用于预测免疫治疗疗效的肠道菌群标志物及其应用的制作方法

responsebiomarker,andpotentialspearheadinadvancingtargetedtherapytrials.cancergenetherapy2020；27:841-853.10.3.routyb,lechateliere,derosaletal.gutmicrobiomeinfluencesefficacyofpd-1-basedimmunotherapyagainstepithelialtumors.sciencecancerimmunotherapy2018；359:91-97.11.4.gopalakrishnanv,spencercn,neziletal.gutmicrobiomemodulatesresponsetoanti-pd-1immunotherapyinmelanomapatients.science2018；359:97-103.12.5.bookoutal,cumminscl,mangelsdorfdj.high-throughputreal-timequantitativereversetranscriptionpcr.currentprotocolsinmolecularbiology2005；15.8:1-21.技术实现要素：13.本发明的目的在于克服现有技术的至少一个不足，提供一组用于预测免疫治疗疗效的肠道菌群标志物及其应用方式。14.本发明所采取的技术方案是：15.本发明的第一个方面，提供：16.用于预测免疫治疗疗效的肠道菌群标志物组，所述肠道菌群标志物组中的检测靶点选自如下31种细菌dna靶点中的至少2种，优选为其中的至少5种：[0017][0018][0019]所述肠道菌群标志物组可以用于预测免疫治疗疗效。[0020]在一些实例中，所述肠道菌群标志物组涉及的肠道细菌dna检测靶点为以下组合中的至少一个：[0021]组合i：clusterivruminococcusspp.、bifidobacteriumspp.、bifidobacteriumadolescentis、peptostreptococcusproductus、bacteroidesthetaiotaomicron、bacteroidesvulgatus、bacteroidesdistasonis、bacteroidesspp.、enterococcushirae、akkermansiamuciniphila、corynebacterium，共计11个肠道细菌dna检测靶点；[0022]组合c1c3：bacteroidesvulgatus、bacteroidesdistasonis、alleubacteria、bifidobacteriumcatenulatumgroup、bifidobacteriumbifidum，共计5个肠道细菌dna检测靶点；[0023]组合c2c4：fusobacteriumprausnitzii、bacteroidesspp.、clostridialclusteriv、bifidobacteriumcatenulatumgroup、clostridiumperfringensgroup，共计5个肠道细菌dna检测靶点；[0024]组合al：clusterivruminococcusspp.、fusobacteriumspp.，共计2个肠道细菌dna检测靶点；[0025]组合v：bacteroides-prevotella-porphyromonas、alleubacteria、clostridialclusterxiva、butyryl-coacoa-transferasegene、clostridiumcoccoides-eubacteriumrectalegroup，共计5个肠道细菌dna检测靶点。[0026]在一些实例中，所述免疫治疗为单独pd-1途径阻断治疗、pd-1途径阻断治疗联合化疗或pd-1途径阻断治疗联合靶向治疗。[0027]在一些实例中，所述免疫治疗为黑色素瘤的免疫治疗。[0028]在一些实例中，所述预测免疫治疗疗效的评分公式为：[0029]公式i：cf＝-186.811*靶2 500.54*靶11-397.623*靶17 243.817*靶22 468.598*靶24-564.659*靶25m 60.101*靶26 1652.688*靶29-1291.203*靶46-38.697*靶47-416.678*靶55-987.267；[0030]公式c1c3：cf＝-54.105*靶25m-321.927*靶26 904.879*靶28-16.335*靶38-35.708*靶39-531.83；[0031]公式c2c4：cf＝189.453*靶21-767.437*靶29-683.808*靶34-15.06*靶38-36.041*靶42 1216.563；[0032]公式al：cf＝195.493*靶2 468.221*靶43-411.411；[0033]公式v：cf＝1452.393*靶13-2926.599*靶28 3257.596*靶30-1753.58*靶36-526.748*靶41-573.037；[0034]上述各公式中，靶号指对应肠道细菌dna检测靶点的相对表达量，所述相对表达量基于内参考基因确定；优选的，所述内参考基因为细菌16srrnav4区域。[0035]在一些实例中，公式i用于计算用药方案为单药帕博丽珠、特瑞普利、纳武利尤或帕博丽珠联用易普利姆玛的cf值。[0036]在一些实例中，公式c1c3用于计算用药方案为帕博丽珠或特瑞普利联合替莫唑胺的cf值。[0037]在一些实例中，公式c2c4用于计算用药方案为帕博丽珠或特瑞普利联合白蛋白紫杉醇的cf值。[0038]在一些实例中，公式al用于计算用药方案为帕博丽珠或特瑞普利联合安罗替尼、乐伐替尼或阿昔替尼的cf值。[0039]在一些实例中，公式v用于计算用药方案为帕博丽珠或特瑞普利联合维莫非尼的cf值。[0040]本发明的第二个方面，提供：[0041]引物序列组在预测免疫治疗疗效中的应用，所述引物序列可以确定本发明第一个方面所述肠道菌群标志物的表达量。[0042]在一些实例中，所述表达量为相对表达量，基于内参考基因确定。[0043]在一些实例中，所述内参考基因为细菌16srrnav4区域。[0044]在一些实例中，所述免疫治疗为单独pd-1途径阻断治疗、pd-1途径阻断治疗联合化疗或pd-1途径阻断治疗联合靶向治疗。[0045]在一些实例中，所述免疫治疗为黑色素瘤的免疫治疗。[0046]本发明的第三个方面，提供：[0047]一种预测免疫治疗疗效的检测分析系统，包括肠道细菌基因组dna不同检测靶点的相对定量装置、数据分析装置和结果输出装置。[0048]所述肠道细菌基因组dna不同检测靶点的相对定量装置用于确定本发明第一个方面所述肠道菌群标志物的相对表达量；[0049]所述数据分析装置用于基于相对表达量，计算联合预测因子cf；[0050]所述结果输出装置用于输出计算结果，预测免疫治疗疗效。[0051]在一些实例中，所述相对表达量基于内参考基因确定。[0052]在一些实例中，所述内参考基因为细菌16srrnav4区域。[0053]在一些实例中，所述肠道菌群标志物组为以下组合中的至少一个：[0054]组合i：clusterivruminococcusspp.、bifidobacteriumspp.、bifidobacteriumadolescentis、peptostreptococcusproductus、bacteroidesthetaiotaomicron、bacteroidesvulgatus、bacteroidesdistasonis、bacteroidesspp.、enterococcushirae、akkermansiamuciniphila、corynebacterium，共计11个肠道细菌dna检测靶点；[0055]组合c1c3：bacteroidesvulgatus、bacteroidesdistasonis、alleubacteria、bifidobacteriumcatenulatumgroup、bifidobacteriumbifidum，共计5个肠道细菌dna检测靶点；[0056]组合c2c4：fusobacteriumprausnitzii、bacteroidesspp.、clostridialclusteriv、bifidobacteriumcatenulatumgroup、clostridiumperfringensgroup，共计5个肠道细菌dna检测靶点；[0057]组合al：clusterivruminococcusspp.、fusobacteriumspp.，共计2个肠道细菌dna检测靶点；[0058]组合v：bacteroides-prevotella-porphyromonas、alleubacteria、clostridialclusterxiva、butyryl-coacoa-transferasegene、clostridiumcoccoides-eubacteriumrectalegroup，共计5个肠道细菌dna检测靶点。[0059]在一些实例中，所述免疫治疗为单独pd-1途径阻断治疗、pd-1途径阻断治疗联合化疗或pd-1途径阻断治疗联合靶向治疗。[0060]在一些实例中，所述免疫治疗为黑色素瘤的免疫治疗。[0061]在一些实例中，所述预测免疫治疗疗效的评分公式为：[0062]公式i：cf＝-186.811*靶2 500.54*靶11-397.623*靶17 243.817*靶22 468.598*靶24-564.659*靶25m 60.101*靶26 1652.688*靶29-1291.203*靶46-38.697*靶47-416.678*靶55-987.267；[0063]公式c1c3：cf＝-54.105*靶25m-321.927*靶26 904.879*靶28-16.335*靶38-35.708*靶39-531.83；[0064]公式c2c4：cf＝189.453*靶21-767.437*靶29-683.808*靶34-15.06*靶38-36.041*靶42 1216.563；[0065]公式al：cf＝195.493*靶2 468.221*靶43-411.411；[0066]公式v：cf＝1452.393*靶13-2926.599*靶28 3257.596*靶30-1753.58*靶36-526.748*靶41-573.037；[0067]上述各公式中，靶号指对应肠道细菌dna检测靶点的相对表达量，所述相对表达量基于内参考基因确定，所述内参考基因为细菌16srrnav4区域。[0068]在一些实例中，公式i用于计算用药方案为单药帕博丽珠、特瑞普利、纳武利尤或帕博丽珠联用易普利姆玛的cf值。[0069]在一些实例中，公式c1c3用于计算用药方案为帕博丽珠或特瑞普利联合替莫唑胺的cf值。[0070]在一些实例中，公式c2c4用于计算用药方案为帕博丽珠或特瑞普利联合白蛋白紫杉醇的cf值。[0071]在一些实例中，公式al用于计算用药方案为帕博丽珠或特瑞普利联合安罗替尼、乐伐替尼或阿昔替尼的cf值。[0072]在一些实例中，公式v用于计算用药方案为帕博丽珠或特瑞普利联合维莫非尼的cf值。[0073]在一些实例中，如果cf小于0，则预测相应的免疫治疗方案对患者有效；若所得cf大于0，则预测患者对相应的免疫治疗方案耐药。[0074]本发明的有益效果是：[0075]1)本发明以黑色素瘤作为研究对象，从55个肠道细菌dna检测靶点中筛选出在获得不同临床疗效的患者中具表达差异的dna检测靶点，可解决黑色素瘤免疫治疗患者可用生物标志物少且效果不理想的问题。[0076]2)单一的检测指标很难有效预测免疫治疗疗效。发明人利用肠道菌群个体差异大、检测靶点多等优势，采用多个dna检测靶点联合分析的方法，可有效避免检测单一指标的弊端。[0077]3)发明人首次提出，应根据治疗方案类型选择不同的联合检测靶点，并建立了5种免疫治疗方案的疗效预测模型。[0078]4)肠道菌群特征与pd-1/pd-l1阻断治疗的关系在不同类别的肿瘤中或许存在共性；本项目的研究成果经过数据补充与再分析，具有在黑色素瘤以外的肿瘤，如肉瘤、肾癌、肺癌、胃癌或结直肠癌中应用并使患者获益的可能。附图说明[0079]图1是8份dna标本的内参考基因(绿色圆圈)及bacteroidesthetaiotaomicron(红色三角形)的荧光定量pcr扩增曲线；[0080]图2是46例单独pd-1途径阻断治疗患者的联合预测因子cf在不同临床疗效评价组中的分布；[0081]图3是11例pd-1途径阻断联合替莫唑胺治疗患者的联合预测因子cf在不同临床疗效评价组中的分布；[0082]图4是10例pd-1途径阻断联合白蛋白紫杉醇治疗患者的联合预测因子cf在不同临床疗效评价组中的分布；[0083]图5是8例pd-1途径阻断联合tki靶点治疗患者的联合预测因子cf在不同临床疗效评价组中的分布；[0084]图6是11例pd-1途径阻断联合braf靶点治疗患者的联合预测因子cf在不同临床疗效评价组中的分布。具体实施方式[0085]根据目前研究结果，单一的检测指标很难有效预测免疫治疗疗效，并且存在较高的假阳性率或假阴性率。作为生物标志物，肠道菌群具有个体差异大、检测靶点多等优势。本发明以实时荧光定量pcr的检测方法为基础，对肠道细菌基因组dna的55个检测靶点进行筛选，得到5个可用于预测免疫治疗疗效的评分公式，检测公式中肠道细菌基因组dna各靶点的相对表达量并评分，可预测不同用药方案的黑色素瘤患者免疫治疗疗效。具体的检测靶点及其编号如下：[0086][0087]粪便标本的特殊性使标本的采集量或加样量不能达到与血、尿标本相同的标准化程度，所以难以实现肠道细菌表达水平的绝对定量；鉴于此，选择使用同时分析内参考基因的方法对肠道不同细菌种属的表达进行相对定量，利用内参考基因的特点及优势，可以避开粪便标本采集及加样难以标准化的问题。本发明以细菌16srrnav4区域作为实时荧光定量pcr内参考基因用于计算目标靶点的相对表达量。图1所示为8份dna标本的内参考基因(绿色圆圈)及bacteroidesthetaiotaomicron(红色三角形)的荧光定量pcr扩增曲线；当控制dna加样质量在一定的范围内时，8份标本可得到相对稳定的内参考基因表达水平，而bacteroidesthetaiotaomicron的表达量则各有不同。[0088]黑色素瘤患者免疫治疗用药方案并不相同，主要包含三大类：[0089]1)单独pd-1/pd-l1途径阻断治疗，例如单药帕博丽珠(pembrolizumab)、单药特瑞普利(tripalimab)或纳武利尤(nivolumab)；[0090]2)pd-1/pd-l1途径阻断治疗联合化学治疗，例如联合替莫唑胺(temozolomide)或白蛋白紫杉醇(paclitaxel)；[0091]3)pd-1/pd-l1途径阻断治疗联合靶向治疗，例如联合tki靶点药物安罗替尼(anlotinib)、乐伐替尼(lenvatinib)，或braf靶点药物维莫非尼(vemurafenib)；[0092]本项目以86例黑色素瘤患者为研究对象，其用药方案及临床疗效评价见表1。[0093]表186例黑色素瘤患者免疫治疗用药方案及临床疗效评价[0094][0095]表注：pr，partialresponse；cr，completeresponse；pd，progressivedisease；sd，stabledisease；ict＝immunecheck-pointinhibitortherapy，免疫检查点抑制剂治疗。[0096]具体实验方案：[0097]1)收集患者新鲜采集粪便，置于商品化含有稳定剂的粪便采集套装内(深圳华大智造)，提取粪便细菌基因组dna(磁珠法magen试剂盒自动化提取)。[0098]2)等质量混合10例不同癌种患者粪便细菌基因组dna作为引物验证模板，参考bookoutal等学者推荐的实时荧光定量pcr引物验证方法，对55个肠道细菌基因组dna检测靶点进行引物扩增效率验证。55个检测靶点涵盖bifidobacterium、eubacterium、fusobacterium、peptostreptococcus、lactobacillus、bacteroides、ruminococcus、clostridium等肠道常见菌，及现有研究发现的表达量低而意义重大的菌种，如enterococcushirae及akkermansiamuciniphila。[0099]3)根据步骤2引物验证结果，挑选33个引物扩增效率基本符合要求的检测靶点。以细菌16srrnav4区域作为内参考基因，对上述33个检测靶点进行实时荧光定量pcr检测，并计算各dna靶点相对定量结果，具体计算步骤如下：[0100]①.计算δctsample。公式为δctsample＝ctgoi-ctref，其中ctgoi为目标靶点的荧光定量pcr跑板结果，ctref为内参考基因跑板结果。[0101]②.计算δδct。公式为δδct＝δctsample-δctcalibrator，其中δctcalibrator为常数，取值-20至20之间。[0102]③.计算检测靶点相对表达量(fold-change)。公式为fold-change＝x(-δδct)，其中x为常数，取值1至3之间。[0103]4)初步分析86例患者的相对定量结果，发现当患者使用不同的免疫治疗用药方案时，其肠道菌群各有特点；所以当使用肠道菌群作为预测免疫治疗临床疗效的生物标志物时，使用不同治疗方案的患者，应联合检测不同细菌靶点。[0104]本项目根据用药方案将患者分为5组：[0105][0106]同时根据临床疗效将患者分为两组：pr/cr(部分缓解或完全缓解)及pd/sd(疾病进展或疾病稳定)；根据步骤3所得相对定量结果，对各用药方案患者作不同临床疗效的两组独立样本的t检验分析；各用药方案分别从33个入筛靶点中获得11个较有差异靶点，所得靶点及其统计学差异见表2。[0107]表2不同用药方案的差异靶点及其p值[0108][0109]表注：表中的p值为对应靶点在不同临床疗效组通过两组独立样本的t检验分析所得，空值表示未发现显著差异，*标记的为建模靶点。[0110]以spss-logisticregression分析各用药方案差异靶点，得到用于预测免疫治疗疗效的评分公式：[0111][0112]表注：cf＝combinationfactor，联合预测因子；靶点编号为对应细菌dna靶点的相对表达量。[0113]以评分公式对患者评分，所得cf在不同临床疗效组的分布及统计学差异见图2、图3、图4、图5及图6。如图所示，以公式中所述dna检测靶点建立联合检测方案并计算cf，各用药方案的不同临床疗效患者所得cf在两组间均具有显著的统计学差异；说明上述评分公式可根据肠道细菌dna靶点的相对表达量对获得不同临床疗效患者的肠道菌群特征作出有效的分类判断。[0114]实际应用中，以cut-off＝0作为判断标准，若所得cf小于0，则预测相应的免疫治疗方案对患者有效；若所得cf大于0，则预测患者对相应的免疫治疗方案耐药。[0115]肠道菌群特征与pd-1/pd-l1阻断治疗的关系在不同类别的肿瘤中或许存在共性；本项目的研究成果经过数据补充与再分析，具有在黑色素瘤以外的肿瘤，如肉瘤、肾癌、肺癌、胃癌或结直肠癌中应用并使患者获益的可能。[0116]以上是对本发明所作的进一步详细说明，不可视为对本发明的具体实施的局限。对于本发明所属
技术领域：
：的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的简单推演或替换，都在本发明的保护范围之内。当前第1页12当前第1页12