一种适用于酶解艾草叶片组织的酶解液、艾草叶片组织原生质体的制备方法及其应用与流程

10g)、离析酶r-10(solarbio：m8190-1g)、果胶酶(solarbio：p8181-5g)、半纤维素酶(solarbio：9025-56-3)、甘露醇(翌圣：60327es76)、mes(sigma：m3671-50g)、kcl(sigma&p9541-500g)、cacl2(sigma： 93639-100g)、bsa(macs，130091376)。
14.本发明还提供了所述酶解液在单细胞转录组测序中的应用。
15.现有技术常用的叶片酶解液无法制备符合单细胞测序样本要求的艾草原生质体悬液，表现为活率低于30％、得率极低。本发明提供的一种适用于单细胞测序的艾草叶片原生质体制备方法中使用的酶解液a通过本发明中所描述的实验步骤可以分离得到活率大于85％、碎片率低于10％、结团率低于4％且得率很高的原生质体悬液。
16.本发明还提供了一种艾草叶片组织原生质体的制备方法，所述方法包括以下步骤：
17.步骤1、配置酶解液：分别配置酶解液a和yf缓冲液，并置于离心管中室温放置备用；
18.步骤2、样本预处理：将艾草叶片用无菌水冲洗后，切成细丝后放入盛有所述酶解液a 的培养皿中；
19.步骤3、酶解：将装有酶解液a和组织的培养皿置于恒温混匀仪后酶解，避光消化，吸取酶解液镜检，计算酶解得到的原生质体总数；
20.步骤4、过滤：将步骤3中的消化液用组装在离心管上的细胞筛网过滤；
21.步骤5、离心：将过滤液用水平转子离心，富集原生质体，弃去部分上清液，重悬沉淀，镜检计算原生质体总数；
22.步骤6、洗涤原生质体沉淀：用室温的yf缓冲液富集原生质体1-2次，弃去上清液后，用yf缓冲液重悬原生质体，得到所述艾草叶片组织原生质体。
23.其中，所述艾草叶片组织原生质体的纯度高：碎片率由35％降低至4％以下、得率由相同鲜重的组织由2100个提升至1
×
106个、活性由27％提升至90％。
24.本发明所述步骤6后还包括步骤7镜检原生质体活性：通过台盼蓝染色，显微镜下镜检计算存活原生质体比例、原生质体结团比例、碎片比例和原生质体浓度。
25.在一个优选的实施方式中，所述制备方法包括如下具体步骤：
26.步骤1、配置酶解液
27.步骤1.1、依照各自配方，分别配置酶解液a、yf缓冲液。
28.步骤1.2、配置完成后的酶解液a、yf溶液经过0.22μm滤膜过滤后分别置于50ml离心管中于室温放置备用。
29.其中，所述酶解液a和yf缓冲液分别使用，yf缓冲液的作用为洗涤原生质体并作为上机油包水缓冲液。
30.步骤2、样本预处理
31.步骤2.1、将艾草叶片从植株上取下，使用无菌水冲洗去除表面灰尘。
32.步骤2.2、将厨房用纸对折或滤纸平铺在20cm
×
20cm方皿中展平，湿水。
33.步骤2.3、将组织置于展平的厨房用纸或滤纸上，在镊子辅助下使用刀片将组织切成 0.5mm的细丝后转移至盛有5ml酶解液的35mm直径的培养皿中。
34.步骤2.4、每5ml酶解液a对应组织鲜重0.5(
±
0.01)g。
35.步骤3、酶解
36.步骤3.1、将装有酶解液a和组织的培养皿置于恒温混匀仪进行酶解4h，避光消化，至叶片组织完全散开。
37.步骤3.2、酶解液a处理时间为3～4h叶片会得到充分的酶解，结构会因此而完全散开。此时通过吸取部分酶解液镜检，计算酶解得到的原生质体总数。
38.步骤4、过滤
39.步骤4.1、将细胞筛网组装到50ml离心管上。
40.步骤4.2、使用5ml、宽口一次性滴管吸取“消化液”，尽可能少的吸到组织，逐滴滴加到筛网上，缓慢过滤。
41.步骤5、离心
42.步骤5.1、将过滤液转移至新的15ml离心管中。每管中液体不超过5ml，使用水平转子离心，富集原生质体。
43.步骤5.2、弃去部分离心上清液，保留1ml上清液重悬原生质体沉淀，吸取部分悬液镜检，计算原生质体总数。
44.步骤6、洗涤原生质体沉淀
45.步骤6.1、补加室温的yf溶液至5ml，使用水平转子离心，富集原生质体。
46.步骤6.2、移去6.1步骤上清液，补加室温的yf溶液至5ml，使用水平转子离心，富集原生质体。
47.步骤6.3、移去6.2步骤上清液，选用合适体积的yf溶液重悬原生质体。
48.步骤7、镜检原生质体活性。
49.通过台盼蓝染色，显微镜下镜检计算存活原生质体比例、原生质体结团比例、碎片比例和原生质体浓度。原生质体计数采用0.4％的台盼蓝与原生质体悬液按1:9混匀，用移液器吸取10μl加到血球计数板的加样孔中计数，显微镜观察计数区的原生质体个数。光镜下死亡原生质体会被染成蓝色，存活的原生质体不会被台盼蓝标记。
50.步骤1中，所述室温是20～25℃，优选地，为25℃。
51.步骤1中，所述50ml的离心管是指eppendorfproteintubes，编号为0030122240。
52.步骤1中，所述酶解液a中含有2％(m/v)纤维素酶r-10、0.4％(m/v)离析酶r-10、0.1～1％ (m/v)果胶酶、1～3％(m/v)半纤维素酶、0.45～0.55mol/l甘露醇、20mm 2-(n-吗啉基)乙磺酸 mes、20mm kcl、10mm cacl2、0.1％(v/v)bsa，溶解于超纯水中。
53.优选地，所述果胶酶的终浓度为1％(m/v)；
54.优选地，所述半纤维素酶的终浓度为3％(m/v)；
55.优选地，所述甘露醇的终浓度为0.55mol/l。
56.步骤1中，所述yf溶液中含有20mm 2-(n-吗啉基)乙磺酸mes、20mm kcl、0.1％(v/v)bsa、 0.5mol/l甘露醇、1～3％(m/v)聚乙烯吡咯烷酮pvp-40，溶于超纯水中。
57.优选地，所述聚乙烯吡咯烷酮pvp-40的终浓度为3％。
58.步骤2中，所述无菌水的冲洗次数为3～5次，优选地，为5次。
59.步骤2中，所述艾草叶片新鲜取材后，立刻进行冲洗、实验。
60.步骤3中，酶解温度为30～37℃，优选地，为37℃。
61.步骤3中，酶解转速为200～300rpm，优选地，为200rpm。
62.步骤3中，所述恒温混匀仪是指杭州瑞诚仪器有限公司，型号为tcs10。
63.步骤4中，所述细胞筛孔径为40μm。
64.步骤4中，所述15ml离心管为eppendorfproteintubes低吸附离心管，编号为 0030122216。
65.步骤4中，所述离心机条件：转速为660-740rpm、18～25℃离心6～7min，优选地，转速为740rpm、25℃离心7min。
66.步骤5中，所述镜检使用质量分数为0.4％台盼蓝(thermo fisher scientifc，t10282)进行，并将台盼蓝溶液与解离液按体积比1：9混匀；优选地，取1μl台盼蓝溶液与9μl解离液混匀，进行镜检。
67.步骤5中，所述离心机条件：转速为660-740rpm、18～25℃离心6～7min，优选地，转速为740rpm、25℃离心7min。
68.步骤6中，所述离心的目的是置换符合油包水微滴生成的离子环境以及去除游离的 mrna。以得到可以进行单细胞转录组测序的原生质体悬液。
69.步骤6中，所述离心机条件：所述离心机条件：转速为660-740rpm、18～25℃离心6～7min，优选地，转速为740rpm、25℃离心7min。
70.步骤6中，所述用于重悬原生质体的yf缓冲液的体积为300-500μl；优选地，为300 μl。
71.步骤7中，所述镜检使用质量分数为0.4％台盼蓝(thermo fisher scientifc，t10282)进行，并将台盼蓝溶液与解离液按体积比为1：9混匀；优选地，取1μl台盼蓝溶液与9μl解离液混匀，进行镜检。
72.本发明还提供了由上述方法制备得到的艾草叶片原生质体。
73.所述艾草叶片组织原生质体的纯度高：碎片率由35％降低至4％以下、得率由相同鲜重的组织由2100个提升至1
×
106个、活性由27％提升至90％。
74.本发明还提供了上述艾草叶片原生质体在单细胞转录组测序中的应用。
75.具体地，所述艾草叶片原生质体在单细胞转录组测序中的应用包括如下步骤：
76.步骤一、依照10x genomics公司说明书：chromium next gem single cell 3’reagent kitv3.1，cg000204rev c，进行单细胞转录组测序操作。
77.步骤二、使用qubit3.0测定cdna产量，使用cell ranger流程对样本测序结果进行质控并导出报告。
78.与现有技术相比，本发明取得的有益效果包括：(1)填补了目前的技术空白，目前尚缺少专门针对单细胞转录组测序的艾草叶片的制备方法，现有技术常用的叶片酶解液无法制备符合单细胞测序样本要求的艾草原生质体悬液，表现为活率低于30％、得率极低，本发明通过调整酶解液以及洗涤缓冲液的渗透势提高了原生质体的活率，通过改变酶解液的配方提高了原生质体的得率，因此，本发明提供的技术方案将有力促进单细胞转录组测序在艾草叶片中的应用；(2)本发明通过在洗涤缓冲液中加入保护rna的物质解决了现有技术制备得到的艾草原生质体无法生成油包水微滴进行单细胞转录组测序的问题；(3)提升了制备到的原生质体的各项质量指标，如纯度碎片率由35％降低至4％以下、得率由相同鲜重的组织由2100 个提升至1
×
106个、活性由27％提升至90％等。
附图说明
79.图1是本发明实施例1艾草叶片原生质体分离效果图。
80.图2是本发明实施例1艾草叶片原生质体分离后进行10x genomics平台单细胞转录组测序中的cdna质控结果。
81.图3是本发明实施例2艾草叶片原生质体分离效果图。
82.图4是本发明实施例2艾草叶片原生质体分离后进行10x genomics平台单细胞转录组测序中的cdna质控结果。
具体实施方式
83.结合以下具体实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明。实施本发明的过程、条件、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。
84.实施例1：
85.1溶液配置
86.1.1酶解液a、yf溶液：酶解液a中含有2％(m/v)纤维素酶r-10、0.4％(m/v)离析酶r-10、 0.1％(m/v)果胶酶、1％(m/v)半纤维素酶、0.45mol/l甘露醇、20mm 2-(n-吗啉基)乙磺酸mes、20mm kcl、10mm cacl2、0.1％(v/v)bsa，溶解于超纯水中。yf溶液中含有20mm 2-(n-吗啉基)乙磺酸mes、20mm kcl、0.1％(v/v)bsa、0.5mol/l甘露醇、1％(m/v)聚乙烯吡咯烷酮pvp-40，将上述成分溶于超纯水中。
87.1.2配置酶解液a、yf溶液经过0.22μm滤膜过滤后置于50ml离心管中于室温放置备用。
88.2样本预处理
89.2.1将艾草叶片从植株上取下，使用无菌水冲洗去除表面灰尘。
90.2.2将厨房用纸对折或滤纸平铺在20cm
×
20cm方皿中展平，湿水。
91.2.3将组织置于展平的厨房用纸或滤纸上，在镊子辅助下使用刀片将组织切成0.5mm的细丝后转移至盛有5ml酶解液的35mm直径的培养皿中。
92.2.4每5ml酶解液对应组织鲜重0.5(
±
0.01)g。
93.3酶解
94.3.1将装有酶解液和组织的培养皿置于恒温混匀仪进行酶解4h，避光消化，至叶片组织完全散开。
95.3.2酶解液处理时间为4h叶片会得到充分的酶解，结构会因此而完全散开。此时通过吸取部分酶解液镜检，计算酶解得到的原生质体总数。
96.4过滤
97.4.1将筛网组装到50ml离心管上。
98.4.2使用5ml、宽口一次性滴管吸取“消化液”，尽可能少的吸到组织，逐滴滴加到筛网上，缓慢过滤。
99.5离心
100.5.1将过滤液转移至新的15ml离心管中。每管中液体不超过5ml，使用水平转子离心，富集原生质体。
101.5.2弃去部分离心上清液，保留1ml上清液重悬原生质体沉淀，吸取部分悬液镜检，计算原生质体总数。
102.6洗涤原生质体沉淀
103.6.1补加室温的yf溶液至5ml，使用水平转子离心，富集原生质体。
104.6.2移去6.1步骤上清液，补加室温的yf溶液至5ml，使用水平转子离心，富集原生质体。
105.6.3移去6.2步骤上清液，选用合适体积的yf溶液重悬原生质体。
106.7镜检原生质体活性
107.通过台盼蓝染色，显微镜下镜检计算存活的原生质体比例、原生质体结团比例、碎片比例和原生质体浓度。原生质体计数采用0.4％的台盼蓝与原生质体悬液按1:9混匀，用移液器吸取10μl加到血球计数板的加样孔中计数，显微镜观察计数区的原生质体个数。光镜下死亡原生质体会被染成蓝色，存活的原生质体不会被台盼蓝标记。
108.8建库测序
109.8.1依照10x genomics公司说明书：chromiumnext gem single cell 3’reagent kit v3.1， cg000204rev c，进行单细胞转录组测序操作。
110.8.2使用qubit3.0测量cdna产量，使用cell ranger流程对样本测序结果进行质控并导出报告。
111.9结果及分析
112.结果显示，通过本发明技术方案，艾草叶片通过酶解液a酶解，原生质体通过台盼蓝进行染色、血球计数板计数，原生质体数量1.0
×
106个、存活原生质体比例90％、原生质体结团比例3％、碎片比例8％，均能达到10x genomics平台单细胞转录组测序对样本质量要求。单细胞转录组测序过程中质控指标均符合标准品指标，本发明技术方案取得了应有的技术效果。
113.表2是本发明实施例1艾草叶片原生质体分离后进行10x genomics平台单细胞转录组测序中的cell ranger质控结果。如表2所示经过初步质控，实验检测到的细胞数为12806个，基因中位值为2294，总检测基因数为19146，各项指标均通过初步质控。
114.表2
115.样本信息回收细胞数目基因中位值总检测基因数艾草-叶片12806个229419146
116.实施例2：
117.1溶液配置
118.1.1酶解液a、yf溶液：酶解液a中含有2％(m/v)纤维素酶r-10、0.4％(m/v)离析酶r-10、1％(m/v)果胶酶、3％(m/v)半纤维素酶、0.55mol/l甘露醇、20mm 2-(n-吗啉基)乙磺酸mes、20mm kcl、10mm cacl2、0.1％(v/v)bsa，溶解于超纯水中。yf溶液中含有20mm 2-(n-吗啉基)乙磺酸mes、20mm kcl、0.1％(v/v)bsa、0.5mol/l甘露醇、3％(m/v)聚乙烯吡咯烷酮pvp-40，将上述成分溶于超纯水中。
119.1.2配置酶解液a、yf溶液经过0.22μm滤膜过滤后置于50ml离心管中于室温放置备用。
120.2样本预处理
121.2.1将艾草叶片从植株上取下，使用无菌水冲洗去除表面灰尘。
122.2.2将厨房用纸对折或滤纸平铺在20cm
×
20cm方皿中展平，湿水。
123.2.3将组织置于展平的厨房用纸或滤纸上，在镊子辅助下使用刀片将组织切成0.5mm的细丝后转移至盛有5ml酶解液的35mm直径的培养皿中。
124.2.4每5ml酶解液对应组织鲜重0.5(
±
0.01)g。
125.3酶解
126.3.1将装有酶解液和组织的培养皿置于恒温混匀仪进行避光酶解消化，至叶片组织完全散开。
127.3.2酶解液处理时间为4h叶片会得到充分的酶解，结构会因此而完全散开。此时通过吸取部分酶解液镜检，计算酶解得到的原生质体总数。
128.4过滤
129.4.1将筛网组装到50ml离心管上。
130.4.2使用5ml、宽口一次性滴管吸取“消化液”，尽可能少的吸到组织，逐滴滴加到筛网上，缓慢过滤。
131.5离心
132.5.1将过滤液转移至新的15ml离心管中。每管中液体不超过5ml，使用水平转子离心，富集原生质体。
133.5.2弃去部分离心上清液，保留1ml上清液重悬原生质体沉淀，吸取部分悬液镜检，计算原生质体总数。
134.6洗涤原生质体沉淀
135.6.1补加室温的yf溶液至5ml，使用水平转子离心，富集原生质体。
136.6.2移去6.1步骤上清液，补加室温的yf溶液至5ml，使用水平转子离心，富集原生质体。
137.6.3移去6.2步骤上清液，选用合适体积的yf溶液重悬原生质体。
138.7镜检原生质体活性
139.通过台盼蓝染色，显微镜下镜检计算存活原生质体比例、原生质体结团比例、碎片比例和原生质体浓度。原生质体计数采用0.4％的台盼蓝与原生质体悬液按1:9混匀，用移液器吸取10μl加到血球计数板的加样孔中计数，显微镜观察计数区的原生质体个数。光镜下死亡原生质体会被染成蓝色，存活的原生质体不会被台盼蓝标记。
140.8建库测序
141.8.1依照10x genomics公司说明书：chromiumnext gem single cell 3’reagent kit v3.1， cg000204rev c，进行单细胞转录组测序操作。
142.8.2使用qubit3.0测量cdna产量，使用cell ranger流程对样本测序结果进行质控并导出报告。
143.9结果及分析
144.结果显示，通过本发明技术方案，艾草叶片通过酶解液a酶解，原生质体通过台盼蓝进行染色、血球计数板计数，原生质体数量1.2
×
106个、存活原生质体比例92％、原生质体结团比例2％、碎片比例6％均能达到10x genomics平台单细胞转录组测序对样本质量要求。单细胞转录组测序过程中质控指标均符合标准品指标，本发明技术方案取得了应有的
技术效果。
145.表3是实施例2艾草叶片原生质体分离后进行10x genomics平台单细胞转录组测序中的 cell ranger质控结果。如表3所示经过初步质控，实验检测到的细胞数为15755个，基因中位值为1902，总检测基因数为19112，各项指标均通过初步质控。
146.表3
147.样本信息回收细胞数目基因中位值总检测基因数艾草-叶片15755个190219112
148.对比实施例1：
149.本实施例采用《arabidopsis mesophyll protoplasts:a versatile cell system for transient gene expression analysis》提供的原生质体悬液制备方法制备拟南芥叶片原生质体
150.1溶液配置
151.1.1酶解液中含有2％(m/v)纤维素酶r-10、0.4％(m/v)离析酶r-10、0.4mol/l甘露醇、 20mm 2-(n-吗啉基)乙磺酸mes、20mm kcl、10mm cacl2、0.1％(v/v)bsa，溶解于超纯水中。
152.1.2配置酶解液经过0.22μm滤膜过滤后置于50ml离心管中于室温放置备用。
153.2样本预处理
154.2.1将拟南芥叶片从植株上取下，使用无菌水冲洗去除表面灰尘。
155.2.2将厨房用纸对折或滤纸平铺在20cm
×
20cm方皿中展平，湿水。
156.2.3将组织置于展平的厨房用纸或滤纸上，在镊子辅助下使用刀片将组织切成0.5mm的细丝后转移至盛有5ml酶解液的35mm直径的培养皿中。
157.2.4每5ml酶解液对应组织鲜重0.5(
±
0.01)g。
158.3酶解
159.3.1将装有酶解液和组织的培养皿置于恒温混匀仪进行避光酶解消化，至叶片组织完全散开。
160.3.2酶解液处理时间为4h叶片会得到充分的酶解，结构会因此而完全散开。此时通过吸取部分酶解液镜检，计算酶解得到的原生质体总数。
161.4过滤
162.4.1将筛网组装到50ml离心管上。
163.4.2使用5ml、宽口一次性滴管吸取“消化液”，尽可能少的吸到组织，逐滴滴加到筛网上，缓慢过滤。
164.5离心
165.5.1将过滤液转移至新的15ml离心管中。每管中液体不超过5ml，使用水平转子离心，富集原生质体。
166.5.2弃去部分离心上清液，保留1ml上清液重悬原生质体沉淀，吸取部分悬液镜检，计算原生质体总数。
167.6结果及分析
168.结果显示，拟南芥叶片通过酶解液酶解，原生质体通过台盼蓝进行染色、血球计数板计数，原生质体数量2
×
106个、存活原生质体比例90％、原生质体结团比例4％、碎片比例
8％，各项指标达到10x genomics平台单细胞转录组测序对样本质量要求。
169.对比实施例2：
170.本实施例采用《arabidopsis mesophyll protoplasts:a versatile cell system for transient geneexpression analysis》提供的原生质体悬液制备方法制备艾草叶片原生质体。
171.1溶液配置
172.1.1酶解液中含有2％(m/v)纤维素酶r-10、0.4％(m/v)离析酶r-10、0.4mol/l甘露醇、 20mm 2-(n-吗啉基)乙磺酸mes、20mm kcl、10mmcacl2、0.1％(v/v)bsa，溶解于超纯水中。
173.1.2配置酶解液经过0.22μm滤膜过滤后置于50ml离心管中于室温放置备用。
174.2样本预处理
175.2.1将艾草叶片从植株上取下，使用无菌水冲洗去除表面灰尘。
176.2.2将厨房用纸对折或滤纸平铺在20cm
×
20cm方皿中展平，湿水。
177.2.3将组织置于展平的厨房用纸或滤纸上，在镊子辅助下使用刀片将组织切成0.5mm的细丝后转移至盛有5ml酶解液的35mm直径的培养皿中。
178.2.4每5ml酶解液对应组织鲜重0.5(
±
0.01)g。
179.3酶解
180.3.1将装有酶解液和组织的培养皿置于恒温混匀仪进行避光酶解消化，至叶片组织完全散开。
181.3.2酶解液处理时间为4h叶片会得到充分的酶解，结构会因此而完全散开。此时通过吸取部分酶解液镜检，计算酶解得到的原生质体总数。
182.4过滤
183.4.1将筛网组装到50ml离心管上。
184.4.2使用5ml、宽口一次性滴管吸取“消化液”，尽可能少的吸到组织，逐滴滴加到筛网上，缓慢过滤。
185.5离心
186.5.1将过滤液转移至新的15ml离心管中。每管中液体不超过5ml，使用水平转子离心，富集原生质体。
187.5.2弃去部分离心上清液，保留1ml上清液重悬原生质体沉淀，吸取部分悬液镜检，计算原生质体总数。
188.6结果
189.结果显示，艾草叶片通过酶解液酶解，原生质体通过台盼蓝进行染色、血球计数板计数，原生质体数量2100个、存活原生质体比例27％、原生质体结团比例12％、碎片比例35％，无法达到10x genomics平台单细胞转录组测序对样本质量要求。
190.对比实施例3：
191.本实施例将酶解液中的甘露醇浓度调整至0.45m，其余组分见表1。
192.1溶液配置
193.1.1酶解液中含有2％(m/v)纤维素酶r-10、0.4％(m/v)离析酶r-10、0.45mol/l甘露醇、 20mm 2-(n-吗啉基)乙磺酸mes、20mm kcl、10mm cacl2、0.1％(v/v)bsa，溶解于超纯
水中。
194.1.2配置酶解液经过0.22μm滤膜过滤后置于50ml离心管中于室温放置备用。
195.2样本预处理
196.2.1将艾草叶片从植株上取下，使用无菌水冲洗去除表面灰尘。
197.2.2将厨房用纸对折或滤纸平铺在20cm
×
20cm方皿中展平，湿水。
198.2.3将组织置于展平的厨房用纸或滤纸上，在镊子辅助下使用刀片将组织切成0.5-1mm 的细丝后转移至盛有5ml酶解液的35mm直径的培养皿中。
199.2.4每5ml酶解液对应组织鲜重0.5(
±
0.01)g。
200.3酶解
201.3.1将装有酶解液和组织的培养皿置于恒温混匀仪进行酶解4h，避光消化，至叶片组织完全散开。
202.3.2酶解液处理时间为4h叶片会得到充分的酶解，结构会因此而完全散开。此时通过吸取部分酶解液镜检，计算酶解得到的原生质体总数。
203.4过滤
204.4.1将筛网组装到50ml离心管上。
205.4.2使用5ml、宽口一次性滴管吸取“消化液”，尽可能少的吸到组织，逐滴滴加到筛网上，缓慢过滤。
206.5离心
207.5.1将过滤液转移至新的15ml离心管中。每管中液体不超过5ml，使用水平转子离心，富集原生质体。
208.5.2弃去部分离心上清液，保留1ml上清液重悬原生质体沉淀，吸取部分悬液镜检，计算原生质体总数。
209.6结果及分析
210.结果显示，艾草叶片通过酶解液酶解，原生质体通过台盼蓝进行染色、血球计数板计数，原生质体数量1.0
×
104个、存活原生质体比例85％、原生质体结团比例13％、碎片比例10％, 原生质体数量无法达到10x genomics平台单细胞转录组测序对样本质量要求。
211.对比实施例4：
212.本实施例将酶解液中的甘露醇浓度调整至0.55m。
213.1溶液配置
214.1.1酶解液中含有2％(m/v)纤维素酶r-10、0.4％(m/v)离析酶r-10、0.55mol/l甘露醇、 20mm 2-(n-吗啉基)乙磺酸mes、20mm kcl、10mm cacl2、0.1％(v/v)bsa，溶解于超纯水中。
215.1.2配置酶解液经过0.22μm滤膜过滤后置于50ml离心管中于室温放置备用。
216.2样本预处理
217.2.1将艾草叶片从植株上取下，使用无菌水冲洗去除表面灰尘。
218.2.2将厨房用纸对折或滤纸平铺在20cm
×
20cm方皿中展平，湿水。
219.2.3将组织置于展平的厨房用纸或滤纸上，在镊子辅助下使用刀片将组织切成0.5-1mm 的细丝后转移至盛有5ml酶解液的35mm直径的培养皿中。
220.2.4每5ml酶解液对应组织鲜重0.5(
±
0.01)g。
221.3酶解
222.3.1将装有酶解液和组织的培养皿置于恒温混匀仪进行酶解4h，避光消化，至叶片组织完全散开。
223.3.2酶解液处理时间为4h叶片会得到充分的酶解，结构会因此而完全散开。此时通过吸取部分酶解液镜检，计算酶解得到的原生质体总数。
224.4过滤
225.4.1将筛网组装到50ml离心管上。
226.4.2使用5ml、宽口一次性滴管吸取“消化液”，尽可能少的吸到组织，逐滴滴加到筛网上，缓慢过滤。
227.5离心
228.5.1将过滤液转移至新的15ml离心管中。每管中液体不超过5ml，使用水平转子离心，富集原生质体。
229.5.2弃去部分离心上清液，保留1ml上清液重悬原生质体沉淀，吸取部分悬液镜检，计算原生质体总数。
230.6结果及分析
231.结果显示，艾草叶片通过酶解液酶解，原生质体通过台盼蓝进行染色、血球计数板计数，原生质体数量1.1
×
104个、存活原生质体比例90％、原生质体结团比例12％、碎片比例5％，原生质体数量无法达到10x genomics平台单细胞转录组测序对样本质量要求。
232.对比实施例5：
233.本实施例将酶解液中的甘露醇浓度调整至0.6m。
234.1溶液配置
235.1.1酶解液中含有2％(m/v)纤维素酶r-10、0.4％(m/v)离析酶r-10、0.6mol/l甘露醇、 20mm 2-(n-吗啉基)乙磺酸mes、20mm kcl、10mmcacl2、0.1％(v/v)bsa，溶解于超纯水中。
236.1.2配置酶解液经过0.22μm滤膜过滤后置于50ml离心管中于室温放置备用。
237.2样本预处理
238.2.1将艾草叶片从植株上取下，使用无菌水冲洗去除表面灰尘。
239.2.2将厨房用纸对折或滤纸平铺在20cm
×
20cm方皿中展平，湿水。
240.2.3将组织置于展平的厨房用纸或滤纸上，在镊子辅助下使用刀片将组织切成0.5-1mm 的细丝后转移至盛有5ml酶解液的35mm直径的培养皿中。
241.2.4每5ml酶解液对应组织鲜重0.5(
±
0.01)g。
242.3酶解
243.3.1将装有酶解液和组织的培养皿置于恒温混匀仪进行酶解4h，避光消化，至叶片组织完全散开。
244.3.2酶解液处理时间为4h叶片会得到充分的酶解，结构会因此而完全散开。此时通过吸取部分酶解液镜检，计算酶解得到的原生质体总数。
245.4过滤
246.4.1将筛网组装到50ml离心管上。
247.4.2使用5ml、宽口一次性滴管吸取“消化液”，尽可能少的吸到组织，逐滴滴加到筛
网上，缓慢过滤。
248.5离心
249.5.1将过滤液转移至新的15ml离心管中。每管中液体不超过5ml，使用水平转子离心，富集原生质体。
250.5.2弃去部分离心上清液，保留1ml上清液重悬原生质体沉淀，吸取部分悬液镜检，计算原生质体总数。
251.6结果及分析
252.结果显示，艾草叶片通过酶解液酶解，原生质体通过台盼蓝进行染色、血球计数板计数，原生质体数量9100个、存活原生质体比例78％、原生质体结团比例13％、碎片比例17％，原生质体数量无法达到10x genomics平台单细胞转录组测序对样本质量要求。
253.对比实施例6：
254.本实施例在酶解液中添加1％果胶酶。
255.1溶液配置
256.1.1酶解液中含有2％(m/v)纤维素酶r-10、0.4％(m/v)离析酶r-10、0.55mol/l甘露醇、 20mm 2-(n-吗啉基)乙磺酸mes、20mm kcl、10mm cacl2、1％(m/v)果胶酶、0.1％(v/v)bsa，溶解于超纯水中。
257.1.2配置酶解液经过0.22μm滤膜过滤后置于50ml离心管中于室温放置备用。
258.2样本预处理
259.2.1将艾草叶片从植株上取下，使用无菌水冲洗去除表面灰尘。
260.2.2将厨房用纸对折或滤纸平铺在20cm
×
20cm方皿中展平，湿水。
261.2.3将组织置于展平的厨房用纸或滤纸上，在镊子辅助下使用刀片将组织切成0.5-1mm 的细丝后转移至盛有5ml酶解液的35mm直径的培养皿中。
262.2.4每5ml酶解液对应组织鲜重0.5(
±
0.01)g。
263.3酶解
264.3.1将装有酶解液和组织的培养皿置于恒温混匀仪进行避光酶解消化，至叶片组织完全散开。
265.3.2酶解液处理时间为4h叶片会得到充分的酶解，结构会因此而完全散开。此时通过吸取部分酶解液镜检，计算酶解得到的原生质体总数。
266.4过滤
267.4.1将筛网组装到50ml离心管上。
268.4.2使用5ml、宽口一次性滴管吸取“消化液”，尽可能少的吸到组织，逐滴滴加到筛网上，缓慢过滤。
269.5离心
270.5.1将过滤液转移至新的15ml离心管中。每管中液体不超过5ml，使用水平转子离心，富集原生质体。
271.5.2弃去部分离心上清液，保留1ml上清液重悬原生质体沉淀，吸取部分悬液镜检，计算原生质体总数。
272.6结果及分析
273.结果显示，艾草叶片通过酶解液酶解，原生质体通过台盼蓝进行染色、血球计数板
计数，原生质体数量3
×
105个、存活原生质体比例87％、原生质体结团比例10％、碎片比例8％，继续10x genomics平台单细胞转录组测序存在风险。
274.对比实施例7:
275.本实施例在酶解液中添加3％半纤维素酶。
276.1溶液配置
277.1.1酶解液中含有2％(m/v)纤维素酶r-10、0.4％(m/v)离析酶r-10、3％半纤维素酶、 0.55mol/l甘露醇、20mm 2-(n-吗啉基)乙磺酸mes、20mm kcl、10mm cacl2、0.1％(v/v)bsa，溶解于超纯水中。
278.1.2配置酶解液经过0.22μm滤膜过滤后置于50ml离心管中于室温放置备用。
279.2样本预处理
280.2.1将艾草叶片从植株上取下，使用无菌水冲洗去除表面灰尘。
281.2.2将厨房用纸对折或滤纸平铺在20cm
×
20cm方皿中展平，湿水。
282.2.3将组织置于展平的厨房用纸或滤纸上，在镊子辅助下使用刀片将组织切成0.5-1mm 的细丝后转移至盛有5ml酶解液的35mm直径的培养皿中。
283.2.4每5ml酶解液对应组织鲜重0.5(
±
0.01)g。
284.3酶解
285.3.1将装有酶解液和组织的培养皿置于恒温混匀仪进行酶解4h，避光消化，至叶片组织完全散开。
286.3.2酶解液处理时间为4h叶片会得到充分的酶解，结构会因此而完全散开。此时通过吸取部分酶解液镜检，计算酶解得到的原生质体总数。
287.4过滤
288.4.1将筛网组装到50ml离心管上。
289.4.2使用5ml、宽口一次性滴管吸取“消化液”，尽可能少的吸到组织，逐滴滴加到筛网上，缓慢过滤。
290.5离心
291.5.1将过滤液转移至新的15ml离心管中。每管中液体不超过5ml，使用水平转子离心，富集原生质体。
292.5.2弃去部分离心上清液，保留1ml上清液重悬原生质体沉淀，吸取部分悬液镜检，计算原生质体总数。
293.6结果及分析
294.结果显示，艾草叶片通过酶解液酶解，原生质体通过台盼蓝进行染色、血球计数板计数，原生质体数量5
×
105个、存活原生质体比例88％、原生质体结团比例10％、碎片比例6％，继续10x genomics平台单细胞转录组测序存在风险。
295.对比实施例8:
296.本实施例在酶解液中添加2％(m/v)蜗牛酶。
297.1溶液配置
298.1.1酶解液中含有2％(m/v)纤维素酶r-10、0.4％(m/v)离析酶r-10、2％(m/v)蜗牛酶、 0.55mol/l甘露醇、20mm 2-(n-吗啉基)乙磺酸mes、20mm kcl、10mm cacl2、0.1％(v/v)bsa，溶解于超纯水中。
299.1.2配置酶解液经过0.22μm滤膜过滤后置于50ml离心管中于室温放置备用。
300.2样本预处理
301.2.1将艾草叶片从植株上取下，使用无菌水冲洗去除表面灰尘。
302.2.2将厨房用纸对折或滤纸平铺在20cm
×
20cm方皿中展平，湿水。
303.2.3将组织置于展平的厨房用纸或滤纸上，在镊子辅助下使用刀片将组织切成0.5mm的细丝后转移至盛有5ml酶解液的35mm直径的培养皿中。
304.2.4每5ml酶解液对应组织鲜重0.5(
±
0.01)g。
305.3酶解
306.3.1将装有酶解液和组织的培养皿置于恒温混匀仪进行酶解4h，避光消化，至叶片组织完全散开。
307.3.2酶解液处理时间为4h叶片会得到充分的酶解，结构会因此而完全散开。此时通过吸取部分酶解液镜检，计算酶解得到的原生质体总数。
308.4过滤
309.4.1将筛网组装到50ml离心管上。
310.4.2使用5ml、宽口一次性滴管吸取“消化液”，尽可能少的吸到组织，逐滴滴加到筛网上，缓慢过滤。
311.5离心
312.5.1将过滤液转移至新的15ml离心管中。每管中液体不超过5ml，使用水平转子离心，富集原生质体。
313.5.2弃去部分离心上清液，保留1ml上清液重悬原生质体沉淀，吸取部分悬液镜检，计算原生质体总数。
314.6结果及分析
315.结果显示，艾草叶片通过酶解液酶解，原生质体通过台盼蓝进行染色、血球计数板计数，原生质体数量2.3
×
104个、存活原生质体比例86％、原生质体结团比例14％、碎片比例9％，原生质体数量无法继续10x genomics平台单细胞转录组测序实验。
316.对比实施例9:
317.本实施例在酶解液中添加0.4％(m/v)崩溃酶。
318.1溶液配置
319.1.1酶解液中含有2％(m/v)纤维素酶r-10、0.4％(m/v)离析酶r-10、0.4％(m/v)崩溃酶、 0.55mol/l甘露醇、20mm 2-(n-吗啉基)乙磺酸mes、20mm kcl、10mm cacl2、0.1％(v/v)bsa，溶解于超纯水中。
320.1.2配置酶解液经过0.22μm滤膜过滤后置于50ml离心管中于室温放置备用。
321.2样本预处理
322.2.1将艾草叶片从植株上取下，使用无菌水冲洗去除表面灰尘。
323.2.2将厨房用纸对折或滤纸平铺在20cm
×
20cm方皿中展平，湿水。
324.2.3将组织置于展平的厨房用纸或滤纸上，在镊子辅助下使用刀片将组织切成0.5-1mm 的细丝后转移至盛有5ml酶解液的35mm直径的培养皿中。
325.2.4每5ml酶解液对应组织鲜重0.5(
±
0.01)g。
326.3酶解
327.3.1将装有酶解液和组织的培养皿置于恒温混匀仪进行酶解4h，避光消化，至叶片组织完全散开。
328.3.2酶解液处理时间为4h叶片会得到充分的酶解，结构会因此而完全散开。此时通过吸取部分酶解液镜检，计算酶解得到的原生质体总数。
329.4过滤
330.4.1将筛网组装到50ml离心管上。
331.4.2使用5ml、宽口一次性滴管吸取“消化液”，尽可能少的吸到组织，逐滴滴加到筛网上，缓慢过滤。
332.5离心
333.5.1将过滤液转移至新的15ml离心管中。每管中液体不超过5ml，使用水平转子离心，富集原生质体。
334.5.2弃去部分离心上清液，保留1ml上清液重悬原生质体沉淀，吸取部分悬液镜检，计算原生质体总数。
335.6结果及分析
336.结果显示，艾草叶片通过酶解液酶解，原生质体通过台盼蓝进行染色、血球计数板计数，原生质体数量1.5
×
104个、存活原生质体比例87％、原生质体结团比例13％、碎片比例8％，原生质体数量不足以继续开展10x genomics平台单细胞转录组测序实验。
337.对比实施例10：
338.本实施例在酶解液中添加1％(m/v)果胶酶、3％(m/v)半纤维素酶。
339.1溶液配置
340.1.1酶解液中含有2％(m/v)纤维素酶r-10、0.4％(m/v)离析酶r-10、1％(m/v)果胶酶、 3％(m/v)半纤维素酶、0.55mol/l甘露醇、20mm 2-(n-吗啉基)乙磺酸mes、20mm kcl、10mmcacl2、0.1％(v/v)bsa，溶解于超纯水中。
341.1.2配置酶解液经过0.22μm滤膜过滤后置于50ml离心管中于室温放置备用。
342.2样本预处理
343.2.1将艾草叶片从植株上取下，使用无菌水冲洗去除表面灰尘。
344.2.2将厨房用纸对折或滤纸平铺在20cm
×
20cm方皿中展平，湿水。
345.2.3将组织置于展平的厨房用纸或滤纸上，在镊子辅助下使用刀片将组织切成0.5-1mm 的细丝后转移至盛有5ml酶解液的35mm直径的培养皿中。
346.2.4每5ml酶解液对应组织鲜重0.5(
±
0.01)g。
347.3酶解
348.3.1将装有酶解液和组织的培养皿置于恒温混匀仪进行避光酶解消化，至叶片组织完全散开。
349.3.2酶解液处理时间为4h叶片会得到充分的酶解，结构会因此而完全散开。此时通过吸取部分酶解液镜检，计算酶解得到的原生质体总数。
350.4过滤
351.4.1将筛网组装到50ml离心管上。
352.4.2使用5ml、宽口一次性滴管吸取“消化液”，尽可能少的吸到组织，逐滴滴加到筛网上，缓慢过滤。
353.5离心
354.5.1将过滤液转移至新的15ml离心管中。每管中液体不超过5ml，使用水平转子离心，富集原生质体。
355.5.2弃去部分离心上清液，保留1ml上清液重悬原生质体沉淀，吸取部分悬液镜检，计算原生质体总数。
356.6结果
357.结果显示，艾草叶片通过酶解液酶解，原生质体通过台盼蓝进行染色、血球计数板计数，原生质体数量1.1
×
106个、存活原生质体比例91％、原生质体结团比例2％、碎片比例7％，满足10x genomics平台单细胞转录组测序对样本质量的要求。
358.对比实施例11：
359.本实施例将酶解液a中的果胶酶浓度调整至0.05％(m/v)、半纤维素酶浓度调整至 0.5％(m/v)。
360.1溶液配置
361.1.1酶解液中含有2％(m/v)纤维素酶r-10、0.4％(m/v)离析酶r-10、0.05％(m/v)果胶酶、 0.5％(m/v)半纤维素酶、0.55mol/l甘露醇、20mm 2-(n-吗啉基)乙磺酸mes、20mm kcl、10mm cacl2、0.1％(v/v)bsa，溶解于超纯水中。
362.1.2配置酶解液经过0.22μm滤膜过滤后置于50ml离心管中于室温放置备用。
363.2样本预处理
364.2.1将艾草叶片从植株上取下，使用无菌水冲洗去除表面灰尘。
365.2.2将厨房用纸对折或滤纸平铺在20cm
×
20cm方皿中展平，湿水。
366.2.3将组织置于展平的厨房用纸或滤纸上，在镊子辅助下使用刀片将组织切成0.5mm的细丝后转移至盛有5ml酶解液的35mm直径的培养皿中。
367.2.4每5ml酶解液对应组织鲜重0.5(
±
0.01)g。
368.3酶解
369.3.1将装有酶解液和组织的培养皿置于恒温混匀仪进行酶解4h，避光消化，至叶片组织完全散开。
370.3.2酶解液处理时间为4h叶片会得到充分的酶解，结构会因此而完全散开。此时通过吸取部分酶解液镜检，计算酶解得到的原生质体总数。
371.4过滤
372.4.1将筛网组装到50ml离心管上。
373.4.2使用5ml、宽口一次性滴管吸取“消化液”，尽可能少的吸到组织，逐滴滴加到筛网上，缓慢过滤。
374.5离心
375.5.1将过滤液转移至新的15ml离心管中。每管中液体不超过5ml，使用水平转子离心，富集原生质体。
376.5.2弃去部分离心上清液，保留1ml上清液重悬原生质体沉淀，吸取部分悬液镜检，计算原生质体总数。
377.6结果
378.结果显示，艾草叶片通过酶解液酶解，原生质体通过台盼蓝进行染色、血球计数板
吗啉基)乙磺酸mes、0.5m甘露醇、20mm kcl，将上述成分溶于超纯水中。
404.1.2配置酶解液a、wi溶液经过0.22μm滤膜过滤后置于50ml离心管中于室温放置备用。
405.2样本预处理
406.2.1将艾草叶片从植株上取下，使用无菌水冲洗去除表面灰尘。
407.2.2将厨房用纸对折或滤纸平铺在20cm
×
20cm方皿中展平，湿水。
408.2.3将组织置于展平的厨房用纸或滤纸上，在镊子辅助下使用刀片将组织切成0.5-1mm 的细丝后转移至盛有5ml酶解液的35mm直径的培养皿中。
409.2.4每5ml酶解液对应组织鲜重0.5(
±
0.01)g。
410.3酶解
411.3.1将装有酶解液和组织的培养皿置于恒温混匀仪进行酶解4h，避光消化，至叶片组织完全散开。
412.3.2酶解液处理时间为4h叶片会得到充分的酶解，结构会因此而完全散开。此时通过吸取部分酶解液镜检，计算酶解得到的原生质体总数。
413.4过滤
414.4.1将筛网组装到50ml离心管上。
415.4.2使用5ml、宽口一次性滴管吸取“消化液”，尽可能少的吸到组织，逐滴滴加到筛网上，缓慢过滤。
416.5离心
417.5.1将过滤液转移至新的15ml离心管中。每管中液体不超过5ml，使用水平转子离心，富集原生质体。
418.5.2弃去部分离心上清液，保留1ml上清液重悬原生质体沉淀，吸取部分悬液镜检，计算原生质体总数。
419.6洗涤原生质体沉淀
420.6.1补加室温的wi溶液至5ml，使用水平转子离心，富集原生质体。
421.6.2移去6.1步骤上清液，补加室温的wi溶液至5ml，使用水平转子离心，富集原生质体。
422.6.3移去6.2步骤上清液，选用合适体积的wi溶液重悬原生质体。
423.7镜检原生质体活性。
424.通过台盼蓝染色，显微镜下镜检计算存活原生质体比例、原生质体结团比例、碎片比例和原生质体浓度。原生质体计数采用0.4％的台盼蓝与原生质体悬液按1:9混匀，用移液器吸取10μl加到血球计数板的加样孔中计数，显微镜观察计数区的原生质体个数。光镜下死亡原生质体会被染成蓝色，存活的原生质体不会被台盼蓝标记。
425.8结果及分析
426.结果显示，艾草叶片通过酶解液酶解，原生质体通过台盼蓝进行染色、血球计数板计数，原生质体数量9
×
104个、存活原生质体比例88％、原生质体结团比例3％、碎片比例7％，原生质体数量无法达到10x genomics平台单细胞转录组测序对样本质量要求。
427.对比实施例14：
428.本实施例使用w5溶液洗涤原生质体，其余组分见表1，操作步骤与本发明实施例2
一致。
429.1溶液配置
430.1.1酶解液a、w5溶液：酶解液a中含有2％(m/v)纤维素酶r-10、0.4％(m/v)离析酶 r-10、1％(m/v)果胶酶、3％(m/v)半纤维素酶、0.55mol/l甘露醇、20mm 2-(n-吗啉基)乙磺酸mes、20mm kcl、10mm cacl2、0.1％(v/v)bsa，溶解于超纯水中。w5 溶液中含有154mm nacl、125mm cacl2、5mm kcl、2mm 2-(n-吗啉基)乙磺酸mes 将上述成分溶于超纯水。
431.1.2配置酶解液a、w5溶液经过0.22μm滤膜过滤后置于50ml离心管中于室温放置备用。
432.2样本预处理
433.2.1将艾草叶片从植株上取下，使用无菌水冲洗去除表面灰尘。
434.2.2将厨房用纸对折或滤纸平铺在20cm
×
20cm方皿中展平，湿水。
435.2.3将组织置于展平的厨房用纸或滤纸上，在镊子辅助下使用刀片将组织切成0.5-1mm 的细丝后转移至盛有5ml酶解液的35mm直径的培养皿中。
436.2.4每5ml酶解液对应组织鲜重0.5(
±
0.01)g。
437.3酶解
438.3.1将装有酶解液和组织的培养皿置于恒温混匀仪进行酶解4h，避光消化，至叶片组织完全散开。
439.3.2酶解液处理时间为4h叶片会得到充分的酶解，结构会因此而完全散开。此时通过吸取部分酶解液镜检，计算酶解得到的原生质体总数。
440.4过滤
441.4.1将筛网组装到50ml离心管上。
442.4.2使用5ml、宽口一次性滴管吸取“消化液”，尽可能少的吸到组织，逐滴滴加到筛网上，缓慢过滤。
443.5离心
444.5.1将过滤液转移至新的15ml离心管中。每管中液体不超过5ml，使用水平转子离心，富集原生质体。
445.5.2弃去部分离心上清液，保留1ml上清液重悬原生质体沉淀，吸取部分悬液镜检，计算原生质体总数。
446.6洗涤原生质体沉淀
447.6.1补加室温的w5溶液至5ml，使用水平转子离心，富集原生质体。
448.7镜检原生质体活性
449.7.1根据步骤5中计算的原生质体数量，选用合适体积的w5溶液重悬原生质体。
450.7.2通过fda染色，显微镜下镜检计算存活原生质体比例、原生质体结团比例、碎片比例和原生质体浓度。原生质体计数采用5μg/ml二乙酸荧光素fda染色，用移液器吸取10μl加到血球计数板的加样孔中计数，荧光显微镜观察计数区的原生质体个数。紫外激发光下存活原生质体会被染成绿色，死亡的原生质体不会被fda标记。
451.8结果及分析
452.结果显示，艾草叶片通过酶解液酶解，原生质体通过二乙酸荧光素fda进行染色、血球计数板计数，原生质体数量1.3
×
106个、存活原生质体比例90％、原生质体结团比例
2％、碎片比例7％，各项指标达到10x genomics平台单细胞转录组测序对样本质量要求。但溶液中含有远远超过5mm ca
2
，因此无法使用该缓冲液进行后续实验。
453.对比实施例15：
454.本实施例使用yf_01溶液洗涤原生质体。
455.1溶液配置
456.1.1酶解液a、yf_01溶液：酶解液a中含有2％(m/v)纤维素酶r-10、0.4％(m/v)离析酶r-10、1％(m/v)果胶酶、3％(m/v)半纤维素酶、0.55mol/l甘露醇、20mm 2-(n-吗啉基)乙磺酸mes、20mm kcl、10mm cacl2、0.1％(v/v)bsa，溶解于超纯水中。 yf_01溶液中含有20mm 2-(n-吗啉基)乙磺酸mes、0.5m甘露醇、20mm kcl，将上述成分溶于超纯水中。
457.1.2配置酶解液a、yf_01溶液经过0.22μm滤膜过滤后置于50ml离心管中于室温放置备用。
458.2样本预处理
459.2.1将艾草叶片从植株上取下，使用无菌水冲洗去除表面灰尘。
460.2.2将厨房用纸对折或滤纸平铺在20cm
×
20cm方皿中展平，湿水。
461.2.3将组织置于展平的厨房用纸或滤纸上，在镊子辅助下使用刀片将组织切成0.5-1mm 的细丝后转移至盛有5ml酶解液的35mm直径的培养皿中。
462.2.4每5ml酶解液对应组织鲜重0.5(
±
0.01)g。
463.3酶解
464.3.1将装有酶解液和组织的培养皿置于恒温混匀仪进行酶解4h，避光消化，至叶片组织完全散开。
465.3.2酶解液处理时间为4h叶片会得到充分的酶解，结构会因此而完全散开。此时通过吸取部分酶解液镜检，计算酶解得到的原生质体总数。
466.4过滤
467.4.1将筛网组装到50ml离心管上。
468.4.2使用5ml、宽口一次性滴管吸取“消化液”，尽可能少的吸到组织，逐滴滴加到筛网上，缓慢过滤。
469.5离心
470.5.1将过滤液转移至新的15ml离心管中。每管中液体不超过5ml，使用水平转子离心，富集原生质体。
471.5.2弃去部分离心上清液，保留1ml上清液重悬原生质体沉淀，吸取部分悬液镜检，计算原生质体总数。
472.6洗涤原生质体沉淀
473.6.1补加室温的yf_01溶液至5ml，使用水平转子离心，富集原生质体。
474.6.2移去6.1步骤上清液，补加室温的yf_01溶液至5ml，使用水平转子离心，富集原生质体。
475.6.3移去6.2步骤上清液，选用合适体积的yf_01溶液重悬原生质体。
476.7镜检原生质体活性。
477.通过台盼蓝染色，显微镜下镜检计算存活原生质体比例、原生质体结团比例、碎片比例和原生质体浓度。原生质体计数采用0.4％的台盼蓝与原生质体悬液按1:9混匀，用移
液器吸取10μl加到血球计数板的加样孔中计数，显微镜观察计数区的原生质体个数。光镜下死亡原生质体会被染成蓝色，存活的原生质体不会被台盼蓝标记。
478.8结果及分析
479.结果显示，艾草叶片通过酶解液酶解，原生质体通过台盼蓝进行染色、血球计数板计数，原生质体数量5
×
105个、存活原生质体比例89％、原生质体结团比例3％、碎片比例6％，达到10x genomics平台单细胞转录组测序对样本质量要求。
480.对比实施例16：
481.本实施例使用yf_02溶液洗涤原生质体。
482.1溶液配置
483.1.1酶解液a、yf_02溶液：酶解液a中含有2％(m/v)纤维素酶r-10、0.4％(m/v)离析酶r-10、1％(m/v)果胶酶、3％(m/v)半纤维素酶、0.55mol/l甘露醇、20mm 2-(n-吗啉基)乙磺酸mes、20mm kcl、10mm cacl2、0.1％(v/v)bsa，溶解于超纯水中。 yf_02溶液中含有4mm 2-(n-吗啉基)乙磺酸mes、0.5m甘露醇、40mm kcl，将上述成分溶于超纯水中。
484.1.2配置酶解液a、yf_02溶液经过0.22μm滤膜过滤后置于50ml离心管中于室温放置备用。
485.2样本预处理
486.2.1将艾草叶片从植株上取下，使用无菌水冲洗去除表面灰尘。
487.2.2将厨房用纸对折或滤纸平铺在20cm
×
20cm方皿中展平，湿水。
488.2.3将组织置于展平的厨房用纸或滤纸上，在镊子辅助下使用刀片将组织切成0.5mm的细丝后转移至盛有5ml酶解液的35mm直径的培养皿中。
489.2.4每5ml酶解液对应组织鲜重0.5(
±
0.01)g。
490.3酶解
491.3.1将装有酶解液和组织的培养皿置于恒温混匀仪进行酶解4h，避光消化，至叶片组织完全散开。
492.3.2酶解液处理时间为4h叶片会得到充分的酶解，结构会因此而完全散开。此时通过吸取部分酶解液镜检，计算酶解得到的原生质体总数。
493.4过滤
494.4.1将筛网组装到50ml离心管上。
495.4.2使用5ml、宽口一次性滴管吸取“消化液”，尽可能少的吸到组织，逐滴滴加到筛网上，缓慢过滤。
496.5离心
497.5.1将过滤液转移至新的15ml离心管中。每管中液体不超过5ml，使用水平转子离心，富集原生质体。
498.5.2弃去部分离心上清液，保留1ml上清液重悬原生质体沉淀，吸取部分悬液镜检，计算原生质体总数。
499.6洗涤原生质体沉淀
500.6.1补加室温的yf_02溶液至5ml，使用水平转子离心，富集原生质体。
501.6.2移去6.1步骤上清液，补加室温的yf_02溶液至5ml，使用水平转子离心，富集原生质体。
502.6.3移去6.2步骤上清液，选用合适体积的yf_02溶液重悬原生质体。
503.7镜检原生质体活性。
504.通过台盼蓝染色，显微镜下镜检计算存活原生质体比例、原生质体结团比例、碎片比例和原生质体浓度。原生质体计数采用0.4％的台盼蓝与原生质体悬液按1:9混匀，用移液器吸取10μl加到血球计数板的加样孔中计数，显微镜观察计数区的原生质体个数。光镜下死亡原生质体会被染成蓝色，存活的原生质体不会被台盼蓝标记。
505.8结果及分析
506.结果显示，艾草叶片通过酶解液酶解，原生质体通过台盼蓝进行染色、血球计数板计数，原生质体数量1
×
105个、存活原生质体比例80％、原生质体结团比例3％、碎片比例13％，继续10x genomics平台单细胞转录组测序存在风险。
507.对比实施例17：
508.本实施例使用wi溶液洗涤原生质体，离心力为1050rpm。
509.1溶液配置
510.1.1酶解液a、wi溶液：酶解液a中含有2％(m/v)纤维素酶r-10、0.4％(m/v)离析酶r-10、 1％(m/v)果胶酶、3％(m/v)半纤维素酶、0.55mol/l甘露醇、20mm 2-(n-吗啉基)乙磺酸mes、20mm kcl、10mmcacl2、0.1％(v/v)bsa，溶解于超纯水中。wi溶液中含有4mm 2-(n-吗啉基)乙磺酸mes、0.5m甘露醇、20mm kcl，将上述成分溶于超纯水中。
511.1.2配置酶解液a、wi溶液经过0.22μm滤膜过滤后置于50ml离心管中于室温放置备用。
512.2样本预处理
513.2.1将艾草叶片从植株上取下，使用无菌水冲洗去除表面灰尘。
514.2.2将厨房用纸对折或滤纸平铺在20cm
×
20cm方皿中展平，湿水。
515.2.3将组织置于展平的厨房用纸或滤纸上，在镊子辅助下使用刀片将组织切成0.5-1mm 的细丝后转移至盛有5ml酶解液的35mm直径的培养皿中。
516.2.4每5ml酶解液对应组织鲜重0.5(
±
0.01)g。
517.3酶解
518.3.1将装有酶解液和组织的培养皿置于恒温混匀仪进行酶解4h，避光消化，至叶片组织完全散开。
519.3.2酶解液处理时间为4h叶片会得到充分的酶解，结构会因此而完全散开。此时通过吸取部分酶解液镜检，计算酶解得到的原生质体总数。
520.4过滤
521.4.1将筛网组装到50ml离心管上。
522.4.2使用5ml、宽口一次性滴管吸取“消化液”，尽可能少的吸到组织，逐滴滴加到筛网上，缓慢过滤。
523.5离心
524.5.1将过滤液转移至新的15ml离心管中。每管中液体不超过5ml，使用水平转子离心，富集原生质体。
525.5.2弃去部分离心上清液，保留1ml上清液重悬原生质体沉淀，吸取部分悬液镜检，计算原生质体总数。
526.6洗涤原生质体沉淀
527.6.1补加室温的wi溶液至5ml，使用水平转子离心，富集原生质体。
528.6.2移去6.1步骤上清液，补加室温的wi溶液至5ml，使用水平转子离心，富集原生质体。
529.6.3移去6.2步骤上清液，选用合适体积的wi溶液重悬原生质体。
530.7镜检原生质体活性。
531.通过台盼蓝染色，显微镜下镜检计算存活原生质体比例、原生质体结团比例、碎片比例和原生质体浓度。原生质体计数采用0.4％的台盼蓝与原生质体悬液按1:9混匀，用移液器吸取10μl加到血球计数板的加样孔中计数，显微镜观察计数区的原生质体个数。光镜下死亡原生质体会被染成蓝色，存活的原生质体不会被台盼蓝标记。
532.8结果及分析
533.结果显示，艾草叶片通过酶解液酶解，原生质体通过台盼蓝进行染色、血球计数板计数，原生质体数量1.2
×
105个、存活原生质体比例70％、原生质体结团比例6％、碎片比例15％，原生质体悬液继续进行10x genomics平台单细胞转录组测序存在风险。
534.对比实施例18：
535.本实施例使用yf_03溶液洗涤原生质体。
536.1溶液配置
537.1.1酶解液a、yf_03溶液：酶解液a中含有2％(m/v)纤维素酶r-10、0.4％(m/v)离析酶r-10、1％(m/v)果胶酶、3％(m/v)半纤维素酶、0.55mol/l甘露醇、20mm 2-(n-吗啉基)乙磺酸mes、20mm kcl、10mm cacl2、0.1％(v/v)bsa，溶解于超纯水中。 yf_03溶液中含有4mm 2-(n-吗啉基)乙磺酸mes、0.5m甘露醇、20mm kcl、 0.1％(v/v)bsa，将上述成分溶于超纯水中。
538.1.2配置酶解液a、yf_03溶液经过0.22μm滤膜过滤后置于50ml离心管中于室温放置备用。
539.2样本预处理
540.2.1将艾草叶片从植株上取下，使用无菌水冲洗去除表面灰尘。
541.2.2将厨房用纸对折或滤纸平铺在20cm
×
20cm方皿中展平，湿水。
542.2.3将组织置于展平的厨房用纸或滤纸上，在镊子辅助下使用刀片将组织切成0.5mm的细丝后转移至盛有5ml酶解液的35mm直径的培养皿中。
543.2.4每5ml酶解液对应组织鲜重0.5(
±
0.01)g。
544.3酶解
545.3.1将装有酶解液和组织的培养皿置于恒温混匀仪进行酶解4h，避光消化，至叶片组织完全散开。
546.3.2酶解液处理时间为4h叶片会得到充分的酶解，结构会因此而完全散开。此时通过吸取部分酶解液镜检，计算酶解得到的原生质体总数。
547.4过滤
548.4.1将筛网组装到50ml离心管上。
549.4.2使用5ml、宽口一次性滴管吸取“消化液”，尽可能少的吸到组织，逐滴滴加到筛网上，缓慢过滤。
550.5离心
551.5.1将过滤液转移至新的15ml离心管中。每管中液体不超过5ml，使用水平转子离心，富集原生质体。
552.5.2弃去部分离心上清液，保留1ml上清液重悬原生质体沉淀，吸取部分悬液镜检，计算原生质体总数。
553.6洗涤原生质体沉淀
554.6.1补加室温的yf_03溶液至5ml，使用水平转子离心，富集原生质体。
555.6.2移去6.1步骤上清液，补加室温的yf_03溶液至5ml，使用水平转子离心，富集原生质体。
556.6.3移去6.2步骤上清液，选用合适体积的yf_03溶液重悬原生质体。
557.7镜检原生质体活性。
558.通过台盼蓝染色，显微镜下镜检计算存活原生质体比例、原生质体结团比例、碎片比例和原生质体浓度。原生质体计数采用0.4％的台盼蓝与原生质体悬液按1:9混匀，用移液器吸取10μl加到血球计数板的加样孔中计数，显微镜观察计数区的原生质体个数。光镜下死亡原生质体会被染成蓝色，存活的原生质体不会被台盼蓝标记。
559.8结果及分析
560.结果显示，艾草叶片通过酶解液酶解，原生质体通过台盼蓝进行染色、血球计数板计数，原生质体数量7
×
105个、存活原生质体比例89％、原生质体结团比例3％、碎片比例7％，原生质体悬液质量达到10x genomics平台单细胞转录组测序对样本质量要求。
561.对比实施例19：
562.本实施例使用yf_04溶液洗涤原生质体。
563.1溶液配置
564.1.1酶解液a、yf_04溶液：酶解液a中含有2％(m/v)纤维素酶r-10、0.4％(m/v)离析酶r-10、1％(m/v)果胶酶、3％(m/v)半纤维素酶、0.55mol/l甘露醇、20mm 2-(n-吗啉基)乙磺酸mes、20mm kcl、10mm cacl2、0.1％(v/v)bsa，溶解于超纯水中。 yf_04溶液中含有4mm 2-(n-吗啉基)乙磺酸mes、0.5m甘露醇、20mm kcl、 5％(v/v)fbs，将上述成分溶于超纯水中。
565.1.2配置酶解液a、yf_04溶液经过0.22μm滤膜过滤后置于50ml离心管中于室温放置备用。
566.2样本预处理
567.2.1将艾草叶片从植株上取下，使用无菌水冲洗去除表面灰尘。
568.2.2将厨房用纸对折或滤纸平铺在20cm
×
20cm方皿中展平，湿水。
569.2.3将组织置于展平的厨房用纸或滤纸上，在镊子辅助下使用刀片将组织切成0.5-1mm 的细丝后转移至盛有5ml酶解液的35mm直径的培养皿中。
570.2.4每5ml酶解液对应组织鲜重0.5(
±
0.01)g。
571.3酶解
572.3.1将装有酶解液和组织的培养皿置于恒温混匀仪进行酶解4h，避光消化，至叶片组织完全散开。
573.3.2酶解液处理时间为4h叶片会得到充分的酶解，结构会因此而完全散开。此时通
过吸取部分酶解液镜检，计算酶解得到的原生质体总数。
574.4过滤
575.4.1将筛网组装到50ml离心管上。
576.4.2使用5ml、宽口一次性滴管吸取“消化液”，尽可能少的吸到组织，逐滴滴加到筛网上，缓慢过滤。
577.5离心
578.5.1将过滤液转移至新的15ml离心管中。每管中液体不超过5ml，使用水平转子离心，富集原生质体。
579.5.2弃去部分离心上清液，保留1ml上清液重悬原生质体沉淀，吸取部分悬液镜检，计算原生质体总数。
580.6洗涤原生质体沉淀
581.6.1补加室温的yf_04溶液至5ml，使用水平转子离心，富集原生质体。
582.6.2移去6.1步骤上清液，补加室温的yf_04溶液至5ml，使用水平转子离心，富集原生质体。
583.6.3移去6.2步骤上清液，选用合适体积的yf_04溶液重悬原生质体。
584.7镜检原生质体活性。
585.通过台盼蓝染色，显微镜下镜检计算存活原生质体比例、原生质体结团比例、碎片比例和原生质体浓度。原生质体计数采用0.4％的台盼蓝与原生质体悬液按1:9混匀，用移液器吸取10μl加到血球计数板的加样孔中计数，显微镜观察计数区的原生质体个数。光镜下死亡原生质体会被染成蓝色，存活的原生质体不会被台盼蓝标记。
586.8结果及分析
587.结果显示，艾草叶片通过酶解液酶解，原生质体通过台盼蓝进行染色、血球计数板计数，原生质体数量1.2
×
105个、存活原生质体比例88％、原生质体结团比例3％、碎片比例7％，原生质体悬液继续开展10x genomics平台单细胞转录组测序存在风险。
588.对比实施例20：
589.本实施例使用yf_05溶液洗涤原生质体。
590.1溶液配置
591.1.1酶解液a、yf_05溶液：酶解液a中含有2％(m/v)纤维素酶r-10、0.4％(m/v)离析酶r-10、1％(m/v)果胶酶、3％(m/v)半纤维素酶、0.55mol/l甘露醇、20mm 2-(n-吗啉基)乙磺酸mes、20mm kcl、10mm cacl2、0.1％(v/v)bsa，溶解于超纯水中。 yf_05溶液中含有20mm 2-(n-吗啉基)乙磺酸mes、0.5m甘露醇、20mm kcl、 0.1％(v/v)bsa，将上述成分溶于超纯水中。
592.1.2配置酶解液a、yf_05溶液经过0.22μm滤膜过滤后置于50ml离心管中于室温放置备用。
593.2样本预处理
594.2.1将艾草叶片从植株上取下，使用无菌水冲洗去除表面灰尘。
595.2.2将厨房用纸对折或滤纸平铺在20cm
×
20cm方皿中展平，湿水。
596.2.3将组织置于展平的厨房用纸或滤纸上，在镊子辅助下使用刀片将组织切成0.5mm的细丝后转移至盛有5ml酶解液的35mm直径的培养皿中。
597.2.4每5ml酶解液对应组织鲜重0.5(
±
0.01)g。
598.3酶解
599.3.1将装有酶解液和组织的培养皿置于恒温混匀仪进行酶解4h，避光消化，至叶片组织完全散开。
600.3.2酶解液处理时间为4h叶片会得到充分的酶解，结构会因此而完全散开。此时通过吸取部分酶解液镜检，计算酶解得到的原生质体总数。
601.4过滤
602.4.1将筛网组装到50ml离心管上。
603.4.2使用5ml、宽口一次性滴管吸取“消化液”，尽可能少的吸到组织，逐滴滴加到筛网上，缓慢过滤。
604.5离心
605.5.1将过滤液转移至新的15ml离心管中。每管中液体不超过5ml，使用水平转子离心，富集原生质体。
606.5.2弃去部分离心上清液，保留1ml上清液重悬原生质体沉淀，吸取部分悬液镜检，计算原生质体总数。
607.6洗涤原生质体沉淀
608.6.1补加室温的yf_05溶液至5ml，使用水平转子离心，富集原生质体。
609.6.2移去6.1步骤上清液，补加室温的yf_05溶液至5ml，使用水平转子离心，富集原生质体。
610.6.3移去6.2步骤上清液，选用合适体积的yf_05溶液重悬原生质体。
611.7镜检原生质体活性。
612.通过台盼蓝染色，显微镜下镜检计算存活原生质体比例、原生质体结团比例、碎片比例和原生质体浓度。原生质体计数采用0.4％的台盼蓝与原生质体悬液按1:9混匀，用移液器吸取10μl加到血球计数板的加样孔中计数，显微镜观察计数区的原生质体个数。光镜下死亡原生质体会被染成蓝色，存活的原生质体不会被台盼蓝标记。
613.8结果及分析
614.结果显示，艾草叶片通过酶解液酶解，原生质体通过台盼蓝进行染色、血球计数板计数，原生质体数量1.3
×
106个、存活原生质体比例90％、原生质体结团比例2％、碎片比例7％，原生质体悬液质量达到10x genomics平台单细胞转录组测序对样本质量要求。
615.对比实施例21：
616.本实施例将yf溶液中的1～3％聚乙烯吡咯烷酮pvp-40移除，其余操作与本发明实施例2相同。
617.1溶液配置
618.1.1酶解液a、yf溶液：酶解液a中含有2％(m/v)纤维素酶r-10、0.4％(m/v)离析酶r-10、 1％(m/v)果胶酶、3％(m/v)半纤维素酶、0.55mol/l甘露醇、20mm 2-(n-吗啉基)乙磺酸mes、20mm kcl、10mm cacl2、0.1％(v/v)bsa，溶解于超纯水中。yf溶液中含有20mm 2-(n-吗啉基)乙磺酸mes、20mm kcl、0.1％(v/v)bsa、0.5mol/l甘露醇，将上述成分溶于超纯水中。
619.1.2配置酶解液a、yf溶液经过0.22μm滤膜过滤后置于50ml离心管中于室温放置备
用。
620.2样本预处理
621.2.1将艾草叶片从植株上取下，使用无菌水冲洗去除表面灰尘。
622.2.2将厨房用纸对折或滤纸平铺在20cm
×
20cm方皿中展平，湿水。
623.2.3将组织置于展平的厨房用纸或滤纸上，在镊子辅助下使用刀片将组织切成0.5-1mm 的细丝后转移至盛有5ml酶解液的35mm直径的培养皿中。
624.2.4每5ml酶解液对应组织鲜重0.5(
±
0.01)g。
625.3酶解
626.3.1将装有酶解液和组织的培养皿置于恒温混匀仪进行酶解4h，避光消化，至叶片组织完全散开。
627.3.2酶解液处理时间为4h叶片会得到充分的酶解，结构会因此而完全散开。此时通过吸取部分酶解液镜检，计算酶解得到的原生质体总数。
628.4过滤
629.4.1将筛网组装到50ml离心管上。
630.4.2使用5ml、宽口一次性滴管吸取“消化液”，尽可能少的吸到组织，逐滴滴加到筛网上，缓慢过滤。
631.5离心
632.5.1将过滤液转移至新的15ml离心管中。每管中液体不超过5ml，使用水平转子离心，富集原生质体。
633.5.2弃去部分离心上清液，保留1ml上清液重悬原生质体沉淀，吸取部分悬液镜检，计算原生质体总数。
634.6洗涤原生质体沉淀
635.6.1补加室温的yf溶液至5ml，使用水平转子离心，富集原生质体。
636.6.2移去6.1步骤上清液，补加室温的yf溶液至5ml，使用水平转子离心，富集原生质体。
637.6.3移去6.2步骤上清液，选用合适体积的yf溶液重悬原生质体。
638.7镜检原生质体活性
639.7.1通过台盼蓝染色，显微镜下镜检计算存活原生质体比例、原生质体结团比例、碎片比例和原生质体浓度。原生质体计数采用0.4％的台盼蓝与原生质体悬液按1:9混匀，用移液器吸取10μl加到血球计数板的加样孔中计数，显微镜观察计数区的原生质体个数。光镜下死亡原生质体会被染成蓝色，存活的原生质体不会被台盼蓝标记。
640.8建库测序
641.8.1依照10x genomics公司说明书：chromiumnext gem single cell 3’reagent kit v3.1， cg000204rev c，进行单细胞转录组测序操作。
642.8.2使用qubit3.0测量cdna产量，使用cell ranger流程对样本测序结果进行质控并导出报告。
643.9结果及分析
644.结果显示，艾草叶片通过酶解液酶解，原生质体通过台盼蓝进行染色、血球计数板计数，原生质体数量1
×
106个、存活原生质体比例89％、原生质体结团比例2％、碎片比例
8％，cdna 产量30ng。
645.对比实施例22：
646.本实施例将yf溶液中的1～3％聚乙烯吡咯烷酮pvp-40更换为0.1％(m/v)peg2000。
647.1溶液配置
648.1.1酶解液a、yf溶液：酶解液a中含有2％(m/v)纤维素酶r-10、0.4％(m/v)离析酶r-10、1％(m/v)果胶酶、3％(m/v)半纤维素酶、0.55mol/l甘露醇、20mm 2-(n-吗啉基)乙磺酸mes、20mm kcl、10mm cacl2、0.1％(v/v)bsa，溶解于超纯水中。yf溶液中含有20mm 2-(n-吗啉基)乙磺酸mes、20mm kcl、0.1％(v/v)bsa、0.5mol/l甘露醇、0.1％(m/v)peg2000，将上述成分溶于超纯水中。
649.1.2配置酶解液a、yf溶液经过0.22μm滤膜过滤后置于50ml离心管中于室温放置备用。
650.2样本预处理
651.2.1将艾草叶片从植株上取下，使用无菌水冲洗去除表面灰尘。
652.2.2将厨房用纸对折或滤纸平铺在20cm
×
20cm方皿中展平，湿水。
653.2.3将组织置于展平的厨房用纸或滤纸上，在镊子辅助下使用刀片将组织切成0.5-1mm 的细丝后转移至盛有5ml酶解液的35mm直径的培养皿中。
654.2.4每5ml酶解液对应组织鲜重0.5(
±
0.01)g
655.3酶解
656.3.1将装有酶解液和组织的培养皿置于恒温混匀仪进行酶解4h，避光消化，至叶片组织完全散开。
657.3.2酶解液处理时间为4h叶片会得到充分的酶解，结构会因此而完全散开。此时通过吸取部分酶解液镜检，计算酶解得到的原生质体总数。
658.4过滤
659.4.1将筛网组装到50ml离心管上。
660.4.2使用5ml、宽口一次性滴管吸取“消化液”，尽可能少的吸到组织，逐滴滴加到筛网上，缓慢过滤。
661.5离心
662.5.1将过滤液转移至新的15ml离心管中。每管中液体不超过5ml，使用水平转子离心，富集原生质体。
663.5.2弃去部分离心上清液，保留1ml上清液重悬原生质体沉淀，吸取部分悬液镜检，计算原生质体总数。
664.6洗涤原生质体沉淀
665.6.1补加室温的yf溶液至5ml，使用水平转子离心，富集原生质体。
666.6.2移去6.1步骤上清液，补加室温的yf溶液至5ml，使用水平转子离心，富集原生质体。
667.6.3移去6.2步骤上清液，选用合适体积的yf溶液重悬原生质体。
668.7镜检原生质体活性
669.通过台盼蓝染色，显微镜下镜检计算存活原生质体比例、原生质体结团比例、碎片
比例和原生质体浓度。原生质体计数采用0.4％的台盼蓝与原生质体悬液按1:9混匀，用移液器吸取10μl加到血球计数板的加样孔中计数，显微镜观察计数区的原生质体个数。光镜下死亡原生质体会被染成蓝色，存活的原生质体不会被台盼蓝标记。
670.8建库测序
671.依照10x genomics公司说明书：chromium next gem single cell 3’reagent kit v3.1， cg000204rev c，进行单细胞转录组测序操作。
672.9结果及分析
673.结果显示，艾草叶片通过酶解液酶解，原生质体通过台盼蓝进行染色、血球计数板计数，原生质体数量1.1
×
106个、存活原生质体比例88％、原生质体结团比例1％、碎片比例7％， chromium next gem single cell 3’reagent kit v3.1，cg000204rev c中油包水微滴生成步骤失败，无法继续实验。
674.对比实施例23：
675.本实施例将yf溶液中的聚乙烯吡咯烷酮pvp-40更换为0.01％(m/v)peg2000，其余组分见表1，操作步骤与本发明实施例完全一致。
676.1溶液配置
677.1.1酶解液a、yf溶液：酶解液a中含有2％(m/v)纤维素酶r-10、0.4％(m/v)离析酶r-10、 1％(m/v)果胶酶、3％(m/v)半纤维素酶、0.55mol/l甘露醇、20mm 2-(n-吗啉基)乙磺酸mes、20mm kcl、10mm cacl2、0.1％(v/v)bsa，溶解于超纯水中。yf溶液中含有20mm 2-(n-吗啉基)乙磺酸mes、20mm kcl、0.1％(v/v)bsa、0.5mol/l甘露醇、0.01％(m/v)peg2000，将上述成分溶于超纯水中。
678.1.2配置酶解液a、yf溶液经过0.22μm滤膜过滤后置于50ml离心管中于室温放置备用。
679.2样本预处理
680.2.1将艾草叶片从植株上取下，使用无菌水冲洗去除表面灰尘。
681.2.2将厨房用纸对折或滤纸平铺在20cm
×
20cm方皿中展平，湿水。
682.2.3将组织置于展平的厨房用纸或滤纸上，在镊子辅助下使用刀片将组织切成0.5-1mm 的细丝后转移至盛有5ml酶解液的35mm直径的培养皿中。
683.2.4每5ml酶解液对应组织鲜重0.5(
±
0.01)g。
684.3酶解
685.3.1将装有酶解液和组织的培养皿置于恒温混匀仪进行酶解4h，避光消化，至叶片组织完全散开。
686.3.2酶解液处理时间为4h叶片会得到充分的酶解，结构会因此而完全散开。此时通过吸取部分酶解液镜检，计算酶解得到的原生质体总数。
687.4过滤
688.4.1将筛网组装到50ml离心管上。
689.4.2使用5ml、宽口一次性滴管吸取“消化液”，尽可能少的吸到组织，逐滴滴加到筛网上，缓慢过滤。
690.5离心
691.5.1将过滤液转移至新的15ml离心管中。每管中液体不超过5ml，使用水平转子离
心，富集原生质体。
692.5.2弃去部分离心上清液，保留1ml上清液重悬原生质体沉淀，吸取部分悬液镜检，计算原生质体总数。
693.6洗涤原生质体沉淀
694.6.1补加室温的yf溶液至5ml，使用水平转子离心，富集原生质体。
695.6.2移去6.1步骤上清液，补加室温的yf溶液至5ml，使用水平转子离心，富集原生质体。
696.6.3移去6.2步骤上清液，选用合适体积的yf溶液重悬原生质体。
697.7镜检原生质体活性。
698.通过台盼蓝染色，显微镜下镜检计算存活原生质体比例、原生质体结团比例、碎片比例和原生质体浓度。原生质体计数采用0.4％的台盼蓝与原生质体悬液按1:9混匀，用移液器吸取10μl加到血球计数板的加样孔中计数，显微镜观察计数区的原生质体个数。光镜下死亡原生质体会被染成蓝色，存活的原生质体不会被台盼蓝标记。
699.8建库测序
700.8.1依照10x genomics公司说明书：chromiumnext gem single cell 3’reagent kit v3.1， cg000204rev c，进行单细胞转录组测序操作。
701.8.2使用qubit3.0测量cdna产量，使用cell ranger流程对样本测序结果进行质控并导出报告。
702.9结果及分析
703.结果显示，艾草叶片通过酶解液酶解，原生质体通过台盼蓝进行染色、血球计数板计数，原生质体数量1.1
×
106个、存活原生质体比例89％、原生质体结团比例2％、碎片比例7％，cdna产量29ng。
704.对比实施例24：
705.本实施例使用yf溶液作为取样缓冲液。
706.1溶液配置
707.1.1酶解液a、yf溶液：酶解液a中含有2％(m/v)纤维素酶r-10、0.4％(m/v)离析酶r-10、 1％(m/v)果胶酶、3％(m/v)半纤维素酶、0.55mol/l甘露醇、20mm 2-(n-吗啉基)乙磺酸mes、20mm kcl、10mmcacl2、0.1％(v/v)bsa，溶解于超纯水中。yf溶液中含有20mm 2-(n-吗啉基)乙磺酸mes、20mm kcl、0.1％(v/v)bsa、0.5mol/l甘露醇、 3％(m/v)聚乙烯吡咯烷酮pvp-40，将上述成分溶于超纯水中。
708.1.2配置酶解液a、yf溶液经过0.22μm滤膜过滤后置于50ml离心管中于室温放置备用。
709.2样本预处理
710.2.1将艾草叶片从植株上取下，使用无菌水冲洗去除表面灰尘。
711.2.2将厨房用纸对折或滤纸平铺在20cm
×
20cm方皿中展平，湿水。
712.2.3将组织置于展平的厨房用纸或滤纸上，在镊子辅助下使用刀片将组织切成0.5mm的细丝后转移至盛有5ml酶解液的35mm直径的培养皿中。
713.2.4每5ml酶解液对应组织鲜重0.5(
±
0.01)g。
714.3酶解
吗啉基)乙磺酸mes、20mm kcl、0.1％(v/v)bsa、0.5mol/l甘露醇，将上述成分溶于超纯水中。
738.1.2配置酶解液a、yf溶液经过0.22μm滤膜过滤后置于50ml离心管中于室温放置备用。
739.2样本预处理
740.2.1将艾草叶片从植株上取下，使用无菌水冲洗去除表面灰尘。
741.2.2将厨房用纸对折或滤纸平铺在20cm
×
20cm方皿中展平，湿水。
742.2.3将组织置于展平的厨房用纸或滤纸上，在镊子辅助下使用刀片将组织切成0.5-1mm 的细丝后转移至盛有5ml酶解液的35mm直径的培养皿中。
743.2.4每5ml酶解液对应组织鲜重0.5(
±
0.01)g。
744.3酶解
745.3.1将装有酶解液和组织的培养皿置于恒温混匀仪进行酶解4h，避光消化，至叶片组织完全散开。
746.3.2酶解液处理时间为4h叶片会得到充分的酶解，结构会因此而完全散开。此时通过吸取部分酶解液镜检，计算酶解得到的原生质体总数。
747.3.3加入活性炭粉末充分与悬液接触后室温静置15min。
748.4过滤
749.4.1将筛网组装到50ml离心管上。
750.4.2使用5ml、宽口一次性滴管吸取“消化液”，尽可能少的吸到组织，逐滴滴加到筛网上，缓慢过滤。
751.5离心
752.5.1将过滤液转移至新的15ml离心管中。每管中液体不超过5ml，使用水平转子离心，富集原生质体。
753.5.2弃去部分离心上清液，保留1ml上清液重悬原生质体沉淀，吸取部分悬液镜检，计算原生质体总数。
754.6结果
755.结果显示，艾草叶片通过酶解液酶解，原生质体通过台盼蓝进行染色、血球计数板计数，原生质体数量7000个、存活原生质体比例15％、原生质体结团比例10％、碎片比例41％。无法达到单细胞转录组测序对样本质量的要求。
756.对比实施例26：
757.本实施例将yf溶液中的聚乙烯吡咯烷酮pvp-40浓度调整至0.5％。
758.1溶液配置
759.1.1酶解液a、yf溶液：酶解液a中含有2％(m/v)纤维素酶r-10、0.4％(m/v)离析酶r-10、 1％(m/v)果胶酶、3％(m/v)半纤维素酶、0.55mol/l甘露醇、20mm 2-(n-吗啉基)乙磺酸mes、20mm kcl、10m mcacl2、0.1％(v/v)bsa，溶解于超纯水中。yf溶液中含有20mm 2-(n-吗啉基)乙磺酸mes、20mm kcl、0.1％(v/v)bsa、0.5mol/l甘露醇、0.5％聚乙烯吡咯烷酮pvp-40，将上述成分溶于超纯水中。
760.1.2配置酶解液a、yf溶液经过0.22μm滤膜过滤后置于50ml离心管中于室温放置备用。
761.2样本预处理
762.2.1将艾草叶片从植株上取下，使用无菌水冲洗去除表面灰尘。
763.2.2将厨房用纸对折或滤纸平铺在20cm
×
20cm方皿中展平，湿水。
764.2.3将组织置于展平的厨房用纸或滤纸上，在镊子辅助下使用刀片将组织切成0.5mm的细丝后转移至盛有5ml酶解液的35mm直径的培养皿中。
765.2.4每5ml酶解液对应组织鲜重0.5(
±
0.01)g。
766.3酶解
767.3.1将装有酶解液和组织的培养皿置于恒温混匀仪进行酶解4h，避光消化，至叶片组织完全散开。
768.3.2酶解液处理时间为4h叶片会得到充分的酶解，结构会因此而完全散开。此时通过吸取部分酶解液镜检，计算酶解得到的原生质体总数。
769.4过滤
770.4.1将筛网组装到50ml离心管上。
771.4.2使用5ml、宽口一次性滴管吸取“消化液”，尽可能少的吸到组织，逐滴滴加到筛网上，缓慢过滤。
772.5离心
773.5.1将过滤液转移至新的15ml离心管中。每管中液体不超过5ml，使用水平转子离心，富集原生质体。
774.5.2弃去部分离心上清液，保留1ml上清液重悬原生质体沉淀，吸取部分悬液镜检，计算原生质体总数。
775.6洗涤原生质体沉淀
776.6.1补加室温的yf溶液至5ml，使用水平转子离心，富集原生质体。
777.6.2移去6.1步骤上清液，补加室温的yf溶液至5ml，使用水平转子离心，富集原生质体。
778.6.3移去6.2步骤上清液，选用合适体积的yf溶液重悬原生质体。
779.7镜检原生质体活性
780.通过台盼蓝染色，显微镜下镜检计算存活原生质体比例、原生质体结团比例、碎片比例和原生质体浓度。原生质体计数采用0.4％的台盼蓝与原生质体悬液按1:9混匀，用移液器吸取10μl加到血球计数板的加样孔中计数，显微镜观察计数区的原生质体个数。光镜下死亡原生质体会被染成蓝色，存活的原生质体不会被台盼蓝标记。
781.8建库测序
782.8.1依照10x genomics公司说明书：chromiumnext gem single cell 3’reagent kit v3.1， cg000204rev c，进行单细胞转录组测序操作。
783.8.2使用qubit3.0测量cdna产量，使用cell ranger流程对样本测序结果进行质控并导出报告。
784.9结果及分析
785.结果显示，艾草叶片通过酶解液酶解，原生质体通过台盼蓝进行染色、血球计数板计数，原生质体数量1.0
×
106个、存活原生质体比例90％、原生质体结团比例3％、碎片比例7％， cdna产量392ng。
786.对比实施例27：
787.本实施例将yf溶液中的聚乙烯吡咯烷酮pvp-40浓度调整至5％。
788.1溶液配置
789.1.1酶解液a、yf溶液：酶解液a中含有2％(m/v)纤维素酶r-10、0.4％(m/v)离析酶r-10、1％(m/v)果胶酶、3％(m/v)半纤维素酶、0.55mol/l甘露醇、20mm 2-(n-吗啉基)乙磺酸mes、20mm kcl、10mm cacl2、0.1％(v/v)bsa，溶解于超纯水中。yf溶液中含有20mm 2-(n-吗啉基)乙磺酸mes、20mm kcl、0.1％(v/v)bsa、0.5mol/l甘露醇、5％聚乙烯吡咯烷酮pvp-40，将上述成分溶于超纯水中。
790.1.2配置酶解液a、yf溶液经过0.22μm滤膜过滤后置于50ml离心管中于室温放置备用。
791.2样本预处理
792.2.1将艾草叶片从植株上取下，使用无菌水冲洗去除表面灰尘。
793.2.2将厨房用纸对折或滤纸平铺在20cm
×
20cm方皿中展平，湿水。
794.2.3将组织置于展平的厨房用纸或滤纸上，在镊子辅助下使用刀片将组织切成0.5mm的细丝后转移至盛有5ml酶解液的35mm直径的培养皿中。
795.2.4每5ml酶解液对应组织鲜重0.5(
±
0.01)g。
796.3酶解
797.3.1将装有酶解液和组织的培养皿置于恒温混匀仪进行酶解4h，避光消化，至叶片组织完全散开。
798.3.2酶解液处理时间为4h叶片会得到充分的酶解，结构会因此而完全散开。此时通过吸取部分酶解液镜检，计算酶解得到的原生质体总数。
799.4过滤
800.4.1将筛网组装到50ml离心管上。
801.4.2使用5ml、宽口一次性滴管吸取“消化液”，尽可能少的吸到组织，逐滴滴加到筛网上，缓慢过滤。
802.5离心
803.5.1将过滤液转移至新的15ml离心管中。每管中液体不超过5ml，使用水平转子离心，富集原生质体。
804.5.2弃去部分离心上清液，保留1ml上清液重悬原生质体沉淀，吸取部分悬液镜检，计算原生质体总数。
805.6洗涤原生质体沉淀
806.6.1补加室温的yf溶液至5ml，使用水平转子离心，富集原生质体。
807.6.2移去6.1步骤上清液，补加室温的yf溶液至5ml，使用水平转子离心，富集原生质体。
808.6.3移去6.2步骤上清液，选用合适体积的yf溶液重悬原生质体。
809.7镜检原生质体活性
810.7.1通过台盼蓝染色，显微镜下镜检计算存活原生质体比例、原生质体结团比例、碎片比例和原生质体浓度。原生质体计数采用0.4％的台盼蓝与原生质体悬液按1:9混匀，用移液器吸取10μl加到血球计数板的加样孔中计数，显微镜观察计数区的原生质体个数。
光镜下死亡原生质体会被染成蓝色，存活的原生质体不会被台盼蓝标记。
811.8建库测序
812.8.1依照10x genomics公司说明书：chromiumnext gem single cell 3’reagent kit v3.1， cg000204rev c，进行单细胞转录组测序操作。
813.8.2使用qubit3.0测量cdna产量，使用cell ranger流程对样本测序结果进行质控并导出报告。
814.9结果及分析
815.结果显示，艾草叶片通过酶解液酶解，原生质体通过台盼蓝进行染色、血球计数板计数，原生质体数量9
×
105个、存活原生质体比例89％、原生质体结团比例3％、碎片比例8％，chromium next gem single cell 3’reagent kit v3.1，cg000204rev c中油包水微滴生成步骤失败，无法继续实验。
816.对比实施例28：
817.本实施例将实验物种更换为拟南芥叶片，其余操作步骤与本发明实施例完全相同。
818.1溶液配置
819.1.1酶解液a：酶解液a中含有2％(m/v)纤维素酶r-10、0.4％(m/v)离析酶r-10、1％(m/v) 果胶酶、3％(m/v)半纤维素酶、0.55mol/l甘露醇、20mm 2-(n-吗啉基)乙磺酸mes、 20mm kcl、10mm cacl2、0.1％(v/v)bsa，溶解于超纯水中。
820.1.2配置酶解液a经过0.22μm滤膜过滤后置于50ml离心管中于室温放置备用。
821.2样本预处理
822.2.1将拟南芥叶片从植株上取下，使用无菌水冲洗去除表面灰尘。
823.2.2将厨房用纸对折或滤纸平铺在20cm
×
20cm方皿中展平，湿水。
824.2.3将组织置于展平的厨房用纸或滤纸上，在镊子辅助下使用刀片将组织切成0.5mm的细丝后转移至盛有5ml酶解液的35mm直径的培养皿中。
825.2.4每5ml酶解液对应组织鲜重0.5(
±
0.01)g。
826.3酶解
827.3.1将装有酶解液和组织的培养皿置于恒温混匀仪进行酶解4h，避光消化，至叶片组织完全散开。
828.酶解液处理时间为4h叶片会得到充分的酶解，结构会因此而完全散开。此时通过吸取部分酶解液镜检，计算酶解得到的原生质体总数。
829.4结果
830.结果显示，拟南芥叶片通过酶解液a酶解，原生质体通过台盼蓝进行染色、血球计数板计数，原生质体数量1.4
×
106个、存活原生质体比例68％、原生质体结团比例3％、碎片比例 34％，无法达到单细胞转录组测序对样本质量的要求。
831.对比实施例29:
832.本实施例中将艾草叶片材料更换为艾草茎尖材料，其余操作步骤与实施例无差别。
833.1溶液配置
834.1.1酶解液a：酶解液a中含有2％(m/v)纤维素酶r-10、0.4％(m/v)离析酶r-10、1％
(m/v) 果胶酶、3％(m/v)半纤维素酶、0.55mol/l甘露醇、20mm 2-(n-吗啉基)乙磺酸mes、 20mm kcl、10mm cacl2、0.1％(v/v)bsa，溶解于超纯水中。
835.1.2配置酶解液a经过0.22μm滤膜过滤后置于50ml离心管中于室温放置备用。
836.2样本预处理
837.2.1将艾草茎尖从植株上取下，使用无菌水冲洗去除表面灰尘。
838.2.2将厨房用纸对折或滤纸平铺在20cm
×
20cm方皿中展平，湿水。
839.2.3将组织置于展平的厨房用纸或滤纸上，在镊子辅助下使用刀片将组织切成0.5mm的细丝后转移至盛有5ml酶解液的35mm直径的培养皿中。
840.2.4每5ml酶解液对应组织鲜重0.5(
±
0.01)g。
841.3酶解
842.3.1将装有酶解液和组织的培养皿置于恒温混匀仪进行酶解4h，避光消化，至叶片组织完全散开。
843.3.2酶解液处理时间为4h叶片会得到充分的酶解，结构会因此而完全散开。此时通过吸取部分酶解液镜检，计算酶解得到的原生质体总数。
844.4过滤
845.4.1将筛网组装到50ml离心管上。
846.4.2使用5ml、宽口一次性滴管吸取“消化液”，尽可能少的吸到组织，逐滴滴加到筛网上，缓慢过滤。
847.5离心
848.5.1将过滤液转移至新的15ml离心管中。每管中液体不超过5ml，使用水平转子离心，富集原生质体。
849.5.2弃去部分离心上清液，保留1ml上清液重悬原生质体沉淀，吸取部分悬液镜检，计算原生质体总数。
850.6结果
851.结果显示，艾草茎尖通过酶解液a酶解，原生质体通过台盼蓝进行染色、血球计数板计数，原生质体数量1
×
105个、存活原生质体比例80％、原生质体结团比例10％、碎片比例15％，原生质体数量无法继续单细胞转录组测序存在风险。
852.为了开发适用于单细胞转录组测序的艾草叶片原生质体制备方法，本发明进行了一系列对比实验，如表1对比实施例结果所示。
853.对比实施例1～2使用《arabidopsis mesophyll protoplasts:a versatile cell system for transientgene expression analysis》提供的原生质体制备方法分别进行了拟南芥叶片、艾草叶片的原生质体分离，结果显示该方法制备得到的拟南芥叶片的原生质体悬液各项指标均达到单细胞转录组测序对样品的要求。但该方法制备得到的艾草叶片的原生质体悬液中活率低于30％、原生质体数量少于10000，远远无法达到单细胞转录组测序对样本质量的要求。
854.显微镜镜检显示，艾草酶解液中死亡的原生质体均呈现涨破状。联系艾草生长环境(可以在低海拔或者是中海拔的一些路边、山坡或是荒地生长)，推测艾草原生质体有更高的渗透势用来储存水分维持生长、代谢。因此本发明通过对比实施例3～5调整酶解液中甘露醇的浓度至0.45m、0.55m、0.6m进行酶解，结果显示制备得到的原生质体存活率为
85％、90％、 78％，其中对比实施例3～4均满足单细胞转录组测序实验对于原生质体活率的要求，对比实施例5中原生质体活率只有78％，进行实验有一定的风险。表明艾草叶片原生质体在 0.45m-0.55m甘露醇溶液下可以更好的保持活率。但是每0.5g(
±
0.02g)艾草叶片能通过酶解得到的原生质体数量均为10000左右，无法满足单细胞转录组测序对于细胞数目的要求。
855.艾草为多年生植物，且可以在比较恶劣的环境下生长发育，所以细胞壁成分会比较独特，与拟南芥不同，常用的酶解方法无法应用于艾草叶片原生质体悬液制备实验，因此本发明通过添加新的种类的酶，比较验证酶解液的成分，对比实施例6结果显示，加入1％果胶酶可以提高每0.5g(
±
0.02g)艾草叶片得原生质体数量至3
×
105个。对比实施例7结果显示，加入3％半纤维素酶可以提高每0.5g(
±
0.02g)艾草叶片得原生质体数量至5
×
105个。对比实施例8结果显示，加入2％蜗牛酶后每0.5g(
±
0.02g)艾草叶片原生质体数量2.3
×
104，无显著提升。对比实施例9结果显示，加入0.4％崩溃酶后每0.5g(
±
0.02g)艾草叶片原生质体数量1.5
×
104，无显著提升。对比实施例10结果显示，同时加入3％半纤维素酶和1％果胶酶时可以提高每 0.5g(
±
0.02g)艾草叶片得原生质体至1.1
×
106左右。原生质体悬液质量满足单细胞转录组测序对原生质体数量的要求。
856.进一步地，本发明通过对比实施例11～12验证本发明专利中的酶解液a中果胶酶、半纤维素酶浓度范围。对比实施例11中，在果胶酶和半纤维素酶浓度低于0.1％和1％时，原生质体数目为2
×
105个，不满足单细胞转录组测序对原生质体数目的要求。对比实施例12中，在果胶酶和半纤维素酶浓度高于1％和3％时，原生质体分离结果如表1所示，满足单细胞转录组测序指标，可继续进行单细胞转录组测序。兼顾成本以及高浓度酶对原生质体的伤害，酶解液a中果胶酶的浓度应为0.1％～1％、半纤维素酶的浓度应为1％～3％。
857.综上所述，酶解液a的成分包括2％(m/v)纤维素酶r-10、0.4％(m/v)离析酶r-10、 0.1～1％(m/v)果胶酶、1～3％(m/v)半纤维素酶、0.45～0.55mol/l甘露醇、20mm 2-(n-吗啉基)乙磺酸mes、20mm kcl、10mm cacl2、0.1％(v/v)bsa。本专利描述的一种适用于单细胞转录组测序的艾草叶片原生质体制备方法，艾草叶片0.5g(
±
0.02g)经过酶解液a的酶解4h，其原生质体总量达1
×
106个，且原生质体活率大于90％，原生质体数目、活率、碎片率、结团率指标均满足10x单细胞转录组测序样本要求。
858.单细胞转录组测序要求原生质体经过酶解分离后必须使用取样缓冲液对原生质体进行两次以上的洗涤，从而去除环境中rna后进行油包水微滴生成实验，对于洗涤/取样缓冲液要求不能含有浓度超过5mm ca
2
、mg
2
。对比实施例13中，使用《arabidopsis mesophyll protoplasts:a versatile cell system for transient gene expression analysis》一文中使用的取样缓冲液洗涤原生质体，即wi溶液洗涤原生质体两次，结果显示洗涤后艾草原生质体损失严重，存活的原生质体数目1
×
105个，说明wi溶液洗涤原生质体损失过高，经洗涤后原生质体数目不足以继续进行单细胞转录组测序实验。对比实施例14中，使用离子浓度较高的w5溶液洗涤原生质体两次，经过两次洗涤原生质体数目为1.3
×
106个，活率90％，但w5溶液中含有125mm cacl2，单细胞转录组测序油包水微滴生成缓冲液中含有超过5mm的ca
2
会直接导致实验失败，因此w5无法当作单细胞转录组测序缓冲液完成油包水微滴生成。通过对比实施例13～14结果推测洗涤液拥有较高的离子环境时可以在离心时更容易下沉；原生质体膜表面蛋白与离心管管壁发生了非特异性结合，在740rpm的离
心条件下，原生质体有很大的损失。为了寻找能保持原生质体活率、且有着较高得率并符合取样要求的洗涤/取样缓冲液，通过对比实施例15～20，进行了取样缓冲液的组分调整试验，对比实施例15中，使用yf_01 缓冲液即wi溶液中2-(n-吗啉基)乙磺酸mes浓度由4mm提高至20mm进行洗涤，结果显示经过洗涤后原生质体数目为5
×
105个。对比实施例16中，使用yf_02缓冲液即wi溶液中kcl浓度由20mm提高至40mm进行洗涤，结果显示经过洗涤后原生质体数目为1
×
105个，且原生质体活率降低至80％。对比实施例17中，通过增大离心力至1050rpm，结果显示经过洗涤后原生质体数目为1.2
×
105个，原生质体活率降低至70％。对比实施例18中，使用 yf_03缓冲液即wi溶液中加入0.1％bsa进行洗涤，结果显示经过洗涤后原生质体数目为7
ꢀ×
105个。对比实施例19中，使用yf_04缓冲液即wi溶液中加入5％fbs进行洗涤，结果显示经过洗涤后原生质体数目为1.2
×
105个，无显著提升。对比实施例20中，使用yf_05溶液进行原生质体洗涤，结果显示经过洗涤后的原生质体数目1.3
×
106个，活率为90％。综上所述，yf_05溶液有着和w5相同的洗涤损失率、活率，且溶液成分均符合单细胞转录组测序对缓冲液的要求，本专利中描述的一种适用于单细胞转录组测序的艾草叶片原生质体制备方法中洗涤和油包水微滴生成实验中使用符合要求且能达到减少目的维持活率的yf_05溶液，其成分为20mm 2-(n-吗啉基)乙磺酸mes、20mm kcl、0.1％(v/v)bsa、0.5mol/l甘露醇。
859.在完成单细胞/原生质体悬液制备、油包水微滴生成后，需要进行单细胞转录组测序的分子实验即反转录、高通量测序文库构建等。分子实验与细胞实验一样是实验中关键的一步。对比实施例21中，油包水微滴生成缓冲液成分为20mm 2-(n-吗啉基)乙磺酸mes、20mm kcl、 0.1％(v/v)bsa、0.5mol/l甘露醇，依照10x genomics公司说明书：chromium next gem singlecell 3’reagent kit v3.1，cg000204rev c，进行单细胞转录组测序操作，油包水微滴生成实验正常，但反转录实验产量极低，无法继续进行文库构建实验。因为艾草叶片本身有浓烈的挥发性香气，与叶子大量的富集聚酚类、乙炔类、黄酮类和萜类等次生代谢物有关，反转录的失败可能是分子实验中原生质体中的代谢物影响了mrna的质量。因此需要在实验中加入保护mrna的措施。对比实施例22中，在取样缓冲液中加入分子实验中常用的 0.1％(m/v)peg2000进行实验，结果显示0.1％peg2000的加入会使油包水微滴生成步骤失败，无法正常进行实验。接着希望通过降低浓度，减少peg2000对单细胞转录组测序实验的影响，通过对比实施例23，在取样缓冲液中加入0.01％(m/v)peg2000进行油包水微滴生成，结果显示油包水微滴生成可以正常进行，但cdna产量极低，仍无法正常完成实验。通过对比实施例24，在取样缓冲液中加入3％聚乙烯吡咯烷酮pvp-40进行油包水微滴生成，结果显示油包水微滴可以正常进行，cdna产量有大幅改善。通过对比实施例25，在酶解后加入活性炭粉末的物理方法，对代谢物等分子进行吸附。使用活性炭粉末对酶解后的原生质体悬液进行处理，结果显示活性炭粉末的加入直接导致原生质体绝大部分死亡，无法完成原生质体制备实验。综合对比实施例21～25结果表明聚乙烯吡咯烷酮pvp-40承担着在一定的浓度下可以保护rna质量不被影响且本身不对单细胞转录组测序实验产生影响，达到让实验成功进行的目的，因此本发明专利中的洗涤/取样缓冲液yf溶液在平衡渗透压缓冲液中添加聚乙烯吡咯烷酮pvp-40。对比实施例26～27结果显示yf溶液中聚乙烯吡咯烷酮pvp-40的占比低于1％时cdna产量相较于实施例1～2仅有30％左右，高于3％时，聚乙烯吡咯烷酮pvp-40影响油包水微滴生成的质量。因此yf溶液中聚乙烯吡咯烷酮pvp-40的占比应
该是1～3％。
860.对比实施例28使用本专利中的酶解液a以及yf溶液对拟南芥叶片的原生质体悬液制备实验，结果显示制备得到的拟南芥叶片原生质体存活比例相比于对比实施例2有很大降低，且碎片比例增加，细胞总数减少了30％，不满足开展10x genomics平台单细胞转录组测序实验的样本要求。对比实施例29使用本发明的所述技术方案处理艾草茎尖组织，结果显示开展 10x genomics平台单细胞转录组测序实验存在一定失败风险。因此，使用本发明专利中的酶解液a以及yf溶液进行拟南芥叶片原生质体制备，无法得到满足开展10x genomics平台单细胞转录组测序实验的最低样本要求；使用本发明专利中的酶解液a以及《arabidopsismesophyll protoplasts:a versatile cell system for transient gene expression analysis》提供的油包水微滴生成缓冲液进行艾草叶片原生质体制备，无法得到满足开展10x genomics平台单细胞转录组测序实验的样本要求；使用本发明专利中的实验方法制备艾草茎尖原生质体悬液，结果显示无法得到满足开展10x genomics平台单细胞转录组测序实验的样本要求。
861.综上所述，本发明描述的一种适用于单细胞测序的艾草叶片原生质体制备方法，通过对比实施例1～12得出了酶解液应该选择酶解液a其成分为2％(m/v)纤维素酶r-10、0.4％(m/v) 离析酶r-10、0.1～1％(m/v)果胶酶、1～3％(m/v)半纤维素酶、0.45～0.55mol/l甘露醇、20mm 2-(n
‑ꢀ
吗啉基)乙磺酸mes、20mm kcl、10mm cacl2、0.1％(v/v)bsa；通过对比实施例13～27得出了洗涤/取样缓冲液应选择yf溶液其成分：20mm 2-(n-吗啉基)乙磺酸mes、20mm kcl、 0.1％(v/v)bsa、0.5mol/l甘露醇、1～3％(m/v)聚乙烯吡咯烷酮pvp-40。本发明描述的一种适用于单细胞测序的艾草叶片原生质体制备方法可有效制备开展10x genomics平台单细胞转录组测序实验所需的原生质体悬液。本发明所述的一种适用于单细胞转录组测序的艾草叶片原生质体制备方法中艾草叶片、酶解液a、yf溶液、单细胞转录组测序结果之间是一一对应关系的，即艾草叶片、酶解液a、yf溶液及单细胞转录组测序结果存在配伍关系。如，本发明实施例1～2提到的艾草叶片、酶解液a、yf溶液，应当按照本发明中所指出的方法使用，才能有效的制备原生质体，且制备得到的原生质体悬液各项指标能够达到单细胞转录组测序要求。本发明所述的一种适用于单细胞转录组测序的艾草叶片原生质体制备方法操作科学严谨，重复性高，能够有效的、高效地从艾草叶片组织中分离得到活率高、数量足够多的原生质体悬液，且得到的原生质体悬液能够达到10x genomics平台单细胞转录组测序各项指标。
862.表1
863.864.865.[0866][0867]
本发明的保护内容不局限于以上实施例。在不背离本发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。