酵素生产方法及其酶解生产特定分子段氨基寡糖素应用与流程

1.本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及一种甲基营养型芽孢杆菌酵素的生产方法及用其生产特定分子段的氨基寡糖素的方法。


背景技术：

2.氨基寡糖素（壳寡糖）是新一代海洋生物农药，是壳聚糖的降解产物，无毒害、不污染环境。目前氨基寡糖素的生产方法主要有物理降解法，化学降解法和生物降解法。其中物理降解法对生产设备要求较高，存在收率较低、反应不充分、生产成本高等多种问题；化学降解法存在条件不易控制，选择性较差，有副产物分离纯化困难，目标产物难以控制等问题。生物降解法（酶解法）是应用最主流的方法，但是目前酶解法生产得到的壳寡糖产物的分子量分布区间还是有点广，所得壳寡糖产物的分子量区间普遍在1000
‑
3000之间，如果只想要生产特定窄分子量范围的目标壳寡糖，现有的方法还是显得不够精细。


技术实现要素：

3.本发明的一个目的是提供一种甲基营养型芽孢杆菌酵素，用于酶解壳聚糖。
4.所述甲基营养型芽孢杆菌酵素通过液体发酵和固体发酵两道工序制备，如下:1.液体发酵1.1将甲基营养型芽孢杆菌种按5%重量比接种至lb液体培养基中，在温度为30
‑
37℃，转速为180
‑
200r/min条件下培养18
‑
24h，得到甲基营养型芽孢杆菌种子液；其中lb液体培养基配方：按重量计蛋白胨1%，酵母粉0.5%，氯化钠1%，去离子水补至100%；1.2将甲基营养型芽孢杆菌种子液按3%
‑
5%重量比接种至扩大培养基中，在温度为30
‑
37℃，转速为180
‑
200r/min条件下培养36
‑
48h，进行扩大培养，得到甲基营养型芽孢杆菌发酵液；其中扩大培养基配方：按重量计玉米粉1.6%
‑
2.4%、黄豆粕粉1.2%
‑
1.8%、糖蜜0.4%
‑
0.6%、nacl 0.5%
‑
1%、kh2po
4 0.4%
‑
0.6%、mgso4•
7h2o 0.16%
‑
0.24%、caco
3 0.04%
‑
0.06%，水补至100%；2.固体发酵2.1在温度为30
‑
37℃、湿度为85
‑
99%的控温控湿无菌室中，将甲基营养型芽孢杆菌发酵液接种于固体培养基进行培养3
‑
5天；所述固体培养基配方：按重量计黄豆粕粉25%
‑
30%、麦麸17%
‑
20%、米糠11%
‑
15%、稻壳5%
‑
7%、糖蜜1%
‑
2%、碳酸钙2%
‑
3%、马铃薯浸出液补至100%；其中所述马铃薯浸出液配制方法：加水将马铃薯煮沸，然后打碎，过滤，便可制得马铃薯浸出液；2.2培养好之后，对培养产物进行35
‑
45℃无菌烘干，使其含水量降至10%以下，即可得到固体甲基营养型芽孢杆菌酵素。
5.本发明的另一个目的是提供一种利用甲基营养型芽孢杆菌酵素酶解壳聚糖得到特定分子段的氨基寡糖素的生产方法。
6.所述生产方法具体如下：ⅰ在反应釜中加入壳聚糖 4.4%
‑
6.6%，亚磷酸0.4%
‑
0.6%，甲基营养型芽孢杆菌酵素0.4%
‑
0.6%，纯净水补至100%；ⅱ打开搅拌器和恒温加热系统，50℃
±
2℃酶解发酵，即可得到氨基寡糖素混合液；其中通过控制酶解时间、测定粘度来控制氨基寡糖素的聚合度和平均分子量，粘度是由电子数显粘度计测定，聚合度和平均分子量是由dns法测定；ⅲ氨基寡糖素微生物酶解混合液经过80
‑
120目振动筛过滤掉废渣，再经过微滤过滤机过滤大分子蛋白和酶得到稳定的特定分子段的氨基寡糖素。
7.本技术中，分子量范围是指产物的分子量分布区间的范围。
8.本技术中，涉及物质的百分含量时（%），均表示质量百分含量。
9.技术效果本技术提供了一种新的关于甲基营养型芽孢杆菌酵素的制备方法，其由甲基营养型芽孢杆菌经过液体发酵和固体发酵两道主工序制备，可以用于酶解壳聚糖过程中，能够有效降解壳聚糖得到稳定的氨基寡糖素产物。
10.本技术中利用甲基营养型芽孢杆菌酵素应用在酶解壳聚糖时，通过特定工艺制备（液体发酵和固体发酵两道工序），可以得到窄分子量范围（约为160左右）的氨基寡糖素。
具体实施方式
11.下面结合具体实施案例对本发明各个阶量做进一步详细说明，但绝不仅限于以下几种实施案例。
12.本发明所用材料均为可商购材料，其中甲基营养型芽孢杆菌种购买于陕西恒田生物农业有限公司（800亿芽孢/克母药型），壳聚糖购买于潍坊海之源生物制品有限公司（脱乙酰度≥85%型）。
13.本技术中，dns法测定聚合度和平均分子量，是指利用dns物质测试聚合度和平均分子量。
14.其中，利用dns测试平均分子量请参见《光度法测定甲壳低聚糖的平均相对分子质量》，邬建敏，化学世界[j]，2001年06期。
[0015]
利用dns测试聚合度或平均分子量也可以参见以下测试方法：端基法测定壳聚糖中平均聚合度和分子量<1>取1.0ml的产物样液（酶解10min/20min/30min的壳寡糖液）放入试管中，加入1.0mldns试剂，在沸水中加热5min；<2>取出冷却，再加入蒸馏水8.0ml混匀，在520nm波长处测定溶液的吸光度值，以a0表示；<3>另取相同的样液1.0ml，加入6.0mol/l盐酸溶液3.0ml，置于沸水浴中2h；<4>用适量6.0mol/l naoh溶液中和水解液后，用蒸馏水稀释至10ml；<5>取稀释后的水解液1.0ml放入试管中，加入1.0ml dns试剂，在沸水中加热
5min；<6>取出冷却，再加入蒸馏水8.0ml混匀，在520nm波长处测定溶液的吸光度值，以a1表示；<7>壳低聚糖的平均聚合度n为：n=10a1/a0<8>由此可以计算出壳寡糖样液中壳聚糖的相对平均分子质量为：mw=（10a1/a0）
×
179－(10a1/a0－1)
×
18式中：179为氨基葡萄糖单元的相对分子质量；18为水的相对分子质量。
[0016]
本技术中，分子量分布区间可以采用现有技术中任意合适的方法，例如利用hpc、gpc等；利用dns法测试产物的平均分子量。
[0017]
实施例1：甲基营养型芽孢杆菌的液体发酵（1）将甲基营养型芽孢杆菌种按5%重量比接种至lb液体培养基中，在温度为37℃，转速为200r/min条件下培养18h，得到甲基营养型芽孢杆菌种子液，其中lb液体培养基配方：按重量计蛋白胨1%，酵母粉0.5%，氯化钠1%，去离子水补至100%；（2）将甲基营养型芽孢杆菌种子液按3%重量比接种至扩大培养基中，在温度为37℃，转速为200r/min条件下培养36h，进行扩大培养，得到甲基营养型芽孢杆菌发酵液；其中扩大培养基配方：按重量计玉米粉2.4%、黄豆粕粉1.2%、糖蜜0.4%、nacl 1%、kh2po
4 0.6%、mgso4•
7h2o 0.16%、caco
3 0.06%，水补至100%；（3）通过检测，得到发酵液的活菌数为4.97
×
109cfu/ml。
[0018]
实施例2：甲基营养型芽孢杆菌的液体发酵（1）将甲基营养型芽孢杆菌种按5%重量比接种至lb液体培养基中，在温度为30℃，转速为180r/min条件下培养24h，得到甲基营养型芽孢杆菌种子液；其中lb液体培养基配方：按重量计蛋白胨1%，酵母粉0.5%，氯化钠1%，去离子水补至100%；（2）将甲基营养型芽孢杆菌种子液按5%重量比接种至扩大培养基中，在温度为30℃，转速为180r/min条件下培养48h，进行扩大培养，得到甲基营养型芽孢杆菌发酵液；其中扩大培养基配方：按重量计玉米粉1.6%、黄豆粕粉1.8%、糖蜜0.6%、nacl 0.5%、kh2po
4 0.4%、mgso4•
7h2o 0.24%、caco
3 0.04%，水补至100%；（3）通过检测，得到发酵液的活菌数为5.21
×
109cfu/ml。
[0019]
实施例3：实施例1甲基营养型芽孢杆菌发酵液的进一步固体发酵（1）固体培养基配制：按重量计黄豆粕粉25%、麦麸20%、米糠11%、稻壳7%、糖蜜1%、碳酸钙3%、马铃薯浸出液补至100%；121℃灭菌1.5h；其中马铃薯浸出液配制方法：按重量比马铃薯：水=1:4加水，将马铃薯煮沸，然后用剪切机均匀打碎，通过100目振动筛过滤，便可制得马铃薯浸出液；（2）在温度为37℃，湿度为85
‑
99%的控温控室无菌室中，将制得实施例1甲基营养型芽孢杆菌发酵液利用自动接种机均匀接种于固体发酵培养基进行培养3天；（3）培养好之后进行35
‑
45℃无菌烘干，当含水量测定结果为8.72时，结束无菌烘干，得到固体酵素。（4）通过烘干之后检测，得到固体酵素活菌数为6.57
×
109cfu/g。
[0020]
实施例4：实施例2甲基营养型芽孢杆菌发酵液的进一步固体发酵（1）固体培养基配制：按重量计黄豆粕粉30%、麦麸17%、米糠15%、稻壳5%、糖蜜2%、碳酸钙2%、马铃薯浸出液补至100%；121℃灭菌1.5h；其中马铃薯浸出液配制方法：按重量比马铃薯：水=1:4加水，将马铃薯煮沸，然后用剪切机均匀打碎，通过100目振动筛过滤，便可制得马铃薯浸出液；（2）在温度为25
‑
35℃，湿度为85
‑
99%的控温控室无菌室中，将制得实施
例2甲基营养型芽孢杆菌发酵液利用自动接种机均匀接种于固体发酵培养基进行培养5天；（3）培养好之后进行35
‑
45℃无菌烘干，当含水量测定结果为8.82时，即可得到固体酵素；（4）通过烘干之后检测，得到固体酵素活菌数为6.75
×
109cfu/g。
[0021]
实施例5：实施例3固体酵素酶解生产特定分子段的氨基寡糖素（1）在反应釜中加入壳聚糖5.5%，亚磷酸0.5%，实施例3固体酵素0.5%，纯净水补至100%；（2）打开搅拌器和恒温加热系统，50℃
±
2℃酶解发酵72h，测得氨基寡糖素微生物酶解混合液粘度为35mpa
·
s（36℃），聚合度为15.5，平均分子量为2495.5g/mol；（3）经过100目振动筛过滤掉废渣，再经过微滤过滤机过滤大分子蛋白和酶即得到稳定集中在聚合度15
‑
16、分子量2415
‑
2576g/mol的氨基寡糖素；（4）稳定性跟踪检测：六个月检测结果粘度为37mpa
·
s（22.5℃），聚合度为15.3，平均分子量为2463.3g/mol。一年检测结果粘度为36mpa
·
s（18.5℃），聚合度为15.6，平均分子量为2511.6g/mol。两年检测结果粘度为41mpa
·
s（19℃），聚合度为15.4，平均分子量为2479.4g/mol。
[0022]
实施例6：实施例3固体酵素酶解生产特定分子段的氨基寡糖素（1）在反应釜中加入壳聚糖5.5%，亚磷酸0.5%，实施例3固体酵素0.5%，纯净水补至100%；（2）打开搅拌器和恒温加热系统，50℃
±
2℃酶解发酵84h，测得氨基寡糖素微生物酶解混合液粘度为15mpa
·
s（39℃），聚合度为9.5，平均分子量为1531g/mol；（3）经过100目振动筛过滤掉废渣，再经过微滤过滤机过滤大分子蛋白和酶得到稳定集中在聚合度9
‑
10、分子量1449
‑
1610g/mol的氨基寡糖素；（4）跟踪检测：六个月检测结果粘度为15mpa
·
s（21℃），聚合度为9.5，平均分子量为1547.5g/mol。一年检测结果粘度为21mpa
·
s（17.5℃），聚合度为9.2，平均分子量为1502g/mol。两年检测结果粘度为15mpa
·
s（19℃），聚合度为9.4，平均分子量为1531g/mol。
[0023]
实施例7：实施例3固体酵素酶解生产特定分子段的氨基寡糖素（1）在反应釜中加入壳聚糖5.5%，亚磷酸0.5%，实施例3固体酵素0.5%，纯净水补至100%；（2）打开搅拌器和恒温加热系统，50℃
±
2℃酶解发酵96h，测得氨基寡糖素微生物酶解混合液粘度为9mpa
·
s（41℃），聚合度为6.3，平均分子量为1014.3g/mol；（3）经过100目振动筛过滤掉废渣，再经过微滤过滤机过滤大分子蛋白和酶得到稳定集中在聚合度9
‑
10、分子量966
‑
1127g/mol的氨基寡糖素；（4）跟踪检测：六个月检测结果粘度为11mpa
·
s（22.5℃），聚合度为6.5，平均分子量为1046.5g/mol。一年检测结果粘度为10mpa
·
s（18℃），聚合度为6.4，平均分子量为1030.4g/mol。两年检测结果粘度为9mpa
·
s（18.5℃），聚合度为6.4，平均分子量为1030.4g/mol。
[0024]
实施例8：实施例4固体酵素酶解生产特定分子段的氨基寡糖素（1）在反应釜中加入壳聚糖5.5%，亚磷酸0.5%，实施例4固体酵素0.5%，纯净水补至100%；（2）打开搅拌器和恒温加热系统，50℃
±
2℃酶解发酵96h，测得氨基寡糖素微生物酶解混合液粘度为10mpa
·
s（39.5℃），聚合度为6.8，平均分子量为1094.8g/mol；（3）经过100目振动筛过滤掉废渣，再经过微滤过滤机过滤大分子蛋白和酶得到稳定集中在聚合度9
‑
10、分子量966
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1127g/mol的氨基寡糖素；（4）跟踪检测：六个月检测结果粘度为9mpa
·
s（21℃），聚合度为6.6，平均分子量为1062.6g/mol。一年检测结果粘度为12mpa
·
s（17.5℃），聚合度为6.7，平均分子量为1078.7g/mol。两年检测结果粘度为13mpa
·
s（17℃），聚合度为6.8，平均分子量为1094.8g/mol。
[0025]
尽管通过优选实施例的方式对本发明进行了详细描述，但本发明并不限于此。在不脱离本发明的精神和实质的前提下，本领域普通技术人员可以对本发明的实施例进行各种等效的修改或替换，而这些修改或替换都应在本发明的涵盖范围内任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围以权利要求所述的保护范围为准。