预测食管腺癌患者对联合治疗响应的标志物及其应用的制作方法

1.本发明属于生物医学领域，具体涉及预测食管腺癌患者对联合治疗响应的标志物及其应用。


背景技术：

2.食管癌是常见的消化道肿瘤，全世界每年约有30万人死于食管癌。其发病率和死亡率各国差异很大。食管癌在中国发病率居恶性肿瘤中第3位，死亡率居第4位，局限晚期患者5年生存率仅为24％。大多数患者确诊时已是中晚期，生存率较低。食管癌典型的症状为进行性咽下困难，先是难咽干的食物，继而是半流质食物，最后水和唾液也不能咽下。食管癌的人群分布与年龄、性别、职业、种族、地域、生活环境、饮食生活习惯、遗传易感性等有一定关系。
3.食管癌切除术是用于治疗食管癌的手术方法，对应适用情况有严格的选择。食管癌切术适用于以下情况：经确诊为较早期的食管或贲门癌，及部分三期食管下段癌，病变长度在5cm之内，一般情况尚好，无远处转移，并无心、肺、肝、肾功能严重损害或其他的手术禁忌症者，对70岁以上高龄者则更应严格选择。
4.对于可切除的食管癌患者来说，外科手术仍是首选治疗手段，但单纯手术治疗中晚期食管癌患者的5年生存率只有10％-20％，疗效不佳的主要原因是肿瘤复发和转移。所以多数看似可切除的食管癌患者治愈前景黯淡。放疗可控制食管癌的局部复发，同时化疗也具有抗肿瘤复发转移的作用，这为食管癌的治疗带来了希望。对此不同学者提出了多种以手术为基础的多学科综合治疗方案，有前瞻性研究证实了术前新辅助放化疗(neoadjuvant chemoradiotherapy，ncrt)可以将手术根治的局部晚期患者5年生存率提高10％，中位总生存期(overall survival，os)从24.0个月提高至48.6个月。食管病灶达到病理完全缓解(pathologic complete remission，pcr)的食管癌患者(约为30％)比未达pcr的患者有更好的生存预后。但是，同时有研究认为对于放化疗后达到临床缓解(clinical complete remission，ccr)的患者以手术或者放化疗完成根治其生存预后无差别，放化疗和手术患者的2年生存率分别为39.8％和33.6％，中位os期分别为19.3个月和17.7个月。但考虑到手术带来较高的治疗相关死亡率、不良反应发生率以及因食管切除造成的生活质量下降，ncrt后达pcr的患者是否可以推迟或免于手术正越来越引起研究者们的热议和关注。
5.肿瘤退缩分级(tumor regression grade，trg)也称为病理反应分级，是对新辅助化疗后切除的肿瘤进行病理形态学评估的分级标准，用于对患者的化疗或靶向药物的疗效做出评估，并且预测患者预后情况。肿瘤受到新辅助治疗后退缩反应中可见到多种不同的形态学表现，比如坏死、纤维组织增生、炎细胞浸润、细胞泡沫样变性、少量细胞不典型增生等，但不是所有肿瘤退缩均会有各种形态学特征性表现。故当前的trg评判标准多依赖于肿瘤组织中的纤维化比例以及残存肿瘤比例。手术切除标本按照每1cm取材一次，切片交由至少2位病理学专家独立评分。对于多发肝转移灶的患者，每个病灶均需取材并评级。分级主要依据镜下残余肿瘤细胞和纤维化的比例，分为5级：trg1-无肿瘤细胞残存，由大量纤维化
取代；trg2-存在极少量肿瘤细胞散落在纤维化中；trg3-残存更多肿瘤细胞，但占比小于纤维化；trg4-残存肿瘤细胞占比超过纤维化；trg5-几乎全部为肿瘤细胞，难觅纤维化。


技术实现要素：

6.为在选择进行新辅助放化疗联合阿特珠单抗治疗前，提前预测患者是否对该联合治疗有良好的反应，本发明提供了可以预测联合治疗疗效的标志物；同时提供了标志物组合，为临床开展治疗方案选择提供重要依据。
7.一方面，本发明提供了一种预测患者接受联合治疗疗效的标志物组合，所述标志物组合选自以下任意一种：
8.1)rorb igkv1_9、
9.2)rorb fgd5p1、
10.3)igkv1_9 fgd5p1、
11.4)rorb igkv1_9 fgd5p1；
12.本发明所述“联合治疗”是新辅助放化疗联合阿特珠单抗治疗。
13.如本发明所使用，所述“新辅助放化疗”与“ncrt”、“ncrt”相同含义，可以互换使用。
14.如本文所使用，所述“阿特珠单抗”即“atezolizumab”，也可翻译为“阿替利珠单抗”，在本发明中，以上词语表示相同含义，可以互换使用。阿特珠单抗(atezolizumab)，可靶向pd-l1蛋白。阿特珠单抗与肿瘤细胞和肿瘤浸润性免疫细胞上表达的pd-l1结合，阻断其与pd-1和b7.1受体的相互作用。通过抑制pd-l1，可以激活t细胞消灭肿瘤细胞。
15.具体地，所述“新辅助放化疗联合阿特珠单抗治疗”的治疗方案是：患者在ncrt的第一周和第四周静脉注射阿特珠单抗(1200毫克)。在ncrt后第7、10和13周给予阿特珠单抗单药治疗；所述ncrt是每周五次以下治疗：静脉注射卡铂(auc为2mg/ml/min)、静脉注射帕卡利(50mg/min)和放射治疗(41.4gy/23f/1.8gy)，流程示意图如附图4所示。
16.优选地，所述患者是食管腺癌患者。
17.更优选地，所述患者是可切除食管腺癌的患者。更具体地，所述可切除的食管腺癌是指病理分期《ct4b，cn0或cm0。
18.优选地，所述“疗效”包括“响应(r)”或“不响应(nr)”。所述“响应”是用trg评估为1-2级，所述“不响应”是用trg评估为3-5级，或在手术前病情进展。
19.另一方面，本发明提供了一种预测患者接受联合治疗疗效的试剂盒，所述试剂盒包括检测前述标志物组合中任意一个标志物或多个的表达量的试剂；
20.所述联合治疗是新辅助放化疗联合阿特珠单抗治疗。
21.优选地，所述患者是食管腺癌患者。
22.更优选地，所述患者是可切除食管腺癌的患者。
23.优选地，所述试剂为能够检测标志物mrna水平的试剂。这类试剂是本领域公知的，包括但不限于特异性结合目标序列的核酸探针、扩增目标序列的引物、非特异性荧光染料(例如，sybr green i)等。
24.优选地，所述核酸探针可以为单标记的核酸探针，例如放射性核素(如32p、3h、35s等)标记探针、生物素标记探针、辣根过氧化物酶标记探针、地高辛标记探针或荧光基团(如
fitc、fam、tet、hex、tamra、cy3、cy5等)标记探针；所述核酸探针也可以为双标记的核酸探针，例如taqman探针、分子信标、置换探针、蝎子引物探针、qual探针、fret探针等。
25.优选地，所述试剂为能够检测标志物的蛋白水平的试剂。
26.优选地，所述标志物的蛋白水平的试剂包括免疫学检测所需的试剂；所述免疫学检测包括elisa检测、elispot检测、western印迹或表面等离子共振法。
27.优选地，所述免疫学检测所需要的试剂是本领域熟知的，包括但不限于能够与目标蛋白特异性结合的抗体、靶向多肽。
28.优选地，所述免疫学检测所需要的试剂带有可检测的标记，如本文中所使用的，术语“可检测的标记”是指，可通过荧光、光谱、光化学、生物化学、免疫学、电学、光学或化学手段检测的任何组合物。这类标记是本领域熟知的，包括但不限于，酶(例如，辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、脲酶、葡萄糖氧化酶等)、放射性核素(例如，3h、125i、35s、14c或32p)、荧光染料(例如，异硫氰酸荧光素、四氯-6-羧基荧光素、六氯-6-甲基荧光素、异硫氰酸四甲基罗丹明、藻红蛋白(pe)、德克萨斯红、罗丹明、量子点或花菁染料衍生物(例如cy7、alexa 750))、吖啶酯类化合物、磁珠、测热标记物例如胶体金或有色玻璃或塑料(例如，聚苯乙烯、聚丙烯、乳胶等)珠、以及用于结合上述标记物修饰的亲和素(例如，链霉亲和素)的生物素。
29.所述与目标蛋白特异性结合的抗体是与rorb、igkv1_9、fgd5p1特异性结合的抗体，可以是单克隆抗体，也可以是多克隆抗体。从免疫检测的再现性等角度考虑，可优选使用单克隆抗体。
30.本发明所述“试剂盒”还可以包括缓冲液(例如封闭缓冲液、洗涤缓冲液、底物缓冲液等)、稀释液、滤器、针头、注射器、含有使用说明的包装说明书、其他试剂(如通过酶标记发生化学改变的底物)、表位修复溶液、对照样品(阳性和/或阴性对照)、对照切片等。所述试剂盒可以盛放于任意合适的容器中，所述容器上可以存在标签来指示该容器内仪器和/或试剂的具体应用，且还可以指示体内或体外使用的方向。
31.另一方面，本发明提供了一种预测患者接受联合治疗疗效的系统，所述系统包括根据前述标志物组合中任意一个标志物或多个的表达量的检测结果判断受试者接受联合治疗疗效的计算装置；
32.所述联合治疗是新辅助放化疗联合阿特珠单抗治疗。
33.优选地，所述患者是食管腺癌患者。
34.更优选地，所述患者是可切除食管腺癌的患者。
35.具体地，所述计算是将表达量的检测结果与表达量阈值相比较，来自对联合治疗有响应的患者样本中：rorb表达量下调；igkv1_9表达量下调；fgd5p1表达量下调；符合以上至少一种判断标准，则该受试者对联合治疗响应。
36.本发明所述上调即相对于表达量阈值升高；所述下调即即相对于表达量阈值降低。
37.应指出，本文所述“阈值”可取决于特定的测量技术，因而本文给出的数值仅涉及使用本发明测量标志物表达量的方法的测量值，如果使用不同的方法，则可能需要类推转换。但这种转换是在本领域技术人员技能范畴之内的。
38.本文中“样本”可以包括但不限于组织活检物、切除的组织、组织提取物、呼出的气
体、外周血、腹水液、组织间液、骨髓、脑脊液、胸腔积液、肿瘤浸润物、唾液、黏液、痰、精液、汗水、尿。
39.优选地，本发明所收集的样品是来自受试者的组织活检物。
40.优选地，所述样品是肿瘤细胞百分比≥30％，并且rna浓度不低于20ng/μl的组织活检物。
41.如本发明所使用“组织活检物”、“活检样本”、“肿瘤组织”皆为相同含义。
42.更优选地，所述检测是针对所组织活检物中提取的rna进行的检测。
43.优选地，所述系统可以包括标志物表达量的检测装置，也可以直接收集标志物表达量而进行计算。
44.优选地，所述系统包括用于输入前述标志物组合中任意一个标志物或多个的表达量的输入装置。
45.优选地，所述系统还可以包括用于输出预测结果的输出装置。
46.优选地，所述系统还包括评估结果发送单元，所述评估结果发送单元可以将受试者的评估结果发送到患者或医护人员可以查阅的信息通信终端装置。
47.优选地，所述用户输入装置包括鼠标、键盘、触摸屏显示器、一个或多个按钮、一个或多个开关、一个或多个触发器等等中的一个或多个。
48.优选地，所述显示装置包括液晶显示器(lcd)、发光二极管(led)显示器、等离子体显示器、投影显示器、触摸屏显示器等等中的一个或多个。
49.优选地，所述系统中各个装置之间可以通过有线方式和/或无线方式连接；进一步，无线连接方式可以为无线局域网、蓝牙、红外线等；有线连接方式可以为固话网络等。
50.另一方面，本发明提供了检测前述标志物组合中任意一个标志物或多个的表达量的试剂、前述试剂盒、前述系统在预测患者接受联合治疗疗效中的应用。
51.具体地，还可以是在制备预测患者接受联合治疗疗效的产品中的应用；
52.所述联合治疗是新辅助放化疗联合阿特珠单抗治疗。
53.优选地，所述患者是食管腺癌患者。
54.更优选地，所述患者是可切除食管腺癌的患者。
55.另一方面，本发明提供了一种预测患者接受联合治疗疗效的方法，所述方法包括根据前述标志物组合中任意一个标志物或多个的表达量判断联合治疗的疗效；
56.所述联合治疗是新辅助放化疗联合阿特珠单抗治疗。
57.优选地，所述患者是食管腺癌患者。
58.更优选地，所述患者是可切除食管腺癌的患者。
59.优选地，所述方法包括：
60.(1)收集受试者样本；
61.(2)提取受试者样本中的rna或蛋白，前述标志物组合中任意一个标志物或多个的表达量；
62.(3)根据标志物表达量的变化判断该受试者对联合治疗“响应”或“不响应”。
附图说明
63.图1是差异分析结果图，图1a：rorb，图1b：igkv1_9，图1c：fgd5p1；纵坐标是基因表
达量，nr是无反应组，r是反应组。
64.图2是rorb、igkv1_9、fgd5p1或其组合在预测患者接受联合治疗疗效的roc结果图，图2a：rorb，图2b：igkv1_9，图2c：fgd5p1，图2d：rorb igkv1_9，图2e：rorb fgd5p1，图2f：igkv1_9 fgd5p1；纵坐标是灵敏性，横坐标是特异性。
65.图3是rorb igkv1_9 fgd5p1在预测患者接受联合治疗疗效的roc结果图，纵坐标是灵敏性，横坐标是特异性。
66.图4是联合治疗的流程示意图。
具体实施方式
67.下面结合实施例对本发明做进一步的说明，以下所述，仅是对本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明的技术实质对以下实施例所做的任何简单修改或等同变化，均落在本发明的保护范围内。
68.实施例1、筛选分子标志物并验证其预测效果
69.本研究的数据来源是：gse165252。在可切除食管腺癌的患者进行如附图4所示的联合治疗之前，收集患者肿瘤活检样本进行rna测序。在患者接受治疗后，根据患者是否对联合治疗有反应，将患者分为反应组(r，responder)或无反应组(nr，non-responder)，对比反应组患者和无反应组患者的基因表达谱，即可获得潜在的可以预测对联合治疗的反应的标志物。以上所述“联合治疗”指新辅助放化疗、阿特珠单抗治疗的联合。该数据集中non-responder：responder＝20:12。用r语言limma包对其进行差异分析，按照p.value《0.01、|logfc|》1的标准进行筛选，得到差异表达基因，部分如表1所示。
70.表1.基因表达情况
71.基因名ensemble id平均表达量p.value上/下调rorbensg00000198963.113.06730.0013下调igkv1_9ensg00000241755.13.14090.0028下调fgd5p1ensg00000275340.12.55410.0033下调
72.为验证筛选到的潜在标志物是否具有准确的预测效果，使用r语言proc包绘制受试者工作曲线(roc)，计算auc值、敏感性和特异性，判断标志物的预测效能。在验证了每个差异基因单独可以准确预测患者对联合治疗是否有响应的基础上，进一步探索多个差异基因联合时的预测效果，roc曲线如图2-3所示，auc值如表2所示。
73.表2.标志物或标志物组合的auc值
74.标志物/组合aucrorb0.8042igkv1_90.7833fgd5p10.8250rorb igkv1_90.8333rorb fgd5p10.9375igkv1_9 fgd5p10.8958rorb igkv1_9 fgd5p10.9458
75.以上结果说明，在临床中，以上标志物的检测结果可以为可切除食管腺癌的患者对新辅助放化疗、阿特珠单抗治疗的联合治疗是否会有响应，为临床上选择治疗方案提供了依据。