单核苷酸多态性位点在制备代谢相关因素的遗传风险评分系统中的应用的制作方法

1.本发明属于单核苷酸多态性分析领域，更具体地，本发明涉及单核苷酸多态性位点在制备代谢相关因素的遗传风险评分系统中的应用。


背景技术：

2.在全球许多发达国家和发展中国家，血液胆固醇水平异常一方面是导致一些人群处于亚健康状态的因素之一，另一方面其也是心血管疾病、阿尔茨海默症和癌症等疾病的关键危险因素之一。
3.血液胆固醇水平异常主要表现为总胆固醇(total cholesterol，tc)、低密度胆固醇(low density lipoprotein cholesterol，ldl-c)水平较高和高密度胆固醇(high density lipoprotein cholesterol，hdl-c)水平较低。根据最近一份汇集200个国家，超过1亿成年人的报告估计，2017年全球因为非hdl-c水平较高导致的死亡人数为390万，其中一半发生在非hdl-c水平增加较快的亚洲国家中。人体中的胆固醇有两种来源，其中约30％来自饮食摄入，约70％来自肝脏的从头合成。
4.一些研究表明，饮食和生活方式因素，遗传变异和药物可能会单独或共同影响血浆胆固醇的水平。考虑到多数研究并未发现膳食胆固醇摄入量与循环胆固醇水平之间有明显较强的联系，美国、中国等多个国家的居民膳食指南取消了饮食胆固醇的限制。然而，不同人群和个体之间血液胆固醇水平对饮食胆固醇摄入的反应差异较大，遗传易感性可能部分解释了异质性。
5.最近的一些研究结果确定了一些与血液胆固醇水平相关的遗传位点，不乏一些参与胆固醇的生物合成、吸收和外排的基因。研究表明，npc1l1等基因上的单核苷酸多态性位点(single nuclear polymorphism，snp)可以改变胆固醇摄入与血浆胆固醇水平的关系。
6.尽管许多基因参与维持胆固醇稳态的复杂调控，但到目前为止，大多数研究仅局限于单个或几个snp的作用，很少有研究系统地评估多种遗传变异对饮食胆固醇摄入与血浆胆固醇之间关系的整体影响。因此，找到合适的分析方法来对个体对膳食胆固醇的敏感程度进行评价以及精准膳食干预方案的制定具有十分重要的意义。


技术实现要素：

7.本发明的目的在于提供一种单核苷酸多态性位点在制备评估膳食胆固醇敏感性、代谢性亚健康状态或代谢性疾病的检测系统中的应用。
8.本发明的目的还在于提供一种进行遗传风险评分的方法，所述方法用于代谢性亚健康状态或代谢性疾病评估。
9.在本发明的第一方面，提供单核苷酸多态性位点在制备用于膳食胆固醇敏感性、代谢性亚健康状态或代谢性疾病评估的检测系统(如检测试剂、检测试剂盒或检测装置)中的应用，所述单核苷酸多态性位点通过以下方式获得：(1)选择(包括初步选择)与血浆tc，
ldl-c或hdl-c水平显著相关的单核苷酸多态性位点；(2)从(1)的位点中选择maf≥1％且缺失率《10％的单核苷酸多态性位点。
10.在一个优选例中，所述选择或初步选择可包括：根据统计学有意义数量的人群进行基因分析后获得(包括初步获得)的血浆tc，ldl-c或hdl-c水平显著相关的单核苷酸多态性位点；或根据现有技术数据库提供的相关人群的基因信息/单核苷酸多态性信息而获得的。
11.在另一优选例中，所述应用为用于总胆固醇(tc)水平相关的评估。
12.在另一优选例中，所述应用为用于低密度脂蛋白胆固醇(ldl-c)水平相关的评估。
13.在另一优选例中，所述应用为用于高密度脂蛋白胆固醇(hdl-c)水平相关的评估。
14.在另一优选例中，所述用于总胆固醇水平相关的评估的单核苷酸多态性位点、用于低密度脂蛋白胆固醇水平相关的评估的单核苷酸多态性位点、用于高密度脂蛋白胆固醇水平相关的评估的单核苷酸多态性位点两两结合被应用于评估，或三者结合被应用于评估。
15.在另一优选例中，所述用于膳食胆固醇敏感性、代谢性亚健康状态或代谢性疾病评估的检测试剂或检测装置包括：生物检测试剂，检测单元或数据分析单元。
16.在另一优选例中，所述的膳食胆固醇敏感性、代谢性亚健康状态或代谢性疾病评估的方法包括：计算遗传风险评分(grs)，根据评分结果进行评估。
17.在另一优选例中，包括采用如下的公式计算遗传风险评分：grs＝(β1
×
snp1 β2
×
snp2
…
βn
×
snpn)
×
(n/β系数之和)；其中，β为每个单核苷酸多态性位点对血浆胆固醇的作用大小，n是每个grs的单核苷酸多态性位点数量(一般为正整数)，β的总和是grs中包含的单核苷酸多态性位点的效应大小的总和；较佳地，β的总和：tc为2.78，ldl-c为2.29，hdl-c为2.8，所述数值在≤10％范围浮动，较佳地在≤5％范围浮动(如≤8％，≤6％，≤4％，≤2％或≤1％的范围)。
18.在另一优选例中，还包括根据所获得的遗传风险评分数值来进行人群的总胆固醇水平、低密度脂蛋白胆固醇水平、高密度脂蛋白胆固醇水平进行分析，指导人群的膳食摄入，所述遗传风险评分数值越高则总胆固醇水平、低密度脂蛋白胆固醇水平或高密度脂蛋白胆固醇水平越高。
19.在另一优选例中，所述遗传风险评分数值与总胆固醇水平、低密度脂蛋白胆固醇水平、高密度脂蛋白胆固醇水平的相关性包括：基于中位数值，总胆固醇水平相关遗传风险评分数值每增加1，总胆固醇水平增加0.99mg/dl；低密度脂蛋白胆固醇水平相关遗传风险评分数值每增加1，低密度脂蛋白胆固醇水平增加0.98mg/dl；高密度脂蛋白胆固醇水平相关遗传风险评分数值每增加1，高密度脂蛋白胆固醇水平增加0.47mg/dl；其中，各个水平数值在≤10％范围浮动，较佳地在≤5％范围浮动(如≤8％，≤6％，≤4％，≤2％或≤1％的范围)。
20.在另一优选例中，待测样品来自待测个体的血液(包括血浆、血清等血制品)。
21.在另一优选例中，总胆固醇水平相关遗传风险评分数值的中位数(范围)为61.28(46.32-75.45)；较佳地，根据人群差异，该数值在≤10％范围浮动。
22.在另一优选例中，低密度脂蛋白胆固醇水平相关遗传风险评分数值的中位数(范围)为42.09(29.53-56.51)；较佳地，根据人群差异，该数值在≤10％范围浮动。
23.在另一优选例中，高密度脂蛋白胆固醇水平相关遗传风险评分数值的中位数(范围)为68.93(54.24-89.17)；较佳地，根据人群差异，该数值在≤10％范围浮动。
24.在本发明的另一方面，提供一种用于膳食胆固醇敏感性、代谢性亚健康状态或代谢性疾病评估的系统(如检测试剂或检测装置)，其包括检测单元以及数据分析单元；所述检测单元包括：特异性检测单核苷酸多态性位点的试剂或装置；所述数据分析单元包括：用于对检测单元的检测结果进行分析处理的处理单元，获得遗传风险评分；其中，所述单核苷酸多态性位点包括：用于总胆固醇水平相关评估的位点、用于低密度脂蛋白胆固醇水平相关评估的位点、用于高密度脂蛋白胆固醇水平相关评估的位点。
25.在一个优选例中，所述特异性检测单核苷酸多态性位点的试剂或装置包括(但不限于)：芯片(如illumina human660w-quad beadchip)，探针组，引物组，引物探针组，限制性酶(如限制性核酸内切酶)，电泳试剂，基因测序仪器(如pcr仪器)。
26.在另一优选例中，所述用于对检测单元的检测结果进行分析处理的处理单元包括：计算遗传风险评分的单元，其采用如下的公式计算遗传风险评分：grs＝(β1
×
snp1 β2
×
snp2
…
βn
×
snpn)
×
(n/β系数之和)。
27.在另一优选例中，所述系统还包括：用于检测个体基本因素的单元；较佳地，所述基本因素包括：体重指数、吸烟、饮酒、体力活动水平、膳食摄入。
28.在本发明的另一方面，提供一种进行膳食胆固醇敏感性、代谢性亚健康状态或代谢性疾病评估的方法，包括：利用前面所述的系统进行代谢性亚健康状态或代谢性疾病评估。
29.在一个优选例中，所述的评估包括：(a)利用特异性检测单核苷酸多态性位点的试剂或装置进行单核苷酸多态性位点的检测；(b)根据(a)的检测结果进行数据分析，获得遗传风险评分。
30.在另一优选例中，还包括：(c)根据(b)的遗传风险评分结果分析个体的膳食胆固醇敏感性、代谢性亚健康状态或代谢性疾病的存在与否或风险性。
31.在另一优选例中，其采用如下的公式计算遗传风险评分：grs＝(β1
×
snp1 β2
×
snp2
…
βn
×
snpn)
×
(n/β系数之和)。
32.在另一优选例中，所述方法还包括：根据所获得的遗传风险评分数值来进行人群的总胆固醇水平、低密度脂蛋白胆固醇水平、高密度脂蛋白胆固醇水平进行分析，指导人群的膳食摄入，所述遗传风险评分数值越高则总胆固醇水平、低密度脂蛋白胆固醇水平或高密度脂蛋白胆固醇水平越高。
33.在另一优选例中，所述遗传风险评分数值与总胆固醇水平、低密度脂蛋白胆固醇水平、高密度脂蛋白胆固醇水平的相关性包括选自下组：总胆固醇水平相关遗传风险评分数值每增加1，总胆固醇水平增加0.99mg/dl；低密度脂蛋白胆固醇水平相关遗传风险评分数值每增加1，低密度脂蛋白胆固醇水平增加0.98mg/dl；高密度脂蛋白胆固醇水平相关遗传风险评分数值每增加1，高密度脂蛋白胆固醇水平增加0.47mg/dl；其中，各个水平数值在≤10％范围浮动，较佳地在≤5％范围浮动(如≤8％，≤6％，≤4％，≤2％或≤1％的范围)。
34.本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
35.图1、grs与胆固醇的关系。x轴代表根据grs的分组，在左侧的y轴代表直方图中每个grs分组人数；右侧的y轴表示不同组个体的血浆胆固醇水平。点和误差线代表每个grs类别的胆固醇水平的平均值和标准误差。效应值大小和p值是通过校正了年龄、性别、地域、城乡、教育程度、吸烟、饮酒、身体活动、体质指数(bmi)、总能量摄入、饮食中的碳水化合物和脂肪摄入(占能量百分比)以及和前四个基因组主成分的线性回归模型计算得出。
36.图2、不同grs水平下膳食胆固醇与血液胆固醇水平的关系。数据展示的是在grs
tc
，grs
ldl-c
和grs
hdl-c
的四分位分组中，膳食胆固醇对血浆tc(左上)，ldl-c(中上)，hdl-c(右上)和非hdl-c(下)水平的作用大小(效应值 /-标准误差)。grs
tc
四分位各组的样本数量分别为583、584、581和582；grs
ldl-c的四分位各组的样本数量分别为583、582、582和583；grs
hdl-c
的四分位各组的样本数量分别为583、584、580和583。grs
tc
四分位各组的grs
tc
中位数(范围)分别为56.34(46.32-58.33)，60.03(58.34-61.28)，62.69(61.29-64.17)和66.31(64.18-75.45)。grs
ldl-c
四分位各组的grs
ldl-c
中位数(范围)分别为37.81(29.53-39.50)，40.84(39.51-42.09)，43.27(42.09-44.71)和46.58(44.71-56.51)。grs
hdl-c
四分位各组的grs
hdl-c
中位数(范围)分别为62.98(54.24-65.29)，67.23(65.30-68.93)，70.71(68.93-72.74)，75.32(72.74-89.17)。每个条形上方或下方的p值是每个四分位分组中膳食胆固醇与血浆胆固醇水平的关联关系显著性。图顶部的p值代表交互作用的显著性。模型校正了年龄，性别，地区，居住，教育程度，当前吸烟，当前饮酒，体育锻炼，bmi，总能量摄入，饮食碳水化合物和脂肪摄入(能量百分比)。
37.图3、数据是在不同膳食胆固醇摄入四分位分组中grs
tc
，grs
ldl-c
和grs
hdl-c
对血浆tc(左)，ldl-c(中)和hdl-c(右)水平的效应。每个条形上方或下方的p值是每个四分位分组中grs与血浆胆固醇水平的关联关系显著性。图顶部的p值代表交互作用的显著性。模型校正了年龄，性别，地区，居住，教育程度，当前吸烟，当前饮酒，体育锻炼，bmi，总能量摄入，饮食碳水化合物和脂肪摄入(能量百分比)。
具体实施方式
38.本发明人经过深入的研究，通过整合多个单核苷酸多态性位点的遗传变异信息，提供了一种遗传风险评分(grs)方法以及系统。本发明的方法获得的遗传风险分数能够作为判断个体对膳食胆固醇敏感性的指标之一，从而为个体的膳食选择提供指导，以及用于进行代谢性亚健康状态或代谢性疾病评估。
39.术语
40.如本发明所用，所述“受试者”、“个体”可以指生物体，在某些方面，受试者可以是人。提供样品的受试者可以包括健康人群、亚健康人群或潜在疾病风险的人群。
41.如本发明所用，所述“代谢相关因素”是指与个体代谢相关的、可通过grs加以评估的机体状态，被评估“代谢相关因素”的个体可以包括健康个体、亚健康个体或罹患疾病的个体。
42.如本发明所用，所述的“遗传风险评分(grs)”是指遗传性相关的评价指标，其具有显著性。由于个体的grs通常是基于其携带的基因型，因此可以衡量个体化遗传风险情况；且，由于个体的基因型信息通常不会随时间变化，因此其可以作为个体的终身风险评估的
指标。
43.如本发明所用，“亚健康”是指人体处于健康和疾病之间的一种状态。处于亚健康状态者，不能达到健康的标准，表现为一定时间内的活力降低、功能和适应能力减退的症状，但不符合现代医学有关疾病的临床或亚临床诊断标准(中华中医药学会，《亚健康中医临床指南》)。
44.如本发明所用，所述的“代谢性亚健康状态”是指与代谢指标相关的“亚健康”状态；所述的代谢指标包括选自：总胆固醇(tc)水平，低密度胆固醇(ldl-c)水平和/或高密度胆固醇(hdl-c)水平。
45.如本发明所用，所述的“评估”包括“检测”、“测定”、“分析”、“预后”、“预测”或“评价”；例如，其是一种对于膳食胆固醇敏感性的分析，或是对于代谢性亚健康状态或代谢性疾病的易感性分析。
46.如本发明所用，所述的“grs
tc”是指针对总胆固醇(tc)水平的grs评估。
47.如本发明所用，所述的“grs
ldl-c”是指针对低密度脂蛋白胆固醇(hdl-c)水平的grs评估。
48.如本发明所用，所述的“grs
hdl-c”是指针对高密度脂蛋白胆固醇(hdl-c)水平的grs评估。
49.如本发明所用，所述的“膳食胆固醇敏感性”是指个体对膳食胆固醇摄入量的反应情况；一般而言，“膳食胆固醇敏感性”高的人，其更需要控制膳食中的胆固醇摄入量，以避免不良的身体代谢状态。
50.如本发明所用，所述的“代谢性疾病”包括：高胆固醇相关的代谢性疾病，或低密度脂蛋白胆固醇过高相关的代谢性疾病，或高密度脂蛋白胆固醇过低相关的代谢性疾病；例如包括：肥胖、高血脂、脂肪肝、高甘油三酯血症、高胆固醇血症、低hdl胆固醇症、高ldl胆固醇症。
51.如本发明所用，所述的“试剂盒”可以指用于实施本发明公开的方法的材料或试剂的系统。
52.单核苷酸多态性(snp)以及遗传风险评分(grs)
53.群体中的基因组序列在个体之间基因组许多位置处显示差异。例如，人类基因组显示平均约每500对碱基或更少就会出现序列变异。这类核酸序列的基因变异通常被称为多态性或多态性位点。
54.个体基因组的细微变化可以造成疾病和疾病风险。个体间的基因可以因基因组可变性而有不同，其中最常见的是由snp引起。
55.本发明中，所述的多态性如基因变异，包括群体中基因组的基因序列的变异，例如，等位基因变异和出现或观察到的其他变异。因此，多态性可以指群体中两种或更多种遗传决定的替代序列或等位基因的出现。这些差异可存在于基因组的编码和非编码部分，并且可以表现或检测为核酸序列、基因表达的差异，包括：例如转录、加工、翻译、转运、蛋白质加工、运输、dna合成、表达的蛋白质、其他基因产物或生物化学途径或翻译后修饰的产物，以及群体成员之间表现出的任何其他差异。snp包括由于单碱基改变而产生的多态性，例如：碱基的插入、缺失或改变。多态性标志物或位点可以是发生分歧的基因座。这样的位点可以小至一对碱基(snp)。多态形式也可表现为基因的不同孟德尔等位基因。可以通过蛋白
质、蛋白质修饰、rna表达修饰、dna和rna甲基化、改变基因表达和dna复制的调节因子、以及基因组核酸或细胞器核酸中改变的任何其他表现，来观察多态性。
56.多态性包含在受试者群体中可能有两种或更多种序列的任何核苷酸位置。在一些情况下，每个与多态性相关的核苷酸序列的版本可代表多态性的特定等位基因。受试者的基因组dna可含有任何给定多态性标志物的两个等位基因，代表每条染色体上标志物的每个拷贝。在一些情况下，等位基因可以是染色体上给定位置的核苷酸序列。多态性可包含任何数量的特定等位基因。在本发明的一些情况下，多态性可以通过群体中存在两个或更多个等位基因来表征。多态性可以通过存在三个或更多个等位基因来表征。基因变异和等位基因可用于将遗传表型(例如，膳食胆固醇敏感性、代谢性亚健康状态或代谢性疾病评估)与负责的基因型关联起来。在某些情况下，在群体中基因变异具有可测量的频率，例如：频率高于10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、99％或更高；频率介于5～10％之间、频率介于1～5％之间、或频率低于1％，如0.01～1％或0.05～1％或0.1～1％。
57.本发明中，根据对大数据量的人群的基因分析，披露了一系列snp，所述单核苷酸多态性位点通过以下方式获得：(1)选择(包括初步选择)与血浆tc，ldl-c或hdl-c水平显著相关的单核苷酸多态性位点；(2)从(1)的位点中选择maf≥1％且缺失率《10％的单核苷酸多态性位点。
58.作为本发明的优选方式，所述的snp包括选自本发明表1～表3中的。优选地，包括与tc水平显著相关的snp(57个)、与dl-c水平显著相关的snp(45个)或与hdl-c水平显著相关的snp(65个)。
59.本发明中，snp的组合效应可以以grs的形式定量，并且可以按grs值分类。在优选的方式中，所述的grs通过如下获得：(a)利用特异性检测单核苷酸多态性位点的试剂或装置进行单核苷酸多态性位点的检测；(b)根据(a)的检测结果进行数据分析，获得grs值。进一步地，可根据grs的评分结果分析个体的膳食胆固醇敏感性、代谢性亚健康状态或代谢性疾病的存在与否或风险性。
60.作为本发明的优选方式，采用如下的公式计算遗传风险评分：grs＝(β1
×
snp1 β2
×
snp2
…
βn
×
snpn)
×
(n/β系数之和)；其中，β为每个单核苷酸多态性位点对血浆胆固醇的作用大小，n是每个grs的单核苷酸多态性位点数量(一般为正整数)，β的总和是grs中包含的单核苷酸多态性位点的效应大小的总和。
61.受试者的膳食胆固醇敏感性、代谢性亚健康状态或代谢性疾病可分为一类(级)、二类(级)、三类(级)或更多类(级)别。例如，需评估代谢性亚健康状态或代谢性疾病的受试者可分为高风险、中等风险或低风险；需评估膳食胆固醇敏感性的受试者可分为高敏感性、中敏感性或低敏感性。在一些实施方案中，可以确定所述分类的阈值。分类可以仅基于grs值。grs值的分析可根据人群的中位数，将个体grs值与该中位数进行比较。在本发明的实施例中，与中位数值进行比较，发现总胆固醇水平相关遗传风险评分数值每增加1，总胆固醇水平增加0.99mg/dl；低密度脂蛋白胆固醇水平相关遗传风险评分数值每增加1，低密度脂蛋白胆固醇水平增加0.98mg/dl；高密度脂蛋白胆固醇水平相关遗传风险评分数值每增加1，高密度脂蛋白胆固醇水平增加0.47mg/dl。其中，各个水平数值在≤10％范围浮动。
62.snp在药物或保健品发现、筛选和开发中有具有作用，本发明的snp也可以作为潜在的药物或保健品筛选靶标。
63.snp的检测
64.基于本发明人的新发现，可以利用本发明披露的上述多态性位点，来作为个体膳食胆固醇敏感性、代谢性亚健康状态或代谢性疾病的存在与否或风险性的判断标志。从而可用于可将人群分为膳食胆固醇敏感性高、中或低的个体/群体；或将人群分为处于代谢性亚健康状态(也可对该状态进行粉剂)或处于健康状态的个体/群体；或将人群分为处于代谢性疾病或处于健康状态的个体/群体。
65.本发明也提供了一种用于膳食胆固醇敏感性、代谢性亚健康状态或代谢性疾病评估的系统，其包括检测单元以及数据分析单元；所述检测单元包括：特异性检测单核苷酸多态性位点的试剂或装置；所述数据分析单元包括：用于对检测单元的检测结果进行分析处理的处理单元，从而获得grs。
66.所述特异性检测单核苷酸多态性位点的试剂或装置可包括，但不限于：芯片，探针组，引物组，引物探针组，限制性酶，电泳试剂，基因测序仪器等。
67.作为一种优选的方式，根据上述提供的基因的多态性，可设计出适合的探针，固定在微阵列(microarray)或基因芯片(又称为“dna芯片”)上。
68.所述的基因芯片上包含针对至少一种所述的基因多态性位点的探针；更优选的，所述的基因芯片上包含针对两种或两种以上所述的基因多态性位点的探针；最优选的，在一张或多张基因芯片上包含本发明所述的所有snp。
69.本发明所述的基因芯片，包括固相载体和有序固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针由连续核苷酸组成。为了增强检测信号的强度，提高检测结果的准确率，杂交相关位点最好位于所在探针的中部。所述探针还可以在其5’端包含一段氨基修饰的1-30聚的聚脱氧胸苷酸(聚dt)。
70.所述固相载体可采用基因芯片领域的各种常用材料，例如但不限于尼龙膜，经活性基团(如醛基、氨基、异硫晴酸基等)修饰的玻片或硅片、未修饰的玻片、塑料片等。
71.所述基因芯片的制备可采用生物芯片的常规制造方法。例如，如果固相载体采用的是修饰玻片或硅片，探针的5’端含有氨基修饰的聚dt串，可将寡核苷酸探针配制成溶液，然后点样仪将其点在修饰玻片或硅片，排列成预定的序列或阵列，然后通过放置过夜来固定，就可得到本发明的基因芯片。也可运用商品化的芯片，例如illumina human660w-quad beadchip。
72.制备用于pcr扩增的染色体dna的方法很多，较佳地可以从全血中制备。
73.用pcr方法扩增染色体基因特定片段的方法已经是本领域公知技术，本发明中没有特别的限制。
74.对扩增产物进行标记可以通过采用5’端带标记基团的引物进行扩增的方法，也可通过在扩增过程中掺入带标记基团的单核苷酸的方法，或通过在杂交时加入与扩增产物特异性结合的检测探针的方法实现，所述标记基团包括但不限于：地高辛分子(dig)、生物素分子(bio)、荧光素及其衍生生物分子(fitc等)、其他荧光分子(如cy3、cy5等)、碱性磷酸酶(ap)、辣根过氧化物酶(hrp)等。这些标记及其标记方法都已是本领域众所周知的常规技术，也可以参照王申五主编的《基因诊断技术-非放射性操作手册》；j.萨姆布鲁克，d.w.拉塞尔主编，《分子克隆实验指南》等。
75.带标记的扩增产物与基因芯片杂交前，可先将扩增产物变性，或也可根据商品化
的检测芯片的说明进行处理。
76.将上述扩增产物与基因芯片进行杂交时，可以先将基因芯片与预杂交缓冲液进行预杂交。
77.本发明扩增产物与基因芯片之间的固相杂交按照本领域的经典方法进行，本领域一般人员依据经验容易确定有关缓冲液、探针和样本浓度、预杂交温度、杂交温度以及时间等的最适条件。或者也可以参照j.萨姆布鲁克，d.w.拉塞尔主编，《分子克隆实验指南》。
78.可根据标记信号在基因芯片上的位置、强度等信息获取待测信息。若扩增产物用荧光基团标记，也可直接用荧光检测设备获取待测信息。
79.本发明还提供一种用于检测的试剂盒，所述试剂盒可包括用于存储、运输反应试剂(例如在适当容器中的探针、酶等)和/或配合材料(例如：缓冲液、执行评估的书面说明等)或将其从一个位置递送到另一个位置的系统。例如，试剂盒可包括一个或多个包含相关反应试剂和/或配合材料的外壳(例如：盒子)。这些内容物可以同时或单独地投递给预期的接收者。
80.作为优选的方式，所述的试剂盒中可包括本发明所述的芯片。
81.更优选的，它还含有选自下组的试剂：(a)特异性扩增上述基因的引物；或(b)识别上述基因的相应的变异位点的限制性内切酶。
82.此外，所述的试剂盒中还可包括用于提取dna、pcr、杂交、显色等所需的各种试剂，包括但不限于：抽提液、扩增液、杂交液、酶、对照液、显色液、洗液、抗体等。
83.此外，所述的试剂盒中还可包括使用说明书和/或芯片图像分析软件等。
84.分析结果及应用
85.本发明中，利用了基于大数据量分析后得到的snp位点进行grs评分。与其他传统方法(例如家族史)相比，grs可成为更有效的个体膳食指导指标、代谢性亚健康状态或代谢性疾病预测指标。grs对于可能无法得到家族史数据的个体非常重要，同时grs也可用于为个体的家族史提供辅助或补充，以提高个体/群体的风险预测的准确性。
86.在一些实施方案中，由于计算grs使用的方法是基于每个个体携带的相关基因型的总和，未加权或按特定基因型的效应大小而加权，可能比单独使用家族史预测风险能解释更多的遗传差异。
87.在不同的实施方案中，本文描述的初步研究中的模型可以分为4个部分：(1)选择用于构建grs评分的snp库，(2)计算grs，(3)基于grs的质量控制(qc)，和(4)用于评估膳食胆固醇敏感性、代谢性亚健康状态或代谢性疾病。
88.在1991-2011年间，中国成年人的膳食胆固醇摄入量从165.8mg/天增加到了266.3mg/天。在2002-2015期间，血液中的tc从151.6mg/dl升高至179.0mg/dl，ldl-c从82.0mg/dl升高至111.0mg/dl；而hdl-c水平从50.3mg/dl降至48.7mg/dl。然而，由于实验设计、人群膳食模式和遗传背景等的差异，目前针对膳食胆固醇与血液胆固醇和心血管疾病关系的研究尚未得到确切一致的结果。利用本发明所述的snp位点，结合grs分析，本发明人发现，grs和膳食胆固醇的摄入均与tc和ldl-c水平显著相关。此外，还发现grs与膳食胆固醇摄入存在显著的交互作用影响血液tc，hdl-c的水平。膳食胆固醇与tc，ldl-c和非hdl-c血浆浓度之间存在着显著的关联关系可能反映了中国人群的膳食模式从基于植物性饮食向动物性饮食的转变以及非hdl-c水平的高速增长。
89.血液胆固醇的水平是一种复杂的性状，反映了多个基因与膳食和生活方式之间的相互作用。在本发明中，位于grs
tc
和grs
ldl-c
的最高四分位数的个体与最低四分位数的个体相比，不仅具有较高的血液tc和ldl-c水平，而且膳食胆固醇摄入对血液tc和ldl-c的影响更为显著。此外，与grs
tc
和grs
ldl-c
较低的人相比，在具有较高grs
tc
和grs
ldl-c
的个体中还观察到膳食胆固醇与血液非hdl-c之间的关联性更强。因此，对于高胆固醇血症等具有高遗传易感性的人群，进行个性化的膳食指南是具有显著意义的。
90.另一方面，本发明人发现，膳食胆固醇摄入可能会增加遗传因素对血浆tc和ldl-c水平的影响，进一步强调了减少膳食胆固醇摄入对预防高胆固醇血症和相关疾病的重要性。膳食中的胆固醇通常与动物蛋白和饱和脂肪共存在于红肉和鸡蛋等食物中，而红肉和加工肉类的摄入会增加心血管疾病的风险。因此，应该尽量保持较低的膳食胆固醇摄入。
91.总之，本发明发现grs
tc
和grs
ldl-c
较高的个体血液的tc和ldl-c水平对于膳食胆固醇的摄入更加敏感，说明该遗传风险分数能够作为判断个体对膳食胆固醇敏感性的指标之一，从而为个体的膳食选择提供指导。
92.下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如j.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
93.实施例1、研究人群及研究方法
94.1、研究人群
95.该研究参与者来自“中国老龄化人口营养与健康研究”的基线样本，该研究是一项基于人群的队列研究，研究对象为年龄在50至70岁之间的3289名个体(男性1458名，女性1831名)，旨在调查代谢性疾病的遗传和环境因素及其相互作用。从2005年3月至2005年6月，采用多阶段抽样方法，选择北京(代表北方)和上海(代表南方)，每个城市选择两个城区和一个农村代表不同社会经济水平，进行志愿者招募。纳入标准为：居住在本地区至少20年，并且没有严重的心理疾病，肢体残疾，癌症，心血管疾病，阿尔茨海默氏病或痴呆症和其他传染病。最后，共计招募了3289名合格参与者，并且所有人均提供了书面知情同意书。
96.在本次研究中排除了符合下面情况的个体：1)使用降脂药物或自我报告患有高脂血症；2)男性的每日能量摄入量《800或》4000千卡/天，女性的能量摄入《500或》3500千卡/天；和3)没有基因型数据，最终纳入分析的样本为2330例。研究方案已获得营养科学研究所机构审查委员会的批准，并获得了所有参与者的书面知情同意。
97.2、数据采集
98.有关人口统计学变量，健康状况，健康行为和体育锻炼的信息是由受过培训的人员使用标准化问卷通过面对面访谈获得的。人口学资料、生活方式和健康信息采用标准化文件收集。身高、体重和血压采用标准化体检采集。膳食数据根据食物频率问卷获得。空腹血液tc，ldl-c和hdl-c采用常规检测方法检测，非hdl-c由tc减去hdl-c计算得出。
99.3、芯片分析
100.本发明中运用芯片来进行snp测定和分型。包括：
101.(1)针对所确定的snp位点在染色体中的位置(见本发明的后续实施例中所列举)设计探针，委托商业公司进行合成；
102.针对rs1077514，探针序列为(seq id no:1)：cctgtaacaggtaaatattcattggtttcttcttcaaagttattcttctc[c/t](方向5
’-3’
snp位点及其前面序列共50bp作为探针序列)；
[0103]
针对rs12027135，探针序列为(seq id no:2)：aaaaaaaaatagttggactgatttctatgtaggtatacttg aagacagcc[a/t](方向5
’-3’
snp位点及其前面序列共50bp作为探针序列；
[0104]
针对rs12748152，探针序列为(seq id no:3)：cattctccaaggaggcaagtagaaaatctgactcagaaggaaataactta[c/t](方向5
’-3’
snp位点及其前面序列共50bp作为探针序列)；
[0105]
其它位点的探针序列的设计与它们是相近的，以此类推；
[0106]
(2)根据芯片设计原则，利用点样仪将合成的探针点样到基片上，形成有序的阵列；
[0107]
(3)点样效果的质检：将点样后的基片依次置于体视显微镜下观察点样效果，重点是有无漏点，各点之间是否均匀、整齐。
[0108]
在利用芯片进行分析时，首先收集个体样品，进行pcr扩增；之后，将扩增产物与经常规预处理的芯片进行接触、发生杂交反应；之后进行显色，利用图像识别软件分析结果。
[0109]
4、统计分析
[0110]
通过线性回归模型分析膳食胆固醇与血浆胆固醇水平的关系，模型以膳食胆固醇各个四分位中胆固醇摄入量的中位数作为自变量，校正了年龄、性别、地域、城乡、教育程度、吸烟、饮酒、身体活动、体质指数(bmi)、总能量摄入、饮食中的碳水化合物和脂肪摄入(占能量百分比)。使用进一步校正全基因组主成分的线性回归模型来分析grs与血浆胆固醇水平的关联关系。对于交互作用分析，在分析之前，由于膳食胆固醇呈偏态分布，对饮食胆固醇摄入量的值进行自然对数转换，在之前的线性回归模型中加入膳食胆固醇摄入量
×
grs这一交互项进行分析。统计分析在r软件(版本3.5.1)中执行，以双侧p值小于0.05为统计学显著的依据。
[0111]
实施例2、基因分型和grs计算
[0112]
从外周血浆白细胞中提取基因组dna，使用illumina human660w-quad beadchip(illumina)进行基因分型，也即通过生物基因芯片法来进行snp测定和分型。
[0113]
本发明人对基因分型的结果在snp水平加以质控。剔除的snp符合如下标准之一：1)基因分型成功率《95％；2)次等位基因频率(minor allele frequence，maf)《1％；3)哈迪温伯格平衡p值《10-6
。不在芯片上的snp位点通过impute(版本2.1.2)软件参考1000genomes haplotype reference panel(phase 3)进行计算填补。本发明人剔除imputed snp的条件有：1)分型成功率《99％；2)maf《1％，3)哈迪温伯格平衡p值《10-6
；4)填补质量info measure《0.5。
[0114]
从前期得出的141个与血浆tc，ldl-c或hdl-c水平显著相关的位点中选择了maf≥1％且缺失率《10％的snp共计117个进行研究。根据增加胆固醇的等位基因即表格中风险等位基因的数量，将每个snp编码为0(不含风险等位基因)、1(含一个风险等位基因)或2(含两个风险等位基因)，并根据从全球脂质遗传学联盟(glgc)数据得出的相对效应大小(表中效应值)进行加权。
[0115]
grs的计算公式如下：
[0116]
grs＝(β1
×
snp1 β2
×
snp2
…
βn
×
snpn)
×
(n/β系数之和)；
[0117]
其中β为每个snp对血浆胆固醇的作用大小，n为每个grs的snp数量，β的总和为grs
中包含的snp的效应大小的总和(β的总和：tc为2.78；ldl-c为2.29；hdl-c为2.86)。
[0118]
个体某个缺失snp的基因型由其他个体该snp的风险等位基因数量平均值代替。结果如表1～表3。
[0119]
表1、glgc研究中发现的与tc水平显著相关的snp(57个)
[0120]
[0121]
[0122][0123]
表2、glgc研究中发现的与ldl-c水平显著相关的snp(45个)
[0124]
[0125][0126]
表3、glgc研究中发现的与hdl-c水平显著相关的snp(65个)
[0127]
[0128]
[0129][0130]
根据上述表1～表3，grs
tc
(57个snp)和grs
ldl-c
(45个snp)之间存在35个重叠的snp，grs
tc
和grs
hdl-c
(65个snp)之间的有13个重叠的snp，grs
ldl-c
和grs
hdl-c
之间有8个重叠snp。上述三个grs共享6个snp。
[0131]
实施例3、人群特征
[0132]
根据饮食胆固醇摄入量的四分位数分组的样本的人群特征显示于表4。
[0133]
表4、根据胆固醇摄入四分位分组人群的基本特征
[0134][0135]
正态分布连续变量表示为均值
±
标准差；偏态分布连续变量表示为中位数(第一分位数，第三分位数)；分类变量表示为计数(百分比)。
[0136]
根据该表可见，胆固醇摄入量较高的个体更为年轻，并且更有可能是男性，北方和城镇居民，饮酒者，受过较高的教育，bmi较高(p≤0.019)。同时胆固醇摄入较高的个体的总
能量摄入，脂肪和蛋白质摄入量也较高，而碳水化合物的摄入量较低(p《0.001)。
[0137]
但是，grs
tc
，grs
ldl-c
和grs
hdl-c
在不同的膳食胆固醇摄入水平个体中没有显著差异。
[0138]
实施例4、膳食胆固醇摄入与血浆胆固醇水平的关系
[0139]
针对受试人群，本发明人统计了膳食胆固醇摄入与血浆胆固醇水平的关系，结果如表5所示。
[0140]
表5、根据胆固醇摄入四分位分组人群的血液胆固醇水平
[0141][0142]
每个四分位的膳食胆固醇摄入以中位数(第一四分位数-第三四分位数)展示；p值通过校正了年龄、性别、地域、城乡、教育程度、吸烟、饮酒、身体活动、体质指数(bmi)、总能量摄入、饮食中的碳水化合物和脂肪摄入(占能量百分比)的线性回归模型计算得出。
[0143]
根据表5，膳食胆固醇的摄入与tc(趋势的p＝0.019)，ldl-c(p＝0.008)和非hdl-c(p＝0.021)的血浆浓度呈正相关，但是血浆hdl-c浓度则不适用(p＝0.486)。胆固醇摄入位于最高四分位的个体的血浆tc，ldl-c和非hdl-c的平均值分别比最低四分位个体的平均值高13.1、14.9和13.0mg/dl。
[0144]
实施例5、grs与血浆胆固醇水平的关联关系
[0145]
针对受试人群，本发明人进一步还分析了grs与血浆胆固醇水平的关联关系，结果如图1所示。
[0146]
根据图1，grs
tc
，grs
ldl-c
，grs
hdl-c
均为正态分布。grs
tc
的中位数(范围)为61.28(46.32-75.45)，grs
ldl-c
的中位数(范围)为42.09(29.53-56.51)，grs
hdl-c
的中位数(范围)为68.93(54.24-89.17)。如图1所示，位于grs
tc
最高组(》69)的个体血浆tc水平(169.71mg/dl)高于grs
tc
最低组(≤54)的tc水平(111.57mg/dl)。与grs
ldl-c
最低组(≤35)个体的ldl-c水平(131.85mg/dl)相比，位于grs
ldl-c
最高组(》50)的个体ldl-c水平更高(187.41mg/dl)。同样的，在grs
hdl-c
最高组(》80)个体的hdl-c水平为54.30mg/dl，而在最低grs
hdl-c
最低组(≤60)的个体hdl-c水平的平均值为45.77mg/dl。经过校正协变量的线性回归模型分析发现，grs
tc
每增加1能够增加0.99mg/dl的tc；grs
ldl-c
每增加1，ldl-c水平增加0.98mg/dl；grs
hdl-c
每增加1，hdl-c的水平增加0.47mg/dl。
[0147]
实施例6、膳食胆固醇摄入与grs之间的交互作用对血浆胆固醇水平的影响
[0148]
如图2所示，在不同的grs水平下，膳食胆固醇的摄入对血浆tc和ldl-c以及非hdl-c水平的影响也显著不同。膳食胆固醇与血浆tc的关联关系在grs
tc
较高时更强(在grs
tc
四分位的效应大小分别为：-0.29、0.34、2.45和6.47；交互作用p值：0.002)；膳食胆固醇与血
浆ldl-c的关联关系在grs
ldl-c
较高时更强(在grs
ldl-c
四分位的效应大小：-1.35、0.17、5.45和6.07；交互作用p值：0.001)。在血浆hdl-c水平上，膳食胆固醇摄入与grs
hdl-c
之间没有明显的交互作用(交互作用p值：0.206)。此外，膳食胆固醇与非hdl-c的关系在grs
tc
较高是更强(在grs
tc
四分位的效应大小：-1.70、0.11、1.13和6.90；交互作用p值：0.001)；膳食胆固醇与非hdl-c的关系在grs
ldl-c
较高是更强(在grs
ldl-c
四分位的效应大小：-1.31，-1.08、4.36和4.53，交互作用p值：0.004)。
[0149]
另一方面，本发明人还发现膳食胆固醇摄入影响grs与血浆胆固醇水平之间的关联关系。如图3所示，与胆固醇摄入量较低的人相比，在胆固醇摄入量较高的人群中，grs与胆固醇水平之间的遗传关联更强。在膳食胆固醇摄入的第一至第四四分位中，grs
tc
每增加1，血浆tc水平的分别增加0.51、0.82、1.21和1.31mg/dl(交互作用p值：0.023)；grs
ldl-c
每增加1，ldl-c水平分别增加0.66、0.52、1.12和1.56mg/dl(交互作用p值：0.020)。
[0150]
在本发明提及的所有文献都在本技术中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本技术所附权利要求书所限定的范围。