构建原位原发膀胱癌动物模型的方法与流程

1.本发明属于肿瘤动物模型领域。


背景技术：

2.膀胱癌(bladder cancer，bc)是泌尿系统常见的恶性肿瘤。据最新全球统计数据显示，2018年全球新发膀胱癌约55万例(3.0％)，占肿瘤发病率第十二位，死亡约20万例(2.1％)，占肿瘤死亡率第十四位。膀胱癌在男性中的发病风险约是女性的3-4倍：在男性中，膀胱癌的发病率占第六位(4.5％)，而在女性中占第九位(2.8％)。在我国，膀胱癌是泌尿系统最常见的恶性肿瘤，发病率居中国男性泌尿生殖系统恶性肿瘤第一位且呈逐年增长趋势；在男性中膀胱癌已上升至肿瘤发病率的第六位，女性第十一位，其势必将给我国医疗卫生系统造成巨大负担。
3.目前能够用于膀胱癌研究的动物模型较少，原发原位的膀胱癌动物模型更是缺乏，极大的制约了对膀胱癌发生发展中的分子机制研究。目前已有的膀胱癌模型包括：化学诱导膀胱癌模型、移植瘤模型、pdx模型及基因鼠模型。致癌原诱发模型大多使用n-丁基-n-(4-羟丁基)亚硝胺口服诱发膀胱癌，它的优点在于其致癌过程自发并且有完整的免疫原性；但其成瘤的基因背景复杂，肿瘤类型多样，少有转移发生，与临床患者的表型差异较大。膀胱癌移植瘤模型成瘤时间较短，其成瘤的基因背景明确，但缺点是其缺乏肿瘤自发形成的过程和免疫原性。人源的pdx模型移植的肿瘤细胞来源于患者肿瘤标本，能特异的反映病人的肿瘤特性，但其成瘤过程缺乏免疫原性，且是非原发的肿瘤模型。基因鼠模型是一个自发且基因背景清楚的模型，但它的技术难度高且耗时长；最近，michael m.shen团队构建了来源于临床患者的膀胱癌类器官的小鼠动物模型，该模型优点在于肿瘤类器官可以更大程度上的保留患者肿瘤的异质性、成瘤时间较短，可用于肿瘤发展及药物筛选等研究，但不能用于研究肿瘤的发生过程。纵观上述已有模型，我们仍缺乏一个更能模拟临床病人肿瘤的发生与发展的动物模型。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一种更接近膀胱癌生物学特性、且制备周期短的原位原发膀胱癌模型。
5.为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
6.一种膀胱类器官培养方法，包括如下步骤：
7.将正常膀胱细胞与matrigel混合，待matrigel凝固后，加入类器官培养基进行培养，即可；
8.术语“正常膀胱细胞”是相对于膀胱癌细胞而言的，指非癌的健康膀胱细胞。
9.所述类器官培养基以dmem/f12为基础培养基，含有如下添加剂：50-100ng/ml wnt3a和300-750ng/ml r-spondin 1。
10.如前述的培养方法，所述wnt3a浓度为75ng/ml。
11.如前述的培养方法，所述r-spondin 1浓度为500ng/ml。
12.如前述的培养方法，所述类器官培养基添加有如下用量的添加剂：
13.b271％(v/v)n-acetylcysteine0.125mmegf50ng/mlnoggin50ng/mlr-spondin 1500ng/mla83-01200nmfgf10100ng/mlnicotinamide1mmy-2763210umwnt3a75ng/mlglutamax100
×
稀释n21％(v/v)青霉素10000units/ml链霉素10000ug/ml。
14.一种构建原位原发膀胱癌动物模型的方法，包括如下步骤：
15.1)对人或动物的正常膀胱细胞进行原代培养；
16.2)使用原代细胞培养成类器官，扩大培养；
17.3)将所得类器官分散成单个细胞，进行基因编辑，而后培养成类器官；
18.4)将基因编辑成功的类器官注射到动物膀胱组织内；
19.步骤2)、步骤3)所述类器官的培养方法如前所示；
20.步骤3)所述基因编辑是指敲除抑癌基因，和/或增加原癌基因的拷贝数。
21.如前述的构建原位原发膀胱癌动物模型的方法，步骤3)的基因编辑具体是：
22.敲除trp53、pten和rb1基因，过表达cmyc和kras
g12d
基因；
23.或，敲除trp53基因，过表达cmyc基因。
24.注：kras
g12d
指kras基因发生g12d突变，即第12位氨基酸从g(甘氨酸)突变为d(天冬氨酸)。
25.如前述的构建原位原发膀胱癌动物模型的方法，步骤3)的基因编辑还包括对类器官转入荧光标记基因和/或荧光素酶基因。
26.如前述的构建原位原发膀胱癌动物模型的方法，步骤1)和4)所述动物是小鼠。
27.前述的方法制备得到的动物模型在非疾病治疗目的的药物筛选、药物毒性试验或免疫治疗试验中应用。
28.本发明的技术路线图如图1所示。
29.本发明的肿瘤模型构建周期较基因工程动物模型大大缩短，且几乎不会导致动物成瘤前死亡，总体效率很高。
30.本发明构建的原位原发的小鼠膀胱肿瘤模型，可模拟在人体内由于遗传改变导致正常细胞向肿瘤细胞转化的过程，能动态地表征了肿瘤发生发展地过程，在基因层面、肿瘤微环境、肿瘤发展及病理生理等方面与肿瘤发生发展真实情况更加贴近。
31.总之，本发明的方法可高效率地制备得到更接近膀胱癌特征、符合临床研究需求的膀胱癌模型；该模型可以在探究膀胱癌发生发展机制、寻找和优化新的膀胱癌可能的治疗方式等研究领域提供有利工具。
32.显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
33.以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说
明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
34.图1.原发原位膀胱癌模型构建技术路线图。
35.图2.小鼠正常膀胱类器官培养。
36.图3.类器官基因编辑后白光图、荧光图。
37.图4.活体成像图。
38.图5.小鼠类器官基因编辑后基因型验证(上:trp53、rb1、pten突变的酶切验证；中：kras
g12d
在肿瘤细胞中过表达；下：cmyc在肿瘤细胞中过表达)。
39.图6.小鼠移植后生存曲线。
40.图7.小鼠成瘤后膀胱肿瘤；bf，白光；gfp，绿色荧光蛋白。
41.图8.膀胱肿瘤he染色图。
42.图9.膀胱肿瘤免疫组化染色图。
43.图10.正常小鼠类器官编辑后白光图及荧光图。
44.图11.基因trp53突变检测图(左)和原位移植一周后小鼠活体成像荧光素酶检测图(右)。
45.图12.原位移植47天后小鼠膀胱白光图及荧光图。
46.图13.膀胱病理h&e染色。
47.图14.原发原位小鼠模型体内化疗药物治疗示意图。
48.图15.化疗治疗后小鼠膀胱荧光素酶信号检测图；左：检测直接结果；右：信号强度统计图。
49.图16.培养基筛选效果图。
具体实施方式
50.本发明中的部分英文缩写解释如下：
51.dmem：是一种应用十分广泛的培养基，可用于许多哺乳动物细胞培养，购买自gibco公司。
52.dmem/f12：是f12培养基和dmem培养基按照1：1结合，称为dmem/f12培养基。综合了f12含有较丰富的成分和dmem含有较高浓度养分的优点。购买自gibco公司。
53.matrigel，从富含胞外基质蛋白的ehs小鼠肿瘤中分离出，其主要成分由层粘连蛋白，ⅳ型胶原，巢蛋白，硫酸肝素糖蛋白等组成，还包含生长因子和基质金属蛋白酶等。购买自康宁公司。
54.b27，即b27补充剂，市售产品，可用于配制培养基。b27补充剂以50倍的液体浓缩液提供，除其它成分外其包含生物素、胆固醇、亚油酸、亚麻酸、黄体酮、腐胺、视黄醇、视黄醇乙酸酯、亚硒酸钠、三碘甲状腺原氨酸(t3)、dl-α-生育酚(维生素e)、白蛋白、胰岛素以及转铁蛋白。购自life technologies公司。n-acetylcysteine：n-乙酰半胱氨酸，购买自sigma公司。
55.egf，表皮生长因子，市售产品，购买自r&d公司。
56.noggin，细胞生长蛋白成分，市售产品，购买自peprotech公司。
57.r-spondin 1，人细胞生长编码蛋白，市售产品，购买自peprotech公司。
58.a83-01，tgf-β抑制剂，购买自tocris bioscience公司。
59.fgf10，成纤维细胞生长因子，购买自peprotech公司。
60.nicotinamide，烟酰胺，购买自sigma公司。
61.y-27632*，rock特异性通路阻断剂。购买自abmole bioscience公司。
62.wnt3a，wnt激动剂，细胞中激活tcf/lef-介导的转录的因子，购买自peprotech公司。
63.glutamax，市售细胞培养添加剂，购自：gibco公司。
64.n2，n2补充剂以100倍的液体浓缩液提供，其包含500μg/ml人转铁蛋白，500μg/ml
65.gastrin，胃泌素，购买自sigma公司。
66.tryple，用于解离贴壁哺乳动物细胞的重组消化酶，购买自gibco公司。
67.实施例1本发明的类器官培养以及扩大培养的方法
68.包括获取新鲜的膀胱组织细胞，胰酶消化为单细胞；体外3d培养条件培养膀胱组织类器官。
69.方法：
70.(1)取1-2个新鲜小鼠膀胱组织冰上剪碎；
71.(2)8ml消化液(1.5mg/ml胶原酶i和1mg/ml胶原酶iv 10um y27632)重悬剪碎的组织块(y27632可抑制细胞死亡，保持细胞在消化过程中的活性)；
72.(3)将消化液重悬的组织在37℃摇床，速度220rpm，消化50min，每隔10min吹打一次。使组织细胞充分分散开来；
73.(4)将消化好的组织液用100μm细胞筛网过滤细胞；
74.(5)过滤后，室温，1500rpm，5min离心处理去除上清液；
75.(6)加入3ml dmem/f12重悬，室温，1500rpm，5min离心，去除上清；
76.(7)细胞计数后，约每10000个细胞混合35μl matrigel，滴于48孔板孔的正中；
77.(8)转移至37℃5％co2的培养箱，凝固matrigel，凝固时间为20-30min；
78.(9)每孔加入180μl类器官培养基(培养基成分如表1)，在细胞培养箱中培养；
79.(10)每间隔2-3天更换一次培养基，培养出正常小鼠膀胱类器官。
80.(11)取培养7天左右的类器官，用tryple重悬消化类器官，转移至15ml离心管中，按48孔板的一个孔加2ml tryple计算，吹打10～20次直至基质胶完全碎裂，37℃水浴消化5min；
81.(12)从水浴锅中取出，再次吹打20～30次，37℃消化5min，之后进行第三次吹打(20～30次)。在显微镜下观察类器官时候消化成单个细胞。如果未成单个细胞，则可重复一次水浴和吹打，直至成为单个细胞。
82.(13)1500rpm，室温离心5min，去除上清液；
83.(14)细胞计数后，每5000个细胞加入30μl matrigel重悬，滴于48孔板孔中；
84.(15)转移至培养箱，凝固matrigel，凝固时间为20-30min；
85.(16)每孔加入180μl类器官培养基，在37℃，5％co2细胞培养箱中培养；
86.(17)每间隔2-3天更换一次培养基，培养出足够数量的小鼠膀胱类器官。
87.表1细胞培养基
88.b271％(v/v)n-acetylcysteine0.125mmegf50ng/mlnoggin50ng/mlr-spondin 1500ng/mla83-01200nmfgf10100ng/mlnicotinamide1mmy-2763210umwnt3a75ng/mlglutamax100
×
稀释n21％(v/v)青霉素10000units/ml链霉素10000ug/ml
89.实施例2基因编辑
90.本实施例的基因编辑包括基因敲除和基因过表达。
91.基因敲除为：将小鼠膀胱类器官运用crispr/cas9技术进行基因敲除。即，将sgrna载体和cas9表达载体包装成慢病毒，再将慢病毒转染类器官，培养，用t7e1酶验证基因敲除效果即可。crispr其中，crispr/cas9技术所使用的sgrna载体为plenti-sgrna-efs-mcherry(带有mcherry红色荧光报告基因)。
92.基因过表达为：使用过表达载体质粒在类器官中进行基因过表达，过表达载体中还含有表达荧光素酶的序列，当细胞转入该载体质粒时，细胞可表达荧光素酶，当该酶与其底物(荧光素)结合时，可检测到生物发光。通过rna测序结果分析基因的过表达情况。
93.涉及如下基因编辑组合：
94.组合a：trp53 rb1 pten cmyc kras，即使用crispr/cas9技术敲除trp53、rb1、pten基因，再过表达cmyc基因以及kras突变(g12d)基因。
95.组合b：trp53 cmyc，即使用crispr/cas9技术敲除trp53基因，再过表达cmyc基因。
96.将编辑后的小鼠膀胱类器官注射到小鼠膀胱，饲养100天，即可得到膀胱癌动物模型。
97.以下用实验例的形式对本发明的有益效果做进一步说明。
98.实验例1一种肌层浸润性膀胱癌模型的构建
99.1.方法
100.使用实施例1、2的方法依次进行类器官培养、传代、基因编辑(组合a)，并将所得基因编辑的类器官移植到小鼠膀胱，通过活体成像技术监测肿瘤的大小和位置，移植30天后，牺牲小鼠，对膀胱组织进行直接观察、he染色以及免疫组织化学(ihc)染色观察。
101.2.结果
102.2.1类器官培养
103.如图2所示，随着时间推移，单个膀胱细胞逐渐长成类器官。
104.2.2基因编辑鉴定
105.类器官基因编辑后的荧光检测结果如图3所示，可见类器官已经成功转染了基因编辑用的病毒。
106.基因编辑效果的检测如图5所示，可见基因编辑后的类器官的dna中，trp53、rb1和pten基因均能被t7e1内切酶切割出多条片段，表明基因编辑产生了dna突变，基因编辑成功。
107.kras
g12d
基因以及cmyc基因过表达也通过rna-seq测序检测到该细胞编辑后cmyc
基因相对于未处理组表达量增高，kras
g12d
表达量也相比对照组较高，说明成功过表达kras
g12d
基因以及cmyc基因(图5)。
108.2.3活体成像
109.移植一周后，进行荧光素活体成像，可发现小鼠膀胱部位有明显的荧光素酶信号，表明移植的类器官在膀胱存活并增殖(图4)。
110.2.4存活率观察
111.随着移植类器官时间的推移，小鼠在移植后30天内全部死亡，可以推定所有被移植小鼠均发展出肿瘤，并死于肿瘤(图6)；本发明的造模成功率高达100％。
112.2.5肿瘤观察
113.荧光显微镜检测显示，整个膀胱均呈现阳性信号(图7)，表明植入的细胞肿瘤细胞增殖至正个膀胱腔内并侵袭至肌肉层。
114.2.6组织切片观察
115.he染色如图8所示，膀胱被大量肿瘤细胞占位，且肿瘤细胞呈低分化癌,并侵及肌层近全层，是较为恶性的肌层浸润性尿路上皮癌。
116.免疫组化染色结果如图9所示，该肿瘤高表达ki67,ck5标志物，表明该肿瘤增殖能力较强，且来源于上皮细胞。
117.实验例2一种膀胱鳞癌模型的构建
118.1.方法
119.同实验例1，唯一不同的是，基因编辑组化选择实施例2的组合b，即敲除trp53，过表达cmyc。
120.2.结果
121.2.1基因编辑鉴定
122.发明人同样采用了crispr/cas9及过表达的方法对小鼠类器官类器官进行了基因编辑，sgrna连接于plenti-sgrna-efs-mcherry质粒(带有mcherry红色荧光报告基因)，且采用表达cas9蛋白的基因小鼠的膀胱进行类器官培养荧光检测结果如图10所示，可见类器官已经成功转染了基因编辑用的病毒。
123.基因编辑效果的检测如图11左图所示，可见基因编辑后的类器官的dna中，trp53能被切割出多条片段(中间的泳道)，表明基因编辑产生了dna突变，基因编辑成功。
124.2.2活体成像
125.移植一周后，进行荧光素活体成像，可发现小鼠膀胱部位有明显的荧光素酶信号，表明移植的类器官在膀胱存活并增殖(图11右图)。
126.2.3小鼠膀胱观察
127.荧光显微镜检测显示，整个膀胱均呈现阳性信号(图12)，表明植入的细胞侵袭整个膀胱。
128.he染色结果如图13所示，肿瘤细胞核深染，肿瘤细胞侵袭至膀胱全层及外膜，故其病理显示为尿路上皮癌伴鳞状分化，肿瘤类型为膀胱鳞癌。
129.实验例1和2的结果表明，本发明的方法能够有效构建原位原发膀胱癌动物模型。
130.实验例3体内药物效果测试
131.1.方法
132.使用膀胱癌一线化疗方案(吉西他滨 顺铂)治疗实验例1所得膀胱癌模型，具体给药时间如图14所示，图中gem ddp表示吉西他滨 顺铂给药，顺铂给药剂量为5mg/kg,每周给一次，吉西他滨给药剂量为100mg/kg,每周给药一次，方式为腹腔注射给药。
133.将基因编辑后的类器官原位注射到小鼠膀胱内，据评估荧光素酶表达的信号值评估小鼠的肿瘤大小，根据肿瘤大小进行分组给药，治疗期间每周进行活体成像监测肿瘤大小范围。
134.2.结果
135.如图15所示，结果：小鼠原位模型构建成功后，我们用目前的一线化疗方案对其治疗，治疗组小鼠较好的反映了给药过程中的化疗敏感及耐受复发的过程，其肿瘤大小先减小后增大，而对照组的肿瘤随时间不断增大。该膀胱癌小鼠模型较好的模拟了临床患者对一线化疗药物的治疗反应，可用于更多化疗问题的研究。
136.实验例4类器官培养基组分筛选实验
137.类器官中包括一个自我更新干细胞群，可分化为多个器官器官特异性的细胞类型，因此它可在体外长期传代培养；wnt通路激活有助于膀胱上皮基底细胞保持其干性，因此我们在其培养基中加入激活wnt通路的两个因子wnt3a及rspondin(即r-spondin 1)，以保持其细胞的干性，从而长期传代培养。
138.如图16，我们在初始时保证类器官的数量一致，在传代到p2时，两组细胞的数量出现了较大差异。加入wnt3a及rspondin组(添加剂同实施例1表1)的类器官生长到p2时状态非常好，而对照组(在实施例1表1的基础上不加wnt3a及rspondin)出现细胞凋亡现象且形成类器官数量明显减少。
139.综上，本发明的方法可高效率地制备得到更接近膀胱癌特征、符合临床研究需求的膀胱癌模型；该模型可以在探究膀胱癌发生发展机制、寻找和优化新的膀胱癌可能的治疗方式等研究领域提供有利工具。