一种Nano-ESI-MS技术检测金线兰中多胺代谢产物的方法与流程

一种nano-esi-ms技术检测金线兰中多胺代谢产物的方法
技术领域
1.本发明属于检测技术领域，具体涉及一种nano-esi-ms技术检测金线兰中多胺代谢产物的方法。


背景技术：

2.多胺是一类广泛存在于生物体内的小分子含氮碱，参与了植物生长发育的整个过程，并与抗逆性密切相关。目前，植物中的多胺合成代谢途径已基本揭示。金线兰为兰科开唇兰属植物，是珍稀名贵中药材和国家二级重点保护野生植物，具有极高的经济和药用价值。目前其野生资源锐减，通过组织培养进行快速繁殖是培育金线兰最有效的途径，但是因为市场混杂，因此金线兰品质的快速检测成为热点问题。
3.近年来，多种分析技术被应用于生物样品中多胺及其代谢衍生物的检测与分析，包括色谱层析、色谱-质谱联用、核磁共振波谱等。多胺类物质在植物中含量很低，一般需要衍生化后检测。因此如何准确而快速地检测植物组织中的多胺越来越受到人们的重视。


技术实现要素：

4.针对背景技术中提到的问题，本发明提供了一种nano-esi-ms技术检测金线兰中多胺代谢产物的方法，具体是通过如下技术方案实现的：
5.一种nano-esi-ms技术检测金线兰中多胺代谢产物的方法，包括以下步骤：
6.1)取新鲜金线兰叶和茎冷冻研磨2min，取出加入提取溶剂，涡旋混匀后50℃超声提取30min，然后4℃下离心10min，滤渣重复提取，合并上清液，过0.22μm有机滤膜得到金线兰样品；
7.2)准确称取1,3-丙二胺、1,4-丁二胺、γ-氨基丁酸、胍基丁胺、鸟氨酸、亚精胺、甲硫氨酸、精氨酸、精胺9种标准品物质，每种分别配制成浓度为0.01、0.05、0.1、0.5、1、5、10μg/ml的溶液，加标检测后建立标准曲线；根据标准品的二级和三级碎片信息对物质进行定性，根据响应较高的二级碎片离子的响应强度建立标准曲线后进行准确定量；
8.3)每种标准品在金线兰样品中加标浓度为0.01、0.05、0.1、5、10、50、100μg/ml，检测9种标准品的加标样品，每个浓度加标样品平行检测6次，以加标样品的浓度为横坐标x，相应的9种标准品的质谱信号强度为纵坐标y绘制标准曲线：y＝ax b，并计算相关系数r2。
9.进一步地，步骤1)所述新鲜金线兰由高5-7cm、长势一致、带3个节的金线兰组培苗茎段接种在ms 0.5mg/l naa 30g/l蔗糖 6.5g/l琼脂 0.5g/l活性炭的培养基上培养120d而得。
10.进一步地，所述金线兰组培苗由江西省植物资源开发与利用重点实验室提供，金线兰叶呈深绿色，脉络为金色。
11.进一步地，培养基ph＝5.8，每瓶接种4段；培养条件为：相对湿度为(75
±
5)％，温度为(25
±
2)℃，led光照强度为60μmol
·
m-2
·
s-1
，光照周期为12h光照培养、12h黑暗培养。
12.进一步地，步骤1)所述提取溶剂为甲醇：水＝2:8，v/v。
13.进一步地，步骤1)所述离心的离心力为10000
×
g；所得金线兰样品装载于用p-1000微电极拉制仪将硅酸硼毛细管熔断拉制成颈部长为10mm的纳米移液管。纳米移液管为锥口内径范围属于纳米级别的移液管，用于装载样品，作为离子源形成样品电喷雾的发射喷口。
14.进一步地，步骤3)检测采用ltq-xl线性离子阱质谱仪和xcalibur处理系统，设置nano-esi为正离子模式，电离电压为1kv，离子传输管温度为150℃，喷雾电压为1.0kv，进样距离为5mm，离子源温度150℃，离子源电压为45v，离子传输管电压为70v。
15.进一步地，最低检测限采用lod＝3.3σ/s公式计算，定量限采用loq＝10σ/s公式计算；其中，σ为空白标准偏差，s为校正曲线斜率。
16.进一步地，在线性范围内通过添加0.01、0.1、1μg/ml三个浓度的加标样品，每个浓度的加标样品平行测定6次，回收率根据公式：回收率＝(测定浓度/实际浓度)
×
100％计算，精密度根据公式：精密度＝标准偏差/平均信号强度
×
100％计算。
17.与现有技术相比，本发明的有益效果是：
18.本发明研究利用nano-esi-ms可灵敏、快速、准确同时检测9种多胺代谢途径物质，建立了nano-esi-ms检测多胺代谢途径中代谢产物方法。相较于传统利用色谱与质谱联用方法，它有以下优点：第一，方法简便，提取简单，不需要进行复杂衍生化处理，只需甲醇水溶液就可提取检测；第二，灵敏度极高，对金线兰中含量极低的多胺类物质同样能够检测，在不同光质下的变化也可以灵敏发现差异；第三，重复性很好，特征性很强，本发明方法非常稳定，基本不会产生较大的仪器偏差或漂移；第四，样本用量少，只需要5μl，甚至更少，甚至对单细胞代谢检测都具有很好的应用前景；第五，检测速度很快，一般一个样品在30s内就可以获取金线兰中的所有指纹图谱信息，尤其是需要大批量检测很多样本时，可以实现高通量快速检测。nano-esi-ms检测多胺具有较好的应用前景，也为道地药材的鉴别和品质检测评价提供了新思路，具有很好的使用价值。
附图说明
19.图1是nano-esi-ms技术检测金线兰中多胺代谢产物的实验装置图。
20.图2是nano-esi-ms技术检测金线兰中多胺代谢产物的一级指纹图谱。
21.图3是nano-esi-ms技术检测金线兰中多胺代谢产物的二级和三级指纹图谱。
具体实施方式
22.为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
23.实施例
24.1.实验材料处理
25.选用高5-7cm、带三个节的福建金线兰组培苗，由江西省植物资源开发与利用重点实验室提供，金线兰叶呈深绿色，脉络为金色。选取长势一致带3个节金线兰组培苗茎段接种在ms 0.5mg
·
l-1
naa 30g
·
l-1
蔗糖 6.5g
·
l-1
琼脂 0.5g
·
l-1
活性炭的培养基上，ph＝5.8，每瓶接种4段。培养室相对湿度为(75 5)％，温度为(25
±
2)℃，led光照强度为60μ
mol
·
m-2
·
s-1
，光照周期为12h光照培养，12h黑暗培养。
26.2.植物样品采集
27.金线兰培养至120d时，选取长势一致金线兰的叶和茎用于样品检测分析。
28.3.实验样品制备
29.将新鲜金线兰叶和茎利用全自动样品冷冻研磨仪在50hz条件下研磨2min，准确快速称取0.1g样品转移至2ml离心管中，加入1ml提取溶剂(甲醇：水＝2:8，v/v)，涡旋使其混匀，50℃超声提取30min，4℃下10000
×
g离心10min，滤渣重复提取一次，合并上清液，过0.22μm有机滤膜，每个分析样本做3个生物学重复，上机检测。
30.4.纳米移液管(nanopipette)的制作
31.纳米移液管为锥口内径范围属于纳米级别的移液管，用于装载样品，作为离子源形成样品电喷雾的发射喷口。利用p-1000微电极拉制仪将硅酸硼毛细管熔断拉制成颈部长为10mm的纳米移液管。
32.5.nano-esi-ms样品检测
33.利用ltq-xl线性离子阱质谱仪和xcalibur处理系统，设置nano-esi为正离子模式，电离电压为1kv，离子传输管温度为150℃，喷雾电压为1.0kv，进样距离为5mm，离子源温度为150℃，离子源电压为45v，离子传输管电压为70v。
34.6.标准品的制备及物质定性定量
35.准确称取1,3-丙二胺、1,4-丁二胺、γ-氨基丁酸、胍基丁胺、鸟氨酸、亚精胺、甲硫氨酸、精氨酸、精胺9种标准品物质，配置成浓度分别为0.01、0.05、0.1、0.5、1、5、10μg/ml溶液，加标检测后建立标准曲线。根据标准品的二级和三级碎片信息对物质进行定性，根据响应较高的二级碎片离子的响应强度建立标曲后进行准确定量。
36.7.方法学实验
37.每种标准品在金线兰样品中加标浓度为0.01，0.05，0.1，5，10，50，100μg/ml，检测9种标准品的加标样品，每个浓度加标样品平行检测6次，以加标样品的浓度(x)为横坐标，相应的9种标准品的质谱信号强度为纵坐标绘制标准曲线(y)：y＝ax b，并计算相关系数r2。最低检测线(limit of detection，lod)采用lod＝3.3σ/s(其中σ为空白标准偏差，s为校正曲线斜率)公式来计算，定量限(limit of quantitation，loq)采用loq＝10σ/s来计算。在线性范围(linear range，lr)内通过添加0.01、0.1、1μg/ml三个浓度的加标样品，每个浓度的加标样品平行测定6次，回收率(recovery)根据公式：回收率＝(测定浓度/实际浓度)
×
100％来计算。精密度(relative standard deviation，rsd)根据公式：精密度＝标准偏差/平均信号强度
×
100％来计算。
38.8.金线兰中多胺代谢产物的一级指纹图谱
39.利用nano-esi-ms在正离子模式下，检测了金线兰叶和茎中的多胺代谢产物并获得一级指纹图谱(图2)，主要离子峰m/z 57、m/z 175、m/z 112、m/z 75、m/z 59、m/z 171在质谱图中都存在，但金线兰叶中物质比茎中更为丰富。
40.9.多胺代谢通路中物质的定性
41.利用nano-esi-ms在正离子模式下，共检测到金线兰多胺代谢途径中1,3-丙二胺、1,4-丁二胺、γ-氨基丁酸、胍基丁胺、鸟氨酸、亚精胺、甲硫氨酸、精氨酸、精胺等9种代谢产物(表1)。以1,3-丙二胺为例，其分子量为74，在正离子模式下其m/z为75，根据图3中的二级
质谱中，质子化分子离子(m/z106)失去质量分数为17(nh3)的碎片产生m/z 58的主要碎片离子，再通过三级质谱实验，m/z 58失去质量数为28(ch2n)的碎片产生m/z 30的主要碎片离子，并且这也与1,3-丙二胺标准品的二级和三级碎片裂解行为一致，因此最终判断m/z 75物质为1,3-丙二胺(图2)。二级质谱图中质子化的1,4-丁二胺(m/z 89)则是通过丢失ch2n和nh3而产生m/z 61和m/z 72的主要碎片，对主要碎片m/z 61进一步三级质谱实验发现，m/z 61丢失nh4产生m/z 43的主要碎片，这也与1,4-丁二胺标准品的二级和三级碎片裂解行为一致。γ-氨基丁酸(m/z 104)通过丢失nh3和h2o而产生m/z 86和m/z 87的主要碎片离子峰，其中m/z 87可进一步通过丢失cho2和h2o产生m/z 43和m/z 69的主要碎片。胍基丁胺(m/z 131)通过丢失c2h5n3和nh3而产生m/z 60和m/z 114的主要碎片离子峰，其中m/z 114可进一步通过丢失ch2n2和nh3产生m/z 72和m/z 97的主要碎片离子峰。鸟氨酸(m/z 133)通过丢失h2o和nh3而产生m/z 115和m/z 116的主要碎片离子峰，其中m/z 115可进一步通过丢失ch2n和h2o产生m/z 87和m/z 97的主要碎片离子峰。亚精胺(m/z 146)通过丢失nh4和nh3而产生m/z 128和m/z 129的主要碎片离子峰，其中m/z 128可进一步通过丢失nh4产生m/z 110主要碎片离子峰。甲硫氨酸(m/z 150)通过丢失ch2n和nh3而产生m/z 122和m/z 133的主要碎片离子峰，其中m/z 133可进一步通过丢失ch2o2和ch5n2产生m/z 87和m/z 105的主要碎片离子峰。精氨酸(m/z 175)通过丢失h2o和ho而产生m/z 157和m/z 158的主要碎片离子峰，其中m/z 157可进一步通过丢失ch5n2和nh3产生m/z 112和m/z 140的主要碎片离子峰。精胺(m/z 203)通过丢失ch2n2和nh4而产生m/z 161和m/z 185的主要碎片离子峰，其中m/z 185可进一步通过丢失ch2n和nh产生m/z 157和m/z 170的主要碎片离子峰。
42.10.多胺代谢通路中物质的定量
43.根据物质的二级碎片离子响应建立标曲后进行准确定量，金线兰中9种多胺代谢通路物质含量在0.3-55.0μg/g范围内(表2)，叶中含量都要高于茎中。
44.表1利用nano-esi-ms对金线兰中多胺代谢产物的串联质谱分析
45.[0046][0047]
表2利用nano-esi-ms检测金线兰中多胺代谢产物的物质含量
[0048]
[0049][0050]
注：lr：线性范围；lod：检测线；loq：定量限。
[0051]
以上所描述的实施例仅为本发明优选实施例，并不用于限制本发明。对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种变化和更改，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。