mir-126a-5p在cd4 t细胞分化中的应用
技术领域：
：：1.本发明属于细胞工程和基因工程
技术领域：
：，具体涉及mir-126a-5p在cd4 t细胞分化的应用。
背景技术：
：：2.包虫病，又叫棘球蚴病，是一种由棘球绦虫引起的严重的人畜共患寄生虫病。作为全球的公共卫生问题，严重影响社会经济的发展和患者身体健康。在包虫病的研究过程中，已制备出了对羊，鼠有很高免疫保护力(90％以上)的重组蛋白p29。在包虫感染的早期，th1细胞活化增殖功能明显增强，激活细胞免疫应答，具有控制包虫早期形成、生长、转移及抗感染的作用；在感染的中晚期，主要以th2型细胞活化为主，包虫产生免疫耐受，有利于包虫病原体的寄生。而重组蛋白p29能够促进小鼠cd4 t细胞朝th1方向分化，保护机体免受病原体的感染。3.mirna是真核生物内广泛表达的一类长度约为22个核苷酸的单链非编码小rna分子，主要通过与其靶基因mrna的3′非翻译区(utr)发生特异性的相互结合降解靶基因mrna或抑制靶基因mrna的翻译，从而阻断靶基因蛋白质的形成。随着生命科学研究的发展，关于mirna在寄生虫感染过程中的作用受到研究者广泛关注，多项研究表明mirna参与宿主感染进程、免疫反应、寄生虫耐药性和免疫逃逸等多个进程。4.dlk1(delta样同源物1)蛋白是一个包含六个表皮生长因子重复的跨膜蛋白，属于表皮生长因子家族成员，在多种细胞的增殖及转分化中起重要作用。技术实现要素：5.本发明在前期研究中，通过高通量测序技术，鉴定包虫感染以及重组蛋白p29免疫不同不同时间的脾脏cd4 t细胞mirna表达谱，发现mir-126a-5p呈显著差异上调表达，推测其可能在cd4 t细胞中发挥重要调控作用。本发明通过生物信息学网站预测了mir-126a-5p的靶基因dlk1，并通过实验验证mir-126a-5p通过调节dlk1进而影响cd4 t细胞的分化。由于实验涉及到脾脏细胞，人体实验无法进行，因此本发明在小鼠脾脏细胞中验证。mir-126a-5p的成熟体序列在鼠和人体中是一致的，为临床探讨包虫感染病人体内免疫机制的变化提供了新的思路和方向。6.本发明提供的技术方案之一，是mir-126a-5p在促进cd4 t细胞朝th1方向分化中的应用。所述mir-126a-5p的核苷酸序列为cauuauuacuuuugguacgcg。7.本发明通过targetscan、mirwalk、mirtarbase3个信息学软件预测mir-126a-5p的靶基因，并通过targetscan网站发现dlk1的3′utr中含有mir-126a-5p序列的结合位点，将dlk1野生型(wt)3′utr和含有预测结合位点的序列突变的3′utr构建到psicheck-2中，通过双荧光素酶报告分析，发现dlk1野生型3′utr区受到mir-126a-5p的调控，而突变型不受mir-126a-5p调控。还利用qrt-pcr和westernblotting在转录和翻译水平验证mir-126a-5p对dlk1的调控作用，发现mir-126a-5p在转录和翻译水平下调dlk1的表达。至此，可以确定，mir-126a-5p与dlk1的靶向关系，即mir-126a-5p能够与dlk1的3′utr发生特异性结合，阻断dlk1蛋白质的合成。8.鉴于dlk1在多种细胞的增殖及转分化中起重要作用，为了进一步确定mir-126a-5p与cd4 t细胞分化的关系，本发明在向cd4 t细胞中转染mir-126a-5p模拟物和mir-126a-5p抑制物后，检测cd4 t细胞的分化情况，具体如下：9.利用qrt-pcr技术，检测mir-126a-5p介导的cd4 t细胞的分化，发现转染mir-126a-5pmimics后，促进th1型细胞代表因子ifn-γ的表达，并抑制th2型细胞代表因子il-4的表达；转染mir-126a-5pinhibitor后，抑制th1型细胞代表因子ifn-γ的表达，并促进th2型细胞代表因子il-4的表达。10.利用流式细胞术检测ifn-γ、il-4的蛋白表达情况，结果显示转染mir-126a-5pmimics后，促进th1型细胞代表因子ifn-γ的表达，并抑制th2型细胞代表因子il-4的表达；转染mir-126a-5pinhibitor后，抑制th1型细胞代表因子ifn-γ的表达，并促进th2型细胞代表因子il-4的表达。11.至此，可以确定，mir-126a-5p能够调节cd4 t的分化，且促进其向th1方向分化，抑制其向th2方向分化。12.为了验证靶基因dlk1对cd4 t细胞分化的影响，本发明还合成了靶基因dlk1干扰小片段sirna-dlk1-523(5′‑ggagaaaggccaguacgaattuucguacuggccuuucucctt-3′)，在cd4 t细胞中转染sirna-dlk1-523，利用qrt-pcr和流式细胞术检测th1型细胞因子ifn-γ和th2型细胞因子il-4的mran和蛋白表达情况，发现dlk1抑制cd4 t细胞朝th1方向分化，促进cd4 t细胞朝th2分化。13.为了验证mir-126a-5p靶基因dlk1功能恢复，通过靶基因挽救实验，即在脾脏小鼠cd4 t细胞补充外源干扰的靶基因dlk1后，验证是否恢复由mir-126a-5p引起的细胞分化。在cd4 t细胞中共转染靶sirna-dlk1-523和mir-126a-5pinhibitor后，通过qrt-pcr和流式检测th1型细胞因子ifn-γ和th2型细胞因子il-4的表达情况，发现mirna引起的促进cd4 t细胞朝th1方向分化能够被dlk1恢复。14.本发明提供的技术方案之二，是mir-126a-5p模拟物在制备包虫病预防或治疗药物中的应用。鉴于mir-126a-5p模拟物能够提高mir-126a-5p在细胞中的表达量，mir-126a-5p能够促进cd4 t细胞朝th1方向分化，激活细胞免疫应答，发挥控制包虫早期形成、生长、转移及抗感染的作用，可以确定，mir-126a-5p模拟物可用于包虫病预防或治疗药物的制备；15.进一步地，所述mir-126a-5p模拟物为双链：16.正义链序列为：5‘‑cauuauuacuuuugguacgcg-3’；17.反义链序列为：5'-cgcguaccaaaaguaauaaug-3'。18.有益效果：19.cd4 t细胞的分化是机体抵御外来病原体的重要过程，本发明首次证实mir-126a-5p，dlk1在小鼠脾脏cd4 t细胞分化中的作用，以及mir-126a-5p与基因dlk1的靶向关系，且通过挽救实验，即在小鼠脾脏cd4 t细胞补充外源干扰的靶基因dlk1后，验证了由mir-126a-5p引起的细胞分化被dlk1恢复。为包虫病的防止和治疗提供了新的理论基础。附图说明：20.图1.mir-126a-5pmimics和inhibitor的转染效率；21.图2.转染mir-126a-5pmimics和inhibitor后th1和th2的表达；22.图3.转染mir-126a-5pmimics和inhibitor后dlk1的表达；23.图4.转染sirna-dlk1-523后th1和th2的表达；24.图5.共转染sirna-dlk1-523和mir-126a-5pinhibitor后th1和th2的表达；25.图6.转染mir-126a-5pmimics和inhibitor后dlk1的表达；26.图7.转染mir-126a-5pmimics和inhibitor后th1和th2的表达；27.图8.转染sirna-dlk1-523后th1和th2的表达；28.图9双荧光素报告结果；29.图10动物实验结果30.(a)mir-126a-5p和dlk1的rna表达水平；(b)dlk1蛋白表达水平。具体实施方式：31.为了使本专利的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本专利进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利，并不用于限定本发明。32.在本发明中，mir-126a-5pmimics(模拟物)代表mir-126a-5p的模拟物，是模拟生物体内的mir-126a-5p，运用化学合成方法合成，能增强mir-126a-5p的表达量。mir-126a-5pmimics的nc(negativecontrol，阴性对照)代表mir-126a-5pmimics的对照，就是和mir-126a-5pmimics结构类似但是比对过数据库是无意义的序列，不会过表达mir-126a-5p。实验组转染mir-126a-5pmimics，对照组转染mir-126a-5pmimics对应的nc，排除转染这种序列本造成的对实验结果的影响。33.本发明使用的mir-126a-5pmimics是双链：34.正义链序列为：5‘‑cauuauuacuuuugguacgcg-3’；35.反义链序列为：5'-cgcguaccaaaaguaauaaug-3'。36.在本发明中，mir-126a-5pinhibitor(抑制物)代表mir-126a-5p的抑制物，化学修饰的专门针对细胞中特异的mir-126a-5p的抑制剂。mir-126a-5pinhibitor的nc(negativecontrol，阴性对照)代表mir-126a-5pinhibitor的对照。37.本发明使用的mir-126a-5pinhibitor是单链：5'-cgcguaccaaaaguaauaaug-3'。38.在本发明中，mir-126a-5p的nc为基于线虫c.elegans的micorna设计的双链mirna分子，但不靶向任何已知的人、小鼠和大鼠基因。39.在本发明中，sirna-dlk1nc为与目的基因的序列无同源性的普通阴性对照，且与靶细胞中其它基因没有同源性。40.以上模拟物，抑制物或者各nc，未经特别说明的本领域技术人员均可根据常规知识设计获得。41.以下将结合具体实施例对本发明做进一步的解释说明。42.实施例1：小鼠脾脏cd4 t细胞分离及培养43.取正常balb/c雌鼠，6-8周龄，剪开表皮，取出脾脏组织。44.(1)将脾脏放在70μm细胞滤网，加入少许组织稀释液，用5ml无菌注射器的带活塞的活塞杆轻柔碾磨脾脏组织，50ml无菌离心管收集组织液(5ml)。45.(2)将5ml组织液沿管壁缓慢的加入到装有等体积脾脏淋巴细胞分离液的无菌15ml离心管中，450g室温离心20min。46.(3)吸取中间淋巴细胞层于新的无菌15ml离心管中，洗涤液定容到10ml，350g，4℃离心10mim。47.(4)重复步骤4一到两次。48.(5)用1mlpbs重悬细胞，取10μl加到90μlpbs中，细胞计数。49.(6)350g，4°离心10min。50.(7)根据细胞数每107细胞数加40μl分选buffer，10μlbiotin-antibodycocktail，4℃避光孵育5min。51.(8)孵育结束后，每107细胞数加入20μlanti-biomicrobeads和10μlcd44microbeads，4℃避光孵育10min。52.(9)待孵育时间剩1-2min时，拆开mscolumn分离柱，放入到分离系统，加入1ml磁珠分选buffer，随后取一个无菌ep管，插入到冰中，放到分离柱下面接口处。用磁珠分选buffer稀释细胞悬液，加入到mscolumn分离柱中，总共加入6ml，约4个无菌管，加完后350g，4℃，离心10min。53.(10)用1ml含1％双抗(青霉素和链霉素)，10％血清的1640培养基重悬细胞，4管ep管合为一管。取10μl重悬液加到90μlpbs中，混匀，计数板计数。54.(11)根据细胞量，接种到96孔板中，使每孔的细胞数约为1×106，置于37°，5％co2培养箱中静置培养。55.实施例2：脾脏cd4 t细胞的转染56.(1)当转染cd4 t细胞时，磁珠分选得到的cd4 t细胞用10％血清的1640培养基重悬，放入到37℃，5％co2培养箱中后，在96孔板中每孔加入90μl，用于配置转染混合液。57.(2)转染mir-126a-5p模拟物(mimics)和抑制剂(inhibitor)。分别加205μl的无菌水到mir-126a-5pmimics和mir-126a-5pinhibitor试剂管中，形成20μm的储存液。当转染时，稀释6倍变成工作液，进行转染(mir-126a-5pinhibitor的转染终浓度为150nm，mir-126a-5pmimics的转染终浓度为60nm)。58.取两个pcr管，按照96孔板每孔量，分别加入6.2μl1640培养基、2μlhiperfect和1.8μl的mimics/inhibitor的工作液构建转染体系，总体系共10μl。对应的nc加入相同体积的试剂。室温孵育10min，在步骤(1)中每孔加入10μl上述转染体系，构建100μl体系，每组设置3个重复。59.(3)靶基因dlk1。加62.5μl无菌水到sirna-dlk1试剂管中，形成20μm储存液，当转染时，稀释6倍变成工作液，进行转染。60.取4个pcr管，按照96孔板每孔量，管1分别加入1.68μlsirna-dlk1和0.82μl1640培养基，管2分别加入0.5μl的lip3000和2μl1640培养基，将管2液体加入到管1中，对应的nc加入相同体积的试剂。避光孵育15min，总体系共10μl。在步骤(1)中每孔加入10μl转染体系，构建100μl体系，每组设置3个重复。61.本发明设计3对靶基因dlk1干扰小片段/对照(sirna-dlk1-523，sirna-dlk1-446和sirna-dlk1-389/sirna-nc)，筛选并检测其干扰效率。转染基因干扰小片段到cd4 t细胞中，利用qrt-pcr技术，最终筛选干扰效果较好的sirna-dlk1-523小片段进行后续实验。所合成的干扰小片段为化学修饰stabletmsirna片段，其序列展示如下：sirna-dlk1-523：5′‑ggagaaaggccaguacgaattuucguacuggccuuucucctt-3′sirna-dlk1-446：5′‑cacgggaaauucugcgaaattuuucgcagaauuucccguctt-3′sirna-dlk1-389：5′‑ggcugugucaauggagucuttagacuccauugacacagcctt-3′62.(4)共转染sirna-dlk1-523和mir-126a-5pinhibitor。将步骤(2)和步骤(3)中转染体系，同时转染到96孔板cd4 t中，每孔加入mir-126a-5pinhibitor转染体系10μl和sirna-dlk1-523转染体系10μl。63.上述(2)-(4)转染后的孔板置于37℃，5％co2培养箱中培养；转染后1～3天，观察细胞状态，生长良好即可收集细胞。64.实施例3：qrt-pcr检测65.本发明中qrt-pcr检测靶基因和mirna分别采用bioscience公司的onesteprtqpcrkit(sybrgreen)和takara公司的mir-xmirnaqrt-pcrtbkit。实验结果用比较ct值法检测样品基因或mirna的含量，具体计算公式如下：66.基因相对表达量＝2-{〈﹙实验组目的基因ct值﹚-﹙实验组内参基因ct值﹚〉-〈﹙对照组目的基因ct值﹚-﹙对照组内参基因ct值﹚〉}67.其中的内参基因，对基因检测用gapdh做内参，对mirna检测用u6做内参。68.细胞的总rna抽提步骤参照thermofisher公司的trizol操作说明书，具体抽提步骤如下：69.(1)收集cd4 t细胞，加入trizol，颠倒混匀10次，室温静置5min。70.(2)避光加氯仿200μl(每1mltrizol)，剧烈混匀15s，室温静置5min。71.(3)4℃，12000g，15min离心，小心吸取上层水相层到新的1.5ml的ep管中。72.(4)加等体积异丙醇，吹打混匀，冰浴静置10min。73.(5)4℃，12000g，10min离心，弃上清。74.(6)加入预冷75％酒精1ml，4℃，7500g，5min离心，弃上清。75.(7)超净工作台吹干5min(不可吹太干，避免rna过度干燥，后续无法融解)。76.(8)加入depc水融解rna沉淀。77.mrna和mirna反转录pcr分别采用thermo公司的thermoscientificrevertaidfirststrandcdnasynthesiskit和takara公司mir-xmirnafirst-strandsynthesiskit。78.实验结果：79.(1)利用qrt-pcr技术，检测mir-126a-5p模拟物(mimics)和抑制剂(inhibitor)的转染效率，其中分别转染浓度为60nm的mir-126a-5pmimics以及150nm的mir-126a-5pinhibitor后，相对于各自的转染的对照组nc，实验组的转染效率分别能达到过表达25倍多和抑制5倍多。结果如图1所示。80.(2)利用qrt-pcr技术，检测转染mir-126a-5p模拟物(mimics)和抑制剂(inhibitor)后cd4 t细胞的分化情况。结果如图2所示，转染mir-126a-5pmimics后，促进th1型细胞代表因子ifn-γ的表达，并抑制th2型细胞代表因子il-4的表达。转染mir-126a-5pinhibitor后，抑制th1型细胞代表因子ifn-γ的表达，并促进th2型细胞代表因子il-4的表达。81.(3)利用qrt-pcr技术，检测转染mir-126a-5pmimics和inhibitor后dlk1的表达，即在转录水平验证mir-126a-5p对dlk1的调控作用。发现mir-126a-5p在转录水平下调dlk1的表达，结果如图3所示。82.(4)利用qrt-pcr技术，研究cd4 t细胞中转染sirna-dlk1时，靶基因dlk1对cd4 t细胞分化的影响，结果显示，转染sirna-dlk1-523后，干扰效果最好，结果如图4所示，利用qrt-pcr检测转染sirna-dlk1-523时th1型细胞因子ifn-γ和th2型细胞因子il-4的mran表达情况，发现dlk1抑制cd4 t细胞朝th1方向分化，促进cd4 t细胞分化。83.(5)利用qrt-pcr技术，研究mir-126a-5p靶基因dlk1功能恢复情况。在cd4 t细胞中共转染靶sirna-dlk1-523/sirna-nc和mir-126a-5pinhibitor/nc后(第一组：sirna-dlk1-523 mir-126a-5pinhibitor；第二组：sirna-nc mir-126a-5pnc)，通过qrt-pcr和流式检测th1型细胞因子ifn-γ和th2型细胞因子il-4的表达情况，发现，如图5所示，mir-126a-5p引起的促进cd4 t细胞朝th1方向分化能够被dlk1恢复。上文已研究，与对照组相比，mir-126a-5p促进cd4 t细胞朝th1方向分化，而dlk1抑制cd4 t细胞朝th1方向分化。当同时抑制后，mir-126a-5p表达减少，理论上会抑制cd4 t细胞朝th1方向分化，dlk1表达减少，理论上促进cd4 t细胞朝th1方向分化，同时转染导致相反的效果叠加后，最后与对照组相比，没有明显差异。说明mir-126a-5p引起的促进cd4 t细胞朝th1方向分化能够被dlk1恢复。84.实施例4：westernblotting85.(1)悬浮细胞总蛋白的提取：收集细胞，350g，4°离心10min。加入遇冷pbs离心3次洗去培养液，最后弃上清。86.(2)按照每1ml冷lysisbuffer加入10μl磷酸酶抑制剂，1μl蛋白酶抑制剂和10μl100mmpmsf，混匀。加入到对应细胞中。87.(3)旋涡震荡30s，置于冰上5min，重复4次。88.(4)4°，12,000g，离心15min。89.(5)取少许上清，bca法测定蛋白样品浓度。90.(6)取剩余上清加入loadingbuffer，煮沸10min，取出等恢复室温后，简单离心，放于-20°保存。91.(9)sds-page电泳：每组取质量为20μg蛋白上样，电泳至溴酚蓝刚跑出分离胶底部为止。92.(10)蛋白转膜：无水乙醇预处理pvdf膜2min，转到转膜液中浸润后放到海绵上，取出凝胶，将其放在pvdf膜上，形成海绵/胶/膜/海绵“三明治”结构。此操作需将胶与膜之间的气泡去除。300ma恒流2h。93.(11)免疫印迹：取出pvdf膜，pbst漂洗5min，重复4次。5％脱脂奶粉室温封闭2h，pbst漂洗5min，重复4次。加入dlk1一抗(购自cst公司)，4°孵育过夜。94.第二天pbst漂洗5min，重复4次，加入二抗(购自abcam公司)室温孵育2h，pbst漂洗5min，重复4次。加入化学发光液到pvdf膜上，放入曝光仪器中曝光。95.实验结果：96.在转染mir-126a-5pmimics和inhibitor后，利用westernblotting在翻译水平验证mir-126a-5p对dlk1的调控作用。发现mir-126a-5p在翻译水平下调dlk1的表达。结果如图6所示。97.实施例5：流式细胞术检测98.本发明中流式细胞术检测细胞表面分子，参照本实验室试验方法，配置方法如下：99.buffer2(1升)：1×pbs(ph7.2-7.4)1l；bsa1g；nan30.5g(4℃保存)。100.buffer3(1升)：1×pbs(ph7.2-7.4)1l；bsa1g；nan30.5g；saponin(皂苷)1g(4℃保存)。101.具体操作步骤如下：102.(1)收集细胞到ep管中(做好空白，单阳，实验组标记)，350g，4°，8min离心，弃上清。103.(2)表面染色：每管加入100μl的buffer2重悬细胞。加入表面抗体(涡旋),4°避光孵育30min。104.(3)洗涤：加入buffer2溶液1ml/管，4°，350g离心8min。105.(4)固定：弃上清，轻轻涡旋细胞，加入4％多聚甲醛500μl/管，室温避光孵育10min。106.(5)洗涤：加入buffer2溶液(或buffer3)1m/管，4°，450g离心8min。107.(6)破膜：弃掉上清后涡旋一下，加入buffer3溶液1ml/管，4°过夜破膜(或常温2h)。108.(7)洗涤：破膜后4℃，450g离心8min，收集细胞，弃掉上清后在纸上沾一下管口，轻轻涡旋细胞沉淀。109.(8)胞内染色：用buffer3溶液重悬细胞至约100ul/管，加入对应抗体后轻轻涡旋，4°避光孵育30min。110.(9)加入buffer2溶液1ml/管，4°，450g离心8min。111.(10)弃上清，加入buffer2300-500μl，上机检测。112.实验结果：113.(1)利用流式细胞术检测ifn-γ、il-4的蛋白表达情况。结果显示转染mir-126a-5pmimics后，促进th1型细胞代表因子ifn-γ的表达，并抑制th2型细胞代表因子il-4的表达。转染mir-126a-5pinhibitor后，抑制th1型细胞代表因子ifn-γ的表达，并促进th2型细胞代表因子il-4的表达。结果如图7所示。114.(2)cd4 t细胞中转染sirna-dlk1-523，研究靶基因dlk1对cd4 t细胞分化的应用，利用流式细胞术检测th1型细胞因子ifn-γ和th2型细胞因子il-4的蛋白表达情况，发现dlk1抑制cd4 t细胞朝th1方向分化，促进cd4 t细胞分化。如图8所示。115.实施例6：荧光素酶报告基因活性检测116.参照promega公司的dual-luciferasereporterassaysystem试剂盒，具体步骤如下：117.(1)事先准备好用于转染的分到96孔板中的293t细胞和目的质粒，待细胞密度达到50％-70％为宜。118.(2)将10μldmem与0.16μg的dlk1-3utr目的质粒以及5pmol的mmu-mir-126a-5p/negative.control(n.c)充分混匀后室温放置(溶液a)，之后将10μldmem与0.3μl的转染试剂(浓度为0.8mg/ml)充分混匀(溶液b)，室温放置5min。119.(3)将溶液a与溶液b充分混匀，室温放置20min。120.(4)转染前为细胞换取新鲜培养基，之后将转染混合物加入混匀。37℃，5％co2培养。121.(5)转染6h后换取新鲜培养基，转染48h后收集细胞检测。122.(6)海肾荧光素酶与萤火虫荧光素酶表达量的比值为海肾荧光素酶相对活性，即为对应靶基因活性(三个重复)。123.实验结果：124.将dlk1野生型(wt)3′utr和含有预测结合位点的序列突变的3′utr构建到psicheck-2中，通过双荧光素酶报告分析，发现dlk1野生型3′utr区受到mir-126a-5p的调控，而突变型不受mir-126a-5p调控。如图9所示。125.实施例7动物实验126.验证p29免疫balb/c小鼠(6-8周龄)一周后，mir-126a-5p和dlk1的表达情况。127.实验分为三组：pbs组，弗氏佐剂组，p29 弗氏佐剂组。每组7只，一周后分离脾脏cd4 t细胞，提rna和蛋白。128.利用qrt-pcr技术检测mir-126a-5p和dlk1的rna表达情况，利用wb技术检测dlk1蛋白表达情况，结果如图10所示，与pbs和弗氏佐剂组相比，p29 弗氏佐剂组中mir-126a-5p表达显著升高，dlk1的表达平显著下降。129.以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本专利构思的前提下，上述各实施方式还可以做出若干变形、组合和改进，这些都属于本专利的保护范围。因此，本专利的保护范围应以权利要求为准。当前第1页12当前第1页12
技术领域：
：：1.本发明属于细胞工程和基因工程
技术领域：
：，具体涉及mir-126a-5p在cd4 t细胞分化的应用。
背景技术：
：：2.包虫病，又叫棘球蚴病，是一种由棘球绦虫引起的严重的人畜共患寄生虫病。作为全球的公共卫生问题，严重影响社会经济的发展和患者身体健康。在包虫病的研究过程中，已制备出了对羊，鼠有很高免疫保护力(90％以上)的重组蛋白p29。在包虫感染的早期，th1细胞活化增殖功能明显增强，激活细胞免疫应答，具有控制包虫早期形成、生长、转移及抗感染的作用；在感染的中晚期，主要以th2型细胞活化为主，包虫产生免疫耐受，有利于包虫病原体的寄生。而重组蛋白p29能够促进小鼠cd4 t细胞朝th1方向分化，保护机体免受病原体的感染。3.mirna是真核生物内广泛表达的一类长度约为22个核苷酸的单链非编码小rna分子，主要通过与其靶基因mrna的3′非翻译区(utr)发生特异性的相互结合降解靶基因mrna或抑制靶基因mrna的翻译，从而阻断靶基因蛋白质的形成。随着生命科学研究的发展，关于mirna在寄生虫感染过程中的作用受到研究者广泛关注，多项研究表明mirna参与宿主感染进程、免疫反应、寄生虫耐药性和免疫逃逸等多个进程。4.dlk1(delta样同源物1)蛋白是一个包含六个表皮生长因子重复的跨膜蛋白，属于表皮生长因子家族成员，在多种细胞的增殖及转分化中起重要作用。技术实现要素：5.本发明在前期研究中，通过高通量测序技术，鉴定包虫感染以及重组蛋白p29免疫不同不同时间的脾脏cd4 t细胞mirna表达谱，发现mir-126a-5p呈显著差异上调表达，推测其可能在cd4 t细胞中发挥重要调控作用。本发明通过生物信息学网站预测了mir-126a-5p的靶基因dlk1，并通过实验验证mir-126a-5p通过调节dlk1进而影响cd4 t细胞的分化。由于实验涉及到脾脏细胞，人体实验无法进行，因此本发明在小鼠脾脏细胞中验证。mir-126a-5p的成熟体序列在鼠和人体中是一致的，为临床探讨包虫感染病人体内免疫机制的变化提供了新的思路和方向。6.本发明提供的技术方案之一，是mir-126a-5p在促进cd4 t细胞朝th1方向分化中的应用。所述mir-126a-5p的核苷酸序列为cauuauuacuuuugguacgcg。7.本发明通过targetscan、mirwalk、mirtarbase3个信息学软件预测mir-126a-5p的靶基因，并通过targetscan网站发现dlk1的3′utr中含有mir-126a-5p序列的结合位点，将dlk1野生型(wt)3′utr和含有预测结合位点的序列突变的3′utr构建到psicheck-2中，通过双荧光素酶报告分析，发现dlk1野生型3′utr区受到mir-126a-5p的调控，而突变型不受mir-126a-5p调控。还利用qrt-pcr和westernblotting在转录和翻译水平验证mir-126a-5p对dlk1的调控作用，发现mir-126a-5p在转录和翻译水平下调dlk1的表达。至此，可以确定，mir-126a-5p与dlk1的靶向关系，即mir-126a-5p能够与dlk1的3′utr发生特异性结合，阻断dlk1蛋白质的合成。8.鉴于dlk1在多种细胞的增殖及转分化中起重要作用，为了进一步确定mir-126a-5p与cd4 t细胞分化的关系，本发明在向cd4 t细胞中转染mir-126a-5p模拟物和mir-126a-5p抑制物后，检测cd4 t细胞的分化情况，具体如下：9.利用qrt-pcr技术，检测mir-126a-5p介导的cd4 t细胞的分化，发现转染mir-126a-5pmimics后，促进th1型细胞代表因子ifn-γ的表达，并抑制th2型细胞代表因子il-4的表达；转染mir-126a-5pinhibitor后，抑制th1型细胞代表因子ifn-γ的表达，并促进th2型细胞代表因子il-4的表达。10.利用流式细胞术检测ifn-γ、il-4的蛋白表达情况，结果显示转染mir-126a-5pmimics后，促进th1型细胞代表因子ifn-γ的表达，并抑制th2型细胞代表因子il-4的表达；转染mir-126a-5pinhibitor后，抑制th1型细胞代表因子ifn-γ的表达，并促进th2型细胞代表因子il-4的表达。11.至此，可以确定，mir-126a-5p能够调节cd4 t的分化，且促进其向th1方向分化，抑制其向th2方向分化。12.为了验证靶基因dlk1对cd4 t细胞分化的影响，本发明还合成了靶基因dlk1干扰小片段sirna-dlk1-523(5′‑ggagaaaggccaguacgaattuucguacuggccuuucucctt-3′)，在cd4 t细胞中转染sirna-dlk1-523，利用qrt-pcr和流式细胞术检测th1型细胞因子ifn-γ和th2型细胞因子il-4的mran和蛋白表达情况，发现dlk1抑制cd4 t细胞朝th1方向分化，促进cd4 t细胞朝th2分化。13.为了验证mir-126a-5p靶基因dlk1功能恢复，通过靶基因挽救实验，即在脾脏小鼠cd4 t细胞补充外源干扰的靶基因dlk1后，验证是否恢复由mir-126a-5p引起的细胞分化。在cd4 t细胞中共转染靶sirna-dlk1-523和mir-126a-5pinhibitor后，通过qrt-pcr和流式检测th1型细胞因子ifn-γ和th2型细胞因子il-4的表达情况，发现mirna引起的促进cd4 t细胞朝th1方向分化能够被dlk1恢复。14.本发明提供的技术方案之二，是mir-126a-5p模拟物在制备包虫病预防或治疗药物中的应用。鉴于mir-126a-5p模拟物能够提高mir-126a-5p在细胞中的表达量，mir-126a-5p能够促进cd4 t细胞朝th1方向分化，激活细胞免疫应答，发挥控制包虫早期形成、生长、转移及抗感染的作用，可以确定，mir-126a-5p模拟物可用于包虫病预防或治疗药物的制备；15.进一步地，所述mir-126a-5p模拟物为双链：16.正义链序列为：5‘‑cauuauuacuuuugguacgcg-3’；17.反义链序列为：5'-cgcguaccaaaaguaauaaug-3'。18.有益效果：19.cd4 t细胞的分化是机体抵御外来病原体的重要过程，本发明首次证实mir-126a-5p，dlk1在小鼠脾脏cd4 t细胞分化中的作用，以及mir-126a-5p与基因dlk1的靶向关系，且通过挽救实验，即在小鼠脾脏cd4 t细胞补充外源干扰的靶基因dlk1后，验证了由mir-126a-5p引起的细胞分化被dlk1恢复。为包虫病的防止和治疗提供了新的理论基础。附图说明：20.图1.mir-126a-5pmimics和inhibitor的转染效率；21.图2.转染mir-126a-5pmimics和inhibitor后th1和th2的表达；22.图3.转染mir-126a-5pmimics和inhibitor后dlk1的表达；23.图4.转染sirna-dlk1-523后th1和th2的表达；24.图5.共转染sirna-dlk1-523和mir-126a-5pinhibitor后th1和th2的表达；25.图6.转染mir-126a-5pmimics和inhibitor后dlk1的表达；26.图7.转染mir-126a-5pmimics和inhibitor后th1和th2的表达；27.图8.转染sirna-dlk1-523后th1和th2的表达；28.图9双荧光素报告结果；29.图10动物实验结果30.(a)mir-126a-5p和dlk1的rna表达水平；(b)dlk1蛋白表达水平。具体实施方式：31.为了使本专利的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本专利进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利，并不用于限定本发明。32.在本发明中，mir-126a-5pmimics(模拟物)代表mir-126a-5p的模拟物，是模拟生物体内的mir-126a-5p，运用化学合成方法合成，能增强mir-126a-5p的表达量。mir-126a-5pmimics的nc(negativecontrol，阴性对照)代表mir-126a-5pmimics的对照，就是和mir-126a-5pmimics结构类似但是比对过数据库是无意义的序列，不会过表达mir-126a-5p。实验组转染mir-126a-5pmimics，对照组转染mir-126a-5pmimics对应的nc，排除转染这种序列本造成的对实验结果的影响。33.本发明使用的mir-126a-5pmimics是双链：34.正义链序列为：5‘‑cauuauuacuuuugguacgcg-3’；35.反义链序列为：5'-cgcguaccaaaaguaauaaug-3'。36.在本发明中，mir-126a-5pinhibitor(抑制物)代表mir-126a-5p的抑制物，化学修饰的专门针对细胞中特异的mir-126a-5p的抑制剂。mir-126a-5pinhibitor的nc(negativecontrol，阴性对照)代表mir-126a-5pinhibitor的对照。37.本发明使用的mir-126a-5pinhibitor是单链：5'-cgcguaccaaaaguaauaaug-3'。38.在本发明中，mir-126a-5p的nc为基于线虫c.elegans的micorna设计的双链mirna分子，但不靶向任何已知的人、小鼠和大鼠基因。39.在本发明中，sirna-dlk1nc为与目的基因的序列无同源性的普通阴性对照，且与靶细胞中其它基因没有同源性。40.以上模拟物，抑制物或者各nc，未经特别说明的本领域技术人员均可根据常规知识设计获得。41.以下将结合具体实施例对本发明做进一步的解释说明。42.实施例1：小鼠脾脏cd4 t细胞分离及培养43.取正常balb/c雌鼠，6-8周龄，剪开表皮，取出脾脏组织。44.(1)将脾脏放在70μm细胞滤网，加入少许组织稀释液，用5ml无菌注射器的带活塞的活塞杆轻柔碾磨脾脏组织，50ml无菌离心管收集组织液(5ml)。45.(2)将5ml组织液沿管壁缓慢的加入到装有等体积脾脏淋巴细胞分离液的无菌15ml离心管中，450g室温离心20min。46.(3)吸取中间淋巴细胞层于新的无菌15ml离心管中，洗涤液定容到10ml，350g，4℃离心10mim。47.(4)重复步骤4一到两次。48.(5)用1mlpbs重悬细胞，取10μl加到90μlpbs中，细胞计数。49.(6)350g，4°离心10min。50.(7)根据细胞数每107细胞数加40μl分选buffer，10μlbiotin-antibodycocktail，4℃避光孵育5min。51.(8)孵育结束后，每107细胞数加入20μlanti-biomicrobeads和10μlcd44microbeads，4℃避光孵育10min。52.(9)待孵育时间剩1-2min时，拆开mscolumn分离柱，放入到分离系统，加入1ml磁珠分选buffer，随后取一个无菌ep管，插入到冰中，放到分离柱下面接口处。用磁珠分选buffer稀释细胞悬液，加入到mscolumn分离柱中，总共加入6ml，约4个无菌管，加完后350g，4℃，离心10min。53.(10)用1ml含1％双抗(青霉素和链霉素)，10％血清的1640培养基重悬细胞，4管ep管合为一管。取10μl重悬液加到90μlpbs中，混匀，计数板计数。54.(11)根据细胞量，接种到96孔板中，使每孔的细胞数约为1×106，置于37°，5％co2培养箱中静置培养。55.实施例2：脾脏cd4 t细胞的转染56.(1)当转染cd4 t细胞时，磁珠分选得到的cd4 t细胞用10％血清的1640培养基重悬，放入到37℃，5％co2培养箱中后，在96孔板中每孔加入90μl，用于配置转染混合液。57.(2)转染mir-126a-5p模拟物(mimics)和抑制剂(inhibitor)。分别加205μl的无菌水到mir-126a-5pmimics和mir-126a-5pinhibitor试剂管中，形成20μm的储存液。当转染时，稀释6倍变成工作液，进行转染(mir-126a-5pinhibitor的转染终浓度为150nm，mir-126a-5pmimics的转染终浓度为60nm)。58.取两个pcr管，按照96孔板每孔量，分别加入6.2μl1640培养基、2μlhiperfect和1.8μl的mimics/inhibitor的工作液构建转染体系，总体系共10μl。对应的nc加入相同体积的试剂。室温孵育10min，在步骤(1)中每孔加入10μl上述转染体系，构建100μl体系，每组设置3个重复。59.(3)靶基因dlk1。加62.5μl无菌水到sirna-dlk1试剂管中，形成20μm储存液，当转染时，稀释6倍变成工作液，进行转染。60.取4个pcr管，按照96孔板每孔量，管1分别加入1.68μlsirna-dlk1和0.82μl1640培养基，管2分别加入0.5μl的lip3000和2μl1640培养基，将管2液体加入到管1中，对应的nc加入相同体积的试剂。避光孵育15min，总体系共10μl。在步骤(1)中每孔加入10μl转染体系，构建100μl体系，每组设置3个重复。61.本发明设计3对靶基因dlk1干扰小片段/对照(sirna-dlk1-523，sirna-dlk1-446和sirna-dlk1-389/sirna-nc)，筛选并检测其干扰效率。转染基因干扰小片段到cd4 t细胞中，利用qrt-pcr技术，最终筛选干扰效果较好的sirna-dlk1-523小片段进行后续实验。所合成的干扰小片段为化学修饰stabletmsirna片段，其序列展示如下：sirna-dlk1-523：5′‑ggagaaaggccaguacgaattuucguacuggccuuucucctt-3′sirna-dlk1-446：5′‑cacgggaaauucugcgaaattuuucgcagaauuucccguctt-3′sirna-dlk1-389：5′‑ggcugugucaauggagucuttagacuccauugacacagcctt-3′62.(4)共转染sirna-dlk1-523和mir-126a-5pinhibitor。将步骤(2)和步骤(3)中转染体系，同时转染到96孔板cd4 t中，每孔加入mir-126a-5pinhibitor转染体系10μl和sirna-dlk1-523转染体系10μl。63.上述(2)-(4)转染后的孔板置于37℃，5％co2培养箱中培养；转染后1～3天，观察细胞状态，生长良好即可收集细胞。64.实施例3：qrt-pcr检测65.本发明中qrt-pcr检测靶基因和mirna分别采用bioscience公司的onesteprtqpcrkit(sybrgreen)和takara公司的mir-xmirnaqrt-pcrtbkit。实验结果用比较ct值法检测样品基因或mirna的含量，具体计算公式如下：66.基因相对表达量＝2-{〈﹙实验组目的基因ct值﹚-﹙实验组内参基因ct值﹚〉-〈﹙对照组目的基因ct值﹚-﹙对照组内参基因ct值﹚〉}67.其中的内参基因，对基因检测用gapdh做内参，对mirna检测用u6做内参。68.细胞的总rna抽提步骤参照thermofisher公司的trizol操作说明书，具体抽提步骤如下：69.(1)收集cd4 t细胞，加入trizol，颠倒混匀10次，室温静置5min。70.(2)避光加氯仿200μl(每1mltrizol)，剧烈混匀15s，室温静置5min。71.(3)4℃，12000g，15min离心，小心吸取上层水相层到新的1.5ml的ep管中。72.(4)加等体积异丙醇，吹打混匀，冰浴静置10min。73.(5)4℃，12000g，10min离心，弃上清。74.(6)加入预冷75％酒精1ml，4℃，7500g，5min离心，弃上清。75.(7)超净工作台吹干5min(不可吹太干，避免rna过度干燥，后续无法融解)。76.(8)加入depc水融解rna沉淀。77.mrna和mirna反转录pcr分别采用thermo公司的thermoscientificrevertaidfirststrandcdnasynthesiskit和takara公司mir-xmirnafirst-strandsynthesiskit。78.实验结果：79.(1)利用qrt-pcr技术，检测mir-126a-5p模拟物(mimics)和抑制剂(inhibitor)的转染效率，其中分别转染浓度为60nm的mir-126a-5pmimics以及150nm的mir-126a-5pinhibitor后，相对于各自的转染的对照组nc，实验组的转染效率分别能达到过表达25倍多和抑制5倍多。结果如图1所示。80.(2)利用qrt-pcr技术，检测转染mir-126a-5p模拟物(mimics)和抑制剂(inhibitor)后cd4 t细胞的分化情况。结果如图2所示，转染mir-126a-5pmimics后，促进th1型细胞代表因子ifn-γ的表达，并抑制th2型细胞代表因子il-4的表达。转染mir-126a-5pinhibitor后，抑制th1型细胞代表因子ifn-γ的表达，并促进th2型细胞代表因子il-4的表达。81.(3)利用qrt-pcr技术，检测转染mir-126a-5pmimics和inhibitor后dlk1的表达，即在转录水平验证mir-126a-5p对dlk1的调控作用。发现mir-126a-5p在转录水平下调dlk1的表达，结果如图3所示。82.(4)利用qrt-pcr技术，研究cd4 t细胞中转染sirna-dlk1时，靶基因dlk1对cd4 t细胞分化的影响，结果显示，转染sirna-dlk1-523后，干扰效果最好，结果如图4所示，利用qrt-pcr检测转染sirna-dlk1-523时th1型细胞因子ifn-γ和th2型细胞因子il-4的mran表达情况，发现dlk1抑制cd4 t细胞朝th1方向分化，促进cd4 t细胞分化。83.(5)利用qrt-pcr技术，研究mir-126a-5p靶基因dlk1功能恢复情况。在cd4 t细胞中共转染靶sirna-dlk1-523/sirna-nc和mir-126a-5pinhibitor/nc后(第一组：sirna-dlk1-523 mir-126a-5pinhibitor；第二组：sirna-nc mir-126a-5pnc)，通过qrt-pcr和流式检测th1型细胞因子ifn-γ和th2型细胞因子il-4的表达情况，发现，如图5所示，mir-126a-5p引起的促进cd4 t细胞朝th1方向分化能够被dlk1恢复。上文已研究，与对照组相比，mir-126a-5p促进cd4 t细胞朝th1方向分化，而dlk1抑制cd4 t细胞朝th1方向分化。当同时抑制后，mir-126a-5p表达减少，理论上会抑制cd4 t细胞朝th1方向分化，dlk1表达减少，理论上促进cd4 t细胞朝th1方向分化，同时转染导致相反的效果叠加后，最后与对照组相比，没有明显差异。说明mir-126a-5p引起的促进cd4 t细胞朝th1方向分化能够被dlk1恢复。84.实施例4：westernblotting85.(1)悬浮细胞总蛋白的提取：收集细胞，350g，4°离心10min。加入遇冷pbs离心3次洗去培养液，最后弃上清。86.(2)按照每1ml冷lysisbuffer加入10μl磷酸酶抑制剂，1μl蛋白酶抑制剂和10μl100mmpmsf，混匀。加入到对应细胞中。87.(3)旋涡震荡30s，置于冰上5min，重复4次。88.(4)4°，12,000g，离心15min。89.(5)取少许上清，bca法测定蛋白样品浓度。90.(6)取剩余上清加入loadingbuffer，煮沸10min，取出等恢复室温后，简单离心，放于-20°保存。91.(9)sds-page电泳：每组取质量为20μg蛋白上样，电泳至溴酚蓝刚跑出分离胶底部为止。92.(10)蛋白转膜：无水乙醇预处理pvdf膜2min，转到转膜液中浸润后放到海绵上，取出凝胶，将其放在pvdf膜上，形成海绵/胶/膜/海绵“三明治”结构。此操作需将胶与膜之间的气泡去除。300ma恒流2h。93.(11)免疫印迹：取出pvdf膜，pbst漂洗5min，重复4次。5％脱脂奶粉室温封闭2h，pbst漂洗5min，重复4次。加入dlk1一抗(购自cst公司)，4°孵育过夜。94.第二天pbst漂洗5min，重复4次，加入二抗(购自abcam公司)室温孵育2h，pbst漂洗5min，重复4次。加入化学发光液到pvdf膜上，放入曝光仪器中曝光。95.实验结果：96.在转染mir-126a-5pmimics和inhibitor后，利用westernblotting在翻译水平验证mir-126a-5p对dlk1的调控作用。发现mir-126a-5p在翻译水平下调dlk1的表达。结果如图6所示。97.实施例5：流式细胞术检测98.本发明中流式细胞术检测细胞表面分子，参照本实验室试验方法，配置方法如下：99.buffer2(1升)：1×pbs(ph7.2-7.4)1l；bsa1g；nan30.5g(4℃保存)。100.buffer3(1升)：1×pbs(ph7.2-7.4)1l；bsa1g；nan30.5g；saponin(皂苷)1g(4℃保存)。101.具体操作步骤如下：102.(1)收集细胞到ep管中(做好空白，单阳，实验组标记)，350g，4°，8min离心，弃上清。103.(2)表面染色：每管加入100μl的buffer2重悬细胞。加入表面抗体(涡旋),4°避光孵育30min。104.(3)洗涤：加入buffer2溶液1ml/管，4°，350g离心8min。105.(4)固定：弃上清，轻轻涡旋细胞，加入4％多聚甲醛500μl/管，室温避光孵育10min。106.(5)洗涤：加入buffer2溶液(或buffer3)1m/管，4°，450g离心8min。107.(6)破膜：弃掉上清后涡旋一下，加入buffer3溶液1ml/管，4°过夜破膜(或常温2h)。108.(7)洗涤：破膜后4℃，450g离心8min，收集细胞，弃掉上清后在纸上沾一下管口，轻轻涡旋细胞沉淀。109.(8)胞内染色：用buffer3溶液重悬细胞至约100ul/管，加入对应抗体后轻轻涡旋，4°避光孵育30min。110.(9)加入buffer2溶液1ml/管，4°，450g离心8min。111.(10)弃上清，加入buffer2300-500μl，上机检测。112.实验结果：113.(1)利用流式细胞术检测ifn-γ、il-4的蛋白表达情况。结果显示转染mir-126a-5pmimics后，促进th1型细胞代表因子ifn-γ的表达，并抑制th2型细胞代表因子il-4的表达。转染mir-126a-5pinhibitor后，抑制th1型细胞代表因子ifn-γ的表达，并促进th2型细胞代表因子il-4的表达。结果如图7所示。114.(2)cd4 t细胞中转染sirna-dlk1-523，研究靶基因dlk1对cd4 t细胞分化的应用，利用流式细胞术检测th1型细胞因子ifn-γ和th2型细胞因子il-4的蛋白表达情况，发现dlk1抑制cd4 t细胞朝th1方向分化，促进cd4 t细胞分化。如图8所示。115.实施例6：荧光素酶报告基因活性检测116.参照promega公司的dual-luciferasereporterassaysystem试剂盒，具体步骤如下：117.(1)事先准备好用于转染的分到96孔板中的293t细胞和目的质粒，待细胞密度达到50％-70％为宜。118.(2)将10μldmem与0.16μg的dlk1-3utr目的质粒以及5pmol的mmu-mir-126a-5p/negative.control(n.c)充分混匀后室温放置(溶液a)，之后将10μldmem与0.3μl的转染试剂(浓度为0.8mg/ml)充分混匀(溶液b)，室温放置5min。119.(3)将溶液a与溶液b充分混匀，室温放置20min。120.(4)转染前为细胞换取新鲜培养基，之后将转染混合物加入混匀。37℃，5％co2培养。121.(5)转染6h后换取新鲜培养基，转染48h后收集细胞检测。122.(6)海肾荧光素酶与萤火虫荧光素酶表达量的比值为海肾荧光素酶相对活性，即为对应靶基因活性(三个重复)。123.实验结果：124.将dlk1野生型(wt)3′utr和含有预测结合位点的序列突变的3′utr构建到psicheck-2中，通过双荧光素酶报告分析，发现dlk1野生型3′utr区受到mir-126a-5p的调控，而突变型不受mir-126a-5p调控。如图9所示。125.实施例7动物实验126.验证p29免疫balb/c小鼠(6-8周龄)一周后，mir-126a-5p和dlk1的表达情况。127.实验分为三组：pbs组，弗氏佐剂组，p29 弗氏佐剂组。每组7只，一周后分离脾脏cd4 t细胞，提rna和蛋白。128.利用qrt-pcr技术检测mir-126a-5p和dlk1的rna表达情况，利用wb技术检测dlk1蛋白表达情况，结果如图10所示，与pbs和弗氏佐剂组相比，p29 弗氏佐剂组中mir-126a-5p表达显著升高，dlk1的表达平显著下降。129.以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本专利构思的前提下，上述各实施方式还可以做出若干变形、组合和改进，这些都属于本专利的保护范围。因此，本专利的保护范围应以权利要求为准。当前第1页12当前第1页12
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