一种TFT5基因在提高植物抵抗灰霉菌侵染中的应用的制作方法

一种tft5基因在提高植物抵抗灰霉菌侵染中的应用
技术领域：
1.本发明属于植物基因工程领域，具体涉及一种tft5基因在提高植物抵抗灰霉菌侵染中的应用。


背景技术：

2.番茄是我国重要的经济作物，由半知菌亚门葡萄孢属的灰葡萄孢真菌(又名灰霉菌)引起的番茄灰霉病是番茄生产中的重要病害之一，是威胁番茄生产的一种毁灭性的腐生型真菌性病害。灰葡萄孢不仅侵染番茄的果实，还会侵染番茄的茎、叶、花等不同的部位，且传播速度快，严重影响番茄的产量和经济效益。灰葡萄孢还有易变异和多型性的特点，容易受环境和寄主的影响而产生新的变异。目前对番茄灰霉病的防治主要是化学防治和农业防治，但防治效果均不理想，因此需要深入研究植物的的抗病机制及其与病原互作的分子机制，为通过基因工程手段控制番茄灰霉病的发生提供依据，从而为番茄灰霉病的防治提供新的思路。
3.tft蛋白又名14-3-3蛋白，是一类高度保守的二聚体蛋白，在大多数生物物种中是由一个基因家族编码的一类蛋白调控家族，广泛存在于所有真核生物细胞中，在细胞周期调控、分化、凋亡中发挥重要作用，并协调多个信号传导通路。
4.tft蛋白的靶蛋白一般具有特异的磷酸化位点，如rsxpsxp、r xy/fxpsxp或ps/ptxxcooh膜体，其中丝氨酸或苏氨酸通常发生磷酸化修饰。tft蛋白的作用机制主要是通过与靶蛋白相互作用来调节靶蛋白，参与生物体内不同的调控途径，从而在细胞信号传导、细胞周期调节、细胞凋亡、胁迫应答等多种细胞活动中起到重要作用。例如 tft蛋白可以形成二聚体从而方便两个靶蛋白之间的互作；改变靶蛋白的亚细胞定位；保护靶蛋白，使其免于磷酸酶或蛋白酶的作用；引发靶蛋白构象改变，从而抑制或增强靶蛋白的催化活性。
5.目前发现的tft蛋白共有200多种。每个真核生物物种中都含有多种tft蛋白的同工型，如人类有7种、酵母有2种，不同的植物中tft蛋白种类和数量差异较大。如烟草有17种，是目前已知tft蛋白家族中最大最全的家族。拟南芥有15种tft蛋白基因，水稻中已报道有4个成员，大麦有5种，棉花中蛋白家族有6个成员。这些t ft蛋白广泛分布于细胞质、细胞核，还有叶绿体、线粒体等细胞器，在代谢、信号转导、细胞周期调控、胁迫响应、植物抗病等方面都具有重要作用。
6.大量研究表明，tft蛋白参与植物的防卫反应，tft蛋白在植物针对不同病原的免疫信号途径中都起着重要作用。如烟草的tft蛋白能与n蛋白、解旋酶相互作用从而促使r基因产物与病毒诱导子的相互作用来抵御烟草花叶病毒的侵染。拟南芥的tft蛋白可与rpw8.2 蛋白相互作用，介导免疫相关的细胞程序性死亡(pcd)及对白粉菌的抗性。
7.番茄中共有11个tft蛋白，其在不同的细胞、组织和器官中表达模式不同，功能也不同。多篇文章报道番茄tft蛋白介导番茄对细菌性病原的抗性，如番茄tft7能够与eti相关的mapkkkα和mkk2 互作，介导pcd从而调控植物对丁香假单孢的抗病性。番茄tft1,t ft4,tft5,tft6,tft10和tft11介导番茄对细菌性疮痂病菌xan thomonas euvesicatoria
的抗性。但是目前为止，关于番茄tft基因对介导番茄对真菌的抗病性未见报道。


技术实现要素：

8.本发明目的在于克服现有技术存在的不足和缺陷，提供一种tft5 基因在提高植物抵抗灰霉菌侵染中的应用。本发明从番茄中分离和克隆到tft5基因，构建了tft5基因敲除重组载体ptx-tft5及其纯合株系，并且证实了tft5基因可以有效提高番茄抵抗灰霉菌侵染的能力。
9.为实现上述发明目的，本发明提供了一种tft5基因在提高植物抵抗灰霉菌侵染中的应用，所述tft5基因的核苷酸序列如seq idno.1所示。
10.进一步的，所述应用包括以下步骤：
11.(1)构建tft5基因敲除重组载体：根据tft5基因的cds序列设计引后，并以质粒ptx-043为模板，进行pcr扩增；扩增产物纯化后，使用限制性内切酶bsa i对其进行酶切，回收酶切产物后与 ptx-041质粒进行连接，得到tft5基因敲除重组载体；
12.(2)构建tft5基因敲除重组菌株：将所述tft5基因敲除重组载体转化至农杆菌中，得到tft5基因敲除重组菌株；
13.(3)构建tft5基因敲除株系：将所述tft5基因敲除重组菌株转化进植物子叶中，使用抗生素kan对转化的愈伤组织进行筛选，并培养至得到再生植物，即得到tft5基因敲除株系。
14.进一步的，所述步骤(1)中引物的序列为
15.tft5-f0：
[0016]5’-
atatatggtctcgtttgaaggtgaagatctaagagcgttttagagc
[0017]
tagaaatagc-3’；
[0018]
tft5-r0：
[0019]5’-
attattggtctcgaaacgaacccgtcactcttctgaacaaactaca
[0020]
ctgttagattc-3’。
[0021]
进一步的，所述质粒为ptx-041。
[0022]
进一步的，所述基因敲除重组载体为ptx-tft5。
[0023]
进一步的，所述农杆菌为lba4404。
[0024]
进一步的，所述步骤(3)中培养的条件为16h光照(26℃)/8h 黑暗(18℃)。
[0025]
进一步的，所述tft5基因敲除株系与野生型株系相比，叶子上的病斑直径明显减小。
[0026]
进一步的，番茄tft5基因敲除株系与野生型株系相比，叶片上的灰霉量明显降低。
[0027]
进一步的，所述植物为番茄。
[0028]
与现有技术相比，本发明的优点和技术效果：本发明从番茄中分离和克隆到tft5基因，并进一步将tft5基因靶点序列连接到基因敲除载体ptx-041上，获得tft5基因敲除重组载体ptx-tft5，再利用农杆菌得到基因敲除重组菌株lba4404-ptx-tft5，并侵染转化番茄子叶，得到纯合的tft5基因敲除株系，通过研究基因敲除转基因株系的表型，并将其与相同条件下生长的野生型番茄的叶子上的病斑进行比较。本发明通过实验分析首次证明了tft5基因具有调控番茄对灰霉病抗病性的功能，而敲除tft5基因可以有效提高番茄抵抗灰
霉菌侵染的能力；tft5基因敲除纯合株系叶子上的病斑明显减小，灰霉量也明显低于野生型番茄株系。本发明的技术方案对tft5基因在提高番茄对灰霉病的抗病性上具有应用价值，同时也为利用tft5基因培育抗病、高产的番茄品种奠定良好的理论和应用基础。
附图说明：
[0029]
图1为tft5靶点序列的pcr扩增，其中m为dna marker，1-3 均为ptx-tft5靶点序列pcr产物。
[0030]
图2为敲除载体构建结果，其中m为dna marker，1-5为重组质粒的筛选。
[0031]
图3为tft5基因t2代纯合敲除突变体突变位点序列比较结果。
[0032]
图4为tft5基因敲除纯合株系的抗病性变化结果；
[0033]
图5为tft5基因敲除纯合株系中叶片上病斑直径的结果， (**p《0.01)。
[0034]
图6为tft5基因敲除纯合株系叶片中的灰霉量的结果， (**p《0.01)。
具体实施方式：
[0035]
下面通过实施例并结合附图对本发明作进一步描述。
[0036]
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均为市售商品。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
[0037]
下述实施例中所述的pqb载体、ptx-041载体和ptx-043载体，公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
[0038]
实施例1：
[0039]
番茄tft5基因敲除突变体和纯合株系的获得。
[0040]
1、番茄tft5基因敲除突变体的获得
[0041]
(1)载体构建
[0042]
在genebank数据库中获得番茄tft5基因的cds序列，其长度为 765bp，编码含有255个氨基酸的蛋白质，其核苷酸序列如seq id no.1 所示(下划线为靶点序列)，其编码的氨基酸序列如seq id no.2所示。在crispr direct网站输入tft5基因全序列，根据结果筛选合适的靶点，其中选择的靶点分别为：tgagcaagctgaacgctatg和 tcggagctaggagagcatcg，并据此设计引物，引物序列如下：
[0043]
tft5-f0：
[0044]5’-
atatatggtctcgtttgaaggtgaagatctaagagcgttttagagc
[0045]
tagaaatagc-3’(seq id no.3)；
[0046]
tft5-r0：
[0047]5’-
attattggtctcgaaacgaacccgtcactcttctgaacaaactaca
[0048]
ctgttagattc-3’(seq id no.4)。
[0049]
以质粒ptx-043为模板，tft5-f0和tft5-r0为引物，并通过高保真酶对靶点序列进行pcr扩增，电泳结果如图1所示，将扩增产物进行回收、纯化；使用限制性内切酶bsa i对纯化pcr产物和ptx-041 质粒进行酶切，分别回收后，在t4连接酶的催化下进行过夜连接；连接完成后，将连接产物转化进大肠杆菌jm109，挑选含有重组质粒的阳性克隆送公司测序，
最后将测序无误的重组质粒命名为 ptx-tft5。其中，质粒筛选时所用引物的序列如下：
[0050]
ptx-fw：
[0051]5’-
agcggataacaatttcacacagga-3’(seq id no.5)；
[0052]
ptx-rv：
[0053]5’-
gcaggcatgcaagcttattgg-3’(seq id no.6)。
[0054]
(2)转基因植株的制备
[0055]
将重组载体ptx-tft5转化至农杆菌lba4404中，得到重组菌株 lba4404-ptx-tft5。
[0056]
按照农杆菌介导的转基因方法利用重组菌株lba4404-ptx-tft5 对番茄子叶进行转化；再利用抗生素kan对转化的愈伤组织进行筛选，同时设置转空载体作为对照；每2-3周更换培养基直到得到再生苗，其中培养条件为16h光照(26℃)/8h黑暗(18℃)。
[0057]
分别提取再生苗的基因组dna，对tft5基因包含靶点的部分序列进行pcr扩增，所用引物的序列为：
[0058]
tft5-f(-46)：
[0059]5’-
ctctctctaa aacccctctt tctc-3’(seq id no.7)；
[0060]
tft5-r550：
[0061]5’-
cctgagcaga cttgtaggcc g-3’(seq id no.8)。
[0062]
将得到的pcr产物经电泳检测后切胶送生物公司测序；如果序列靶点附近开始有套峰或者序列在两个靶点之间有部分缺失，则说明该植株为tft5敲除阳性植株。测序结果显示，本发明得到2个tft5敲除阳性植株，并分别标记为tft5-1和tft5-3。
[0063]
2、番茄tft5基因敲除纯合株系的获得
[0064]
收获t0代敲除阳性植株tft5-1和tft5-3的种子作为t1代；分别将得到的t1代种子播种，待2-3周后每个敲除系分别取5-10棵植株，提取其基因组dna，用tft5-f(-46)和tft5-r550引物对进行 pcr扩增，pcr产物回收后连接pmd-18t载体，挑选阳性克隆送公司测序。每个敲除系的植株送4个样品去克隆。测序结果显示，每个敲除系植株的4个克隆样品均无套峰，且靶点位置发生突变或两个靶点之间发生部分缺失，由此确定样品均为tft5基因敲除纯合株系。
[0065]
将鉴定得到的三株阳性tft5基因敲除纯合株系分别命名为敲除系tft5-1-6和tft5-3-2。与野生型植株相比，敲除系tft5-1-6基因中缺失该基因的第183位，导致翻译提前终止而发生无义突变；敲除系tft5-3-2基因中缺失该基因的第183-184位，发生移码突变；具体的比对序列信息见图3。将得到的tft5基因敲除纯合株系移栽大盆，收取种子，用于后续的实验。
[0066]
实施例2：
[0067]
阳性番茄tft5基因敲除植株表型的鉴定
[0068]
1、将tft5基因敲除株系tft5-1-6和tft5-3-2与野生型番茄 (wt)的种子分别播种于营养土中，培养于温室中，其中培养条件为 16h光照(26℃)/8h黑暗(18℃)。然后，选取4周左右、大小长势相同的tft5基因敲除纯合株系与野生型各3组，每组含3棵番茄植株，用孢子浓度为106的孢子液接种番茄叶片，将叶片置于塑料盒中，上面敷上一层保鲜膜以保持百分百湿度，在22℃下保持24-48 小时后观察番茄叶片发病情况并进行数据统计。结果如图4
和图5所示，与野生型相比，tft5基因敲除纯合株系叶子上的病斑直径明显减小。
[0069]
2、对灰霉菌侵染后的番茄叶片提取总rna，用qrt-pcr检测叶片中的灰霉量，并使用番茄actin做内参，所用引物序列如下：
[0070]
β-tubulin-f：
[0071]5’-
accgttccagagttgactcaa-3’(seq id no.9)；
[0072]
β-tubulin-r：
[0073]5’-
gcaagaaagcctttcttctga-3’(seq id no.10)。
[0074]
结果如图6所示，tft5基因敲除纯合株系中的灰霉量明显低于野生型番茄。
[0075]
以上证据表明tft5基因对番茄抵抗灰霉菌侵染有重要作用，且敲除tft5基因可以有效提高番茄抵抗灰霉菌侵染的能力，因此番茄 tft5基因具有调控番茄抵抗灰霉菌侵染的功能。
[0076]
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。
[0077]
序列表：
[0078]
seq id no.1
[0079]
atggcgtctc cacgtgaagagaacgtgtacatggcgaagcttgctgagcaagctgaacgctatgaggagatggtagaattcatggagaaggtcgtcgcgg ccttgaacggtgaggaacttaccgtcgaggaacgcaacctctctccgtcg catacaaaa acgtgatcgg agctaggagagcatcgtggc gtataatttc atcgatcgagcagaaagaggagagtcgtggtaacgaagatcacgttgcct ccattaagaaatacagatctcagatcgagaatgagctgacttcgatctgta acggcatcctcaagttgcttgattccaaactcatcgggtcagctgctac cggagactccaaggttttct atttgaaaatgaagggagattactaccggt acttggctgagttcaaaaccggaaccgagagaaaagaagctgcagagaa tactctttcggcctacaagtctgctcaggatatcgctaatggcgaattggc cccaacacatccaatccgattgggtctagctctcaatttctcagtgttttac tatgagatattgaattctcctgatcgtgcttgtaatctcgccaaacaggcct ttgatg aggcaattgc ggagcttgac accctgggag aggagtccta caaggatagcactttgatta tgcaacttct gcgtgataac ctcactttgt ggacctcggatatgcaggatgatggaactgatgagatcaaagaaccatca aaagctgataatgagtag
[0080]
seq id no.2
[0081]
maspreenvymaklaeqaeryeemvefmekvvaalngeeltveernllsva
[0082]
yknvigarraswriissieqkeesrgnedhvasikkyrsqieneltsicngilkl
[0083]
ldskligsaatgdskvfylkmkgdyyrylaefktgterkeaaentlsayksa
[0084]
qdiangelapthpirlglalnfsvfyyeilnspdracnlakqafdeaiaeld
[0085]
tlgeesykdstlimqllrdnltlwtsdmqddgtdeikepskadne
[0086]
seq id no.3
[0087]
atatatggtctcgtttgaaggtgaagatctaagagcgttttagagc
[0088]
tagaaatagc
[0089]
seq id no.4
[0090]
attattggtctcgaaacgaacccgtcactcttctgaacaaactaca
[0091]
ctgttagattc
[0092]
seq id no.5
[0093]
agcggataacaatttcacacagga
[0094]
seq id no.6
[0095]
gcaggcatgcaagcttattgg
[0096]
seq id no.7
[0097]
ctctctctaaaacccctctt tctc
[0098]
seq id no.8
[0099]
cctgagcaga cttgtaggccg
[0100]
seq id no.9
[0101]
accgttccagagttgactcaa
[0102]
seq id no.10
[0103]
gcaagaaagcctttcttctga