一种WH54聚合酶及其在RT-PCR中的应用的制作方法

一种wh54聚合酶及其在rt-pcr中的应用
技术领域
1.本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种wh54聚合酶及其在rt-pcr中的应用。


背景技术：

2.热稳定性的dna聚合酶已经在很多嗜热微生物中被广泛发现，例如从thermus aquaticus中分离出了taq dna聚合酶，从pyrococcus furiosus中分离出了pfu dna聚合酶，从pyrococcus sp.kod1中分离出了kod dna聚合酶。这些聚合酶由于其热稳定性，在核酸高温变性的条件下不会失活，是目前核酸扩增的常用酶，在高温扩增反应如pcr、测序反应中都得到广泛应用。
3.目前rt-pcr分为2种，two-step rt-pcr，即为常规rt-pcr方案，先用逆转录酶和逆转录酶反应体系进行cdna合成，再以合成的cdna为模板利用聚合酶和pcr反应体系进行反应；one-step rt-pcr，市面上常见的方案为将逆转录酶和pcr酶混在一起，通过反应buffer的优化来实现一步rt-pcr。需要两个酶进行反应，试剂成本高，而且需要考虑两个酶的反应buffer的兼容性问题，可能因为需要相互妥协无法达到两个酶的最佳活性条件。


技术实现要素：

4.本发明一个目的是提供一种蛋白质。
5.本发明提供的蛋白质，为如下1)或2)或3)：
6.1)氨基酸序列是序列表中序列2所示的蛋白质；
7.2)在序列表中序列2所示的蛋白质的n端或/和c端连接标签得到的融合蛋白质；
8.3)将1)或2)所示的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到具有相同功能的蛋白质。
9.上述经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。
10.上述蛋白质具有逆转录酶和/或dna聚合酶活性。
11.编码上述蛋白质的核酸分子也是本发明保护的范围。
12.上述核酸分子为如下(a1)或(a2)或(a3)或(a4)所示的dna分子：
13.(a1)编码区包括序列表中序列1的dna分子；
14.(a2)核苷酸序列是序列表中序列1的dna分子；
15.(a3)与(a1)或(a2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码上述蛋白质的dna分子；
16.(a4)在严格条件下与(a1)或(a2)限定的核苷酸序列杂交，且编码上述蛋白质的dna分子。
17.含有上述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系也是本发明保护的范围。
18.上述蛋白质，或，上述核酸分子，或，上述表达盒、重组载体、重组微生物或转基因
细胞系，在制备逆转录酶中的应用也是本发明保护的范围；
19.或，上述蛋白质，或，上述核酸分子，或，上述表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系，在制备dna聚合酶中的应用也是本发明保护的范围；
20.或上述蛋白质，或，上述核酸分子，或，上述表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系，在制备具有逆转录和dna聚合双重功能的酶中的应用也是本发明保护的范围。
21.上述蛋白质在作为逆转录酶或dna聚合酶或具有逆转录和dna聚合双重功能的酶中的应用也是本发明保护的范围；
22.或，上述蛋白质在逆转录反应或pcr反应或one-step rt-pcr中的应用也是本发明保护的范围；
23.或，含有上述蛋白质的逆转录扩增体系或pcr扩增体系或one-step rt-pcr反应体系也是本发明保护的范围。
24.本发明另一个目的是提供如下方法:
25.本发明提供了一种对待测核酸进行逆转录反应的方法，包括如下步骤：将上述蛋白质作为逆转录酶对待测核酸进行逆转录反应。
26.本发明还提供了一种对待测dna进行pcr反应，包括如下步骤：将上述蛋白质作为逆转录酶对待测dna进行pcr反应。
27.本发明还提供了一种对待测rna进行one-step rt-pcr反应，包括如下步骤：用上述蛋白质待测rna进行one-step rt-pcr反应。
28.本发明的实验证明，本发明的dna聚合酶，同时具有逆转录酶活性以及聚合酶活性，可以被应用于one-step rt-pcr中，即只需要wh54聚合酶即可完成逆转录及pcr的步骤，简化实验步骤，降低试剂成本。
附图说明
29.图1为重组质粒ecori酶切胶图。
30.图2为逆转录活性测试。
31.图3为纯化后蛋白电泳测试。
32.图4为pcr活性对比测试图。
33.图5为one-step rt-pcr测试结果。
具体实施方式
34.下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
35.下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
36.下述实施例中20xbsa为2mgbsa溶在1ml水里。
37.实施例1、wh54聚合酶基因表达纯化
38.一、wh54聚合酶基因的获得
39.人工合成序列1，即为wh54基因，该基因编码的蛋白命名为wh54蛋白，该蛋白的氨基酸序列为序列表中序列2。
40.二、wh54聚合酶表达纯化
41.1、重组载体的构建
42.将上述序列1所示的wh54基因替换pet32a表达载体(novagen,69015)的ecori和noti酶切位点间的片段，得到重组质粒；转入dh5a中，质粒小提获得重组质粒，再用ecori酶切验证。
43.将重组质粒用ecori酶切验证结果如图1所示，从左到右依次为，1：hindiii digest marker、2-11:重组质粒，可以看到，得到大小为8.6kb左右片段(箭头所指)为目标重组质粒，泳道3-7、泳道10、泳道11的质粒都为目标重组质粒，即为重组载体。
44.重组载体为将序列表中序列1所示的wh54基因替换pet32a表达载体的ecori和noti酶切位点间的片段得到的载体，表达序列2所示的wh54蛋白。
45.2、诱导表达和纯化
46.将上述1制备的重组载体转入bl21感受态细胞中，涂平板，从平板上挑取单菌落，37℃过夜培养，后转接至30ml新培养基，1:100稀释，培养至od值为0.5-0.6，加入0.1mm iptg，30℃过夜诱导，得到诱导培养产物。
47.诱导培养产物12000rpm离心10min时间，获得0.1g菌体沉淀，向其中加入2.7ml结合缓冲液(50mm nah2po4，ph 8.0，300mm nacl,10mm咪唑，余量为水)、300ul溶菌酶(bbi，a610308-0005)，冰上裂解30min，超声(2son 3soff，60％功率)破碎10min，4℃12000rpm离心30min分离上清和沉淀。
48.在手工柱(生工，f506605)中加入750ul histrap ff填料(ge，17531805)，用3ml结合缓冲液冲洗平衡填料；再加入3ml上清液；再用漂洗液(50mm nah2po4，ph 8.0，300mm nacl,30mm咪唑，余量为水)冲洗10次(3ml/次)，然后用洗脱液(50mm nah2po4，ph 8.0，300mm nacl,250mm咪唑，余量为水)500ul洗脱蛋白4-5次，收集ni柱洗脱后的蛋白。
49.将上述洗脱后蛋白取5ul进行sds-page检测，蛋白预制胶(金斯瑞，m01010c)，电压120v，电泳30min。然后使用金斯瑞的蛋白胶自动染色脱色仪进行染色，拍照。
50.结果如图3所示，第一个泳道为ni柱洗脱下蛋白，第二个泳道为蛋白marker(10-180kda,thermo,26617)；可以看出，得到大小为94kd的目的蛋白。
51.将空载体pet32a表达载体转入bl21感受态细胞中，按照上述方法诱导培养和纯化，经过电泳检测，未得到目的大小蛋白。
52.将ni柱洗脱后的蛋白用透析缓冲液(20mm kh2po
4-k2hpo4，ph 7.4,50mm kcl,0.1mm dtt,5％(体积百分含量)glycerol，余量为水)4℃过夜透析，收集透析后产物；再将透析产物用储存buffer溶解，得到蛋白wh54溶液，浓度为0.25mg/ml。
53.上述储存buffer按照如下方法制备：10mm kh2po
4-k2hpo4、300mm kcl、0.1mm edta、1mm dtt、1％(体积百分含量)tween 20,500ug/ml bsa,50％(体积百分含量)甘油，余量为水。
54.实施例2、wh54蛋白活性验证
55.一、反应buffer配制
56.逆转录反应：
57.50mm mnso4水溶液；
58.逆转录反应10xrt buffer：100mm tris-hcl，ph8.3，900mm kcl，余量为水。
59.pcr反应：
60.pcr反应10xpcr buffer：120mm tris-hcl，ph8.3,1.18m kcl，7.5mm egta，0.5％
(体积百分含量)tween20，余量为水。
61.二、逆转录活性测试
62.1、逆转录活性测试1
63.使用健康人组织的total rna(thermo，4307281)作为模板，用n6引物(random n6 primer(thermo,so142)，6个nt的随机引物)按照表1所示2组进行rt反应，得到rt产物：
64.rt反应体系及反应程序为如下表1：
65.表1为rt反应体系及反应程序
[0066][0067][0068]
将上述各组rt产物中取1ul作为模板，用人的看家基因的pcr primer mix(biomol,货号hhk-1)进行pcr(rtaq酶)，得到看家基因pcr扩增产物。
[0069]
30ul的pcr体系如下：
[0070]
rt产物1ul
[0071]
pcr反应10xpcr buffer 3ul
[0072]
2.5mm dntp mix 3.2ul
[0073]
10um primer mix 3ul
[0074]
20xbsa(2mg/ml)1ul
[0075]
rtaq(takara)0.4ul
[0076]
ddh2o 18.4ul
[0077]
将看家基因pcr扩增产物电泳，结果如图2所示，1：hindiii digest marker，2:对照组，3:实验组；可以看出，对照组合成了7条带(最上边一条缺失)，实验组合成了6条带，合成6条以上条带即为合格。
[0078]
上述结果表明，与对照transcriptor reverse transcriptase相比，本发明制备的wh54蛋白也具有很好的逆转录活性。
[0079]
2、逆转录活性测试2
[0080]
选取人hela细胞的总rna(clontech，636543)作为模板，按照如下各组进行rt反应：
[0081]
实验组rt反应：
[0082]
random primer(thermo,so142)1ul
[0083]
人hela细胞总rna(1ug/ul)1ul
[0084]
rnase free water 13ul
[0085]
先上述组分65℃加热5min，迅速置于冰水浴降温，并在冰上静置2min，得到rna mix；再与如下组分进行如下反应：
[0086]
rna mix 15ul
[0087]
逆转录反应10xrt buffer 2ul
[0088]
10mm dntp mix(fermentas,r0192)1ul
[0089]
rnase inhibitor(enzymatics，y9240l)1ul
[0090]
实施例1制备的0.25mg/ml蛋白wh54溶液1ul
[0091]
反应条件：25℃5min，60℃反应30min；得到实验组rt反应产物。
[0092]
对照组1rt反应(商品tth dna polymerase)：
[0093]
random primer(thermo,so142)1ul
[0094]
人hela细胞总rna(1ug/ul)1ul
[0095]
rnase free water 13ul
[0096]
先上述组分65℃加热5min，迅速置于冰水浴降温，并在冰上静置2min，得到rna mix；再与如下组分进行如下反应：
[0097]
rna mix 15ul
[0098]
逆转录反应10xrt buffer 2ul
[0099]
10mm dntpmix(fermentas,r0192)1ul
[0100]
rnase inhibitor(enzymatics,y9240l)1ul
[0101]
tth dna polymerase(fapon md012)1ul
[0102]
反应条件：25℃5min，60℃反应30min；得到对照组1rt反应产物。
[0103]
对照组2rt反应(mmlv reverse transcriptase)：
[0104]
random primer(thermo,so142)1ul
[0105]
人hela细胞总rna(1ug/ul)1ul
[0106]
rnase free water补足至13ul
[0107]
先上述组分65℃加热5min，迅速置于冰水浴降温，并在冰上静置2min，得到rna mix；再与如下组分进行如下反应：
[0108]
rna mix 13ul
[0109]
5x firststrand buffer 4ul
[0110]
10mm dntpmix(fermentas,r0192)1ul
[0111]
rnase inhibitor(enzymatics,y9240l)1ul
[0112]
mmlv reverse transcriptase(thermo,superscript ii)1ul
[0113]
反应条件：25℃5min，60℃反应30min；得到对照组2rt反应产物。
[0114]
阴性对照组rt反应：将实验组rt反应体系中不加入酶，其余组分和反应程序与实验组相同，得到阴性照组rt反应产物。
[0115]
上述各组反应完成后，用1ul 0.5m edta终止反应，并使用qubit dsdna hs kit(thermo)进行产物浓度测量。
[0116]
结果如下：
[0117]
实验组的rt反应产物浓度为5.98ng/ul；
[0118]
对照组1的rt反应产物浓度为4.04ng/ul；
[0119]
对照组2的rt反应产物浓度为5.04ng/ul；
[0120]
阴性照组的rt反应产物浓度为3.56ng/ul。
[0121]
上述结果表明，与其他聚合酶相比，实施例1制备的wh54聚合酶具有较好的逆转录酶活性，得到产物量高。
[0122]
三、聚合酶活性测试
[0123]
1、聚合酶活性对比测试
[0124]
以lambda dna(neb，n3011s)为模板，进行长度为2kb、4kb、6kb、8kb、12kb、15kb的目的片段pcr扩增，实验条件为：
[0125]
表2为所有体系中引物
[0126][0127]
对照组1(rtaq dna polymerase)的pcr扩增体系：
[0128]
10x buffer 2.5ul，
[0129]
10mm dntpmix 0.5ul,
[0130]
10um fw primer 1ul,
[0131]
10um不同的re primer 1ul,
[0132]
lambda dna 10ng,
[0133]
rtaq dna polymerase(takara)0.2ul,
[0134]
nuclease free water补足至25ul
[0135]
上述pcr反应条件为：
[0136]
95℃3min，30cycle x(95℃30s，55℃30s，72℃1kb/min)，72℃7min，12℃forever；
[0137]
对照组2(商品tth dna polymerase)的pcr扩增体系：
[0138]
2x tth rt-pcr buffer 12.5ul，
[0139]
10mm dntp mix 0.5ul,
[0140]
10um fw primer 1ul,
[0141]
10um不同的re primer 1ul,
[0142]
lambda dna 10ng,
[0143]
商品tth dna polymerase(fapon md012)0.5ul,
[0144]
nuclease free water补足至25ul
[0145]
反应条件为：
[0146]
95℃2min，30cycle x(94℃30s，55℃30s，72℃1kb/min)，72℃7min，12℃forever；
[0147]
实验组(wh54 polymerase)的pcr扩增体系：
[0148]
2xtth rt-pcr buffer12.5ul，
[0149]
10mm dntp mix 0.5ul,
[0150]
10um fw primer 1ul,
[0151]
10um不同的re primer 1ul,
[0152]
lambda dna 10ng,
[0153]
实施例1获得浓度为0.25mg/ml的蛋白wh54溶液0.5ul,
[0154]
nuclease free water补足至25ul
[0155]
上述pcr反应条件均为：95℃2min，30cycle x(94℃30s，55℃30s，72℃1kb/min)，72℃7min，12℃forever。
[0156]
结果如图4所示，左侧：rtaq dna pol pcr结果，1，1kb dna marker，2，2kb扩增，3，4kb扩增，4，6kb扩增，5，8kb扩增，6，12kb扩增，7，15kb扩增。右侧：1-6，实验组wh54 tth dna pol pcr结果(2kb到15kb)，7，1kb dna marker，8-13，商品tth dna polymerase pcr结果；可以看出，实验组wh54 pol和rtaq dna聚合酶均可以成功扩增出6kb的目的条带，而商品tth dna polymerase则只能扩增出2kb的目的条带，证明实验组wh54有很好的扩增能力。
[0157]
实施例3、wh54在one-step rt-pcr中的应用
[0158]
1、模板获得
[0159]
使用人hela细胞总rna，浓度为1ug/ul。
[0160]
用水稀释上述总rna，得到不同浓度的rna 1ug/ul,100ng/ul,10ng/ul以及1ng/ul。
[0161]
2、one-step rt-pcr扩增目标基因b2m基因
[0162]
以上述人hela细胞总rna为模板，用如下反应体系进行one-step rt-pcr扩增：
[0163]
实验组：one-step rt-pcr扩增体系：
[0164]
2xrt-pcr buffer 25ul，
[0165]
10mm dntpmix 1.5ul,
[0166]
10um fw primer 2.25ul,
[0167]
10um re primer 2.25ul,
[0168]
不同浓度的rna 1ul,
[0169]
50x mncl2水溶液1ul,
[0170]
实施例1的浓度为0.25mg/ml的蛋白wh54溶液1ul，
[0171]
nuclease free water补足至50ul
[0172]
上述体系中，fw引物和re引物为扩增基因b2m的引物对，其中fw primer为
actgaattcacccccactga；re primer为cctccatgatgctgcttaca。
[0173]
上述体系中，1ug/ul,100ng/ul,10ng/ul以及1ng/ul的rna在扩增体系中的质量分别为1ug,100ng，10ng,1ng。
[0174]
对照组：与实验组相同，不同的仅为实施例1的浓度为0.25mg/ml的蛋白wh54溶液替换为商品tth dna polymerase(fapon md012)，其他扩增体系中各物质与实验组相同。
[0175]
上述one-step rt-pcr扩增的反应程序为：
[0176]
65℃30min，
[0177]
94℃2min，
[0178]
30cycles x(94℃30s,55℃30s,70℃1min)，
[0179]
72℃7min，
[0180]
12℃forever。
[0181]
结果如图5所示，lane 1：100bp marker；lane2-4：商品tth dna polymerase，lane2，1ug total rna，lane3，100ng total rna，lane4,10ng total rna,lane5,1ng total rna；lane 6-9：本实施例1的蛋白wh54溶液实验组扩增结果，lane6，1ug total rna，lane7，100ng total rna，lane8,10ng total rna,lane9,1ng total rna；相比商品tth dna polymerase，蛋白wh54在扩增灵敏性上有更优异的表现，可以实现低至1ng rna模板的rt-pcr扩增。