制备干细胞凝胶的方法与流程

1.本发明涉及一种生物凝胶，特别涉及一种以干细胞提取物为组分的凝胶，利于在组织修复中的应用。


背景技术：

2.水凝胶是一类高度含水的具有三维网络交联结构的生物材料，在水中迅速溶胀并在此溶胀状态可以保持大量体积的水而不溶解。按其来源可分为天然和合成两大类。天然的亲水性高分子包括多糖类(淀粉、纤维素、海藻酸、透明质酸和壳聚糖等)和多肽类(胶原、聚l-赖氨酸和聚l-谷胺酸等)。合成的亲水高分子包括醇、丙烯酸及其衍生物类(聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、聚丙烯酰胺和聚n-聚代丙烯酰胺等)。由于其具有优异的生物相容性及一定的机械强度，可以高度拟合生物组织的微环境，因此广泛应用于组织工程和再生医学。
3.在全球范围内，干细胞临床试验已经超过1000项，其应用正在得到普及，但将这些干细胞应用于创面修复，仍需要合适的载体。


技术实现要素：

4.本发明的一个目的在于提供一种制备干细胞凝胶的方法，为干细胞体外生长提供环境条件，利于作用于创面。
5.本发明的另一个目的在于提供一种制备干细胞凝胶的方法，将干细胞提取物制成凝胶形式利于作用于创面。
6.一种制备干细胞凝胶的方法，包括：
7.从脐血中获取脐血浆及白膜层，并首次离心，取离心后得到的沉淀物，并将沉淀物重悬，得到重悬液；
8.将重悬液反复冷冻-冻融3-5次；
9.最后在重力加速度3,500g～4,000g二次离心，离心时间30分钟～35分钟，取上清，即得干细胞提取物；
10.按dmem基础培养基体积的3％～5％加入干细胞提取物，制得用于形成凝胶的专用培养基，按每毫升专用培养基加入5
×
104～1
×
105个间充质干细胞，混匀后，于37℃，5.0％co2培养箱中培养至细胞汇合度为80％以上，即形成干细胞凝胶。
11.本发明的方法，首次离心的重力加速度设置4500g～5500g，加速设置为5档，减速设置为2档，离心的温度为20℃～22℃，时间为30分钟～35分钟。
12.本发明的方法，将重悬液置入-96℃～-80℃超低温冰箱中12小时～16小时冷冻。
13.本发明的方法，置入37℃～42℃水浴锅中2分钟～3分钟内冻融。
14.本发明的方法，将重悬液置入-96℃～-80℃超低温冰箱中12小时～16小时冷冻，再置入37℃～42℃水浴锅中2分钟～3分钟内冻融，如此重复冷冻-冻融3-5次；
15.本发明的方法，二次离心时间为30分钟～35分钟。
16.本发明的方法，按每毫升专用培养基加入5
×
104～1
×
105个间充质干细胞。
培养箱中培养至细胞汇合度为80％以上，即形成干细胞凝胶。
35.本发明以下实施例，对形成纤维蛋白凝块厚度采用直接度量的方法测定，比如：采用刻度尺进行测量并读取数值。
36.本发明以下实施例，获得细胞的活率的方法如下：
37.采用台盼蓝拒染法测定细胞活率，吸取细胞悬液10ul与等体积的台盼蓝混合均匀后，吸取10μl样品缓缓注入一次性计数板样品槽内，使用全自动计数仪countess ii fl对样品进行细胞活率检测。
38.本发明以下实施例，获得细胞数量的方法如下：
39.使用3ml无菌吸管吸取2ml pbs将培养瓶或培养皿中细胞漂洗一次后弃去，加入0.5-2ml 0.25％胰酶进行消化，消化时长30s，加入2倍体积的培养基终止消化，并吹打细胞，收集全部细胞悬液于15ml离心管内，离心机1200rpm，5min离心。离心结束后弃上清，加入1ml pbs重悬细胞沉淀，采用台盼蓝拒染法进行细胞计数。吸取细胞悬液10ul与等体积的台盼蓝混合均匀后，吸取10ul样品缓缓注入一次性计数板样品槽内，使用全自动计数仪countess ii fl对样品进行细胞计数。
40.实施例1
41.将干细胞提取物分别按照所用dmem基础培养基体积比，添加1％、2％、3％、4％和5％配置用于形成凝胶的专用培养基，取出5个100mm培养皿分别加入上述五个浓度的专用培养基10ml，每皿中每毫升培养基加入1
×
105个脐带间充质干细胞，混匀细胞后，37℃，5.0％co2培养箱中培养24小时。
42.在培养24h后取出上述五组培养皿，分别将培养皿倾斜约45
°
后观察培养皿中形成的纤维蛋白凝块厚薄程度，参见图2。随后4倍镜下拍摄细胞生长状态，参见图1所示，其中a、b、c、d和e分别表示添加量为1％、2％、3％、4％和5％的细胞生长形态，细胞呈成纤维细胞样生长，以放射状或平行状紧密排列。
43.收集各组培养皿中细胞，使用3ml无菌吸管吸取2mlpbs将形成的纤维蛋白凝块吹散，随后分别加入0.25％胰酶2ml进行消化，消化时长30s，终止消化后，吹打细胞并转移至对应添加浓度编号的15ml离心管内，1200rpm，5min离心，并使用细胞计数仪计数。
44.实施例2
45.将干细胞提取物分别按照所用dmem基础培养基体积比，添加1％、2％、3％、4％和5％配置用于形成凝胶的专用培养基，取出5个t25培养瓶分别加入上述五个浓度的专用培养基5ml，并额外取出一个t25瓶加入干细胞提取物5％浓度的专用培养基5ml不接种细胞作为对照组，余下每瓶每毫升培养基加入1
×
105个脐带间充质干细胞，混匀细胞后，37℃，5.0％co2培养箱中培养24小时。
46.在培养24小时后培养瓶中细胞的细胞数量统计参见图5，细胞存活率得到了良好地保持。取出上述6只培养瓶，分别将培养瓶侧向树立后观察培养皿中形成的纤维蛋白凝块厚薄程度，参见图4。随后4倍镜下拍摄细胞生长状态，参见图3所示，其中a、b、c、d和e分别表示添加量为1％、2％、3％、4％和5％的细胞生长形态，细胞呈成纤维细胞样生长，以放射状或平行状紧密排列，f为对照组。
47.收集各组培养瓶中细胞，使用3ml无菌吸管吸取2mlpbs将形成的纤维蛋白凝块吹散，直至完全从细胞上脱落为止，随后分别加入0.25％胰酶1ml进行消化，消化时长30s,终
止消化后，吹打细胞并转移至对应添加浓度编号的15ml离心管内，1200rpm，5min离心，并使用细胞计数仪计数，参见图6，细胞数量随着添加量逐渐增加，添加量4％和5％时细胞数量最多。


技术特征：
1.一种制备干细胞凝胶的方法，其特征在于包括：从脐血中获取脐血浆及白膜层，并首次离心，取离心后得到的沉淀物，并将沉淀物重悬，得到重悬液；将重悬液反复冷冻-冻融3-5次；最后在重力加速度3,500g～4,000g二次离心，取上清，即得干细胞提取物；按dmem基础培养基体积的3％～5％加入干细胞提取物，制得用于形成凝胶的专用培养基，按每毫升专用培养基加入间充质干细胞，混匀后，于37℃，5.0％co2培养箱中培养至细胞汇合度为80％以上，即形成干细胞凝胶。2.根据权利要求1所述的制备干细胞凝胶的方法，其特征在于首次离心的重力加速度设置4500g～5500g。3.根据权利要求1所述的制备干细胞凝胶的方法，其特征在于首次离心时间为30分钟～35分钟。4.根据权利要求1所述的制备干细胞凝胶的方法，其特征在于将重悬液置入-96℃～-80℃超低温冰箱中12小时～16小时冷冻。5.根据权利要求1所述的制备干细胞凝胶的方法，其特征在于置入37℃～42℃水浴锅中2分钟～3分钟内冻融。6.根据权利要求1所述的制备干细胞凝胶的方法，其特征在于二次离心时间为30分钟～35分钟。7.根据权利要求1所述的制备干细胞凝胶的方法，其特征在于按每毫升专用培养基加入5
×
104～1
×
105个间充质干细胞。8.根据权利要求1所述的制备干细胞凝胶的方法，其特征在于在温度20℃～22℃，重力加速度300g～400g预离心，22分钟～25分钟，以从脐血中取得脐血浆及白膜层。

技术总结
一种制备干细胞凝胶的方法，包括从脐血中获取脐血浆及白膜层，并首次离心，取离心后得到的沉淀物，并将沉淀物重悬，得到重悬液；将重悬液反复冷冻-冻融3-5次；最后在重力加速度3,500g～4,000g二次离心，取上清，即得干细胞提取物；按DMEM基础培养基体积的3％～5％加入干细胞提取物，制得用于形成凝胶的专用培养基，按每毫升专用培养基加入间充质干细胞，混匀后，于37℃，5.0％CO2培养箱中培养至细胞汇合度为80％以上，即形成干细胞凝胶。本发明的方法，为间充质干细胞提供生长环境，起到“支架”的作用，便于将间充质干细胞施用于创面，并保留在创面，利于以间充质干细胞实施创面修复。利于以间充质干细胞实施创面修复。利于以间充质干细胞实施创面修复。


技术研发人员：章毅 伍婷 胡肖希
受保护的技术使用者：中国干细胞集团上海生物科技有限公司 重庆市干细胞技术有限公司 中国干细胞集团海南博鳌附属干细胞医院有限公司 上海市干细胞技术有限公司 陕西省干细胞技术有限公司 苏州市干细胞技术有限公司 三亚市干细胞技术有限公司
技术研发日：2021.11.17
技术公布日：2022/2/23