一种分子印迹人工抑制剂及其制备方法和应用与流程

1.本发明属于生物医学高分子材料制备技术领域，具体涉及一种分子印迹人工抑制剂及其制备方法和应用。


背景技术：

2.生物体内存在着多种天然抑制剂，其是一种可以与生物体内活性因子特异性结合并能抑制其生物活性的物质，例如免疫抑制剂、酶抑制剂、生长抑制剂等。抗体是一种能与抗原特异性结合的的天然抑制剂，其在免疫系统中常用来中和病原体抑制抗原的活性。抗体在医疗实践中应用甚为广泛，常被应用在疾病的预防、医学诊断和治疗等方面。但是，抗体仍存在易聚集、难纯化、价格昂贵、不宜存储、非生理条件下性能差的缺点，因此开发人工抗体或者人工抑制剂作为天然抑制剂替代物成为了生物医学领域的焦点课题。
3.分子印迹技术是模拟天然受体与配体相互作用发展而来的，制备对某一特定分子具有特异性识别能力的聚合物的技术。上述技术制备的聚合物即为分子印迹聚合物(molecularly imprinted polymers，mips)，mips具有与天然抗体性能相媲美的特异性识别能力，被广泛的应用于分离、检测等领域。传统分子印迹聚合物的制备方法主要包括本体聚合、分散聚合，表面聚合等。但是这些方法存在着高低亲和性位点不统一、识别位点分布不均、亲水性差、难以制备纳米尺度mips、体系优化复杂等不足，无法满足制备天然抑制剂的替代物的需求，导致mips无法在生物体内以及细胞层面实现真地模拟天然抗体性能。


技术实现要素：

4.针对现有技术中存在不足，本发明提供了一种分子印迹人工抑制剂及其制备方法和应用。在本发明中，将模板分子rgd多肽固定在固体载体上，在此基础上通过固相合成印迹策略制备得到了温敏的分子印迹纳米聚合物(mip-nps)人工抑制剂；所述纳米印迹聚合物人工抑制剂具有特异性高、物理和化学稳定性好、易转移和成本较低的优点，同时还具有温度响应性能，对抑制rgd与整合素结合中有着很好的应用。
5.本发明中首先提供了一种分子印迹人工抑制剂，所述分子印迹人工抑制剂是由rgd多肽复合分子印迹聚合物，所述分子印迹人工抑制剂为单分散球形纳米颗粒，粒径为30～120nm。
6.本发明中还提供了上述分子印迹人工抑制剂的制备方法，具体包括如下步骤：
7.(1)肽功能化的gbs的制备：
8.将活化后的玻璃珠(glassbeads,gbs)与含有3-氨丙基氨乙氧基硅烷(aptes)的甲苯溶液混合均匀，恒温反应过夜，洗涤，干燥，得到硅烷化的gbs；
9.接着向gbs中加入含有戊二醛的pbs缓冲液，恒温反应过夜，得到戊二醛功能化的gbs；
10.然后向得到的戊二醛功能化的gbs中加入含有rgd多肽的缓冲液,并在室温下孵育，孵育结束后洗涤，得到肽功能化的gbs。
11.(2)分子印迹人工抑制剂的制备：
12.将得到的肽功能化的gbs、含异丙基丙烯酰胺nipam和苯甲脒ebam的缓冲液混合均匀后置于色谱柱中，通氮除氧，然后加入氧化剂和还原剂，得到聚合混合物，然后循环水浴保持塔温过夜反应，反应结束后洗脱、收集得到分子印迹人工抑制剂。
13.进一步的，步骤(1)中，gbs的活化步骤为：向煮沸后的naoh溶液中加入玻璃珠，加热反应，反应结束后洗涤，干燥，得到活化后的gbs。
14.进一步的，所述naoh溶液的浓度为4～8mol/l，naoh溶液与玻璃珠的用量比为100～200ml：80～120g；所述加热反应的条件为加热15min。
15.进一步的，步骤(1)中，所述活化后的玻璃珠与含有aptes的甲苯溶液用量比为80～120mg:50～100ml；所述含有aptes的甲苯溶液中，aptes的体积分数为2％～5％；所述含有戊二醛的pbs缓冲液中，戊二醛的体积分数为2％～5％。
16.进一步的，步骤(1)中，两次提及的恒温反应均为在20～60℃下反应。
17.进一步的，步骤(2)中，肽功能化的gbs、nipam、ebam和pbs缓冲溶液的用量比为80～120g：236.2～246.2mg：17～19.2mg：40～53ml，使肽功能化的gbs、nipam和ebam三者浓度和为0.5％(w/w)。
18.进一步的，步骤(2)中，所述氧化剂为过硫酸钾kbs，还原剂为四甲基乙二胺temed；所述肽功能化的gbs、kbs和temed的用量比为80～120g：400μl～500μl：1μl～1.35μl。
19.进一步的，步骤(2)中，所述水浴恒温反应条件为：循环水浴温度为20℃～60℃，反应时间为12h～17h；所述洗脱为采用150ml～250ml的pbs在温度20～40℃下洗脱。
20.本发明中还提供了上述分子印迹人工抑制剂在抑制rgd与整合素结合中的应用。
21.与现有技术相比，本发明的有益效果：
22.本发明通过固相合成印迹策略制备分子印迹纳米人工抑制剂，相比于传统聚合方法制得的聚合物具有位点分布均一，高低亲和位点统一，适用于纯水溶液，纳米尺度等优点。本发明中，将模板分子rgd固定在玻璃珠上，选用与rgd中天冬氨酸d中羧基的具有强氢键作用的苯甲脒作为功能单体，加入温敏性单体n-异丙基丙烯酰胺，37℃下在装满gbs的色谱柱中氧化还原聚合，然后通过温度控制先在低温下将低亲和力纳米粒子和未反应的单体洗脱，最终收集到对rgd具有高亲和力的纳米粒子，方法简单，易于操作。
23.本发明中，合成mip-rgd和nip-rgd并原位纯化在玻璃珠上，通过简单地温度变化释放mip-rgd和nip-rgd，使mip-rgd和nip-rgd对模板分子rgd较高的特异性和选择性。由于mip-rgd和nip-rgd与rgd特异性结合，将rgd表面位点阻断，表现出对rgd与整合素结合的有效抑制作用，进而可逆调控细胞行为，成功合成的具有高特异性且对rgd具有抑制作用的人工抗体抑制剂。
24.本发明制备的mip-nps可在细胞层面实现模拟天然抗体/抑制剂的生物学功能，将分子印迹技术真正实现了仿生功能，在组织学生物工程中有巨大应用前景。
附图说明
25.图1是活化后的gbs(a)和戊二醛功能化的gbs(b)的sem图。
26.图2是gbs的xps图和ftir光谱图；图中，a为未处理、硅烷化和戊二醛功能化gbs的xps图，b为活化和戊二醛功能化的gbs的ftir光谱图。
27.图3是实施例1中mip-rgd(a)和nip-rgd(b)动态光散射测试图(dls)。
28.图4是实施例1中mip-rgd(a)和nip-rgd(b)的透射测试图(tem)。
29.图5是实施例2(a)和实施例3(b)中mip-rgd的dls测量尺寸分布图。
30.图6是注射制备的mip-rgd(a)和nip-rgd(b)引起的rgd固定化qcm传感器的频率变化(δf)的时间过程图(a)和结合等温线图(b)。
31.图7是mip-rgd拟对rgd活性的抑制作用的细胞粘附示意图；图中a为吸附状态，b为脱附状态。
32.图8是不同浓度的mip-rgd和nip-rgd与l929共培养24h后细胞的存活率。
具体实施方式
33.下面结合附图以及具体实施例对本发明作进一步的说明，但本发明的保护范围并不限于此。
34.本领域技术人员应清楚，在下文中，如果未特别说明，本发明所用材料和操作方法是本领域公知的，所使用的实验方法均为常规方法，所用材料、试剂等均可从化学试剂公司购买。本发明中多肽rgd购自苏州强耀生物科技有限公司。
35.实施例1：分子印迹人工抑制剂的制备
36.(1)功能化的gbs的制备：
37.将100g玻璃珠(直径为100μm)孵育在4m naoh溶液中，100℃煮沸10分钟后用水和丙酮清洗，然后在50℃的烤箱中干燥。将上述活化后的gbs放入玻璃培养皿中，与100ml含aptes(2％体积分数)的无水甲苯混合，在摇床上摇匀，过夜反应，然后用250ml无水甲苯和250ml丙酮洗涤，并在50℃的烤箱中干燥3小时。接着将干燥后产物与100ml含有5％戊二醛(v/v)的缓冲液a混匀，在30℃的摇床中反应过夜，然后洗涤得到戊二醛功能化的gbs。
38.向上述得到的戊二醛功能化的gbs中加入50ml含有45mg rgd的缓冲液pbs，室温下孵育5小时，缓冲液pbs洗涤，得到肽功能化的gbs，然后在含有1m nacl的水:乙醇(4:1)混合物中8℃储存，备用。
39.图1为活化后的gbs(a)和戊二醛功能化的gbs(b)的sem图，从图中可以看出，活化的gbs表面更平滑，而功能化的gbs表面更粗糙，且涂有均匀的纳米颗粒涂层。
40.图2a为未处理、硅烷化和戊二醛功能化gbs的xps图，从图中可以看出，戊二醛功能化的gbs中n元素增多。图2b为激活活化和戊二醛功能化的gbs的ftir光谱图，ftir分析证实了戊二醛化gbs的化学衍生化，在3454cm处具有强宽带可能归因于oh在激活的拉伸，-cho在2360cm和2910cm处有两个特征条带，表明gbs表面存在醛基。
41.(2)分子印迹人工抑制剂的制备：
42.将240mg nipam和18mg ebam混合在50ml缓冲液pbs中，用氮气吹扫30min，加入500μl含18.5mg kps和1.35μl temed的缓冲液pbs，得到聚合混合物。将聚合混合物泵入塔内，打开循环水浴，设置并保持塔温37℃，反应15小时。
43.为了去除低亲和力的聚合物和未反应的单体，37℃时用250ml pbs缓冲液清洗色谱柱，收集得到50ml nip-rgd。37℃洗涤后，用20ml pbs缓冲液在6℃下洗脱得到高亲和力mip-rgd，通过动态光散射测试分析了得到的mip-rgd和nip-rgd的尺寸。
44.图3是mip-rgd(a)和nip-rgd(b)动态光散射测试图(dls)。如图3(a)所示，mip-rgd
的粒径在98nm左右；如图3(b)所示，nip-rgd的粒径在122nm左右。
45.图4是mip-rgd(a)和nip-rgd(b)的透射测试图(tem)，从图中可以看出，nip-rgd和mip-rgd的透射测试图粒径和dls粒径测试尺寸一致。
46.实施例2：分子印迹人工抑制剂的制备
47.将236.2mg nipam和17mg ebam混合在40ml缓冲液pbs中，用氮气吹扫30min，加入由含kps(18.5mg)的缓冲液pbs(18.5mg加入500l缓冲液pbs中)和temed(1l)组成的引发剂。将聚合混合物泵入塔内，打开循环水浴，设置并保持塔温37℃，反应15小时。
48.为了去除低亲和力的聚合物和未反应的单体，37℃时用250ml pbs缓冲液清洗色谱柱，收集得到50ml nip-rgd。37℃洗涤后，用20ml pbs缓冲液在6℃下洗脱得到高亲和力mip-rgd，通过动态光散射测试分析了得到的mip-rgd和nip-rgd的尺寸。
49.图5a是实施例2中mip-rgd的dls测量尺寸分布图,通过附图分析，mip-rgd的粒径在30nm左右。
50.实施例3：分子印迹人工抑制剂的制备
51.将246.2mg nipam和19.2mg ebam混合在53ml缓冲液pbs中，用氮气吹扫30min，加入由含kps(18.5mg)的缓冲液pbs(18.5mg加入500l缓冲液pbs中)和temed(1.35l)组成的引发剂。将聚合混合物泵入塔内，打开循环水浴，设置并保持塔温37℃，反应15小时。
52.为了去除低亲和力的聚合物和未反应的单体，37℃时用250ml pbs缓冲液清洗色谱柱，收集得到50ml nip-rgd。37℃洗涤后，用20ml pbs缓冲液在6℃下洗脱得到高亲和力mip-rgd，通过动态光散射测试分析了得到的mip-rgd和nip-rgd的尺寸。
53.图5b是实施例3中mip-rgd的dls测量尺寸分布图，如图所示，mip-rgd的粒径在50nm左右。
54.实施例4：分子印迹人工抑制剂的亲和力测定
55.为了评估mip-rgd、nip-rgd的结合特性，本实施例中，通过带有rgd固定芯片的石英微天平(qcm)系统研究了mip-rgd和nip-rgd的识别特性，具体步骤如下所示。
56.将qcm芯片按照实施例1步骤(1)中所述功能化玻璃珠的步骤进行功能化，然后用带(s-h基团)rgd多肽固定化，得到rgd固定芯片。将rgd固定芯片装入q-sensee1仪器，在相同时间间隔分别将浓度为0.5～250μg/ml的mip-rgd或nip-rgd溶液注入qcm池中，观察信号变化。
57.图6a是注射制备的mip-rgd和nip-rgd引起的rgd固定化qcm传感器的频率变化(δf)的时间过程图，从图中可以看出，注射mip-rgd后观察到频率急剧下降。相反，nip-rgd注射后发现频率变化较小，该现象说明成功合成了具有高特异性的人工抗体抑制剂。
58.图6b是mip-rgd、nip-rgd与rgd的结合等温线图，从图中可以看出，mip-rgd的表观解离常数(kd)被确定为9.61nm，这表明其亲和力极高，比现有技术中通过沉淀聚合得到的rgd印迹微凝胶(kd＝1.5μm)显著提高。这是因为固相合成方法中的洗脱分离步骤将低亲和力纳米颗粒去除了。
59.实施例5：分子印迹人工抑制剂对rgd活性的抑制作用
60.本实施例中通过对细胞的粘附行为进行研究来验证了制备得到的分子印迹人工抑制剂对rgd活性的抑制作用，具体实验步骤如下所示。将石英片置于食人鱼溶液中(体积比为7:3的浓h2so4和h2o2溶液的混合物)，室温下活化24h，然后用超纯水及乙醇反复洗涤石
英片并用氮气干燥。将3ml aptes、30ml乙醇和300μl冰醋酸混合均匀，然后对上述得到的石英片进行硅烷化处理。处理结束后洗涤、氮气干燥，得到硅烷化的石英片。接着加入含戊二醛(5％v/v)的磷酸盐溶液对硅烷化的石英片进行功能化处理，洗涤，干燥，得到戊二醛化的石英片。将上述的戊二醛化的石英片放在50ml含有45mg rgd的pbs缓冲液中，在室温下孵育5h后用pbs洗涤，得到肽功能化的石英片，氮气干燥备用。
61.以小鼠成纤维细胞l929(购自gibco(美国)公司)为测试细胞，并以含有10％(体积分数)的胎牛血清(fbs)和1％双抗的1640为培养基(购自gibco(美国)公司)，于37℃、5％的co2培养箱中培养。使用时，用胰蛋白酶消化、收集以备种植。细胞的浓度为5w/ml，取1ml加入含有肽功能化的石英片的孔板中，放入培养箱37℃培养4小时。
62.图7是rgd分子印迹抑制剂拟对rgd活性的抑制作用的细胞粘附示意图；图中a为吸附状态，b为脱附状态。由图7(a)所示，细胞rgd与细胞膜表面整合素结合，细胞能贴附在接有rgd的石英片基体上；如图7(b)所示，加入rgd分子抑制剂后，细胞脱离，这是由于其与rgd特异性结合，抑制了rgd与整合素结合。
63.实施例6：分子印迹人工抑制剂的毒理性测试
64.本实施例中通过对照组、mip-rgd组和nip-rgd组三组实验来考察分子印迹人工抑制剂是否具有毒性，具体考察步骤如下所示。
65.将消化好的l929细胞稀释计数，控制细胞浓度为5
×
104cell/ml。取100μl的细胞液接种于96孔板(每孔5000个细胞)，于培养箱中培养24h(37℃，5％co2)直至细胞完全贴壁。
66.将mip-rgd和nip-rgd用含有10％(购自gibco(美国)公司)的胎牛血清(fbs)和1％双抗(购自gibco(美国)公司)的1640为培养基(购自gibco(美国)公司)溶解并稀释，取100μl药物溶液加入贴壁的细胞液，最终mip-rgd组和nip-rgd组浓度分别为0.0 5nm、0.1nm、0.25nm、0.5nm、1nm，以无mip-rgd和nip-rgd添加为对照孔，并设置只有mip-rgd、只有nip-rgd和只有1640培养基的背景孔。将混合液在培养箱中继续培养24h(37℃，5％co2)，随后终止培养，吸走上层培养液，加入100μl的1640培养基，然后每孔加入10μl cck-8试剂，继续培养3h后，通过酶标仪测定波长为450nm处的od值，每个样品读取六个平行数据，并计算细胞活力。细胞活力计算公式为：
[0067][0068]
图8是不同浓度的mip-rgd和nip-rgd与l929共培养24h后细胞的存活率，如图7所示，对照组的细胞存活率基本都在95％以上，且不随着浓度的变化而变化，这表明对照组没有细胞毒性。mip-rgd组的细胞存活率随着浓度的升高有所下降，但都在80％以上，表明mip-rgd随浓度升高会表现出比较小的毒性，但在正常使用浓度范围内基本等同于无毒性，具有良好的生物相容性。而nip-rgd组中，细胞存活率也随着浓度的升高而有所减小，但基本都在90％以上，这表明nip-rgd基本等同于无毒性。
[0069]
综上，本发明将模板分子rgd多肽固定在固体载体上，在此基础上通过固相合成印迹策略制备得到了温敏的分子印迹纳米聚合物(mip-rgd和nip-rgd)人工抑制剂。所述纳米印迹聚合物人工抑制剂具有特异性高、物理和化学稳定性好、易转移和成本较低的优点，同时还具有温度响应性能。利用分子印迹人工抑制剂的温敏性，通过改变温度调控mip-rgd和
nip-rgd对rgd的释放，可实现可逆调控细胞脱附的行为。
[0070]
所述实施例为本发明的优选的实施方式，但本发明并不限于上述实施方式，在不背离本发明的实质内容的情况下，本领域技术人员能够做出的任何显而易见的改进、替换或变型均属于本发明的保护范围。