并使用化学荧光成像系统(davinch k)进行检测。结果显示，经鉴定，hsv1-tk片段蛋白在病毒中表达(图2到13)。
[0125]
这100个不同克隆基本不具有tk活性，因为它们是在能够筛选缺乏tk功能细胞的生化环境中培养的。另一方面，为了筛选对gcv敏感的克隆，初始时在96孔板中在gcv存在的情况下进行4天的培养，使用实时细胞成像分析系统(essen biosciences)通过实时成像选取发生细胞凋亡的10个克隆。一般来说，病毒引起的细胞毒性在空斑形成后逐渐增加。但是，在gcv诱导的细胞毒性中，整体细胞毒性在空斑形成后15小时内立即发生。因此，对gcv诱导的细胞毒性进行了定性检测。
[0126]
在最初通过成像分析选择的集落中，检测由gcv施用引起的病毒增殖和细胞毒性的抑制。之后，最终选择了集落s3c4#1_c1、s3c4#1_c3、s3c4#1_c40、s3c4#1_45、s3c4#1_c52、和s3c4#1_c57中的突变的痘苗病毒。集落s3c4#1_c1、s3c4#1_c3、s3c4#1_c40、s3c4#1_45、s3c4#1_c52、和s3c4#1_c57中的突变的痘苗病毒分别命名为“c1”、“c3”、“c40”、“c45”、“c52”、和“c57”。
[0127]
向macrogen(韩国首尔)申请了对c1、c3、c40、c45、c52和c57的氨基酸进行测序。结果显示，鉴定得到c40和c45的氨基酸序列相同；c1、c3、c40/45、c52、c57具有seq id nos：15、17、19、21、23、和25所示的氨基酸。特别地，鉴定到在选定的突变痘苗病毒的hsv1-tk中，从n-端的第145个氨基酸开始发生突变(图14)。
[0128]
实施例1.3突变的痘苗病毒(wots-418/ots-418)的制备
[0129]
hsv-tk中报道最多的突变是由碱基的插入或缺失引起的移码突变，发生在核苷酸序列部分第430到436位(7gs)和第548到583位(6cs)。将野生型hsv-tk插入痘苗病毒中后，98％或以上的突变发生在这些区段。因此，为了在核苷酸序列区段诱发沉默突变，位于430至436位的核苷酸序列ggggggg被转变为ggtggtg，位于548至583位核苷酸序列cccccc被转变为cccctc。此外，所使用的穿梭质粒载体是通过合成编码hsv-tk变体的基因和萤火虫荧光素酶报告基因(p7.5启动子)，并将上述基因的重组体装载入puc57amp 质粒(genewiz，美国)中而产生的穿梭质粒载体，所述hsv-tk变体获取自如seq id no:15所示的hsv-tk氨基酸序列，第167位丙氨酸替换为酪氨酸。之后，使用如实施例1.2中使用的相同方法，用穿梭质粒载体和wr系(atcc)或惠氏系痘苗病毒生产突变的痘苗病毒。使用wr系痘苗病毒生产的突变痘苗病毒命名为“wots-418”，使用惠氏系痘苗病毒生产的突变痘苗病毒命名为“ots-418”。
[0130]
最后检测分离自该经过了穿梭质粒载体和wr系痘苗病毒处理的hela肿瘤细胞系培养液的上清液和颗粒的荧光素酶活性(图15和16)。此外，检测分离自经过了穿梭质粒载体和wr系痘苗病毒处理的hela肿瘤细胞系培养液的上清液的荧光素酶活性(图17)。上述结果确定了编码hsv-tk变体的基因被引入了wr系或惠氏系痘苗病毒。
[0131]
实施例2(体外)应用gcv后突变痘苗病毒(c1、c3、c45、c52)增殖抑制的鉴定
[0132]
检测了实施例1.2中制备的c1、c3、c45和c52在应用gcv后引起的增值能力抑制。在此，集落s3c4#1_c19中的突变的痘苗病毒被用作阴性对照，命名为“c19”。为了检测gcv处理后的c1、c3、c45和c52的病毒颗粒数目差异，使用仅由痘苗病毒特异性表达的e9l进行定量
聚合酶链式反应(qpcr)。
[0133]
具体地，准备可识别e9l基因，同时仅与两个互补的dna链中的一个结合的探针(seq id no:19和20)。准备的探针在每次病毒增殖发生时都会检测到一个荧光。nci-h460肿瘤细胞系以每孔1.5
×
104个细胞接种，随后用病毒c1、c3、c19、c45、或c52以0.01到1的moi进行感染。2小时后，以60μm浓度的gcv进行联合处理。培养48小时，然后使用病毒提取试剂盒提取dna(qiaamp minelute virus spin,qiagen,57704)。提取到的dna稀释到1ng/5μl浓度，并进行qpcr。
[0134]
结果显示，对c19而言，尽管应用了gcv，病毒增殖也并没有被抑制。另一方面，证实了对c1、c3、c45和c52而言，在应用gcv后病毒增殖受到了抑制(图18)。这些结果表明，c1、c3、c45和c52表现出了应用gcv后的增殖能力降低。
[0135]
实施例3(体外)应用gcv后突变痘苗病毒(c40、c57)增殖能力降低的鉴定
[0136]
检测了实施例1.2中制备的c40和c57在应用gcv后的增殖能力。为了检测gcv处理后的c40和c57的增殖水平差异，使用e9l基因进行定量聚合酶链式反应(qpcr)。
[0137]
具体地，准备可识别e9l基因，同时仅与两个互补的dna链中的一个结合的探针。准备的探针在每次病毒增殖发生时都会检测到一个荧光。hela肿瘤细胞系以每孔1
×
104个细胞接种或nci-h460肿瘤细胞系以每孔1.5
×
104个细胞接种，随后用c40或c57以0.1(0.1pfu/cells)的moi进行感染。2小时后，以50μm浓度的gcv进行联合处理。培养48小时，然后使用病毒提取试剂盒提取dna。提取到的dna稀释到1ng/5μl浓度，并进行qpcr。
[0138]
结果证实了对c40和c57而言，在应用gcv后病毒增殖受到了抑制(图19和20)。这些结果表明，c40和c57表现出了应用gcv后的增殖能力降低。
[0139]
实施例4(体外)应用gcv后突变痘苗病毒(c1、c3、c45、c52)毒性的鉴定
[0140]
为了检测虽然实施例2中c1、c3、c45、和c52因gcv而表现出了增殖抑制，但gcv处理后c1、c3、c45、和c52是否保持了细胞毒性，进行了c1、c3、c19、c45、或c52和gcv的联合使用来比较细胞毒性。具体地，nci-h460肿瘤细胞系以每孔1.5
×
104个细胞接种，随后用c1、c3、c19、c45、或c52以0.01到1的moi进行感染。2小时后，以60μm浓度的gcv进行联合处理。培养72小时后，使用cck8试剂盒(cell counting kit 8,dojindo,kumamoto,日本)分析细胞毒性。
[0141]
结果显示，当用c1、c3、c45、或c52和gcv联合使用后，尽管存在gcv诱导的c1、c3、c45、和c52病毒增殖抑制，但nci-h460肿瘤细胞系额外地被杀伤了25％或以上。另一方面，当c19和gcv联合使用后，nci-h460肿瘤细胞系被杀伤的程度近似于仅用c19处理的情况(图21)。这些结果表明，在联合应用c1、c3、c45、或c52和gcv的情况下，c1、c3、c45、或c52的细胞毒性增加了。
[0142]
实施例5(体外)应用gcv后突变痘苗病毒(c40、c57)细胞毒性的鉴定
[0143]
为了检测虽然实施例3中c40和c57因gcv而表现出了增殖抑制，但gcv处理后c40和c57是否保持了细胞毒性，进行了c40或c57和gcv的联合使用来分析其细胞毒性。
[0144]
具体地，hela肿瘤细胞系以每孔1
×
104个细胞接种或nci-h460肿瘤细胞系以每孔1.5
×
104个细胞接种。随后用moi为0.1(0.1pfu/cells)的c40或c57和50μm浓度的gcv联合处理细胞，感染2小时。培养48小时后，使用cck8试剂盒(cell counting kit 8)分析细胞毒性。
[0145]
结果显示，当c40或c57和gcv联合使用后，尽管存在gcv诱导的c40和c57病毒增殖抑制，但hela细胞系和nci-h460肿瘤细胞系被杀伤的程度近似于仅用c40或c57处理的情况(图22和23)。这些结果表明，在联合应用c40或c57和gcv的情况下，c40或c57的细胞毒性增加了。
[0146]
实施例6(体外)突变痘苗病毒(wots-418)细胞毒性的鉴定
[0147]
为了检测实施例1.3中制备的wots-418抗肿瘤细胞的细胞毒性，10种肿瘤细胞系人肺癌细胞系(a549、nci-h460)、人肾癌细胞系(a498、caki-1)、人结直肠癌细胞系(ht-29、hct116)、人乳腺癌细胞系(mda-mb-231、mcf)、小鼠乳腺癌细胞系(4t1)和小鼠肾癌细胞系(renca)的每一种，以每孔3
×
103个细胞接种于96孔板上，随后使用moi为1(1pfu/cells)的wots-418处理这些细胞。培养72小时后，使用cck8试剂盒(cell counting kit 8)分析细胞毒性。其中，人肺癌细胞系(a549)和小鼠乳腺癌细胞系(4t1)是从美国典型培养物保藏中心(atcc)获得的。此外，人肾癌细胞系(a498)、人结直肠癌细胞系(ht-29、hct-116)、人肺癌细胞系(nci-h460)、人乳腺癌细胞系(mda-mb-231、mcf)和小鼠肾癌细胞系(renca)是从韩国细胞系库(kclb)获得的。
[0148]
结果显示，在人肺癌细胞系(a549)、人肾癌细胞系(a498、caki-1)、人结直肠癌细胞系(ht-29、hct-116)和人乳腺癌细胞系(mda-mb-231、mcf)中观察到60％以上的细胞毒性(图24)。
[0149]
实施例7(体外)应用acv、gcv或brdu后突变痘苗病毒(wots-418)增殖能力降低的鉴定
[0150]
检测了实施例1.3中制备的wots-418在应用gcv后的增殖能力。为了检测gcv处理后的wots-418的病毒颗粒数目差异，使用e9l基因进行定量聚合酶链式反应(qpcr)。
[0151]
具体地，准备同时仅与两个互补的dna链中的一个结合的可识别e9l基因的探针。准备的探针在每次病毒增殖发生时都会检测到一个荧光。具体地，a549肿瘤细胞系以每孔1
×
104个细胞接种，随后用wots-418以0.1(0.1pfu/cells)的moi进行感染。2小时后，以200μm或300μm浓度的acv、gcv或brdu进行联合处理。培养48小时后使用病毒提取试剂盒提取dna。提取到的dna稀释到1ng/5μl的浓度，并进行qpcr。
[0152]
结果证实了对wots-418而言，在联合应用acv、gcv或brdu后病毒增殖受到了显著的抑制(图25)。
[0153]
此外，nci-h460肿瘤细胞系以每孔1.5
×
104个细胞接种，随后用wots-418以0.1(0.1pfu/cells)的moi进行感染。2小时后，以100μm浓度的gcv进行联合处理。培养48小时后使用病毒提取试剂盒提取dna。提取到的dna稀释到1ng/5μl的浓度，并进行qpcr。
[0154]
结果证实了对wots-418而言，在联合应用wots-418和gcv后病毒增殖受到了显著的抑制(图26)。这些结果表明，wots-418对acv、gcv和brdu具有敏感性,并表现出了应用acv、gcv或brdu后的增殖能力降低。
[0155]
实施例8(体外)应用gcv后突变痘苗病毒(wots-418)增殖能力降低的鉴定
[0156]
使用qpcr分析在移植了人结直肠癌细胞系(hct-116,5
×
106cells/ml)的小鼠(balb/c nu/nu)模型检测中检测wots-418的增殖能力。
[0157]
具体地，小鼠(balb/c nu/nu)购自koatech(韩国)，在经过一周适应期后，进行人结直肠癌细胞系hct-116肿瘤细胞系(韩国细胞系库)的异种移植，移植量为5
×
106个细胞。
观察直到肿瘤体积达到100mm3到150mm3随后进行wots-418和gcv肿瘤内联合给药。其中，wots-418(1
×
106pfu)是腹腔内给药。从4天后开始，每天给药一次gcv(50mg/kg)，持续3天(d5、d6、d7)。从第5天开始，每组处死3只小鼠，分离出肿瘤。分离出的肿瘤使用样品均质系统(omni bead ruptor 24)均质化，然后使用qpcr对病毒颗粒的数量进行量化。
[0158]
结果显示，gcv处理引起的病毒增殖抑制从第三天开始出现。(图27)
[0159]
实施例9(体外)突变痘苗病毒(wots-418)细胞毒性的鉴定
[0160]
为了检测虽然实施例7和8中wots-418因gcv而表现出了增殖抑制，但gcv处理后wots-418是否保持了细胞毒性，进行了wots-418和gcv的联合处理来比较细胞毒性。具体地，nci-h460肿瘤细胞系以每孔1.5
×
104细胞接种。随后用wots-418以0.02(0.02pfu/cells)的moi进行感染。2小时后，以60μm或100μm浓度的gcv进行联合处理。培养72小时后，使用cck8试剂盒(cell counting kit 8)分析细胞毒性。
[0161]
结果显示，当wots-418和gcv联合使用后，尽管存在gcv诱导的wots-418病毒增殖抑制，但nci-h460肿瘤细胞系额外地被杀伤了30％或以上(图28)。这些结果表明，在联合使用wots-418和gcv的情况下，wots-418的细胞毒性增加了。
[0162]
实施例10(体外)突变痘苗病毒(ots-418)细胞毒性的鉴定
[0163]
为了检测应用gcv后ots-418的细胞毒性，进行了ots-418和gcv的联合处理以比较细胞毒性。具体地，nci-h460肿瘤细胞系以每孔3
×
103细胞接种。随后用ots-418以0.02(0.02pfu/cells)的moi进行感染。2小时后，以6μm或60μm浓度的gcv进行联合处理。培养72小时后，使用cck8试剂盒(cell counting kit 8)分析细胞毒性。
[0164]
结果显示，在ots-418和gcv联合处理的情况下，gcv使ots-418的细胞毒性增加了。特别地,在浓度为60μm的ots-418和gcv联合处理的情况下，nci-h460肿瘤细胞系被额外地杀伤了约20％以上(图29)。这些结果表明，在联合应用ots-418和gcv的情况下，细胞毒性增加了。
[0165]
实施例11检测重组痘苗病毒(wots-418)和羟基脲在移植有人乳腺癌细胞系的小鼠：mda-mb-231中的抗癌效果
[0166]
购自orient bio(韩国釜山)的balb/c nu/nu小鼠(雌性，8周龄)经过一周适应期后，移植5
×
106个细胞的人乳腺癌细胞系(mda-mb-231)。观察直到肿瘤体积达到50mm3后开始给药。31天后测量肿瘤体积。
[0167]
将构建的移植有人乳腺癌细胞系的小鼠分为4组(n＝5)。接受腹腔内盐水给药的组设为对照组，接受羟基脲(hu,30mg/kg)的组、接受wots-418(1
×
107pfu)的组和同时接受wots-418和hu的组归为实验组。wots-418总共给药2次(d0、d10)，其中在第0天以腹腔内方式给药，随后在第10天以肿瘤内方式给药。羟基脲每天两次腹腔内给药(6次/周)(图30)。
[0168]
连续31天测量肿瘤体积。结果显示，对照组的肿瘤体积缓慢增长，在第17天后开始大幅增加，因而第31天肿瘤体积比初始体积增大了6倍或以上。此外，接受hu治疗组小鼠的肿瘤体积也逐步增长，因而第31天肿瘤体积比初始体积增大了5倍或以上
[0169]
另一方面，观察到对于接受wots-418治疗的实验组小鼠的肿瘤体积，肿瘤生长从第14天起受到抑制，直到第31天肿瘤体积都保持不变。另一方面，观察到对于接受wots-418和羟基脲治疗的实验组小鼠的肿瘤体积，肿瘤生长从第17天起受到抑制，并表现出肿瘤体积下降的趋势(图31)。
[0170]
上述结果显示，wots-418能够抑制肿瘤生长，并证实了虽然单独应用羟基脲进行治疗时无法抑制肿瘤生长，但比起wots-418或羟基脲单独应用，wots-418和羟基脲联用能够增强抗肿瘤效果。
[0171]
实施例12检测重组痘苗病毒(wots-418)和羟基脲在移植有小鼠肾癌细胞系的小鼠：renca中的抗癌效果
[0172]
balb/c nu/nu小鼠(雌性，8周龄)购自orient bio(韩国釜山)，在经过一周适应期后，进行小鼠肾癌细胞系(renca,韩国)的同种异体移植。观察直到肿瘤体积达到100mm3，随后开始给药。28天后测量肿瘤体积。
[0173]
将构建的移植有小鼠肾癌细胞系的小鼠分为3组(n＝7)。接受腹腔内盐水给药的组设为对照组，接受单剂量wots-418和羟基脲(1
×
106pfu,30mg/kg)的组、接受多剂量wots-418和羟基脲(1
×
106/1
×
107pfu,30mg/kg)的组归为实验组。wots-418在第0天和第14天腹腔内给药，羟基脲每天两次腹腔内给药(6次/周)。
[0174]
结果证明，与对照组相比，接受wots-418和羟基脲治疗的实验组小鼠肿瘤体积受到了显著抑制，并证明了相比单剂量治疗组，多剂量治疗组的肿瘤体积受到了进一步抑制。此外，还证明了在第二次给药时增加wots-418浓度的多剂量治疗组中，抗癌效果有所增强(图32)。
[0175]
实施例13检测重组痘苗病毒(wots-418)和羟基脲在移植有小鼠结直肠癌细胞系的小鼠：ct-26中的抗癌效果
[0176]
实验实施例13.1移植有小鼠结直肠癌细胞的小鼠构建以及给药方法
[0177]
balb/c nu/nu小鼠(雌性，8周龄)购自orient bio(韩国釜山)，在经过一周适应期后，进行小鼠结直肠癌细胞系(ct-26,韩国细胞系库)的同种异体移植。观察直到肿瘤体积达到100mm3后开始给药。
[0178]
将构建的移植有小鼠结直肠癌癌细胞系的小鼠分为4组(g1、g2、g3:n＝15,g4:n＝14)。接受腹腔内盐水给药的组设为对照组，接受单用羟基脲(30mg/kg)腹腔内给药的组、接受单用wots-418两次腹腔内给药(1
×
108pfu,i.p.,d0,d3)和两次瘤内给药(1
×
107pfu,i.t.,d14,d21)的组、和接受wots-418和羟基脲以相同剂量和方案联合给药的组归为实验组。wots-418在第0和3天腹腔内给药，随后在第14和21天瘤内给药，羟基脲每天一次进行腹腔内给药(6次/周)，从病毒给药前开始直到第26天(图33)。
[0179]
在第25天测量肿瘤体积并处死小鼠。随后分离出小鼠的免疫细胞，进行γ-干扰素检测。
[0180]
实验实施例13.2鉴定肿瘤体积变化
[0181]
在实验实施例13.1中对每组小鼠进行给药，并在第25天测量肿瘤体积。结果显示，与对照组相比，接受wots-418单用给药的实验组小鼠、接受羟基脲单用的实验组小鼠、和接受wots-418和羟基脲联合给药的实验组小鼠都表现出了肿瘤体积受抑制。特别地，经鉴定接受wots-418和羟基脲联合给药的实验组小鼠肿瘤体积受到了显著抑制(图34)。
[0182]
实验实施例13.3γ-干扰素检测
[0183]
在实验实施例13.1中对每组小鼠进行给药。随后分离出小鼠的免疫细胞，进行γ-干扰素检测。
[0184]
具体地，使用(ly-2)微珠试剂盒和磁激活细胞分选技术分离每组小鼠的脾cd8 t
细胞，随后(以1
×
104cells)与ct-26细胞系共培养。对分泌ifn-γ的cd8 t细胞进行elispot(mabtech,瑞典)实验，使用lk生物科学(首尔,韩国)对斑点进行扫描和计数。
[0185]
结果显示，相比于分离自对照组小鼠脾脏的cd8 t细胞，在接受wots-418单用给药的实验组、接受羟基脲单用给药的实验组、和接受wots-418和羟基脲联合给药的实验组小鼠脾脏中，分离出了大量分泌ifn-γ的cd8 t细胞。特别地，经鉴定接受wots-418和羟基脲联合给药的实验组小鼠肿瘤体积受到了显著抑制(图35和36)。