褪黑激素在延缓牛卵泡颗粒细胞体外分化中的应用的制作方法

1.本发明属于家畜配子胚胎工程技术领域，具体涉及褪黑激素在延缓牛卵泡颗粒细胞体外分化中的应用。


背景技术：

2.卵泡颗粒细胞是卵泡中最重要的体细胞，对卵泡局部微环境调节有重要作用。早期颗粒细胞是由卵泡上皮细胞分化而来。颗粒细胞作为重要的类固醇激素合成细胞，可以促进卵巢合成与分泌雌激素和孕激素等多种激素及生长因子，通过缝隙连接调控卵泡膜细胞和卵母细胞的生长、分化和成熟，进而调控卵泡发育、成熟、排卵以及卵泡闭锁等过程。
3.褪黑激素，n-乙酰基-5甲氧基色胺(melatonine，mt)，在脊椎动物中主要由松果体合成和分泌，受光照调节明显。褪黑激素具有清除自由基和防止氧化损伤，促进抗氧化酶的表达，增强线粒体功能，缓解卵泡内的氧化应激等作用。研究表明，褪黑激素与生殖系统联系紧密，主要通过结合下丘脑-垂体-性腺轴系上的结合位点、活化其受体进而调控繁殖功能。褪黑激素通过控制gnrh、lh产生和分泌、睾酮的合成从而启动动物性腺发育和繁殖活动。褪黑激素能够促进许多物种的卵母细胞成熟，如绵羊、猪、牛、小鼠和人等。另外，褪黑激素表现出极强的抗氧化和抗凋亡能力，能够降低囊胚凋亡，提高胚胎质量和胚胎着床率，促进受精及体外受精后的早期胚胎发育。
4.褪黑激素对卵巢颗粒细胞具有调节作用。褪黑激素刺激体外培养大鼠颗粒细胞孕酮的合成(fiske等，1984)，也有研究证明褪黑激素对孕酮分泌无影响(nakamura等，2014)。也有研究结果表明褪黑激素促进体外培养的牛和人颗粒细胞孕酮的合成和分泌(webley等，1986)。近期研究证实褪黑激素促进体外培养羊颗粒细胞孕酮的分泌(baratta等，1992)。褪黑激素对猪颗粒细胞的影响不同于牛和羊，sirotki(1994)证实其刺激雌激素的合成，抑制孕酮的合成。综上，褪黑激素对颗粒细胞的影响因物种，处理浓度和时间，培养液成分的不同而造成结果有所差异。目前，褪黑激素对牛颗粒细胞的发育和功能调节作用的研究比较少见，有待深入研究。
5.卵巢囊肿是引起奶牛不孕症最常见的原因之一，其严重影响着奶牛的繁殖效率，制约着奶牛场的发展和养殖业的经济效益。外源促肾上腺皮质激素(acth)可诱导奶牛发生卵泡囊肿，其主要通过激活下丘脑-垂体-肾上腺轴，改变lh分泌的脉冲频率，使排卵前lh峰无法出现而不能排卵，继而形成卵巢囊肿，其机理与应激导致卵巢囊肿一致(amweg等，2013；biran等，2015；velazquez等，2013)。基于此，体外培养牛卵泡颗粒细胞，加acth后对颗粒细胞类固醇激素分泌水平产生了影响。但是，acth对颗粒细胞类固醇激素的分泌影响是否可以得到恢复，褪黑素对颗粒细胞类固醇激素分泌功能的恢复的作用尚不确定，目前无此方面的研究报道。


技术实现要素：

6.本发明目的在于提供褪黑激素一种新的用途，具体是褪黑激素在延缓牛卵泡颗粒
细胞体外分化中的应用。
7.为实现上述目的，本发明采用以下的技术方案为：
8.褪黑激素在延缓牛卵泡颗粒细胞体外分化中的应用。
9.如上所述的应用，其包括先用促肾上腺皮质激素对孕酮合成的刺激，后再添加褪黑激素进行延缓牛卵泡颗粒细胞体外分化。
10.如上所述的应用，优选地，所述褪黑激素在牛卵泡颗粒细胞体外的培养液中浓度为10-9
mol/l～10-5
mol/l。
11.进一步，优选地，所述褪黑激素在牛卵泡颗粒细胞体外的培养液中浓度为10-7
mol/l。
12.如上所述的应用，优选地，所述培养液包括有dmem和ham’s f-12的按体积比为1:1的基础培养基，并含有体积比为10％的胎牛血清，浓度为100u/ml的青霉素和浓度为0.1mg/ml的链霉素。
13.进一步地，所述dmem和ham’s f-12的按体积比为1:1的基础培养基为含有浓度为365mg/l的谷氨酰胺和2438mg/l的碳酸氢钠。
14.如上所述的应用，优选地，所述培养液还包括含有30ng/ml的类胰岛素一号增长因子(igf1)。
15.如上所述的应用，优选地，所述培养液还包括含有浓度为10-7
mol/l促肾上腺皮质激素(acth)。
16.褪黑激素在抑制牛卵泡颗粒细胞体产生孕酮中的应用。
17.褪黑激素在制备牛卵泡颗粒细胞抑制类固醇激素合成药物制剂中的应用。
18.如上所述的应用，优选地，所述类固醇激素为孕酮。
19.本发明的有益效果在于：
20.本发明提供了褪黑激素的一种新的用途。在牛卵泡颗粒细胞进行体外培养时，类胰岛素一号增长因子(igf1)诱导下促肾上腺皮质激素(acth)可促进颗粒细胞孕酮等类固醇激素的合成。促肾上腺皮质激素通过上调类固醇激素的合成，加速颗粒细胞的分化。本发明通过采用添加有褪黑激素的体外培养液对牛卵泡颗粒细胞培养时，褪黑激素能够抑制牛卵泡颗粒细胞孕酮的合成。牛颗粒细胞在acth igf1诱导下，褪黑激素抑制颗粒细胞孕酮等类固醇激素的合成。褪黑激素作为牛卵泡发育的调控因子，通过下调孕酮的合成抑制acth igf1的效应，进而延缓颗粒细胞分化。
21.将褪黑激素应用在牛卵泡颗粒细胞的抑制孕酮合成的制剂中，具有良好的应用价值。褪黑激素可作为新型的牛卵泡颗粒细胞抑制类固醇激素合成药物制剂在家畜胚胎工程上推广应用，具有良好的市场效应和社会效应。
附图说明
22.图1为全部添加有acth和igf1时，在不加与加不同浓度的褪黑激素(同时添加acth，处理48h)处理时，颗粒细胞孕酮合成情况的比较图。
23.图2为全部添加有acth和igf1时，在不加与加不同浓度的褪黑激素(acth先处理24h，褪黑激素再处理24h)处理时，颗粒细胞孕酮合成情况的比较图。
24.图3为全部添加有acth和igf1时，在不加与加不同浓度的褪黑激素(褪黑激素先处
理24h，acth再处理24h)处理时，颗粒细胞孕酮合成情况的比较图。
25.其中，图中*表示存在差异(p《0.05)。
具体实施方式
26.以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的前提下，对本发明所作的修饰或者替换，均属于本发明的范畴。本发明的实施例中所用卵巢采自河北省大厂县屠宰场，促肾上腺皮质激素由南京莱昂生物科技有限公司合成，褪黑激素由美国sigma公司合成。
27.若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，除另有规定，本发明所用试剂均为分析纯或以上规格。所用试剂来源如下：dmem/f(1:1)基础培养基、胎牛血清(fbs)购自gibco(上海)，重组人igf-1购自science 11(san diego，ca)。牛孕酮放射免疫测定(ria)：北京北方生物技术研究所；rna检测试剂：一链合成试剂盒，荧光定量试剂盒(天根生化科技有限公司，北京)。
28.实施例1褪黑激素对牛卵泡颗粒细胞类固醇激素合成的影响
29.1.细胞培养
30.在屠宰场采集卵巢，置于生理盐水中，其中生理盐水含有青霉素100iu/ml和链霉素100iu/ml及0.9％的氯化钠，37℃保温瓶在2h内运回实验室。颗粒细胞分离自直径3～8mm的中等大小的卵泡。要求卵泡血管清晰，卵泡液透明。使用10ml注射器从屠宰场获取的牛卵巢表面抽取3～8mm卵泡中的液体。将卵泡液收集在一个15ml的离心管中，然后用500g离心5min，细胞沉淀于离心管底部，去上清。用pbs缓冲液重悬细胞，如此离心重复，反复4次。用含有胎牛血清的1ml和dmem/f(1:1)培养液9ml的混合的培养液重悬细胞，经200目过滤网过滤除去细胞块，获得的颗粒细胞的纯度大于90％。
31.进行颗粒细胞计数，大约铺2
×
105个细胞/ml，用5ml含有10％胎牛血清(fbs)的培养液，置于5％co2，37℃条件下培养箱中静置培养。经12h，颗粒细胞即可贴壁，观察，此时更换培养液。每隔24小时更换一次培养液。
32.当细胞增长融合至80％以上时，弃去培养液，用pbs漂洗2次。加1ml0.25％胰蛋白酶消化液，37℃消化3min，镜下看到细胞收缩变圆，加1ml含有10％胎牛血清的培养液终止消化。收集细胞于离心管中，1500rpm离心5min。用pbs洗涤3次。收集的细胞用培养液重悬，计数，按1
×
105个细胞/ml接种于12孔培养板上，37℃、5％co2培养箱内培养。上述所用10％胎牛血清的培养液为dmem/f(1:1)即dmem和ham’s f-12的按体积比为1:1作为基础培养液，之后添加有体积比为10％的胎牛血清，和浓度为100u/ml的青霉素和浓度为0.1mg/ml的链霉素，其中，dmem/f(1:1)培养液中含有谷氨酰胺的浓度为365mg/l和碳酸氢钠的浓度2438mg/l。
33.2.褪黑激素对牛卵泡颗粒细胞的处理步骤1获得的颗粒细胞在含体积比为10％fbs的培养液中培养24小时后，弃去培养液，pbs洗涤2次。之后进行如下实验：
34.实验一，分别用含有浓度为10-7
mol/l的促肾上腺皮质激素(acth)和30ng/ml的igf1，及浓度为0，10-9
，10-7
，10-5
mol/l的褪黑激素，无血清dmem培养液处理48h。
35.实验二，分别用30ng/ml的igf1和浓度为10-7
mol/l的促肾上腺皮质激素(acth)处理颗粒细胞24h后，再用浓度为0，10-9
，10-7
，10-5
mol/l的褪黑激素处理24h，无血清培养液培
养。
36.实验三，分别用浓度为0，10-9
，10-7
，10-5
mol/l的褪黑激素处理24h后，再用浓度为10-7
mol/l的促肾上腺皮质激素(acth)处理颗粒细胞24h，无血清培养液培养。待培养结束后，收集培养液用于测定孕酮含量。此实验设计3个不同重复。其中无血清培养液培养为含有浓度为365mg/l的谷氨酰胺和2438mg/l的碳酸氢钠，浓度为100u/ml的青霉素和浓度为0.1mg/ml的链霉素。
37.3.检测方法及结果
38.孕酮激素分泌水平用spss软件中的单因素因子anova分析。数据用平均数
±
标准误表示。孕酮采用放射免疫方法进行测定，孕酮激素表示为ng/ml。对孕酮含量的检测结果，全部添加有acth时，在不加与加不同浓度的褪黑激素(同时添加acth，处理48h)处理时，颗粒细胞孕酮合成情况的比较图如图1所示，其中，图中0表示不添加即为对照，mel10-5 m表示褪黑激素的浓度为10-5
mol/l，其它以此类推；具体数据见表1，全部添加有acth时，在不加与加不同浓度的褪黑激素(acth先处理24h，褪黑激素再处理24h)处理时，颗粒细胞孕酮合成情况的比较图如图2所示，具体数据见表2。
39.全部添加有acth时，在不加与加不同浓度的褪黑激素(褪黑激素先处理24h，acth再处理24h)处理时，颗粒细胞孕酮合成情况的比较图如图3所示，具体数据见表3。
40.表1 acth mt同时添加处理(48h)对牛颗粒细胞孕酮分泌的影响
41.处理处理次数(n)孕酮(p4,pg/ml)control(0)33.27
±
0.44acth(10-7
m)34.83
±
0.51aacth(10-7
m) mt(10-5
m)同时33.24
±
0.86acth(10-7
m) mt(10-7
m)同时33.02
±
0.34bacth(10-7
m) mt(10-9
m)同时33.01
±
0.97
42.表2 acth先处理24h,后mt处理24h对牛颗粒细胞孕酮分泌的影响
[0043][0044][0045]
表3先mt处理24h，acth后处理24h对牛颗粒细胞孕酮分泌的影响
[0046]
处理处理次数(n)孕酮(p4,pg/ml)control(0)37.64
±
0.92cacth(10-7
m)312.41
±
1.84a先mt(10-5
m) 后acth(10-7
m)36.46
±
1.63
bc
先mt(10-7
m) 后acth(10-7
m)35.79
±
0.90b先mt(10-9
m) 后acth(10-7
m)34.04
±
0.78b[0047]
注：同列不同字母表示差异显著(p《0.05)
[0048]
从结果图1-3，数据如表1-3看，其中单独的促肾上腺皮质激素能提高颗粒细胞的孕酮合成，引起雌激素/孕酮比值降低，促进了颗粒细胞的分化，可能会引起牛卵泡囊肿的发生。
[0049]
为了验证褪黑激素延缓颗粒细胞的分化，不同浓度褪黑激素对颗粒细胞进行预处理后，再用acth进行处理，发现被acth刺激的孕酮合成得到抑制。acth和褪黑激素同时添加处理，或者acth先处理后，褪黑激素再添加处理颗粒细胞，两者结果是相同的，褪黑激素抑制孕酮合成。这些结果表明acth促进颗粒细胞孕酮的合成，而褪黑素可以消除acth对孕酮合成的刺激，从而延缓颗粒细胞分化，保证其正常排卵。所以，将褪黑激素应用在牛卵泡颗粒细胞的抑制孕酮合成的制剂中，能够消除acth对孕酮合成的刺激，从而延缓颗粒细胞分化，保证其正常排卵，同时避免牛卵泡囊肿的发生，具有良好的应用价值。