使用营养缺陷型可调控细胞的方法和组合物与流程

技术特征：
1.供体模板，其包含：(a)一个或多个核苷酸序列，其与营养缺陷诱导型基因座的区域同源，或与所述营养缺陷诱导型基因座的区域的互补序列同源，以及(b)编码治疗因子的转基因，其任选地与表达控制序列连接。2.如权利要求1所述的供体模板，其中所述供体模板是单链的。3.如权利要求1所述的供体模板，其中所述供体模板是双链的。4.如权利要求1所述的供体模板，其中所述供体模板是质粒或dna片段或载体。5.如权利要求4所述的供体模板，其中所述供体模板是包含复制所必需的元件，任选地包含启动子和3’utr的质粒。6.载体，其包含：(a)一个或多个核苷酸序列，其与营养缺陷诱导型基因座的区域同源，或与所述营养缺陷诱导型基因座的区域的互补序列同源，以及(b)编码治疗因子的转基因。7.如权利要求6所述的载体，其中所述载体是病毒载体。8.如权利要求7所述的载体，其中所述载体选自：逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体和单纯疱疹病毒载体。9.如权利要求7所述的载体，其还包含所述病毒载体复制所必需的基因。10.如前述权利要求中任一项所述的供体模板或载体，其中所述转基因的两侧均侧接有与所述营养缺陷诱导型基因座的区域或其互补序列同源的核苷酸序列。11.如前述权利要求中任一项所述的供体模板或载体，其中所述营养缺陷诱导型基因座是编码参与营养缺陷型因子的合成、再循环或补救的蛋白质的基因。12.如前述权利要求中任一项所述的供体模板或载体，其中所述营养缺陷诱导型基因座位于表1中的基因内，或位于控制表1中基因表达的区域内。13.如前述权利要求中任一项所述的供体模板或载体，其中所述营养缺陷诱导型基因座位于编码尿苷单磷酸合成酶(umps)的基因内。14.如前述权利要求中任一项所述的供体模板或载体，其中所述营养缺陷诱导型基因座位于编码羧化全酶合成酶的基因内。15.如前述权利要求中任一项所述的供体模板或载体，其中与所述营养缺陷诱导型基因座的区域同源的所述核苷酸序列与所述营养缺陷诱导型基因座的至少200个连续的核苷酸具有98％的同一性。16.如前述权利要求中任一项所述的供体模板或载体，其中与所述营养缺陷诱导型基因座的区域同源的所述核苷酸序列与人尿苷单磷酸合成酶或羧化全酶合成酶或表1中的任一基因的至少200个连续的核苷酸具有98％的同一性。17.如前述权利要求中任一项所述的供体模板或载体，其还包含与所述转基因可操作地连接的表达控制序列。18.如权利要求17所述的供体模板或载体，其中所述表达控制序列是组织特异性表达控制序列。19.如权利要求17所述的供体模板或载体，其中所述表达控制序列是启动子或增强子。20.如权利要求17所述的供体模板或载体，其中所述表达控制序列是诱导型启动子。
21.如权利要求17所述的供体模板或载体，其中所述表达控制序列是组成型启动子。22.如权利要求17所述的供体模板或载体，其中所述表达控制序列是转录后调控序列。23.如权利要求17所述的供体模板或载体，其中所述表达控制序列是微小rna。24.如前述权利要求中任一项所述的供体模板或载体，其还包含标志物基因。25.如权利要求24所述的供体模板或载体，其中所述标志物基因包括至少ngfr或egfr的片段、至少cd20或cd19的片段、myc、ha、flag、gfp或抗生素抗性基因。26.如前述权利要求中任一项所述的供体模板或载体，其中所述转基因编码选自以下的蛋白质：激素、细胞因子、趋化因子、干扰素、白介素、白介素结合蛋白、酶、抗体、fc融合蛋白、生长因子、转录因子、血液因子、疫苗、结构蛋白、配体蛋白、受体、细胞表面抗原、受体拮抗剂和共刺激因子、结构蛋白、细胞表面抗原、离子通道、表观遗传修饰子和rna编辑蛋白。27.如前述权利要求中任一项所述的供体模板或载体，其中所述转基因编码t细胞抗原受体。28.如权利要求1-25中任一项所述的供体模板或载体，其中所述转基因编码rna，任选地编码调控性微小rna。29.用于将转基因靶向整合至营养缺陷诱导型基因座的核酸酶系统，其包含：(a)cas9蛋白，和(b)特异性针对营养缺陷诱导型基因座的向导rna。30.用于将转基因靶向整合至营养缺陷诱导型基因座的核酸酶系统，其包含：特异性针对所述营养缺陷诱导型基因座的大范围核酸酶。31.如权利要求30所述的核酸酶系统，其中所述大范围核酸酶是zfn或talen。32.如权利要求29-31中任一项所述的核酸酶系统，其还包含权利要求1-28中任一项所述的供体模板或载体。33.离体的经修饰的宿主细胞，其包含：编码整合在营养缺陷诱导型基因座处的治疗因子的转基因，其中所述经修饰的宿主细胞是营养缺陷型因子营养缺陷型的，并且能够表达所述治疗因子。34.如权利要求33所述的经修饰的宿主细胞，其中所述经修饰的宿主细胞是哺乳动物细胞。35.如权利要求33所述的经修饰的宿主细胞，其中所述经修饰的宿主细胞是人类细胞。36.如权利要求33所述的经修饰的宿主细胞，其中所述经修饰的宿主细胞选自：胚胎干细胞、干细胞、祖细胞、多能干细胞、诱导型多能干(ips)细胞、成体干细胞、分化的细胞、间充质干细胞、神经干细胞、造血干细胞或造血祖细胞、脂肪干细胞、角化细胞、骨骼干细胞、肌肉干细胞、成纤维细胞、nk细胞、b细胞、t细胞和外周血单个核细胞(pbmc)。37.如权利要求33所述的经修饰的宿主细胞，其中所述经修饰的宿主细胞来源于来自用所述经修饰的宿主细胞或其群体治疗的对象的细胞。38.产生经修饰的哺乳动物宿主细胞的方法，包括：(a)向所述哺乳动物宿主细胞中引入靶向并切割营养缺陷诱导型基因座处的dna的至少第一核酸酶系统，或编码所述至少一种核酸酶系统的一个或多个组件的核酸；和(b)向所述哺乳动物宿主细胞中引入权利要求1-28中任一项所述的供体模板或载体。39.如权利要求38所述的方法，其还包括引入靶向并切割第二基因组基因座处的dna的
第二核酸酶系统，或编码所述第二核酸酶系统的一个或多个组件的核酸，以及任选地第二供体模板或载体。40.将转基因靶向整合至离体哺乳动物细胞中营养缺陷诱导型基因座的方法，其包括：使所述哺乳动物细胞与权利要求1-28中任一项所述的供体模板或载体，以及核酸酶接触。41.如权利要求38-40中任一项所述的方法，其中所述核酸酶是zfn。42.如权利要求38-40中任一项所述的方法，其中所述核酸酶是talen。43.产生经修饰的哺乳动物宿主细胞的方法，其包括：(a)向所述哺乳动物宿主细胞中引入(i)cas9多肽，或编码所述cas9多肽的核酸；(ii)特异性针对营养缺陷诱导型基因座的向导rna，或编码所述向导rna的核酸；和(iii)权利要求1-28中任一项所述的供体模板或载体。44.如权利要求42所述的方法，其还包括：(b)向所述哺乳动物宿主细胞中引入(i)特异性针对第二营养缺陷诱导型基因座的第二向导rna，或编码所述向导rna的核酸，和任选地(ii)第二供体模板或载体。45.将转基因靶向整合至离体哺乳动物细胞中营养缺陷诱导型基因座的方法，其包括：使所述哺乳动物细胞与权利要求1-28中任一项所述的供体模板或载体、cas9多肽和向导rna接触。46.如权利要求43-45中任一项所述的方法，其中所述向导rna是嵌合rna。47.如权利要求43-45中任一项所述的方法，其中所述向导rna包含两个杂交的rna。48.如权利要求38-45中任一项所述的方法，其还包括在所述营养缺陷诱导型基因座中产生一个或多个单链断裂。49.如权利要求38-45中任一项所述的方法，其还包括在所述营养缺陷诱导型基因座中产生双链断裂。50.如权利要求38-49中任一项所述的方法，其中所述营养缺陷诱导型基因座使用所述供体模板或载体通过同源重组进行修饰。51.如权利要求38-50中任一项所述的方法，其还包括将所述经修饰的哺乳动物宿主细胞或离体的哺乳动物细胞扩增成经修饰的哺乳动物宿主细胞群或离体的哺乳动物细胞群，以及任选地培养所述细胞或其群体。52.如权利要求51所述的方法，其还包括选择包含整合到所述营养缺陷诱导型基因座中的转基因的细胞或其群体。53.如权利要求52所述的方法，其中所述选择包括：(i)选择需要所述营养缺陷型因子以发挥功能的细胞或其群体；以及任选地(ii)选择包含整合到所述营养缺陷诱导型基因座中的转基因的细胞或其群体。54.如权利要求52所述的方法，其中所述营养缺陷诱导型基因座是编码尿苷单磷酸合成酶的基因，并且通过与5-foa接触来选择所述细胞或其群体。55.无菌组合物，其包含权利要求1-28中任一项所述的供体模板或载体，或权利要求29-32中任一项所述的核酸酶系统，以及无菌水或药学上可接受的赋形剂。56.无菌组合物，其包含：权利要求33-37中任一项所述的经修饰的宿主细胞，和无菌水或药学上可接受的赋形剂。57.试剂盒，其包含前述权利要求中任一项所述的供体模板或载体或核酸酶系统或经
修饰的宿主细胞，或以上的组合，任选地带有容器或小瓶。58.在对象中表达治疗因子的方法，其包括：(a)施用权利要求33-37中任一项所述的经修饰的宿主细胞；(b)任选地施用条件化方案以允许所述经修饰的宿主细胞移植；和(c)施用所述营养缺陷型因子。59.如权利要求58所述的方法，其中施用所述经修饰的宿主细胞和营养缺陷型因子同时进行。60.如权利要求58所述的方法，其中施用所述经修饰的宿主细胞和营养缺陷型因子依序进行。61.如权利要求58所述的方法，其还包括在足以促进所述治疗因子表达的一段时间内定期持续施用所述营养缺陷型因子。62.如权利要求58所述的方法，其还包括降低所述营养缺陷型因子的施用速率，以降低所述治疗因子的表达。63.如权利要求58所述的方法，其还包括增加所述营养缺陷型因子的施用，以增加所述治疗因子的表达。64.如权利要求58所述的方法，其还包括中止所述营养缺陷型因子的施用，以产生导致所述经修饰的宿主细胞生长抑制或死亡的条件。65.如权利要求58所述的方法，其还包括暂时中断所述营养缺陷型因子的施用，以产生导致所述经修饰的宿主细胞生长抑制的条件。66.如权利要求58所述的方法，其还包括在足以在对象中发挥治疗效应的一段时间内持续施用所述营养缺陷型因子。67.如权利要求58所述的方法，其中所述经修饰的宿主细胞是再生的。68.如权利要求58所述的方法，其中所述经修饰的宿主细胞的施用包括定位递送。69.如权利要求58所述的方法，其中所述营养缺陷型因子的施用包括系统性递送。70.如权利要求38-54和58-69中任一项所述的方法，其还包括在修饰前从待治疗对象得到所述宿主细胞。71.治疗患有疾病、病症或病况的对象的方法，其包括：根据权利要求58-70中任一项所述的方法以足以产生治疗量的所述治疗因子的表达的量向所述对象施用所述经修饰的宿主细胞和所述营养缺陷型因子。72.如权利要求71所述的方法，其中所述疾病、病症或病况选自：癌症、帕金森病、移植物抗宿主病(gvhd)、自身免疫性病况、过度增生性病症或病况、恶性转化、肝脏病况、包括遗传性遗传缺陷的遗传性病况、青少年发病型糖尿病和眼室病况。73.如权利要求71所述的方法，其中所述疾病、病症或病况影响选自以下的至少一种身体系统：肌肉系统、骨骼系统、循环系统、神经系统、淋巴系统、呼吸系统、内分泌系统、消化系统、排泄系统和生殖系统。74.权利要求33-37中任一项所述的经修饰的宿主细胞用于治疗疾病、病症或病况的用途。75.如权利要求33-37中任一项所述的经修饰的宿主细胞，其用于向人类施用，或用于治疗疾病、病症或病况。
76.营养缺陷型因子，其用于向已接受权利要求33-37中任一项所述的经修饰的宿主细胞的人施用。77.减轻或治疗有需要的对象中疾病或病症的方法，所述方法包括向所述对象施用：(a)包含经修饰的宿主细胞的组合物，所述经修饰的宿主细胞包含编码整合在营养缺陷诱导型基因座处的蛋白质的转基因，其中所述经修饰的宿主细胞是营养缺陷型因子营养缺陷型的；以及(b)足以产生所述蛋白质的治疗性表达的量的营养缺陷型因子。78.如权利要求77所述的方法，其中所述营养缺陷诱导型基因座位于编码尿苷单磷酸合成酶(umps)的基因内。79.如权利要求78所述的方法，其中所述营养缺陷型因子是尿苷。80.如权利要求77所述的方法，其中所述营养缺陷诱导型基因座位于编码羧化全酶合成酶(hlcs)的基因内。81.如权利要求80所述的方法，其中所述营养缺陷型因子是生物素。82.如权利要求77所述的方法，其中所述蛋白质是酶。83.如权利要求77所述的方法，其中所述蛋白质是抗体。84.如权利要求77所述的方法，其中所述经修饰的宿主细胞是胚胎干细胞、干细胞、祖细胞、多能干细胞、诱导型多能干(ips)细胞、成体干细胞、分化的细胞、间充质干细胞、神经干细胞、造血干细胞或造血祖细胞、脂肪干细胞、角化细胞、骨骼干细胞、肌肉干细胞、成纤维细胞、nk细胞、b细胞、t细胞或外周血单个核细胞(pbmc)。85.如权利要求77所述的方法，其中所述经修饰的宿主细胞是哺乳动物细胞。86.如权利要求85所述的方法，其中所述哺乳动物细胞是人类细胞。87.如权利要求77所述的方法，其中所述经修饰的宿主细胞来源于待用所述经修饰的宿主细胞治疗的对象。88.如权利要求77所述的方法，其中所述组合物和所述营养缺陷型因子依序施用。89.如权利要求88所述的方法，其中所述组合物在所述营养缺陷型因子之前施用。90.如权利要求77所述的方法，其中所述组合物和所述营养缺陷型因子同时施用。91.如权利要求77所述的方法，其中定期持续施用所述营养缺陷型因子一段时间，其足以促进所述蛋白质的治疗性表达。92.如权利要求77所述的方法，其中所述营养缺陷型因子的施用减少，以降低所述蛋白质的表达。93.如权利要求77所述的方法，其中所述营养缺陷型因子的施用增加，以增加所述蛋白质的表达。94.如权利要求77所述的方法，其中所述营养缺陷型因子的中止施用诱导所述经修饰的宿主细胞的生长抑制或细胞死亡。95.如权利要求77所述的方法，其中在足以在所述对象中发挥治疗效应的一段时间内持续施用所述营养缺陷型因子。96.如权利要求77所述的方法，其中所述经修饰的宿主细胞是再生的。97.如权利要求77所述的方法，其中所述组合物的施用包括定位递送。98.如权利要求77所述的方法，其中所述营养缺陷型因子的施用包括系统性递送。
99.如权利要求77所述的方法，其中所述疾病是溶酶体贮积病(lsd)。100.如权利要求99所述的方法，其中所述溶酶体贮积病(lsd)是高歇氏病(1/2/3型)、mps2(hunter)病、庞贝氏病、法布里病、krabbe病、低磷酸酯酶症、a/b型niemann-pick病、mps1、mps3a、mps3b、mps3c、mps3、mps4、mps6、mps7、苯丙酮尿症、mld、sandhoff病、tay-sachs病或battens病。101.如权利要求82所述的方法，其中所述酶是：葡糖脑苷脂酶、艾度硫酸酯酶、阿糖苷酶α、半乳糖苷酶α、半乳糖苷酶β、半乳糖神经酰胺酶、阿司福酶α、酸性鞘磷脂酶、拉罗尼酶、乙酰肝素n-硫酸酯酶、α-n-乙酰葡糖胺糖苷酶、乙酰肝素-α-氨基葡糖苷n-转乙酰酶、n-乙酰氨基葡萄糖6-硫酸酯酶、elosulfaseα、glasulfate、b-葡萄糖苷酸酶、苯丙氨酸羟化酶、芳基硫酸酯酶a、氨基己糖苷酶b、氨基己糖苷酶a或三肽基肽酶1。102.如权利要求77所述的方法，其中所述疾病是弗里德希氏共济失调、遗传性血管性水肿或脊髓性肌萎缩症。103.如权利要求77所述的方法，其中所述蛋白质是共济蛋白、c1酯酶抑制剂或smn1。104.减小对象中肿瘤大小或降低对象中肿瘤生长速率的方法，所述方法包括：向所述对象施用权利要求33-37中任一项所述的经修饰的宿主细胞。105.离体的经修饰的宿主细胞，其包含：编码治疗因子的转基因，其中所述经修饰的宿主细胞是营养缺陷型因子营养缺陷型的，并且能够表达所述治疗因子。106.如权利要求105所述的经修饰的宿主细胞，其中所述经修饰的宿主细胞是哺乳动物细胞。107.如权利要求105或106所述的经修饰的宿主细胞，其中所述经修饰的宿主细胞是人类细胞。108.如权利要求105-107中任一项所述的经修饰的宿主细胞，其中所述经修饰的宿主细胞是t细胞。109.如权利要求105-108中任一项所述的经修饰的宿主细胞，其中所述经修饰的宿主细胞来源于来自用所述经修饰的宿主细胞或其群体治疗的对象的细胞。110.如权利要求105-109中任一项所述的经修饰的宿主细胞，其中所述经修饰的宿主细胞是包含所述umps基因的敲除的营养缺陷型细胞，并且所述营养缺陷型因子是尿嘧啶来源或尿苷。111.如权利要求105-110中任一项所述的经修饰的宿主细胞，其中所述治疗因子是嵌合抗原受体(car)。112.如权利要求111所述的经修饰的宿主细胞，其中所述car是cd19特异性的car(cd19-car)。113.经修饰的t细胞，其包含：umps基因的敲除以及编码car的转基因，所述umps基因的敲除使所述经修饰的t细胞为尿嘧啶来源或尿苷营养缺陷型的。114.如权利要求113所述的经修饰的t细胞，其用于制备治疗对象的疾病或病况的药物中的用途。115.如权利要求114所述用途的经修饰的t细胞，其中所述疾病或病况是：癌症、帕金森病、移植物抗宿主病(gvhd)、自身免疫性病况、过度增生性病症或病况、恶性转化、肝脏病况、青少年发病型糖尿病、眼室病况，或影响对象的肌肉系统、骨骼系统、循环系统、神经系
统、淋巴系统、呼吸系统、内分泌系统、消化系统、排泄系统或生殖系统的病况。116.如权利要求114或115所述用途的经修饰的t细胞，其中所述疾病或病况是系统性红斑狼疮。117.如权利要求114-116中任一项所述用途的经修饰的t细胞，其中用于治疗所述对象的疾病或病况的药物还包含营养缺陷型因子，其中所述经修饰的t细胞需要所述营养缺陷型因子以在体外、离体和/或在体内发挥功能。118.治疗对象中的疾病或病况的方法，其包括向所述对象施用权利要求105-117中任一项所述的经修饰的宿主细胞。119.如权利要求118所述的方法，其还包括向所述对象施用营养缺陷型因子，其中所述经修饰的宿主细胞需要施用所述营养缺陷型因子以在对象中发挥功能，并且任选地其还包括停止施用所述营养缺陷型因子。120.如权利要求118或119所述的方法，其中所述疾病或病况是自身免疫性病况，并且所述营养缺陷型因子在所述疾病或病况发生时施用至所述对象。121.产生经修饰的哺乳动物宿主细胞的方法，其包括：(a)向所述哺乳动物宿主细胞中引入靶向并切割营养缺陷诱导型基因座处的dna的一种或多种核酸酶系统，或编码所述一种或多种核酸酶系统中的一个或多个组件的核酸；以及(b)向所述哺乳动物宿主细胞中引入编码治疗因子的供体模板。122.如权利要求121所述的方法，其还包括：(c)选择已整合供体模板并敲除所述营养缺陷诱导型基因座的细胞。123.如权利要求122所述的方法，其中所述选择包括：(i)选择需要与所述营养缺陷诱导型基因座对应的营养缺陷型因子以发挥功能的细胞。124.如权利要求121-123中任一项所述的方法，其中所述营养缺陷诱导型基因座是编码尿苷单磷酸合成酶的基因，并且通过需要尿嘧啶来源或尿苷发挥功能或通过使所述细胞与5-foa接触来选择所述细胞。

技术总结
本公开提供了用于生产和使用经修饰的营养缺陷型宿主细胞来改善涉及施用营养缺陷型因子的治疗的组合物和方法。因子的治疗的组合物和方法。因子的治疗的组合物和方法。


技术研发人员：詹姆斯
受保护的技术使用者：莱兰斯坦福初级大学评议会
技术研发日：2020.05.08
技术公布日：2022/2/18